Recherche fondamentale

120 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation sous la peau d'un biomatériau osseux, avant d'être tué pour l'analyse histologique des tissus. Le porteur indique que l'implantation peut provoquer une gêne ou une douleur légère et fixe un seuil d'euthanasie. Il décrit cette étape sur souris comme un préalable à des essais sur os de rat puis chez le "gros animal", et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier ensemble formation osseuse, vascularisation et innervation.

Objectifs

En raison des changements de mode de vie et du vieillissement des nations industrialisées, les lésions osseuses traumatiques et les fractures fragiles induites par l'ostéoporose représentent un énorme défi médical et socio-économique. Notre projet vise à créer une nouvelle approche de régénération osseuse, qui combine l'administration de gènes et l'impression 3D pour la création de matériaux personnalisés qui permettraient d'aboutir à une meilleure réparation osseuse par la stimulation conjointe de la réparation des nerfs, des vaisseaux et des os. Ici, il s’agit de réaliser une première évaluation de nos matériaux en les implantant sous la peau de souris, en préalable à des expérimentations sur site osseux chez le rat. Cette évaluation servira deux objectifs : d’une part, évaluer la biocompatibilité (réaction inflammatoire, réaction à corps étranger, …), et d’autre part évaluer la fonctionnalité (formation osseuse, vascularisation, innervation) des produits, pour définir la ou les formulations les plus appropriées pour l’application chez le rat en modèle de réparation osseuse.

Bénéfices attendus

Les résultats des expériences d’implantation de nos matériaux menées sur modèle souris sont un préalable à la poursuite des travaux sur site osseux chez le rat. De mauvais résultats obtenus avec ce biomatériau et/ou l'un des gènes administrés conduiront à l’abandon de l’élément mis en cause. En revanche, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager dans un premier temps les expérimentations en site osseux chez le rat, et dans un deuxième temps le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie d'implantation sous-cutanée (acte chirurgical unique d'une durée de 5 à 10 minutes)

Impact sur les animaux

L'implantation sous-cutanée peut entraîner une gêne voire une douleur légère. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie selon les standards européens. Au-delà d'un certain seuil, l’animal sera euthanasié sans attendre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de leur temps expérimental pour procéder à une analyse histologique des tissus de la région opérée.

Remplacement

L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau et pour évaluer le potentiel régénératif de celui-ci. Aucune méthode in vitro actuelle (ex. organoïdes, sphéroïdes,...) n'a démontré la capacité ou ne présente de validation scientifique permettant d'étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l'innervation induites par les biomatériaux tout en tenant compte de la complexité d'un être vivant (système immunitaire, flux sanguin...).

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré in vitro une absence de cytotoxicité, et une seule lignée de souris sera utilisée. Les échantillons explantés à l'issue des temps expérimentaux seront utilisés pour plusieurs types de marquages et détections. Deux implantations seront réalisées par souris, en tenant compte de la taille du matériau et de la taille des animaux. La possibilité d'implanter au moins deux matériaux par animal, de réaliser un suivi longitudinal, d'analyser plusieurs paramètres à partir des mêmes prélèvements sur animaux après euthanasie, permet de collecter un maximum d'informations sur les animaux utilisés.

Raffinement

L’opération est réalisée sous anesthésie générale. Afin de réduire la souffrance des animaux, des analgésiques sont utilisés lors de l’opération, puis de nouveau en cas de douleur après l’opération. En cas de lésion sérieuse ne pouvant être traitée par suture et/ou antiseptique, l’animal est euthanasié. La cage reçoit un surcroît d’enrichissements le jour de la chirurgie de manière à distraire l’animal de la gêne liée à la présence du matériau implanté, et ainsi limiter les risques d’arrachement de l’implant, de rupture des points de suture, et d’infection de la plaie.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris présentant une immuno-déficience marquée, adaptée à l'implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Les souris seront implantées à l'âge de 7 à 12 semaines. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´implantation sous-cutanée.

90 brebis vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis renvoyées en élevage. Chaque animal subit cinq anesthésies générales de 45 minutes en 48 heures, séquence répétée deux mois plus tard, avec des jeûnes de 29 puis 18 heures, pour suivre par IRM la rétention d'un gel contraceptif destiné aux femmes. Le porteur présente ce gel comme une "alternative révolutionnaire" affichant "100 % d'efficacité in vitro" et justifie la brebis par la proximité de son col utérin avec celui de la femme. Il affirme que le comportement du gel dans le tractus ne peut être appréhendé in vitro et nécessite une validation chez l'animal vivant.

Objectifs

La présente demande s’intègre dans un projet plus vaste visant à développer un gel contraceptif d’origine naturelle (non hormonal) à destination des femmes, comme alternative aux méthodes hormonales existantes. En effet, celles-ci provoquent des effets secondaires et/ou del'inconfort, tels que prise de poids, diminution de la libido, augmentation du risque de maladies cardiovasculaires et de dépression. Malheureusement, les contraceptifs non hormonaux existants sont souvent peu pratiques. Ce projet propose de développer in vitro, puis de tester in vivo chez la brebis, un gel à déposer au niveau du col de l’utérus, qui en interagissant avec le mucus, formerait un bouchon empéchant le passage des spermatozoïdes. L’objectif ici est de mieux comprendre le comportement du gel contraceptif une fois introduit dans le vagin de la brebis. En effet, le comportement du gel dans le tractus reproducteur de l’animal est étroitement lié à son efficacité. Cette expérimentation cherche à répondre à 2 questions : 1- quel est le temps de rétention du gel dans le tractus reproducteur, et en quelles quantités ? 2- quelle est la localisation exacte du gel au cours du temps ? En effet l’hypothèse est que plus le gel est proche du col de l’utérus (voire dans le col), plus il sera efficace. Pour ce faire, la technique d’IRM sera utilisée. En effet, cette méthode non invasive permet de suivre le même animal au cours du temps, et ainsi de réduire la variabilité individuelle. Elle permet aussi de quantifier le gel, et d’avoir accès à l’intégralité du tractus reproducteur de la brebis, avec des images de haute qualité. De plus, la morphologie du col de l’utérus de la brebis ne permet pas d’y insérer des outils d’imagerie tels qu’échographe, fibre optique. La seule contrainte de cette méthode est qu’elle nécessite d’anesthésier les brebis avant de les passer à l’IRM, ce qui implique plusieurs anesthésies dans une même journée si l’on souhaite suivre l’évolution dans le temps du comportement du gel dans le tractus. Le gel contraceptif est constitué du polymère et d'excipients différents. Il existe donc de nombreuses possibilités de formulations différentes. Il s'agit ici de tester des gels avec des propriétés physiques, mécaniques et adhésives variables, et d'identifier la ou les formulations les plus adaptées.

Bénéfices attendus

Le gel contraceptif développé dans ce projet est présenté comme une alternative révolutionnaire aux méthodes actuellement existantes : hormonales (avec tous les effets secondaires connus), non hormonales (qui présentent elles aussi des inconvénients), et les méthodes dites non-techniques (qui ont une efficacité relative). Ce gel est en effet très efficace (100% d’efficacité in vitro annoncée), sans hormones, peu invasif et très pratique d’utilisation. Il représente donc une solution de choix pour les millions de femmes qui ne peuvent et ne veulent pas utiliser d’hormones. La partie développée ici permettra de mieux comprendre la cinétique du gel une fois appliqué dans le tractus, et ainsi de renforcer son efficacité, ainsi que sa sécurité d’utilisation (s’assurer que le gel est bien résorbé ou rejeté au bout d’un certain temps).

Procédures

5 anesthésies générales (d'une durée de 45 minutes) en 2 semaines, dont 4 sur 48 heures, espacées d'au moins 3 heures. Ceci répété une fois, après 2 mois de repos. Deux périodes de mise à jeun de 29 et 18 heures respectivement, répétées à 2 mois d'intervalle.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront 5 anesthésies générales, entrecoupées de réveils, sur une période de 48 heures. Le temps de récupération peut être plus long au fur et à mesure de l’avancement de l’expérimentation. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse. Les animaux seront à jeun durant 29 heures pour la première journée de mesures. Du foin leur sera distribué le soir de cette première journée. Puis ils seront de nouveau à jeun pendant 18 heures la deuxième journée.

Devenir

Les animaux retournent à l'élevage à l'issu de l'expérimentation.

Remplacement

L’étude de l’efficacité d’un produit destiné à l’usage chez l’Homme doit d’abord se faire sur animaux, lorsque cela est éthiquement admissible. Dans notre cas, l’efficacité du gel testé a été évaluée in vitro. Elle doit maintenant être confirmée in vivo, avant de pouvoir démarrer une phase d’essai chez la femme. Chaque formulation à tester sera au préalable évaluée in vitro pour la rhéologie, puis ex vivo sur des tractus pour les caractéristiques d'adhésion, et pour finir in vivo en version colorée et visualisation à l'endoscope. La concentration optimale de l’agent de contraste sera déterminée in vitro en amont. Le comportement du gel dans le tractus reproducteur, en tenant compte du mouvement de l’animal, des contractions naturelles du tractus, ne peut être appréhendé in vitro, et nécessite une validation in vivo.vo.

Réduction

L’utilisation de l’imagerie de façon répétée permet de limiter la variabilité individuelle, et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Une étude effectuée en 2012 visant à suivre la rétention de crême vaginale dans la brebis par scintigraphie gamma et par IRM chez la femme, a montré qu’un effectif de 6 brebis ou femmes par groupe est suffisant pour mettre en évidence des différences. Les animaux seront leurs propres témoins et suivis durant 4 périodes successives. L’intensité du signal du produit de contraste inclus dans le gel contraceptif sera mesurée par IRM pour ces 4 répétitions par animal. Les données seront analysées par un test non paramétrique. Un logiciel spécialement dédié au calcul d’effectifs pour tests statistiques, en tablant sur une diminution de 25 % du signal entre les périodes d’analyse, un risque alpha de 0.05 et une puissance de 95 %, nous donne le nombre requis d’animaux de 5 par lot. Pour assurer la réussite de l’essai, nous avons choisi la valeur de 6 brebis par lot.

Raffinement

L’IRM est un outil de choix pour investiguer de façon précise et non invasive des questions au niveau de l’organe ou du tractus entier. D’autres techniques ne nécessitant pas d’endormir les animaux ont déjà été testées, tels qu’utilisation d’un gel coloré et observation à l’endoscope, marquage fluorescent du gel et visualisation par endomicroscopie. Cependant, elles ne permettent pas de quantifier précisément le gel, ni de visualiser l’intérieur du col de l’utérus, ou d’avoir une vue d’ensemble du tractus génital. Les animaux seront maintenus en groupe, manipulés dans le calme. La procédure sera réalisée par du personnel expérimenté, ayant une expertise de l'anesthésie chez des modèles ovins. Etant donné la succession des différentes anesthésies sur 48H, les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Pré-examen imagerie/Anesthésie: les animaux arriveront la veille, et seront mis à jeun 16h avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Induction par voie intraveineuse, puis maintien au masque avec inhalation d’un mélange gazeux d’oxygène et de produit anesthésiant pour obtenir une myorelaxation suffisante avant intubation orotrachéale. Postimagerie – Les animaux sont logés en cases collectives sur paille.

Choix des espèces

La brebis est un bon modèle pour notre étude. En effet, malgré que la morphologie du col de l'utérus de la brebis est plus complexe que celui de la femme, ces 2 espèces ont plusieurs points communs : ce sont toutes les deux des espèces à dépôt de semence au niveau du vagin, la sélection des spermatozoïdes se fait en grande partie par le mucus cervical, la longueur du vagin et le diamètre cervical sont proches. De plus, la brebis a déjà été utilisée à plusieurs reprises comme modèle pour tester des dispositifs contraceptifs; une équipe a montré en 2012 que des données récoltées chez la brebis sont comparables à celles obtenues chez la femme. La vache et la jument ne sont pas des modèles pertinents car ce sont des espèces à dépôt de semence intra-utérine pour les bovins, et les individus sont trop lourds et volumineux pour passer à l'IRM. Brebis adultes multipares pouvant être synchronisées.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras et sucré sur vingt-quatre semaines, elles subissent des tests de tolérance au glucose après jeûne, un test d'endurance sur tapis, des échographies sous anesthésie et l'introduction d'une sonde dans la carotide avant d'être tuées pour analyse des organes. Le porteur affirme que l'obésité et la dysfonction cardiaque n'entraînent pas de surmortalité sur la période. Il indique étudier le mécanisme d'action des gliflozines, un traitement déjà utilisé chez les patients, pour l'optimiser à terme.

Objectifs

Le diabète entraine très souvent des complications cardiaques avec notamment l’apparition d’un mauvais fonctionnement du cœur, appelé cardiopathie diabétique, et pouvant mener à l’insuffisance cardiaque. Or, le diabète est en pleine expansion dans notre société, ce qui confirme la nécessité de constantes recherches pour mieux cibler les solutions thérapeutiques. Récemment, les gliflozines, i.e. des inhibiteurs des co-transporteurs sodium-glucose (SGLT2), ont démontré un effet bénéfique sur la diminution de la survenue d’évènements cliniques majeurs chez les patients insuffisants cardiaques. Les résultats prometteurs d’un nouveau traitement de l’insuffisance cardiaque par les gliflozines ouvrent une nouvelle voie thérapeutique pour les patients. Néanmoins, pour optimiser les molécules actuelles, nous devons d‘abord identifier leurs mécanismes d’action. En effet, en plus de leur action au niveau des reins, les gliflozines semblent avoir un effet cardiaque direct, notamment sur le métabolisme. Ainsi, notre projet a pour objectif de comprendre comment la gliflozine agit sur la cellule cardiaque, notamment sur la communication du signal calcium entre le réticulum, réservoir de calcium, et la mitochondrie, source d’énergie au sein de la cellule cardiaque dans un modèle chez la souris de cardiomyopathie diabétique. Ces informations permettront de préciser le mécanisme d’action de cette molécule en vue de l’optimiser.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de préciser le mécanisme d’action des gliflozines au niveau cardiaque, mais aussi dans les autres organes, afin d’envisager à terme le développement de nouvelles molécules plus spécifiques et avec une meilleure efficacité pour un plus grand nombre de patients insuffisants cardiaques.

Procédures

Le protocole dure au total 24 semaines. La moitié des souris seront mises sous régime standard pendant 24 semaines et l’autre moitié sera mise sous régime enrichie en lipides et en sucrose. Au bout de 16 semaines, la moitié de chaque groupe aura une supplémentation dans leur nourriture avec la gliflozine, pour mimer le traitement chez les patients. Le développement du diabète chez les souris sera mesuré par un test à 15 et 22 semaines. Pour cela, les souris seront mises à jeun pendant 6 heures, puis une injection de glucose ou d'insuline, selon le test, sera réalisée et la glycémie sera mesurée toutes les 15 minutes pendant 1 heure. Un test d’endurance sera également effectué à 23 semaines sur tapis de course (durée du test : 20min). Les souris auront été au préalable habituées au tapis de course, 1 fois par jour pendant 3 jours (2mn par session). Une échographie sera effectuée à 16 et 23 semaines sous anesthésie gazeuse (durée anesthésie générale :30min) pour étudier la fonction contractile du cœur. Pour étudier la communication du calcium, la moitié des souris de chaque groupe recevra une injection pour exprimer un senseur du calcium (durée anesthésie générale :11min ; durée injection : 30s). Pour mesurer la pression artérielle, la moitié des souris de chaque groupe seront anesthésiées sous analgésie pour introduire une sonde de mesure dans la carotide (durée anesthésie générale :30min) et seront ensuite mises à mort pour prélèvements des organes à analyser.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons durant ce régime riche en sucre et en gras à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un dysfonctionnement cardiaque caractérisé par un cœur plus gros et un remplissage du cœur par le sang diminué, raison de l’étude. Toutefois, l’obésité et la dysfonction cardiaque/métabolique n’entrainent pas de surmortalité, ni d’effets indésirables sur les animaux sur la période considérée (24 semaines). Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) réalisés sous anesthésie générale, ni à l’injection réalisée sous analgésie et anesthésie.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire et cellulaire) des différents organes.

Remplacement

Notre projet ayant pour but d’étudier la cardiopathie diabétique impliquant un mauvais fonctionnement contractile du cœur suite à un dérèglement d’origine métabolique et multi-organe, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire. Cependant, l’isolation de cellules contractiles du cœur des souris de cette étude permettra de réaliser de nombreuses analyses en limitant le nombre d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables, soit au maximum 72 animaux sur 2 ans. Par ailleurs, les prélèvements des autres organes en parallèle du cœur ont été mutualisés sur chaque procédure afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisées sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis. Les souris sont soumises à une période d’habituation sur le tapis de course. La mise à jeun courte de 6h avant les tests métaboliques est réalisée au matin, ce qui correspond au début de période diurne pour les animaux (c’est à dire à leur période de plus faible activité et en situation post-prandiale).

Choix des espèces

La physiologie de la souris étant « proche » de celle de l’Homme, pour la problématique étudiée ici, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Les animaux C57BL/6-Ola-Hsd auront 5 semaines lors de la mise en place de la diète pour 6 mois, menant à un âge de 29 semaines à l'issue de la procédure. La mise en place de la diète dès cet âge permet le développement d’une cardiopathie diabétique.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour altérer une voie de signalisation lipidique, elles alternent des régimes pauvres puis riches en sel, passent jusqu'à quatorze heures par semaine en cage métabolique et subissent des prélèvements de sang et d'urine ainsi que des mesures de pression, avant d'être mises à mort pour analyse des tissus. Le porteur indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % déclenche la mise à mort anticipée par dislocation cervicale. Il affirme que l'étude d'une voie de signalisation dans un contexte d'"échanges cellulaires complexes" ne peut être menée in vitro et renvoie les retombées contre l'hypertension au long terme.

Objectifs

L'hypertension artérielle représente une des causes majeures de mortalité et de morbidité dans le monde ainsi qu’un problème majeur de santé publique. L'identification et la caractérisation physiopathologique qui l’entoure est donc importante afin de développer de nouvelles thérapies contre ces maladies. Des études génétiques et physiologiques effectuées chez l'homme ou le primate, ont démontré qu'une alimentation riche en sel représente le facteur de risque le plus répandu d'hypertension. Les mécanismes responsables de cette sensibilité au sel ne sont cependant toujours pas clairement identifiés. Des études récentes ont montré que la signalisation lipidique contribue à la régulation de la pression artérielle chez les souris nourries avec un régime alimentaire normal. Ce projet vise à déterminer si la signalisation lipidique est également impliquée dans la modulation de la pression artérielle en réponse aux modifications de l'apport alimentaire en sel. Le choix de l'espèce murine nous permet d’avoir conjointement accès à des animaux génétiquement modifiés tout en permettant de moduler les apports en sodium et étudier l'impact sur la pression artérielle. Nous allons générer des souris chez lesquelles la signalisation lipidique a été génétiquement altérée dans différents types de cellules et les nourrir avec des régimes riches ou faibles en sel. Cela nous permettra d'évaluer l’implication de la signalisation lipidique dans la modulation de la pression artérielle par le sel alimentaire. Ce projet nous permettra de faire varier les régimes sodés chez les souris mutantes et leurs témoins respectifs afin d’effectuer des analyses de la tension artérielle, des protéines et des électrolytes sanguins. Il nécessite 480 souris sur 5 ans et a été élaboré afin de respecter les règles éthiques des 3R : Les méthodes alternatives in vitro ne nous permettent pas de tester nos hypothèses et nécessitent l’utilisation d’un modèle animal. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. Afin de prévenir au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance régulière. Enfin, des points limites ont été établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. A terme, les résultats de ce projet seront utiles pour le développement de nouvelles stratégies pour le traitement de l'hypertension.

Bénéfices attendus

A cour terme les resultats de cette étude permetrons d’évaluer le rôle de la signalisation lipidique dans la régulation de la pression artérielle chez la souris. A long terme, le nouvel aperçu physiopathologique fourni par les résultats de ce projet sera utile pour le développement de nouvelles stratégies pour le traitement de l'hypertension.

Procédures

Les souris seront soumises à différentes procédures tout au long de ce projet : Tous les animaux seront soumis à des changements de régimes alimentaires (pauvre en sodium pendant 3 semaines puis riche en sodium ou en potassium pendant 3 semaines). Des prélèvements d’urine de manière hebdomadaire sur 7 semaines (recueil en continu en cage métabolique, 14h par semaine). Des prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse (3 fois sur 7 semaines, environ 5 minutes par souris). Tous les animaux subiront également des mesures de pression sanguine (3 séries sur 7 semaines, environ 10 minutes par souris).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress supplémentaire attenant au changement de régime alimentaire (3 semaines par régime), à la mesure de pression sanguine ainsi qu’à la mise en cage métabolique 14 heures par semaine durant les phases de régime pauvre ou riche en sel.

Devenir

Les animaux, après avoir subi le régime riche en sel seront mis à mort afin de permettre l’analyse de tissus prédéterminés pour analyses immuno histo chimiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire pour ce projet car nous évaluons l'impact de la perturbation des voies de signalisation dans des types cellulaires distincts dans un contexte où les autres types cellulaires de l'organisme restent inchangés. Dans ce contexte d’echanges cellulaires complexes, ces études ne peuvent donc pas être réalisées in vitro (mesure de la pression sanguine, modification de régime alimentaires, analyse de sang et d’urine).

Réduction

De nombreux paramètres de natures variées sont à prendre en compte dans cette étude (Pressions sanguines, taux de calcium et de potassium, numération sanguine, dosage de S1P sur plasma, immuno-histochimie) ce qui rend difficiles tout calculs statistiques concernant le nombre minimum d’animaux requis. Pour cela nous nous sommes basés sur les études reportées dans la littérature utilisant les mêmes approches expérimentales afin d’utiliser la même approche statistique. Afin de réduire le nombre total de souris nous soumettrons les groupes à 2 régimes différents avec une phase de récupération d’une semaine entre les 2 plutôt que d’utiliser un groupe pour chaque régime alimentaire.

Raffinement

Afin de prévenir au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux, toutes les étapes de la procédure se dérouleront avec une surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie et tout comportement anormal sera renseigné à la personne en charge du protocole. Deux fois par semaine (avant et après la mise en cage métabolique), l’un des responsables ira observer et peser tous les animaux entrés dans la procédure et remplira la grille de score établie durant toute la durée de l’expérience : Le poid de référence sera celui relevé une semaine avant le passage en régime pauvre en sodium. - Variation du poid corporel : 0= Normal 1= Perte de poid inferieur à 10% 2= Perte de poid entre 10% et 20% 3= Perte de poid supérieur à 20% - Variation de l’aspect général : 0= Normal 1= Mauvais état du pelage 2= Position anormale (dos voûté, couché sur le côté) 3= difficultés respiratoires (sifflements, râle) - Blessures éventuelles : 0= Pas de blessure 1= Réduction de la mobilité, atrophie musculaire 2= Hémorragie, automutilation Tout animal ayant un score égal à 2 subira des soins adaptés (gelée nutritive, surveillance accrue, traitement des plaies). Tout score supérieur ou égal à 3 atteint pour l’un ou l’ensemble des critères ci-dessus par un animal entrainera la mise à mort de manière anticipée par dislocation cervicale par le personnel compétent. Pendant les phases de régimes salés (HSD) les souris seront dans des cages à double litière et double coton afin d’améliorer leur confort. Lors de la perfusion intra cardiaque les animaux seront mis sous anesthésie profonde par injection IP d’un mélange de 180 mg/kg Kétamine et 10 mg/kg Xylasine. Afin de prévenir une douleur éventuelle, ils seront également sous traitement d’analgésique lors de cette procédure (Buprénorphine, injection IP de 0,05 à 0,1 mg/kg).

Choix des espèces

Nous étudions les souris car elles se prêtent particulièrement à des manipulations génétiques. Par exemple : Les souris chimériques que nous avons créées, nous permettent d'aborder spécifiquement le rôle de S1P circulant dans le sang plutôt que S1P dans les tissus rénaux, chez la souris adulte. Par ailleurs, la physiologie de la souris est maintenant bien caractérisée et de nombreux tests ont été développés pour mesurer les paramètres cardio vasculaires, dans les meilleures conditions possibles et en réponse aux exigences de l'expérimentation animale. Nos études portent sur la régulation de la pression artérielle. Elles sont donc menées sur des animaux adultes (souris agées au minimum de 8 semaines).

2 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses puis des chimiothérapies et immunothérapies répétées, la tumeur pouvant gêner leurs déplacements, avant d'être tuées quand elle dépasse un seuil ou pour prélèvement. Le porteur fixe des points limites, perte de poids supérieure à 20 %, léthargie ou ulcération de la tumeur, déclenchant la mise à mort. Il présente l'organisme vivant comme le seul cadre "prédictif" pour évaluer des combinaisons thérapeutiques en oncologie.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer le rôle de CXCL10 (une chimiokine permettant le recrutement des lymphocytes T CD8) sur l’efficacité antitumorale d’une immunothérapie (anti-PD-1), des chimiothérapies ou d’une association des deux thérapies utilisées en clinique, dans différents modèles de cancers chez la souris. Nous étudierons également les infiltrats immunitaires dans les tumeurs. Ainsi nous pourrons 1) évaluer l’efficacité des traitements en présence ou non de CXCL10 et 2) déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiée en fonction du traitement. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

En 2018, les cancers du côlon du pancréas et du poumon font partie des cancers les plus fréquents avec le cancer de la prostate et du sein. Ces 3 types de cancers représentent les cancers causant le plus de décès. Actuellement, le traitement des cancers colorectaux, du pancréas et du poumon repose sur l’utilisation de chimiothérapies. Bien que ces chimiothérapies aient un effet antitumoral avéré, elles ne conduisent pas systématiquement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. En effet, l’activation de certaines cellules immunitaires pourra favoriser la réponse des patients au traitement, alors que leur blocage conduira à son inefficacité. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas et pour certains cancers colorectaux. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de CXCL10, une chimiokine impliquée dans le recrutement des lymphocytes T CD8 cytotoxiques, sur l’efficacité anti-tumorale de l’immunothérapie ou de la chimiothérapie ou d’une association des deux thérapies, utilisées en clinique dans différents modèles de cancers murins. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par l’immunothérapie et/ou la chimio-immunothérapie (immunomonitoring, Nanostring). L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser l’immunothérapie, la chimiothérapie et/ou la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer.

Procédures

- Injection par voie sous-cutanée de cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée 5 minutes - Nombre de souris : 2800 - Traitements par chimiothérapie par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée 1 minute - Nombre de souris : 2400 - Traitements par immunothérapie par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée 1 minute - Nombre de souris : 2400

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. On note que lorsque le volume tumoral est supérieur à 2000 mm3 (~300mm2), ou que la tumeur parait gêner le déplacement de la souris celle-ci sera sacrifiée. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. Donc surveillance régulière du poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage… Si un point limite est atteint, la souris sera sacrifiée. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies et immunothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. Surveillance régulière de l’état général et des points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, soit parce que la taille de la tumeur dépassera 2000mm3, soit parce que les tumeurs seront prélevées pour les tests biologiques.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Le nombre de souris par groupe a été estimé en utilisant un test bilatéral et en considérant qu’un traitement sera efficace s’il modifie la moyenne des valeurs de 20% avec une différence significative (test de Student). Si l’un des modèles ne donne pas les résultats escomptés (absence de recrutement de lymphocytes CD8 dans les tumeurs surexprimant CXCL10 visualisé par immunomonitoring dans la partie I) ou s’il s’avère que les points limites sont atteints prématurément, celui-ci sera abandonné dès la partie I.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe. Points limites : - perte de poids dépassant 20% par rapport au poids maximum enregistré : arrêt des traitements ; si persistance au-delà de 24h, mise à mort de l’animal ; - posture ou autre expression de la douleur : arrêt des traitements ; si persistance au-delà de 24h, mise à mort de l’animal ; - absence de toilettage : arrêt des traitements et surveillance de l’apparition d’autres points limites ; - léthargie, immobilité : si persistance au-delà de 24h, mise à mort de l’animal ; - une mauvaise cicatrisation ou une ouverture des sutures : mise à mort de l’animal. - Points limites spécifiques à la présence de tumeurs et dont l’atteinte entrainera l’euthanasie des animaux : - volume tumoral supérieur à 2000 mm3 (300mm2) ; - tumeurs gênant les fonctions vitales et motrices ; - ulcération ou nécroses de la tumeur sous-cutanée supérieure à 20% de la surface totale de la tumeur ; - difficultés respiratoires. Le projet se déroule en 3 parties. L’absence de faisabilité (points limites atteints) ou de résultats (absence de recrutement de CD8 dans les tumeurs surexprimant CXCL10) conduira à l’arrêt de certains modèles.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.