Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rôle de la plasticité présynaptique dans l’encodage d’information sensorielle et contextuelle dans le cortex
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 332 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vecteurs viraux par chirurgie intracérébrale sous anesthésie, puis passent une série de tests, exposition à des goûts et à des sons, exploration d'un labyrinthe et test de mémoire contextuelle conditionnée, avant euthanasie pour des analyses d'électrophysiologie et d'imagerie. Le porteur présente l'objectif comme fondamental, mieux comprendre le rôle de la plasticité présynaptique dans la formation des souvenirs, sans application annoncée à court terme. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico n'étudie la neurotransmission de synapses matures et que les souris transgéniques sont "nécessaires".
Objectifs
La capacité de garder en mémoire une expérience est essentielle pour la survie des organismes supérieurs. Cette capacité est assurée en partie par 2 structures cérébrales appelées néocortex et hippocampe. Ces structures sont composées de cellules appelées "neurones". Ces derniers sont connectés entre eux par des synapses, et sont capables de modifier leurs connexions en fonction des informations qu’ils reçoivent, autrement dit, ils sont capables de « plasticité synaptique ». L'objectif général du projet est de mieux comprendre le rôle de la plasticité présynaptique dans la formation et le stockage des informations des souvenirs dans ces 2 structures du cerveau. La formation de la mémoire et la mémorisation de nouvelles informations dans les circuits neuronaux du cortex dépend de la capacité des neurones et des synapses à modifier leurs propriétés. Nous allons utiliser comme modèle soit des souris contrôle, soit des souris génétiquement modifiées (souis n'exprimant pas des protéines présynaptiques). Nous utilisons des injections localisées de vecteurs viraux (outils permettant de délivrer un gène d'intérêt) pour visualiser les cellules impliquées dans la formation de la mémoire, ou pour réaliser des modifications génétiques, en supprimant par exemple les protéines impliquées dans la plasticité présynaptique. Nous effectuerons ensuite des expériences d'électrophysiologie (enregistrement de l'activité électrique des neurones) et d'imagerie cellulaire sur tranches de cerveau, combinées à des taches comportementales.
Bénéfices attendus
Nous espérons mieux comprendre comment les neurones du cerveau, en particulier dans nos 2 structures cérébrales d'intérêt, traite la formation et le stockage d'informations des souvenirs.
Procédures
Une injection de virus par chirurgie intra cérébrale: entre 30 et 60 min pour tous les animaux du projet. Tests sensoriels: - gustatifs: exposition à différents gouts pendant 2 Heures une fois par animal. - Exposition à des sons: 5 minutes une fois par animal Tests contextuels: - Exploration dans un labyrinthe: 1H une fois par animal. Tests comportementaux de mémoire contextuelle : une fois par animal pendant 5 minutes. Injcetion intrapéritonéale durant quelques secondes d'une molécule une fois par animal.
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie stéréotaxique (stess de l'anesthésie, perte de poids légère). Les tests comportementaux ne durent que quelques minutes et n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Le test de mémoire contextuelle conditionnée peut induire un léger stress.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en vue d'études électrophysiologiques ou d'imagerie.
Remplacement
La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à mieux comprendre en quoi la plasticité présynaptique au niveau des synapses contribue à l'encodage et la mémorisation d'informations sensorielles et contextuelles. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici. En effet, les modèles alternatifs ne permettent pas d’étudier la neurotransmission au niveau de synapses matures complètement développées. De plus, l’étude du rôle des différe,tes protéines nécessite d'utiliser des souris transgéniques.
Réduction
Le même animal sera utilisé pour différents protocoles d’électrophysiologie ou d’imagerie afin de récolter un maximum de données scientifiques pour chaque souris. Si cela est possible, le nombre d’animaux sera revu à la baisse en cours d’expérimentation. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement (tunnel et matériel de nidification) et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex et de l'hippocampe de la souris présentent de nombreuses similitudes avec ceux d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les protocoles utilisés seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. L'introduction des différents gènes d'intérêt doit se faire à l'âge jeune (3 semaines) et le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge jeune adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage.
Suivi longitudinal de deux populations de chevreuils étudiées à différents niveaux d’organisation biologique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
3 500 chevreuils vont être capturés puis relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal capturé au filet reçoit des boucles auriculaires, un transpondeur sous-cutané et subit des prélèvements de sang, de poils, de fèces et de parasites, pour un suivi démographique et physiologique de deux populations closes. Le porteur indique que la capture provoque un stress et une mobilité réduite, parfois une myopathie de capture ou des fractures, et chiffre à 3,5 % la part des animaux morts ou mis à mort lors des captures hivernales entre 1993 et 2022. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne se substitue au suivi longitudinal d'individus marqués, qu'il juge "indispensable".
Objectifs
De par leur rôle dans la dynamique de la biodiversité, leur valeur patrimoniale et leurs interactions croissantes avec les activités humaines, il est de plus en plus nécessaire de bien comprendre la dynamique des populations, l'utilisation de l'espace, l'éco-épidémiologie et l'éco-physiologie des grands mammifères herbivores. C'est dans cette optique que notre laboratoire pilote des programmes de recherche intégratifs sur l'ensemble des espèces de grands mammifères herbivores, en collaboration étroite avec la Direction de la Recherche et de l’Appui Scientifique de l'Office Français de la Biodiversité (OFB). L’objectif du présent programme de recherche est la perpétuation d’un suivi démographique, phénotypique, génétique, physiologique et épidémiologique de deux populations de chevreuils (Capreolus capreolus), une peuplant un territoire d'études dans le nord-est de la France et l’autre une réserve biologique dans l’ouest de la France. Ces deux populations sont encloses et très faiblement chassées. Depuis 1975 (pour la première population) et 1977 (pour la seconde), et le début du programme de Capture-Marquage-Recapture, la collecte des données s’est enrichie pour répondre aux questions posées dans des projets scientifiques aux thématiques diverses (ex : démographie, communautés de parasites, horloges moléculaires, interaction entre stress et immunité). Les suivis individuels de ces populations constituent aujourd’hui deux des suivis longitudinaux de populations sauvages les plus longs et complets au monde, fait d’autant plus exceptionnel qu’il concerne deux populations contrastées en termes de conditions environnementales, permettant ainsi d’étudier le rôle de l'environnement sur les processus éco-évolutifs et éco-épidémiologiques. Les suivis à long-termes de populations naturelles constituent aujourd’hui une ressource scientifique précieuse à préserver. Notre objectif est donc de mettre notre programme de recherche sur le suivi du chevreuil (et la collecte de données associée) en adéquation et au service de projets scientifiques ambitieux et multi-disciplinaires, tout en respectant la sécurité et le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet à long terme est fondé sur le suivi détaillé des trajectoires individuelles de chevreuils faisant face à des contextes environnementaux très variés aussi bien au sein (variation entre cohortes, variation spatiale de la qualité d’habitat) qu’entre (productivité de l’habitat et conditions climatiques très contrastées) populations. Ce cadre unique permettra (1) de quantifier l’importance des différences individuelles de trajectoires démographiques, comportementales, et physiologiques, (2) d’identifier les facteurs responsables de cette hétérogénéité, (3) d’appréhender la covariation entre ces trajectoires pour établir une typologie, et (4) de mesurer la performance de chaque type de trajectoires et de prédire leur fréquence relative suivant le contexte environnemental. Ces tâches permettront de tester empiriquement de nombreuses théories actuelles de la biologie évolutive qui restent difficiles à appréhender en milieu naturel, et plus généralement de quantifier le rôle respectif des contraintes, du hasard et de l’évolution adaptative dans la réponse des traits constitutifs des trajectoires individuelles aux changement de conditions environnementales. En plus de ces bénéfices en termes d’une meilleure compréhension des processus biologiques agissant dans la nature, ce projet a clairement une forte valeur sociétale. Ciblant une espèce « ingénieure des écosystèmes » qui est actuellement l’espèce de grand mammifère la plus abondante et l’une des plus intensivement chassée en France (avec près de 500 000 individus tirés chaque année) et dans toute l’Europe, ce projet apportera les connaissances nécessaires à une gestion plus raisonnée du chevreuil afin de limiter les conflits avec les activités humaines tels que l’augmentation des collisions automobiles, la prévalence de la maladie de Lyme, ou les dégâts à la régénération forestière.
Procédures
Dans le cadre des captures hivernales, les animaux d’âge connu (c’est-à-dire capturés pour la première fois alors qu’ils étaient faons ou chevrillards) seront soumis aux interventions suivantes : une pose de boucles auriculaires à la première capture (si non marqué - durée 1 min), une pose de transpondeur sous-cutané (si non marqué - durée 1 min), un prélèvement de sang par an maximum (durée 1 min), un prélèvement de poils par an maximum (durée 1 min), un prélèvement de fèces par an maximum (durée 2 min), et un prélèvement de parasites externes (durée 1 min). Les animaux d’âge non connu (c’est-à-dire capturés pour la première fois alors qu’ils étaient déjà adultes) ne seront soumis qu’au prélèvement de fèces. Dans le cadre de la recherche et du marquage des faons nouveau-nés, les interventions sur animaux vigiles correspondront à la pose de boucles auriculaires (durée 1 min) et à un prélèvement de sang (durée 1 min).
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue est le stress causé par la capture (phase de course avant la capture au filet puis phase de manipulation pour la mise en sabot) et par la manipulation sur la table. La conséquence la plus fréquente de ce stress est une mobilité réduite dans les jours suivant la capture, dont la durée a été évaluée à 14 jours chez le cerf de Virginie. Plus rarement, peut survenir une myopathie de capture (fréquence évaluée à moins de 2% des cas lorsque des bonnes pratiques sont respectées), s’exprimant essentiellement soit sous la forme d’un choc post-capture (dans les 6 heures suivant la capture, avec risque mortel) soit sous la forme d’un syndrome d’ataxie-myoglobinurie (dans les heures ou jours suivant la capture). Une douleur pourrait être liée à une manipulation maladroite, à la prise de sang, à la pose de boucles auriculaires et du transpondeur. La douleur associée au protocole est donc modérée et de courte durée et ne persiste pas au-delà de la manipulation. Les réactions de fuite ou de lutte peuvent avoir pour conséquences des traumatismes physiques: occasionnellement des plaies sans conséquences majeures, ou rarement des fractures ou des atteintes articulaires, ces dernières pouvant entraîner un risque mortel. Au total, pour les années 1993-2022, le pourcentage d’animaux morts ou mis à mort au cours des captures hivernales était de 3,5% dans la population de l’ouest de la France (de 1,2% à 8,3%) et de 2,7% dans celle du nord-est (de 0,8% à 5,7%). Il était stable au fil du temps dans la première et a eu tendance à diminuer à dans la seconde. La différence entre les deux populations et les variations interannuelles semblent liées à la condition physique des animaux, généralement meilleure dans la population du nord-est que dans celle de l’ouest. Ainsi, dans cette population, l’année de plus forte mortalité associée aux captures était l’hiver 2003-2004 faisant suite à la sécheresse de l’été 2003 (8,3%), et était due en partie à la présence exceptionnelle de faons de très petite masse (
Devenir
Remis en liberté.
Remplacement
Notre programme de recherche sur le chevreuil repose en grande partie sur l’étude des réponses individuelles et populationnelles aux variations des conditions environnementales d’origines diverses (e.g. conditions climatiques, ressources, pollution, agents pathogènes). Ces réponses sont étudiées aux niveaux comportemental, physiologique et démographique. Le suivi longitudinal d’individus marqués, permettant de quantifier les trajectoires individuelles est donc indispensable, tout comme le prélèvement de tissus biologiques sur ces mêmes individus. Il n’existe donc, par essence, aucune méthode substitutive à notre protocole de recherche. Les approches in vitro ou in silico ne permettent pas d’étudier simultanément (i) les réponses aux variations des conditions environnementales d’origines diverses (climat, pollution, pathogène) de manière intégrée (des réponses physiologiques complexes jusqu’à leurs conséquences sur la valeur sélective) au niveau individuel, et (ii) les conséquences démographiques au niveau populationnel. Notre protocole a été réfléchi de sorte à ce que toutes les quantités de tissus prélevées soient en adéquation avec des objectifs pré-définis précis. Toutefois, si certains échantillons s’avéraient non utilisés ou si une amélioration des protocoles de biologie moléculaire permettait de réduire la quantité de tissus à utiliser pour la quantification d’un paramètre donné, les échantillons supplémentaires et restants seraient mis à disposition de notre réseau de collaborations (et participeraient ainsi à du remplacement pour des projets futurs).
Réduction
Chaque année, un total de 350 à 500 animaux sont capturés sur les deux sites (entre 150 et 250 dans la population du nord-est et entre 200 et 250 dans la population de l’ouest sur les 10 dernières années). Environ 50% de ces animaux sont capturés pour la première fois (et donc marqués à cette occasion) ; 50% sont des animaux qui ont déjà été capturés et marqués une année précédente. Ce nombre permet de maintenir une proportion importante d’animaux marqués dans la population (> 50%) et d'obtenir des estimations précises des paramètres démographiques. Comme il n'est pas possible de prendre en compte les effets de l'âge sur les paramètres démographiques et physiologiques à partir des animaux d'âge non connu, ces derniers ne font pas l'objet de prélèvements biologiques (hormis un morceau de cartilage auriculaire pour la reconstitution du pédigrée) mais sont examinés, pesés et mesurés. En effet, l'âge et le sexe des animaux ont des effets marqués sur les traits d'histoire de vie et les mesures physiologiques, et un effectif minimum situé entre 80 et 100 prélèvements par an et par population est nécessaire pour appréhender la forte hétérogénéité entre individus et obtenir des mesures précises des marqueurs physiologiques étudiés. En outre, le chevreuil est une espèce avec une forte espérance de vie, ce qui nous permet d’étudier et de contrôler l’importance des conditions environnementales rencontrées dans l’environnement natal, et ainsi de prendre en compte les effets de l’année de naissance (appelés ‘effet cohorte’). La fourchette de 80-100 prélèvements annuels (en fonction de la réussite des captures) par site sur des animaux d’âge connu nous permet d’assurer la capture d’individus de chaque cohorte non éteinte, même pour les cohortes de plus mauvaise qualité. En termes de réduction de l'inconfort et des prélèvements, les manipulations qui peuvent être stressantes ou douloureuses pour l’animal (pose de boucle auriculaire et transpondeur) sont réalisées une seule fois dans sa vie (excepté les cas rares où l'individu a perdu une de ses marques). Les autres prélèvements réalisés sur les adultes (captures hivernales) ou les faons (au printemps) ne sont réalisés qu’une seule fois dans l’année. Si un animal d’âge connu venait à être capturé une seconde fois dans la même saison, aucun prélèvement ne serait pris et l’animal serait relâché le plus rapidement possible.
Raffinement
Afin de minimiser le stress, les manipulations sont effectuées dans un local réservé à cet effet par du personnel formé et qualifié. Les animaux ont les yeux couverts d’un tissu le temps que les prélèvements soient réalisés et sont manipulés le plus silencieusement possible. Ils sont ensuite transférés dans une autre pièce au calme en attendant d'être relâchés. La durée totale entre la capture et le relâcher est de 2 à 6 heures incluant 10 (mâles) à 20 (femelles) minutes de contention et de manipulation en dehors du sabot (boite de contention). La survie des animaux est tout à fait conforme à ce que l'on observe chez les autres espèces de mammifères terrestres de taille similaire (sauf Primates). La survie annuelle des jeunes (jusqu'à 1 an) est très variable en fonction des conditions environnementales (
Choix des espèces
Le chevreuil est un ongulé forestier commun, pour lequel les techniques de capture et de contention sont éprouvées et qui présentent des enjeux importants en termes de gestion cynégétique (actions de gestion de la faune sauvage par la chasse), forestière et sanitaire. C’est un mammifère au cycle de vie lent, plus proche de l’homme que les modèles murins, ce qui multiplie les implications et la portée scientifique de nos travaux situés à l’interface de l’écologie et des sciences de la santé. Le chevreuil est aussi la seule espèce de mammifère au monde pour laquelle deux populations vivant en milieux contrastés sont suivies intensivement depuis des décennies. Cet atout permet de capitaliser sur les données démographiques et environnementales (qualité de l’habitat, conditions climatiques) collectées sur plus de 2000 individus dans le cadre de nos projets (maximisant ainsi le remplacement), mais également de profiter de l’expérience passée pour raffiner nos protocoles. Tous les stades de développement seront utilisés. L’âge des chevreuils ne pouvant être déterminé avec exactitude que durant leur première année de vie (grâce à l’analyse de la dentition et l’éruption des incisives), il est nécessaire de capturer les nouveaux individus (pas encore marqués) avant un an pour suivre ensuite des animaux d’âge connu. De plus, l’un des objectifs du projet étant d’estimer la survie des jeunes individus (notamment la phase de vie précoce entre la naissance et l’entrée de l’hiver, cruciale dans la dynamique des populations chez cette espèce), les chevreuils sont capturés à 2 périodes distinctes dans l’année: au printemps au moment de leur naissance (faons nouveau-nés) et pendant leur premier hiver lorsqu’ils sont âgés de 7 à 9 mois (chevrillards). Les captures hivernales sont aussi l’occasion de capturer des animaux adultes d’âge connu (s’ils ont été marqués faons et/ou chevrillards) et des animaux adultes d’âge non connu (pas marqués faons ni chevrillards).
Production d’anticorps de souris spécifiques de protéines recombinantes et essai de candidats vaccins à ARNm de Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum et Plasmodium knowlesi
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Des injections de protéines avec adjuvant de Freund, complet la première fois puis incomplet, précèdent une exsanguination par ponction intracardiaque sous anesthésie pour les souris immunisées : 600 souris âgées de 6 semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet doit produire des anticorps polyclonaux contre des protéines de Plasmodium, le parasite du paludisme, et cribler des candidats vaccins à ARNm injectés dans le muscle. Le porteur prévient que les souris "peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d'angoisse". Celles dont le titre d'anticorps suffit sont mises à mort pour leur sérum, et les autres doivent l'être à la fin de chaque procédure, même si le porteur ajoute qu'elles "peuvent être réutilisées dans d'autre projets dans la mesure du possible".
Objectifs
Le paludisme est un problème de santé publique, majeur qui sévit dans plus de 100 pays et fait plus de 627 000 morts par an surtout chez les jeunes enfants. Chez les femmes enceintes, l’infection par Plasmodium peut causer leur mort et celle de leur enfant ainsi qu’un poids de naissance inférieur à la normale entraînant une mortalité très fréquente après la naissance. Depuis 2021, un vaccin est disponible sur le marché. La prise d’antipaludiques et l’utilisation de moustiquaires imprégnées augmentent la résistance du parasite aux antipaludiques. La maladie est causée par le parasite du genre Plasmodium, un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexes. Parmi les 5 espèces qui infectent l’Homme, deux sont les plus répandues : Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Le cycle de vie du parasite, entre un hôte mammifère et un moustique du genre Anopheles, est complexe. La partie la mieux connue de ce cycle est la phase érythrocytaire se déroulant chez le mammifère, durant laquelle les parasites se multiplient dans les érythrocytes de l’hôte. Notre laboratoire étudie les mécanismes d’invasion des globules rouges humains par Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Nous nous intéressons, en particulier, au stade sanguin du cycle du parasite. Nous étudions les mécanismes mis en jeu par le parasite pour s’attacher au globule rouge, y pénétrer et s’y développer. Cette phase érythrocytaire pour P. falciparum et P. knowlesi, peut être reproduite in vitro dans des systèmes de culture de globules rouges humains. Nous avons identifié plusieurs protéines d’intérêt exprimées par le parasite lors de son cycle de vie dans le globule rouge. Afin de les étudier, nous allons produire, chez la souris, des anticorps polyclonaux (AcP) dirigés contre ces protéines. Ces anticorps nous permettrons d’inhiber ces protéines à la surface du merozoïte (forme du parasite permettant d’infecter un nouveau globule rouge) ainsi que de déterminer la réponse immunitaire des candidats vaccins.
Bénéfices attendus
Notre compréhension du paludisme est limitée par des outils de recherche tels que les anticorps. Il existe en effet peu d’anticorps spécifiques contre les différentes espèces de Plasmodium disponibles. Ce projet a pour but de produire un outil qui sera indispensable dans la lutte contre cette maladie. Les anticorps sont essentiels pour faire progresser notre connaissance sur le fonctionnement du parasite. Nous pouvons étudier l’expression de ces molécules dans les différents stades du parasite en utilisant les techniques suivantes : ELISA, Western Blot, l’inhibition de la croissance parasitaire, les procédures d’immunoprécipitation, l’immunofluoromicroscopie. Avec des anticorps spécifiques nous sommes en mesure de mieux comprendre l’implication des protéines responsables de l’invasion chez P. falciparum, P. vivax et P. knowlesi. De plus, les infections de souris par des candidats vaccins permettront un criblage des préparations vaccinales.
Procédures
1) Une prise de sang (une minute). 2) Une injection (une minute). 3) L'exsanguination par ponction intra-cardiaque (5 minutes) à la fin de l’expérience, préalablement anesthésiées par injection par voie intrapéritonéale (une minute).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés à l’injection des protéines avec adjuvant et des candidats vaccins. Dans des très rares cas les souris peuvent mal supporter les protéines recombinantes et les candidats vaccins à ARNm. Elles peuvent montrer une réaction inflammatoire. Les souris recevront les protéines recombinantes en présence d’adjuvant Complet de Freund (CFA) pour la première injection et l'adjuvant Incomplète de Freund (IFA) pour les autres injections. L’utilisation de l’adjuvant CFA par voie sous-cutanée peut induire des effets indésirables. Les injections des candidats vaccins à ARNm se feront par la voie intra-musculaire sans adjuvant. Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse.
Devenir
Toutes les souris ayant un titre d’anticorps satisfaisant seront mises à mort afin d’obtenir une quantité de sérum suffisant pour l’études des protéines d’invasion ou déterminer les candidats vaccins permettant la meilleure immunisation possible contre P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi. Toutes les souris n’ayant de titre d’anticorps satisfaisant lors de prélèvements intermédiaires seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car elles ont reçu au moins une injection de protéines recombinantes ou une dose de candidats vaccins à ARNm. Elles ne peuvent donc pas être réutilisés dans notre projet. Cependant, elles peuvent être réutilisées dans d’autre projets dans la mesure du possible.
Remplacement
L’alternative possible à l’emploi de sérums serait d’employer les sérums prélevés chez des personnes vivant en zone d’endémie, porteuses d’anticorps contre les antigènes d’intérêt et d’immuno-purifier les immunoglobulines spécifiques par affinité sur les antigènes recombinants. Les expériences d’autre groupes de recherche ont montré que les anticorps ainsi obtenus sont de faible affinité pour des protéines spécifiques, avec un titre très faible et ne fonctionnent pas pour les protéines intracellulaires qui ne sont pas exposée à la réponse immunitaire de l'hôte. Il existe aujourd'hui des alternatives non animales pour produire les anticorps telles que les anticorps recombinants et les aptamères (courts fragments d'ADN ou d'ARN qui peuvent se lier à des cibles telles que des protéines). Cependant, une bibliothèque de gènes d'anticorps de Plasmodium n'a pas encore été constituée, ce qui rend cette technique hors de portée pour le moment. Le recours à l’animal est nécessaire car ces anticorps ne peuvent être obtenus qu’après immunisation d’une espèce animale. Cependant, pour chaque protéine identifiée avec certitude dans l’invasion du globule rouge par P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi, nous ferons des hybridomes permettant d’obtenir des anticorps monoclonaux. Ce qui nous permettra de bénéficier d’une banque d’anticorps pour l’étude des mécanismes d’invasion du globule rouge par les Plasmodium.
Réduction
Le nombre de souris pour chaque expérimentation a été calculé au plus juste pour permettre un nombre minimum des animaux. Cette estimation a été réalisée en concertation avec un biostatisticien. Ainsi, nous avons choisi des groupes de 5 souris dont les sérums seront poolés afin d’avoir une quantité de sérums suffisante pour une étude approfondie et répétée.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse de nos souris, nous mettrons en œuvre un enrichissement de l’environnement avec par exemple des abris et des bâtons de coton pour la nidification. Si les souris montrent des signes de détresse ou de souffrance pendant les prélèvements nous pouvons utiliser une anesthésie gazeuse sous isoflurane. Une surveillance accrue pendant 3 jours suivant les injections et puis 2 fois par semaine entre les injections et les prélèvements ainsi que des soins post manipulation (injections et prélèvements) seront pratiqués.
Choix des espèces
Nous avons choisi de produire nos anticorps chez la souris car nous savons par des expériences antérieures que les protéines recombinantes de Plasmodium sont très immunogènes chez la souris. De plus il est indispensable de tester des candidats vaccins sur des souris avant de continuer leur développement. Les souris utilisées pour les immunisations seront âgées de 6 semaines, âge auquel on obtient une bonne réponse immune et une préhension correcte pour l’immunisation et le prélèvement sanguin.
Effet chronique de la kisspeptine et test d’expression et de sécrétion de la protéine dans le tissu musculaire de souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
779 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des pompes osmotiques renouvelées deux fois, des injections dans la veine saphène, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline et des tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour tenter de faire produire un peptide de la reproduction par leurs cellules musculaires. Le porteur signale des douleurs, une perte de poids et une perte de mobilité liées aux pompes et aux injections, tous les animaux étant mis à mort pour prélèvement d'organes. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est envisageable pour cette approche encore jamais testée.
Objectifs
La kisspeptine (Kp), produite dans le cerveau, est un puissant stimulateur de la sécrétion de gonadolibérine (GnRH) qui, à son tour, induit la libération de l’hormone lutéinisante (LH) dans la circulation sanguine chez les mammifères. A ce jour, de très nombreuses études ont évalué l’effet d’une injection aigüe de kisspeptine pour tenter de comprendre et de maitriser la reproduction de plusieurs mammifères (notamment la souris, l’Homme, mais aussi les animaux de rente pour lesquels le système reproducteur n’est pas actif tout au long de l’année). De ce fait, les mécanismes impliquant le contrôle de la sécrétion de LH et l'action de la Kp sont alors très bien connus et documentés. Cependant, une faiblesse majeure de la kisspeptine, utilisée en tant que telle pour maitriser la reproduction, est le délai d’action de la protéine qui est relativement vite dégradée. Des études ont alors tenté de mettre au point une forme modifiée de la kisspeptine afin de la rendre plus résistante aux processus de dégradation. A ce jour, aucune forme modifiée du peptide n’a cependant été assez performante pour être utilisée comme outils de maitrise de la reproduction. Le présent projet vise alors à adopter une approche totalement innovante à la lumière de ce qui est en cours de développement dans le domaine des biomédicaments : faire produire la kisspeptine directement par les cellules musculaires qui sont des cellules définitivement différenciées, qui ne se divisent pas, et sont capables de fortement exprimer une protéine puis de l'excréter dans le système circulatoire. Concrètement, l’idée est d’injecter dans le muscle un complexe ADN pour faire produire de la Kp qui sera excrété du muscle vers le système sanguin. Comme ils n’impliquent pas d’agents viraux, ces complexes sont plus faciles d’utilisation et n’ont pas d’effet inflammatoire. Nous souhaitons donc tester si l’injection de ces complexes dans le muscle peut être une technique efficace pour, à terme, faire produire de façon stable la Kp dans l’optique de stimuler ou inhiber la reproduction de l’organisme cible qui, dans ce projet, est la souris.
Bénéfices attendus
Le présent projet vise à mettre au point une méthode permettant de sécréter de la kisspeptine de façon continue par les cellules musculaires de l’organisme cible. Les bénéfices sont donc multiples 1) étudier l’effet d’une diffusion continue de kisspeptine sur la physiologie de l’organisme, 2) mettre au point une technique de production de peptides par les cellules musculaires et 3) développer un outil permettant de maitriser la reproduction.
Procédures
- Pose de mini pompes osmotiques sur 96 animaux : les mini pompes diffusent la solution qu'ils contiennent pendant 28 jours maximum, le protocole étant prévu pour 3 mois, les mini pompes seront remplacées 2 fois. - Test de tolérance au glucose (GTT) et à l'insuline (ITT) sur 56 animaux avec des prélèvements de sang. L'ITT sera toujours réalisé 1 semaine avant le GTT et ceux ci seront réalisés 3 fois avec 28 jours d'intervalle. - Frottis vaginaux réalisés sur 28 femelles sur une période de 8 jours tout les 28 jours. - Tests de comportements sur 80 animaux - Prises de sang sur 96 animaux tout les 28 jours. L'intervention sera réalisée 4 fois. - Injection d'un solution et 16 prélèvements de 4ul de sang de façon sériée, une seule fois au 84ème jour du protocole. - Mise à mort après anesthésie - Injection hydrodynamique d'un vecteur plasmidique via la veine saphène réalisé sur 637 animaux au total sur les deux procédure (630 + 7). Prises de sang tout les 10 jours pendant 3 mois, soit 9 fois. - Mise à mort après anesthésie - Electroporation ou injection hydrodynamique sur 14 animaux
Impact sur les animaux
Le peptide et ses effets sont très bien décrits chez les mammifères, et notamment chez les rongeurs. En termes de manipulation des animaux, les tests comportementaux, chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets secondaires peuvent être observés, notamment suite à la pose des mini pompes ou l'injection hydrodynamique : des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent apparaître mais sont anticipés par l'injection d'antidouleurs au moment des procédures. De plus un suivi journalier sera mis en place pour prévenir ce genre d'effets et pouvoir traiter les animaux en conséquence. L’objectif de ce projet est d’induire une production continue de kisspeptine par l’organisme, ce qui n’a encore jamais été testé jusqu’à présent.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes pour des études post mortem
Remplacement
Une grande partie du travail de sélection des meilleurs vecteurs ADN a été réalisé en amont sur des modèles de cultures cellulaire, mais l'étude de l'effet de la Kp sur la fonction de reproduction et sur la physiologie globale de l’organisme nécessite un système complexe et vivant tel que le modèle murin afin d'avoir une compréhension complète des mécanismes mis en jeu, aucune méthode de remplacement n'est donc envisageable dans ce contexte.
Réduction
Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 7 animaux par traitement.
Raffinement
Les animaux impliqués dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique dans des cages en présence d'enrichissement (de type carton pour la mise en place d'un nid, petite cabane en carton...). De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Aussi une attention toute particulière sera portée aux points limites. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence des souris sera suivi avec attention et les animaux seront pesés tous les jours pendant 3 jours après les prises de sangs puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Afin de de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de cookie sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin. De plus, lors des chirurgies (implantation de mini pompes et injections hydrodynamique, des traitements anesthésiques et analgésiques seront apportés aux animaux pour réduire leur douleurs au maximum.
Choix des espèces
Les mécanismes d’action de la kisspeptine, de façon aigüe chez la souris sont très bien documentés au niveau de la physiologie de la reproduction. De plus les mécanismes sous-jacents sont bien décrits et conservés chez les mammifères. Cependant, l’effet de la kisspeptine sur le long terme sur la physiologie globale de l’organisme reste assez peu étudiée, or, ce peptide est de plus en plus présenté comme étant un outil prometteur pour la maitrise de la reproduction et le traitement de pathologies associées à la fertilité. La souris est alors un très bon modèle pour analyser les effets de composés sur la physiologie et le comportement tout en offrant la possibilité de réaliser des parallèles avec d’autres espèces qui permettront d’avoir un bon aperçu de l’effet de la kisspeptine sur le long terme. Enfin, ces études font suite à des manipulations in vitro et permettront de poursuivre avec des expérimentations sur les espèces de rente telles que les ovins et constituent alors un chainon essentiel au développement de notre approche de façon optimale et rigoureuse.
Evaluation de l’effet d’un nouveau traitement sur la douleur dans un modèle d’inflammation aigüe articulaire induite par la carragénine chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur injecte de la carragénine dans le genou pour déclencher une inflammation articulaire, avant d'administrer des traitements et de mesurer la douleur chaque jour, pour évaluer une nouvelle formulation antidouleur contre la goutte. Le porteur décrit un œdème, une douleur et une perte de mobilité de la patte, ainsi qu'un inconfort lié aux tests de douleur, tous les rats étant euthanasiés pour prélever les pattes. Il affirme qu'aucun procédé in vitro ou in silico ne permet d'évaluer cet effet antalgique.
Objectifs
La goutte est une pathologie articulaire fréquente qui touche plus de 17,5% des personnes âgées de plus de 75 ans. Cette affection est caractérisée par des dépôts de cristaux d’urate de sodium, de pyrophosphate de calcium ou de phosphate de calcium au sein des articulations. Ils peuvent être responsables d’inflammation articulaire aiguë récidivante. Cette inflammation est contrée par la colchicine ; mais celle-ci, utilisée par voie orale et systémique expose à des effets secondaires parfois mortels, en particulier chez des patients avec insuffisance rénale. Ainsi, il existe un réel besoin de traitement local efficace, et rapidement actif sur la douleur, qui est intense au cours d’un accès goutteux. Les études pré-cliniques sont menées principalement pour évaluer la capacité de nouveaux traitements à inhiber l’inflammation et de la destruction des articulations, et non à inhiber les paramètres de la douleur. La douleur est très rarement étudiée dans les modèles animaux d’arthrite, or c’est d’un intérêt clinique majeur pour les patients. Finalement notre objectif est de démontrer : (1) l’intérêt d’évaluer la douleur dans un modèle d’inflammation à la carraghénine, (2) l’intérêt d’une nouvelle formulation innovante utilisant une nouvelle technologie de délivrance de médicament, (3) d’établir l’effet sur la douleur de cette formulation, de la comparer et l’associer à un antalgique local.
Bénéfices attendus
La douleur dégrade très fortement la qualité de vie des patients atteints de maladie goutteuse. Dans cette maladie très inflammatoire qui altère progressivement les articulations, la douleur peut être associée à une inflammation en cours (douleur inflammatoire) ou peut survenir durant la phase chronique de la maladie, en dehors des poussées. La douleur est ressentie de façon variable par les patients au cours de la maladie. Les médicaments anti-inflammatoires sont efficaces sur l’inflammation et la douleur à condition d’être tolérés. Les médicaments actuels voient leur efficacité limitée, faute de pouvoir atteindre une concentration suffisante au sein de l'articulation inflammée. Localement, l'administration simultanée d’une préparation délivrant de façon lente et continue un anti-inflammatoire (M1) et un anesthésique local (M2), serait un progrès significatif dans la prise en charge des malades. Ce projet serait donc susceptible d’apporter la preuve de l’efficacité d’une telle approche sur la goutte et permettrait d’envisager un nouveau traitement efficace sur la douleur pour ces patients difficiles à soigner.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 injections intra-articulaires (Carraghénine, puis traitements) d'une durée de quelques secondes sous anesthésie gazeuse d'une durée de 3 min. Ils seront manipulés tous les jours pendant 3 jours pour les mesures de douleur et de score clinique, cette évaluation dure environ 30 min par rat. Le temps de maintien total des rats dans l'animalerie est de 2 semaines, adaptation et expérimentation incluses, puis les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour réaliser des prélevement d'organes et des analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des injections intra-articulaires dans le genou droit qui provoqueront un œdème, une douleur et une perte de mobilité transitoire de la patte injectée. Les tests d'évaluation de la douleur seront responsables d'un inconfort passager pour les rats (isolement pendant environ 15 minutes, stimulation des pattes jusqu'à la détection du seuil de douleur).
Devenir
Tous les animaux (150 rats) seront euthanasiés à l'issue de la procédure. Ceci permettra d'effectuer le prélèvement des pattes postérieures nécessaire à l'étude histologique complémentaire.
Remplacement
Les expériences in vivo dans ce projet sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance de la drogue par un procédé nouveau utilisant des microparticules dans des conditions inflammatoires, d’autre part car l’originalité principale ici consiste à évaluer l’effet antalgique du procédé que nous étudions.
Réduction
Pour la réduction, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Le nombre de rats nécessaires pour cette étude de 150. La taille des groupes a été définie sur la base des études antérieures réalisées au laboratoire sur les modèles expérimentaux d'arthrite, y compris le modèle d'AIC. Nous avons également tenu également compte d'une possible perte d'animaux liée à la procédure expérimentale. Une étude préliminaire dans le genou est programmée. Elle constitue un point bloquant, pour ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire. A l'euthanasie, les pattes seront prélevées afin d’obtenir un maximum d’information complémentaires sur l'impact de l’arthrite et son traitement au niveau de l'articulation et limiter ainsi la répétition d'expériences.
Raffinement
Les rats seront hébergés dans des cages en plastique enrichies avec des tunnels et maintenus en groupes de 4 individus minimum afin de respecter leurs besoins sociaux. Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Des points limites destinés à limiter l'inconfort et la douleur des rats seront mis en place dans chaque expérience et tous les animaux seront pesés et leur comportement surveillé afin de veiller à leur bien-être. L’euthanasie se fera par une méthode réglementaire. Toutes les injections intra-articulaires se font sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. Dès les premiers signes cliniques, des aliments sous forme de granulés seront placés directement dans la cage pour faciliter la prise de nourriture des rats.
Choix des espèces
Le rat a été choisi car c’est le plus petit animal chez qui il est fiable d’injecter des volumes bien définis, de l’ordre de 50 μl (moins devient problématique à préparer et à injecter) dans un site anatomique aussi précis qu’une articulation. Des rats de 250 à 300g seront utilisés, soit environ 6 à 7 semaines. Pour l’évaluation de la douleur posturale, des animaux plus gros ont tendance à s’appuyer avec leur corps et non leurs pattes sur le capteur et on perd donc l’information voulue.
Modèle GVHD : Développement de la maladie du greffon contre l’hôte dans le modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souris receveuses sont irradiées puis greffées avec des cellules prélevées sur des souris donneuses tuées à cet effet, avant de recevoir des composés par de multiples voies sous anesthésie, pour tester des traitements de la maladie du greffon contre l'hôte. Le porteur décrit une perte de poids, des diarrhées, des lésions cutanées et une déshydratation, des points limites déclenchant la mise à mort, tous les animaux étant euthanasiés pour prélever organes et sang. Il affirme que les co-cultures in vitro ne modélisent pas cette maladie et que le modèle souris est "requis".
Objectifs
L’objectif de ce projet de recherche est d’identifier des composés chimiques ou biologiques pour le développement de nouveaux médicaments dans le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte (Graft versus Host Disease, GvHD). La greffe de cellules souches sanguines est un traitement qui est proposé à des patients souffrant de cancers ou maladies du sang (leucémies, lymphomes etc…). Ce traitement consiste à injecter des cellules sanguines provenant d’un donneur sain au patient receveur dont la moelle osseuse a été partiellement ou totalement détruite. Ce transfert de cellules sanguines chez le patient receveur provoque dans 20 à 80 % des cas la maladie dite du greffon contre l’hôte (GVHD). Elle se caractérise par une réaction immunitaire des cellules du donneur envers les tissus du patient receveur. La GVHD se manifeste par deux phases distinctes appelées GVHD aigue et GVHD chronique. Lors de la GVHD aigue, les patients présentent une inflammation des muqueuses intestinales et cutanées. Ces symptômes sont également présents dans la GVHD chronique et sont alors associés à des atteintes au niveau musculaire et pulmonaire. A ce jour, il n’existe aucun traitement de la GVHD. Dans le but de modéliser cette pathologie incurable, des expériences chez le rongeur montrent que l’irradiation sublétale d’une souris recevant de la moelle osseuse provenant d’une souris donneuse provoque une réaction immunitaire caractéristique du développement de la GVHD. Les manifestations chez le rongeur sont très similaires à celles observées chez l’homme et démontrent de la pertinence de ce modèle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments dans le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte (Graft Versus Host Disease, GVHD), sur une période allant jusqu’à 3 mois.
Procédures
Les souris receveuses seront irradiées chez l’éleveur si nécessaire, puis recevront une administration IV de cellules de souris donneuses (euthanasiées pour récupération de cellules immunitaires dans la rate et la moelle osseuse) ou de cellules immunitaires humaines. Afin d’évaluer l’efficacité de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); ou par minipompe ou implant (intraveineux, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 3 mois. Les effets de la mise en place de maladie du greffon contre l’hôte (perte de poids, lésions cutanées, diarrhées) seront suivis à l’aide d’une grille de scoring et des points limites adaptés à l’objectif de l’étude ont été mis en place. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang.
Impact sur les animaux
Du fait de la mise en place de la maladie du greffon contre l’hôte, les animaux pourront présenter des signes cliniques : perte de poids, douleur en particulier abdominale, diarrhée, déficit de toilettage (yeux collés, poil hérissé), une déshydratation, des dépilations, des déficits moteurs). Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat.
Devenir
Après la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont l’efficacité seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (toxicité et efficacité cellulaire) afin d’éviter l’administration des composés présentant un mauvais index thérapeutique. Afin d’étudier les mécanismes de réaction immunitaires induite par la greffe allogénique, il existe des systèmes de co culture permettant d’évaluer une réponse immunitaire (production d’interleukine par exemple). Cependant, ces expériences ne permettent pas de modéliser la maladie du greffon contre l’hôte dont les caractéristiques sont multiples et dont l’expression varient dans les différents organes. C’est pour cette raison que l’utilisation de ce modèle murin est requis afin de développer et d’évaluer des nouvelles molécules ou stratégies thérapeutiques pour le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte chez l’homme. Ces données sont insuffisantes pour prédire les effets in vivo des molécules. L’efficacité réelle devra donc être vérifiée chez le rongeur.
Réduction
Sur la base des expériences passées dans notre centre, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure a été déterminé : 10 animaux par groupe de receveur seront utilisés. Ce nombre pourra augmenter jusqu’à 15 si nécessaire pour obtenir une puissance statistique différente, compte tenu des analyses ex-vivo prévues et de leur variabilité. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux par groupe. Concernant les souris donneuses le cas échéant, il est nécessaire d’inclure entre 1 donneuse pour 2 receveuses et 1 donneuse pour 20 receveuses selon les souches de souris concernées. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps.
Raffinement
Les animaux seront pesés tous les jours et un scoring clinique sera effectué pour évaluer la perte de poids, les signes de douleur, les signes digestifs, les signes cutanés, la déshydratation et le comportement des animaux. La grille se scoring sera raffinée suite aux premières études. Dès l’apparition de pertes de poids sur certains animaux, de la nourriture sera placée au fond de toutes les cages ainsi que de la nourriture gélifiée. En cas de déshydratation constatée sur certains animaux, de l’eau gélifiée sera placée au fond de toutes les cages et les animaux concernés seront réhydratés une (déshydratation légère) ou deux fois (déshydratation modérée ou sévère) par jour par voie sous cutanée. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Un score de 3 dans une catégorie constituera un point limite. Un score total égal à 13 ou supérieur sera un point limite. Les autres points limites concernant l’état général de l’animal sont listés en détail dans la procédure. Dans le cas où l’administration de composé nécessite une chirurgie (implants), une analgésie, un suivi adapté et des mesures post-chirurgicales sont mises en place pour prévenir la souffrance des animaux. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait d’implant maximum par animal.
Choix des espèces
De nombreuses études ont utilisé et démontré la modélisation de la maladie du greffon contre l’hôte sur les souris Tout comme pour l’espèce humaine, l’irradiation suivi d’une greffe de cellules donneuses induit une réaction immunologique chez la souris receveuse. Les manifestations de la maladie du greffon contre l’hôte sont proches de celles observés chez l’homme : altération du tractus intestinal, lésions cutanées, perte de poids, état général altéré. En raison de la similarité des symptômes présent tant chez l’homme que la souris, les futures études seront entreprises chez la souris. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature. Des animaux mâles et femelles seront utilisés selon le produit à évaluer. Dans la plupart des cas, lorsque le sexe de l’animal n’a pas d’influence, ce seront des femelles qui seront utilisés car elles sont moins bagarreuses. Lorsque des volumes plus importants de sang à prélever seront requis et pour limiter le nombre d’animaux à utiliser, les males pourront être priorisés du fait de leur poids plus important à âge égal.
Etude de l’effet curatif et préventif de souches de bactéries probiotiques sur la régulation du métabolisme des glucides et des lipides chez la souris prédiabétique.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par une alimentation grasse et sucrée, elles sont gavées chaque jour pendant cinq semaines, puis soumises à des tests de tolérance au glucose et aux lipides avec incision de la queue, pour comparer des bactéries probiotiques. Le porteur mentionne comme effets un gonflement de l'œsophage, une prostration possible et une infection au point d'incision, les souris étant anesthésiées puis mises à mort pour prélever leurs organes. Il justifie l'usage de la souris par l'impossibilité éthique de prélever ces organes chez l'humain.
Objectifs
Le diabète de type 2 est une maladie reconnue comme une priorité urgente et un enjeu majeur de santé publique. La mortalité et la morbidité associées à cette maladie entraînent des coûts exorbitants de santé dans le monde. A ce jour, malgré un arsenal thérapeutique important, le traitement est loin d'être optimal. Il apparaît urgent d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour optimiser le traitement des patients. Une nouvelle voie s’est ouverte depuis que des études ont montré que l’un des effets bénéfiques d’un médicament anti-diabétique très largement prescrit résulte de sa capacité à modifier les populations de bactéries présentes dans l’intestin. Actuellement, des souches de bactéries probiotiques sont développées pour améliorer l’état du métabolisme des patients diabétiques de type 2. Les probiotiques sont définis comme des microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en quantité suffisante, confèrent un bienfait pour la santé de l’hôte. Récemment, dans modèle de souris, une nouvelle souche de bactérie probiotique ciblant le diabète de type 2 a été identifiée. Ce projet vise à identifier le mécanisme d’action de cette nouvelle souche en la comparant avec des bactéries probiotiques déjà connues et qui ont des effets bénéfiques sur le diabète.
Bénéfices attendus
A court teme, ce projet permettra de comparer les effets d’une nouvelle bactérie probiotique avec des bactéries probiotiques déjà connues sur le métabolisme du glucose et des lipides afin identifier son mécanisme d’action. A plus long terme, les résultats de ce projet ouvriront la possibilité de valider l’effet anti-diabétique de la nouvelle bactérie vivante ou de préférence de la bactérie sous une forme inactivée pasteurisée (risque sanitaire réduit) chez des personnes diabétiques au cours d’un essai clinique. Ainsi, ce projet doit permettre de développer un nouveau traitement pour les patients avec un diabète de type 2, ce qui est particulièrement précieux face à des traitements médicaux existants qui ne sont pas optimaux.
Procédures
Toutes les souris éveillées seront gavées pendant 5 semaines (tous les jours, une fois par jour, 15 secondes au maximum par souris). A l’issue des 3 premières semaines de traitement à l’âge de 13 semaines, toutes les souris éveillées seront soumises à un test sanguin permettant de mesurer l’effet du traitement sur la capacité de leur organisme à utiliser le glucose injecté dans la cavité abdominale (une fois, 15 secondes). L’évolution du taux de sucre dans le sang après l’injection du glucose sera mesuré 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère inscision à la queue de l’animal (une seule incision, 5 secondes par prélèvement). A l’âge de 14 semaines, toutes les souris éveillées seront soumises à un test de charge en lipides donnés par gavage pour tester leur capacité à absorber les lipides (une fois, 15 seconde). L’évolution des taux de lipides dans le sang sera suivie 4 fois par un prélèvement d’une goutte de sang à la queue des souris (5 secondes par prélèvement). A l’âge de 15 semaines, toutes les souris seront anesthésiées par injection (une fois 15 secondes) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).
Impact sur les animaux
On pourrait observer après gavage du sang sur la canule, un gonflement de l’œsophage et/ou une prostration de la souris. Dans les jours qui suivent l’incision superficielle de la veine de la queue (une seule fois par test), une infection au point d’incision peut être observé. Il est important de noter qu’au cours des protocoles similaires précédemment réalisés, aucun comportement anormal qui dénote une souffrance ou une anxiété particulière chez les animaux n’a été observé.
Devenir
A l’issue du protocole, à l’âge de 15 semaines, tous les animaux seront anesthésiés avant une dernière prise de sang, puis les souris seront rapidement mises à mort pour récupérer les organes nécessaires aux analyses biologiques pour permettre l’identification du mécanisme d’action de la bactérie probiotique.
Remplacement
Comme l’effet attendu d’un anti-diabétique se fait par des modifications physiologiques coordonnées entre plusieurs organes (foie, intestin et tissus adipeux, entre autres) et qu’il n’est pas possible éthiquement de réaliser ces prélèvements dans chacun de ces organes chez l’Homme, ils seront réalisés chez la souris, un animal qui fonctionne physiologiquement de manière similaire à l’Homme pour les paramètres physiologiques analysés.
Réduction
Le nombre de 16 animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance statistique et par l’expérience acquise dans des protocoles précédemment réalisés. Avec cet effectif de 16 souris par groupe, les données recueillies pourront être comparées entre le groupe contrôle et les groupes traîtés à l’aide de tests statistiques ce qui permetta de répondre aux questions initialement posées. Plusieurs bactéries seront testées en parallèle afin de ne consituter qu’une seule fois les groupes contrôles et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les souris seront surveillées tous les jours avec une attention particulière en période de gavâge pour vérifier l’apparition de troubles du comportement ou de stress. Il est important de noter qu’au cours des protocoles similaires précédemment réalisés, aucun comportement anormal qui dénote une souffrance ou une anxiété particulière chez les animaux n’a été observé. De plus, la personne qui va manipuler les souris lors du gavage est très expérimentée (si possible toujours la même), et réalisera un geste rapide et précis pour limiter la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Au sein de la communauté scientifique, les travaux effectués dans le domaine des bactéries probiotiques sont majoritairement réalisés chez la souris ce qui permet la comparaison des résultats obtenus par les différentes équipes. Comme la physiologie du métabolisme des sucres et des lipides chez la souris est proche de celle de l’Homme, les expériences seront réalisées chez cette espèce animale. La souris C57BL/6J est reconnue comme une souche de référence pour les études du métabolisme et tolère très bien la nourriture riche en gras et en sucres. De plus, les altérations du métabolisme glucidique et lipidique induites chez les souris par une nourriture riche en gras et en sucres sont très bien décrites et maîtrisées. L’intervention nutritionnelle débutera chez les souris âgées de 10 semaines car à cet âge, les souris sont adultes et présentent un microbiote intestinal mature. De plus, à l’âge de 10 semaines de vie, les souris sont métaboliquement prêtes à consommer une nourriture riche en gras et en sucres et à développer les altérations métaboliques voulues.
Effets de la température sur la physiologie et l’écologie du médaka.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
80 médakas vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les poissons sont manipulés, photographiés et pesés, puis soumis par couple à une montée rapide de température jusqu'à la perte d'équilibre, pour mesurer leur tolérance thermique dans un contexte de changement climatique. Le porteur reconnaît un stress lié aux manipulations et au stress thermique, les poissons étant mis à mort après deux semaines pour prélever leurs muscles et alimenter une banque de tissus. Il affirme que l'étude de l'écologie ne peut se faire ni sur cellules ni sur tissus isolés.
Objectifs
Les effets du changement climatique sur la faune et la flore sont déjà bien visibles. Un des grands défis en écologie est donc d’identifier les effets de ce changement sur la survie des espèces et la biodiversité. L'objectif de ce projet est d’examiner comment la température influence les réponses physiologiques du poisson médaka Oryzias latipes. Nous voulons utiliser des poissons élevés à deux températures afin de réaliser des mesures de tolérance thermique (résistance à des températures chaudes) pour déterminer si les poissons peuvent s’adapter à des températures plus élevées. Nous nous attendons à ce que les poissons élevés à des températures chaudes puissent tolérer des températures plus élevées que ceux élevés à des températures froides. L’objectif de ce projet est donc de tester cette hypothèse.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances essentielles à propos de l’adaptation des poissons à des températures plus chaudes.
Procédures
Les poissons seront soumis à des manipulations en laboratoire (transfert entre aquariums, mesures morphométriques et pesées). Les transferts durent environ 10 secondes et le poisson est immergé dans un bac de 2L. Pour les mesures morphométriques, nous prenons des photographies des poissons dans une boite de pétri avec un fond d’eau afin que les poissons restent immergés mais sans possibilité de nager. La prise de photo prend 30 secondes. Pour peser les poissons, chaque poisson est transféré individuellement dans un bac de 2L noir opaque. Le contenant et son contenu sont ensuite pesés à l'aide d'une balance de précision. Le poisson est ensuite retourné à l'élevage. Cette manipulation est rapide (1 minute par poisson) et le poisson reste immergé. Pendant l’expérience de tolérance thermique, les poissons subiront une augmentation rapide de la température et serons sortis du groupe pour être placés en couple. L’expérience durera 4h au maximum pendant lesquelles les poissons seront exposés (par couple) à une montée rapide de la température jusqu’à la perte de l’équilibre du poisson qui est utilisée comme indicateur du CTmax. Les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois.
Impact sur les animaux
Tout d’abord, les poissons subiront un léger stress lors des manipulations en laboratoire (transfert entre aquariums, photographie et pesées). Les poissons subiront un stress plus important lors des expériences de tolérance thermique en raison du stress thermique et de la sortie du groupe (isolement en couple). Néanmoins, ce type d’expérience est pratiqué sur les poissons depuis des décennies et n’entraîne pas de mortalité. Dans notre cas, l’expérience sera de courte durée (4 heures maximum) et les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois.
Devenir
Pour cette expérience, n=80 (40 mâles, 40 femelles) individus seront utilisés au total pour la mesure de tolérance thermique. Après deux semaines de récupération, ils seront ensuite mis à mort. Leurs muscles seront ensuite utilisés pour effectuer des mesures de respiration tissulaire. De plus, tous les individus seront stockés dans une banque de tissus pour des analyses ultérieures.
Remplacement
L'écologie a pour objet l'étude des populations et des écosystèmes. Il n'est donc pas possible de substituer des cellules ou des tissus à des individus pour de telles recherches. Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné qu’il s’agit d’étudier les réponses comportementales et physiologiques des poissons.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser un total de 80 poissons. Puisque les mâles et les femelles ont des physiologies différentes, il est nécessaire de tester les deux sexes (mâles et femelles). Notre choix pour ce nombre de poisson est justifié par des tests statistiques qui indiquent que l’on doit tester 80 poissons pour pouvoir détecter une différence entre les poissons élevés à des températures chaudes et ceux élevés à des températures froides et pour détecter d’éventuelles différences entre les lignées.
Raffinement
Pour les transferts entre aquarium, nous utilisons un bac de 2L avec un fond noir pour ne pas stresser les poissons. Les transferts sont rapides (10 secondes). Pour les photographies, nous prenons des photographies des poissons dans une boite avec un fond d’eau afin que les poissons restent immergés. La prise de photo prend 30 secondes et la lumière est tamisée pour réduire le stress au maximum. Pour peser les poissons, chaque poisson est transféré individuellement dans un bac de 2L noir opaque, contenant de l’eau de l’élevage (cette eau est changée à chaque poisson pour limiter le stress lié à la production d’hormones). Le poisson est ensuite transféré dans un petit contenant noir opaque contenant 100mL d’eau. Le contenant et son contenu sont ensuite pesés à l'aide d'une balance de précision. Le poisson est ensuite retourné à l'élevage. Cette manipulation est rapide (1 minute par poisson) et est effectuée sous lumière tamisée. Les mesures de tolérance thermique seront les plus courtes possible (4 heures maximum) et les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois. Les poissons pourront observer leurs congénères dans les aquariums voisins ce qui permettra de diminuer leur niveau de stress. Aucun personnel ne sera présent dans la pièce pendant les mesures (surveillance par caméra). Nous contrôlerons la température et l’oxygène pendant l’expérience et nous stopperons l’expérience si la montée en température n’est pas conforme au protocole (1°C par 10 minutes) ou si la concentration en oxygène est trop faible. Le lendemain de l’expérience de tolérance, les poissons sont transférés dans des aquariums à leur température d’élevage (bacs d’eau fraîche et oxygénée). Les poissons seront mis par couple mâle/femelle avec 6 couples par aquarium afin de limiter le stress lié à l’isolement. Si nous constatons que l’hébergement par couple pose un problème (ex : male agressif envers la femelle), nous ajouterons des poissons de l’élevage de taille plus petites ce qui nous permettra d’identifier nos poissons « tests » sans utiliser de marquage. Les poissons seront ainsi maintenus et nourris dans ces aquariums pendant deux semaines afin de s’assurer de leur bonne récupération. Nous évaluerons l’état sanitaire des poissons 30 minutes et 1 heure après la perte d‘équilibre, ainsi que le lendemain de l’expérience et ensuite après 3, 7, 10 et 14 jours.
Choix des espèces
Nous avons choisi le médaka car il vit naturellement dans les milieux peu profond et riches en nutriments, typiquement les rizières (d'où le nom du genre, Oryzias). Ces milieux sont très chauds en été et très froids en hiver. Ils sont donc naturellement très rustiques. Nous utiliserons des poissons adultes à l’optimum physiologique (âgés de 200 jours) correspondant à un standard concernant les mesures physiologiques puisque ces dernières peuvent différer selon l’âge des poissons.
Rôle des macrophages résidant dans l’altération de la réparation des organes après une septicémie
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ligature-ponction du caecum pour déclencher une septicémie, puis la pose d'une pompe osmotique et des échocardiographies sous anesthésie, pour étudier le rôle des cellules immunitaires dans la réparation du cœur et des reins. Le porteur indique une douleur postopératoire, une perte de poids de 10 à 15 % et une baisse d'activité, tous les animaux étant euthanasiés pour prélever les organes. Il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire", les modèles in vitro ne reproduisant pas l'interaction entre organes, et n'utilise que des mâles.
Objectifs
Le sepsis est défini comme une infection grave caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Touchant près de 50 millions de personnes chaque année dans le monde, le sepsis est un problème majeur de santé publique. Lors d’un sepsis, le système immunitaire est complètement déréglé, et conduit les patients à un état d’immunodépression, c’est-à-dire à une incapacité du corps à combattre une infection. Cet état d’immunodépression induit à long terme à de graves dysfonctions d’organes telles qu'une insuffisance cardiaque ou une insuffisance rénale. Notre projet a pour but d’évaluer le rôle des cellules immunitaires dans la réparation rénale et cardiaque après un sepsis. Notre hypothèse est qu’après un sepsis, les cellules immunitaires dans les organes tels que le cœur et les reins, se réorganisent dans le temps et l’espace contribuant à l’installation d'une insuffisance cardiaque et rénale. Moduler l’organisation de ces cellules dans les tissus pourrait alors permettre d’améliorer les défaillances cardiaques et rénales induites par un sepsis.
Bénéfices attendus
La plupart des avancées récentes dans le traitement des infections graves se sont focalisées sur le traitement de la source infectieuse plus que le contrôle de la réponse immunitaire. A l'heure actuelle, on observe un surrisque de maladies cardiovasculaires, d'insuffisance rénale et de cancer chez les patients qui survivent à une infection grave (pneumonie, infection urinaire, infection abdominale). Mieux comprendre le role du systeme immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'infection pourrait permettre de dégager de nouvelles thérapeutiques et un meilleur suivi de ces patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de ligature ponction caecale sous anesthésie (durée 10 minutes) suivit 14 jours après d'une deuxième chirurgie pour la pose d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée 5 minutes). Ceci est combiné à une échocardiographie sous anesthésie avant les chirurgies et au moment de l’euthanasie de l’animal (3 fois 10 min) ainsi qu'à une mesure de la pression artérielle sur animal vigile chaque jour pendant 5 jours avant la première chirurgie pour habituer l’animal, puis au moment de la deuxième chirurgie et 7 jours, 14 jours et 28 jours après la deuxième chirurgie (9 fois 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales s'accompagnent de douleurs au niveau du site opératoire, un traitement antalgique sera administré durant les 24 premières heures à tous les spécimens, possiblement réitéré à plusieurs reprises en cas de persistance de signes d'inconfort. La perte de poids est une complication attendue suite à la chirurgie, celle-ci n'excède pas 10-15% du poids corporel, et régresse en quelques jours. La diminution de l'activité est également attendue et habituelle (composante du comportement maladie) et n'excède pas 5 à 7 jours. Ces affirmations font suite à une étude antérieure réalisée dans notre laboratoire montrant un retour au poids avant chirurgie et un activité normale des animaux entre 5 et 7 jours après ligature et ponction ceacale. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie et n’induit pas de nuisance spécifique. La mesure de la pression artérielle peut induire un stress à l’animal du fait de la contention, ce stress sera atténué par une habituation des animaux à ce type de procédure préalablement à la chirurgie.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés afin de prelever les différents organes à analyser (rate, rein, coeur, moelle osseuse, sang).
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n’existe pour l’heure aucune autre technique que l’expérimentation in vivo pour réaliser les procédures expérimentales prévues dans ce projet. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permetent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction et leur effet sur le corps entier. Le modèle murin a été retenu pour sa proximité avec les situations cliniques humaines, il est régulièrement cité en référence dans les publications relatives à l’insuffisance rénale aigüe et maitrisé par les équipes scientifiques du laboratoire.
Réduction
Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal.
Raffinement
Les gestes chirurgicaux sont maîtrisés par le personnel de l’étude permettant ainsi une manipulation plus aisée conduisant à un réveil et à une récupération plus rapide en post-opératoire. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux lors des procédures expérimentales, les mesures suivantes seront prises : Injection intrapéritonéale d'anesthésiques; administration systématique d'antalgique par voie intra péritonéale à h6 post-chirurgie pour tous les animaux; surveillance 2 fois/jour pendant les 3 premiers jours après chirurgie et administration à h24, h36, h48 chez les animaux montrant des signes de mal-être voire euthanasiés si le traitement est sans effet au-delà puis surveillances chaque jour par le personnel de l'animalerie pendant toute la durée du protocole.
Choix des espèces
Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de sepsis comporte de nombreuses similitudes par rapport à un sepsis polymicrobien abdominal chez l’Homme. L'utilisation du modèle murin pour l'étude de la réponse immunologique au sepsis est le modèle le plus couramment utilisé. Par ailleurs, les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront le fonds génétique le plus utilisé pour les modèles transgéniques. Nous utiliserons des souris mâles jeunes adultes de 4 à 8 semaines environ afin de permettre une récupération optimale. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme. Seuls des mâles seront utilisés dans ce protocole car les femelles présentent une protection relative au sepsis liée aux oestrogènes.
Étude des réseaux neuronaux du cerveau activés par la stimulation de la transmission dopaminergique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène et de médicaments psychiatriques, puis passent jusqu'à trois tests comportementaux dont des mesures d'impulsivité et de locomotion, pour étudier l'action de deux composés sur les réseaux neuronaux de la dopamine. Le porteur classe la procédure en modérée en raison des injections et des tests et prévoit une grille de score, tous les animaux étant tués pour prélèvement de tissus. Il affirme que la souris est le "seul organisme modèle" permettant ce type d'étude grâce aux lignées transgéniques.
Objectifs
Les neurones du cerveau communiquent entre eux à l’aide de substances appelées neurotransmetteurs, dont la dopamine. De nombreuses maladies psychiatriques telles que la schizophrénie, les troubles attentionnels et la dépression sont associées à un déséquilibre important des quantités de dopamine libérées dans le cerveau. Les neurones se retrouvent alors suractivés et le comportement est modifié de façon pathologique. Des composés utilisés en clinique, tels que le pramipexole et l'aripiprazole, vont réguler la suractivation des neurones et ainsi neutraliser certains des symptômes. Cependant leur utilisation s’accompagne, à plus ou moins long terme, de complications dont des troubles de l’impulsivité motrice et cognitive qui se manifestent sous forme d'agressivité, impatience, recherche de sensations fortes. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes d'action de ces deux médicaments sur les différents types de neurones du cerveau. Ceci constitue un aspect important pour développer des approches thérapeutiques efficaces pour traiter les troubles de l’impulsivités induites par ces deux médicaments. La réalisation de ce projet nécessite l'utilisation de souris non génétiquement modifiées ainsi que de différentes lignées de souris transgéniques permettant 1) l'identification cellulaire et moléculaire des populations neuronales activées dans le cerveau en réponse à la dopamine et de 2) déterminer le rôle fonctionnel de ces réseaux dans le contrôle des fonctions motrices, cognitives et des émotions.
Bénéfices attendus
Cette étude s'inscrit dans le cadre d'une meilleure compréhension de l'action dans le cerveau du pramipexole et de l'aripiprazole, deux composés prescrits dans de nombreuses maladies psychiatriques. Les résultats obtenus lors de la réalisation de ce projet permettront également de préciser certains des mécanismes neuronaux et moléculaires sous-tendant l'apparition d'effets secondaires indésirables tels que des troubles anxieux ou de l'impulsivité associés à ces traitements, et à terme de proposer des approches thérapeutiques innovantes.
Procédures
Les animaux recevront différents types d'injections par voie intra péritonéale : de tamoxifène, de composé pharmacologique (pramipexole ou aripiprazole) ou de solution saline (Nacl 0.9%). La durée de ces injections ne dépassant pas 1 minute par animal. Des tests comportementaux sont prévus dans la procédure. Les animaux ne seront jamais soumis à plus de 3 tests (2 tests uniques toujours suivi d’un nécessitant un conditionnement). Ces tests ont une durée comprise entre 10 et 30 min dans la majorité des cas, 45 min à 1h pour certains (impulsivité, locomotion). Chaque test sera répété qu'une fois, à l'exception du protocole d'impulsivité qui, incluant des phases d'habituation et d'apprentissage, prévoit des séances étalées sur plusieurs jours (maximum 3 semaines). Le cumul de ces tests ne dépassera pas les 4 semaines.
Impact sur les animaux
La procédure prévoit des injections intrapéritonéales ainsi que des tests comportementaux. Ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, dégradation de l'apparence physique). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de ces signes cliniques (voir annexe). D'autre part, selon notre expérience le protocole prévu est très bien supporté par les animaux.
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
La réalisation de notre projet repose sur l'utilisation de nombreuses lignées transgéniques nous permettant de travailler sur différentes populations de neurones. La souris est le seul organisme modèle permettant ce genre d'étude. L'utilisation d'animaux demeure donc la seule option à ce jour pour évaluer avec précision et pertinence certains des mécanismes neuronaux et moléculaires sous-tendant l'apparition d'effets secondaires indésirables tels que des troubles anxieux ou de l'impulsivité associés à la prise de pramipexole et d’aripiprazole.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé grâce à l'utilisation d'un logiciel statistique sur la base de publications précédentes et de l’expérience acquise au laboratoire depuis plus d’une vingtaine d’année, de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences. Dans le but d'une exploitation maximale des données obtenues, plusieurs régions cérébrales seront systématiquement analysées sur le même animal.
Raffinement
Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages: sciure, pellets de coton. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Une grille de score avec des points limites sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.
Choix des espèces
Les souris fournissent des excellents modèles pour l'étude des réseaux neuronaux, au cœur de notre projet. En effet, nous disposons aujourd'hui de nombreux modèles murins transgéniques qui nous permettront d'atteindre les objectifs de notre étude, à savoir l’étude détaillée des réseaux neuronaux. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes d’un point de vue médical. Les animaux seront utilisés entre 3 et 8 mois ce qui permettra de travailler sur une système cérébral stable, mature, qui n'évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs semaines.
Etude de l’effet de différentes voies de signalisation sur le muscle en régénération chez la souris C57BL/6 saine
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une lésion musculaire par injection de cardiotoxine puis des injections intramusculaires sous anesthésie, avant d'être mises à mort pour prélever leurs muscles, afin d'étudier le rôle d'une protéine dans la régénération. Le porteur affirme que les injections ne provoquent pas d'effets indésirables aux doses utilisées et que les souris reprennent leur activité dès le réveil. Il conclut qu'"aucune autre méthode alternative" ne peut se substituer à l'animal pour ce processus.
Objectifs
Les muscles squelettiques composent la moitié de la masse totale d'un individu et permettent la motricité du corps. Ils sont principalement composés de fibres musculaires mais également de vaisseaux sanguins, de nerfs et d'un tissu de soutien. Suite à une blessure, les différents types cellulaires qui composent le tissu coopèrent et interagissent pour reconstruire le muscle blessé. Parmi elles, les cellules souches musculaires s'activent et fusionnent ensemble pour former de nouvelles fibres musculaires. Le projet de recherche porte sur l'étude du rôle d'une protéine impliquée dans la fusion de ces cellules souches. Cette protéine est connue pour bloquer la fusion et donc la bonne réparation des muscles blessés. Le projet consiste à étudier par quels mécanismes elle agit sur la régénération. L’hypothèse est que plusieurs types cellulaires participent à ce processus en réponse à la protéine d'intérêt. L’approche qui sera développée consiste à isoler et étudier les cellules issues d'animaux modèles traités avec la protéine lors de la régénération musculaire. Cela permettra d'évaluer quelles sont les cellules répondeuses à cette protéine et comment ces cellules réagissent au traitement par cette protéine. A terme, ce projet de recherche permettra de comprendre les mécanismes par lesquels la protéine contrôle la réparation du muscle blessé.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats du projet permettront de comprendre précisément comment la protéine d'intérêt contrôle les différents types cellulaires lors de la réparation d'un muscle squelettique blessé. En plus d'augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction de ces cellules lors de la régénération, les résultats de cette étude pourraient permettre la conception de nouvelles stratégies de médecine régénérative.
Procédures
Deux injections intramusculaires dans le muscle releveur de la patte seront réalisées. Elles durent moins de 5 secondes et seront faites sur animaux anesthésiés. Une injection d’analgésique (anti-douleur) sera également réalisée.
Impact sur les animaux
Les injections de la protéine d'intérêt n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal aux doses utilisées. L'utilisation d'anesthésiques au cours des procédures de lésion musculaire et d'injection de la protéine garantit l'absence de douleur chez l'animal. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu'elles ne montrent pas de signes de douleurs pendant les jours suivants.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et les muscles seront prélevés.
Remplacement
Aucune autre méthode alternative actuelle ne peut se substituer à l'utilisation d'animaux pour l'étude de la régénération du muscle via l'activation des cellules souches musculaires. Ce processus repose sur des interactions complexes entre les tissus blessés et sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Ces résultats ne peuvent pas être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ce qui justifie la poursuite de notre projet utilisant des modèles murins.
Réduction
L'utilisation des animaux sera réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales et contrôlée à l'aide d'analyses statistiques adaptées. Nous avons optimisé notre expérience afin d’utiliser un nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiques fiables, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisé. La méthode de lésion musculaire utilisée est déjà très décrite au sein de la littérature et provoque peu de douleur chez l’animal.
Raffinement
Avant le début de la procédure, les animaux suivront une période d'acclimatation d'au moins une semaine. Les animaux seront également pesés 4 jours avant l’injection de cardiotoxine puis 4 jours après afin de vérifier qu'il n'y a pas de perte de poids anormale. Des anesthésiques et des médicaments anti- douleur seront utilisés afin de prévenir au maximum le stress et la souffrance des animaux. En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés avant et après la manipulation. Si des changements sont relevés pendant plus de 24h, des mesures adéquates seront prises en accord avec le personnel animalier afin d'améliorer les conditions de vie de l'animal et d'éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l'humain, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l'analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. Les expériences seront principalement réalisées sur des souris âgées de 8 à 12 semaines. L'âge choisi est le plus adapté à l'étude de la régénération du muscle squelettique. Plus jeune, le tissu est encore en croissance. Plus âgé, une fibrose peut se développer et perturber le processus de régénération.
Rôle du peptide Aeta dans le comportement social et anxieux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
396 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 264 étant tuées pour analyses histologiques et 132 souris dites "visiteurs" gardées vivantes pour d'autres projets. Elles subissent une chirurgie, un isolement social pouvant durer jusqu'à douze semaines et une série de tests comportementaux dont le RNT donne le nombre sans les nommer précisément, pour étudier le rôle d'un peptide dans le comportement social et anxieux. Le porteur cite l'isolement comme la nuisance principale et l'implantation de minipompes ou de ciment dentaire comme gênes possibles. Il affirme que le comportement social ne peut être reproduit ni par ordinateur ni par cultures de neurones.
Objectifs
Ce projet de recherche porte sur le rôle physiologique du peptide Aeta et son impact sur la fonction cérébrale et le comportement social et anxieux chez la souris. Ce peptide est fortement impliqué dans la modulation d'un récepteur au glutamate impliqué dans la plasticité cérébrale mais également dans le comportement social. Grâce à des animaux transgéniques sur-exprimant ou sous-exprimant ce peptide, nous réaliserons une caractérisation de son rôle dans le comportement social, anxieux et d'anhédonie (manque de plaisir). En fonction des déficits observés chez les animaux sous exprimant, ou surexprimant le peptide, des stratégies de sauvetage , permettront de confirmer son rôle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre l'impact de la modulation de ce peptide sur les comportements sociaux et anxieux. En effet, ce peptide modulant un récepteur qui est très impliqué dans les comportements sociaux, il est très interessant de voir les effets de sa modulation. De plus, nous saurons également si le rôle de ce peptide et plus important lors du developpement ou lors de l'âge adulte. ce projet nous donnera donc potentiellement un nouveau peptide naturel qui pourrait être utilisé comme un nouveau modulateur de ces récepteurs dans certaines pathologies comme la Schizophrénie par exemple mais également dans des troubles sociaux.
Procédures
Les animaux expérimentaux (264) seront soumis à une procédure chirurgicale de 5 minutes. Parmi eux, 72 animaux expérimentaux subirons une procédure chirurgicale de 1h. Des tests comportementaux sont réalisés à l’adolescence et l’âge adulte grâce à 7 ou 9 tâches ( 4 tâches durant 30 min, trois tâches durant 10min environs et une tâche de 3 jours et une de 7 jours). Uniquement à l'âge adulte, un isolement de 12 semaines maximum sera réalisé. Les animaux visiteurs, qui sont un renforcement social dans nos comportements, seront soumis à trois tâches de 10 min avec au maximum deux restriction dans une zone de 20 x 10 cm.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet la majeure nuisance sera un isolement à l'âge adulte .L'anesthésie est également une nuisance , ainsi que la présence de chapeau en ciment dentaire ou l'implantation de minipompes qui pourrait gêner certain animaux par rapport à des éléments dans la cage de vie (Tube ou maison trop étroite).
Devenir
Dans les trois procédures, les animaux expérimentaux seront euthanasiés pour nous permettre de réaliser des analyses histologiques. Toutes les souris visiteurs mâles et femelles seront gardées en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets.
Remplacement
Ce projet de recherche porte sur le rôle physiologique du peptide Aeta et l'impact sur le comportement social et anxieux chez la souris qui à l'interêt d'être un mammifère social. Ce peptide est fortement impliqué dans la modulation d'un récepteur au glutamate impliqué dans la plasticité cérébrale ainsi que dans le comportement social. le comportement social ne peut pas encore être remplacé par des modélisations informatiques, ni par des études de neurones en culture. Ce projet ne peux pas non plus être conduit chez des espèces autres que les mammifères.
Réduction
La réduction des animaux est faite par le suivit des mêmes animaux de l'adolescence à l'âge adulte pour eviter d'avoir trop d'animaux. Nous passons également deux fois les animaux "visiteurs" en tests sociaux pour éviter d'avoir le double d'animaux. le nombre d'animaux est choisi en lien avec nos expérimentations précédente et le fait que les comportements sociaux sont très variables. Les tests statistiques spécifiques seront utilisés en fonction de la normalité ou non des distributions.
Raffinement
Pour les chirurgies d’implantation de puces RFID (en anglais Radio Frequency Identification, c'est à dire identification par radiofréquence), ou les mini-pompes, ou les canules intracérébrales, les animaux recoivent l'anesthésie et l'analgésie adéquate. Lors du suivi post opératoire, une grille de score, avec des points limites adaptés et précoce, est utilisé pour réduire la souffrance et réaliser des traitements de la douleur si nécessaire. Si le chapeau en ciment dentaire, ou les minipompes sont une gène par rapport a ce qui est dans la cage, nous adapterons l'enrichissement pour éviter que les animaux se frottent contre un tube trop étroit ou une maison trop petite. Afin de réduire les effets anxiogènes de l'isolement social, des objets permettant de faire un nid, ainsi qu'une cachette (maison ou tube) seront disposés dans les cages de vie. A l’âge adulte, Après ces deux tâches qui nécessitent une mise temporaire en cage individuelle à l’âge adulte, les souris sont replacées en cages collectives pour les manipulations suivantes. Nous avons déjà réalisé ces regroupements qui se passent généralement sans problème. Les animaux seront évalués dans les 3 premiers jours après le regroupement grâce à la grille de score comprenant des points limites.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que ces animaux ont des capacités sociales adaptées aux questions posées dans le projet. Notre projet consistant à étudier le comportement des animaux à différents stades de développement, nous utiliserons donc les animaux à l’adolescence (entre 30 et 60 jours) puis à l’âge adulte (à partir de 70 jours).