Recherche fondamentale

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent pendant quatre semaines des instillations intra-trachéales d'un agent pro-inflammatoire sous anesthésie et, pour certains, une exposition continue à un air appauvri en oxygène simulant 4 300 à 5 000 mètres d'altitude, avant d'être tués par exsanguination pour prélever cœur et muscles. Le porteur décrit une baisse transitoire de prise alimentaire et d'activité, sans douleur attendue selon lui. Il affirme que ce dialogue entre organes ne peut s'étudier que sur "l'organisme entier" et retient le rat pour la quantité de muscle qu'il fournit.

Objectifs

Le tissu musculaire squelettique est doté d'une plasticité particulièrement sollicitée en réponse à des contraintes comme l'entraînement, la réhabilitation, la nutrition ou l'environnement permettant une amélioration de la performance sportive mais aussi de la santé au sens large. De nombreux travaux montrent une corrélation entre la masse musculaire et la survie des individus âgés, qu'ils soient en bonne santé ou porteurs de pathologies chroniques. Ainsi, dans les pathologies chroniques, le maintien voire l'amélioration de la masse et de la fonction musculaires sont considérés comme des outils de santé, justifiant le recours à la réhabilitation par l'activité physique. Cependant, que ce soit dans le cadre de l'optimisation de la performance ou dans la prise en charge des patients, on note une fraction non négligeable de personnes ne répondant pas ou pas bien à de tels programmes qui peut aller jusqu'à 30% dans le cas de la maladie respiratoire chronique. Cette non-réponse est encore mal expliquée. A côté des mécanismes classiques de régulation de gènes d'intérêt dont l'expression peut varier fortement avec l'exercice, l'hypothèse d'un rôle significatif du micro-environnement musculaire sur le contrôle de ces adaptations, s'appuyant sur l'existence de régulations d'ordre épigénétique, semble privilégiée, que ce soit chez le sportif de haut niveau ou chez le patient. Ces modifications pourraient conduire à des difficultés à activer les voies de signalisation classiques contrôlant la masse musculaire (protéosynthèse, protéolyse) selon des critères qui restent à préciser (prédisposition, mode de vie, environnement, niveau d'activité physique). Ces critères agiraient via des modifications épigénétiques sur le développement musculaire et en particulier sur les limitations des capacités hypertrophiques du muscle en présence d'hypoxie et d'inflammation. Il convient maintenant de disséquer les mécanismes qui pourraient être à l'origine de ces réponses différentielles. Dans le cadre de la maladie respiratoire, ces échecs pourraient être liés à des modifications de la chromatine (ADN+histones) qui contrôleraient négativement la régulation de la masse musculaire mais dont on ne sait pas comment elle obéit au stress hypoxique et/ou inflammatoire associé. Notre objectif est de déterminer ces modifications pour ensuite proposer des solutions de contournement pour rendre plus efficace la réponse du tissu musculaire des patients au réentrainement à l'effort.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer la signature épigénétique du tissu musculaire ainsi que ses signaux de réponse à l'exposition à l'hypoxie et/ou à l'inflammation d'origine pulmonaire, pouvant expliquer les niveaux de réponse variables du muscle à un stimulus hypertrophique observée dans des travaux précédents. Nos résultats permettront de relier les caractéristiques de l'épigénome associé à une contrainte environnementale (hypoxie et/ou inflammation) en fonction du type de muscle (oxydatif ou glycolytique) à des indicateurs métaboliques déterminés sur fibres isolées ou mitochondries isolées. L'objectif est ensuite d'utiliser des perturbations du métabolisme énergétique afin de modifier cet épigénome pour le rendre plus favorable, constituant ainsi un outil de personnalisation de la prise en charge de la fonction musculaire dans un contexte similaire d'hypoxie et d'inflammation comme chez le malade respiratoire.

Procédures

Les animaux utilisés pour ce projet subiront soit des instillations intra-trachéales bi-hebdomadaires d'un agent pro-inflammatoire, sous anesthésie gazeuse de courte durée (inférieure à 2 min/session), pendant 4 semaines (groupes Inflammation seule et Hypoxie+Inflamation) représentant un total de 8 instillations. De plus, le groupe Hypoxie+Inflamation sera exposé en continu durant les 2 dernières semaines à un environnement appauvri en oxygène (similaire à une altitude de 4300m à 5000m) ainsi que le groupe Hypoxie seule. Après cette période de conditionnement, les animaux seront endormis (anesthésie gazeuse) et mis à mort immédiatement par exsanguination et prélèvement du coeur, suivis de prélèvements de divers organes ou tissus d'intérêt pour analyses ultérieures in vitro.

Impact sur les animaux

Le statut nutritionnel des animaux exposés à l'hypoxie continue peut être légèrement impacté avec une prise alimentaire diminuée dans les premiers jours en dépit d'un accès à l'eau de boisson et à la nourriture ad libitum mais qui revient ensuite à une quantité de nourriture consommée normale. L'activité locomotrice spontanée peut également être légèrement diminuée les premiers jours d'hypoxie pour revenir à la normale, facilitée en cela par l'hébergement qui se fait dans les mêmes cages que la stabulation normale, en groupe, avec enrichissement du milieu. L'instillation pulmonaire de LPS, génératrice d'une inflammation pulmonaire (avec présence de signes d'atteinte de l'épithélium pulmonaire) n'engendre pas de douleurs ou limitation physiologique chez l'animal au repos sur une période aussi courte (4 semaines). Le laryngoscope utilisé pour insérer la canule pour l'instillation de LPS est adapté à l'anatomie des animaux (diamètre, longueur) et n'est pas susceptible d'induire de gêne ou souffrance. L'exposition à l'hypoxie se faisant dans une enceinte accueillant les cages d'hébergement qui est installée dans une pièce d'hébergement où les paramètres environnementaux sont régulés, aucune nuisance relative à l'environnement thermique ou lumineux n'est attendu.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever divers tissus et organes d'intérêt étudiés in vitro ensuite.

Remplacement

Nous voulons explorer les conséquences d'une perturbation de la disponibilité en oxygène associées à une inflammation pulmonaire similaires à celles engendrées par la maladie respiratoire, sur des tissus périphériques comme les muscles squelettiques en utilisant un modèle combinant une hypoxie et une inflammation environnementale reproduisant les principales conséquences de la maladie respiratoire chronique. Cette relation inter-organes n'est pas possible sur un modèle autre que l'organisme entier. En raison de la quantité de tissus nécessaire pour un rendement d'isolement de mitochondries musculaires ou de fibres perméabilisées suffisant, nous avons choisi le rat qui propose une taille adaptée, par rapport à la souris.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux pour atteindre le seuil de significativité lors de l'analyse statistique des résultats avec une puissance de test cible de 0.8. Les méthodes d'exploration utilisées introduisent une variabilité qui reste limitée à 5%. Les changements attendus sur les paramètres mesurés sont de l'ordre de + ou - 15% par rapport à la valeur moyenne contrôle. Avec ces différents critères pris en compte, notre approche statistique donne un calcul d'effectif de 10 animaux par groupe. Par mesure de précaution, afin de tenir compte des aléas expérimentaux, nous incluerons 12 animaux par groupe soit un total de 48. Nous profiterons de ce protocole pour prélever et stocker des tissus qui ne seront pas directement utilisés dans ce projet. Cependant, ils seront stockés pour éventuellement être analysés dans le cadre d'un projet portant sur le foie, évitant de reconditonner de nouveaux lots d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe, en cages ouvertes, avec un enrichissement du milieu (cachettes, litière) dans des locaux où les paramètres d'ambiance (température, hygrométrie, lumière, cascades de pression) sont suivis et enregistrés en continu, avec remontée d'alarme en cas d'écart avec les valeurs de consigne. L'exposition à l'hypoxie sera réalisée dans le même matériel d'hébergement, dans une enceinte pouvant accueillir plusieurs cages de plusieurs animaux. L'instillation intra-trachéale se fera après une légère anesthésie gazeuse d'une durée maximale de 2 min/session et l'animal sera observé jusqu'à son réveil complet avec de retrouver ses congénères. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long du projet et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés 2 fois par jour après chaque procédure ou 3 fois par jour en cas de symptômes cliniques jusqu'à leur disparition ou la mise à mort de l'animal. Les gestes techniques seront réalisés par des personnes compétentes et formées pour leur exécution. Ceux-ci comprennent l'observation de l'apparition éventuelle de signes cliniques (troubles du comportement, prostration, manque de toilettage) ou une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids de départ. Ils seront alors mis à mort et exclus de l'étude. Un examen post-mortem sera pratiqué pour identifier d'éventuelles lésions pouvant expliquer cet état afin de trouver des mesures de correction pour de futurs projets. Le volume à instiller sera limité à 1 µL/g de poids corporel.

Choix des espèces

Ce projet porte sur les conséquences d'une exposition environnementale à l'hypoxie et/ou à une inflammation pulmonaire sur le tissu musculaire squelettique. Le seul moyen d'étudier ce dialogue interorganes et l'influence d'un tissu ou d'un organe sur le fonctionnement d'un autre est d'utiliser l'organisme entier. Il n'existe actuellement aucune alternative scientifiquement validée. Le rat de laboratoire est l'espèce la plus adaptée car sa taille adulte permet d'obtenir des quantités de muscle adaptées aux mesures à réaliser, limitant le nombre d'animaux à utiliser par rapport au recours à d'autres espèces plus petites (souris..). De plus, la littérature scientifique montre que cette espèce présente des signes d'adaptation musculaire et cardiaque à ces facteurs environnementaux semblables à ce que l'on peut observer chez l'être humain dans un contexte de maladie respiratoire chronique, en faisant ainsi un modèle d'étude pertinent. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte moyen (âge en début de projet : 6 à 8 mois), de façon à se rapprocher de l'âge moyen d'apparition de la maladie respiratoire chez l'homme (âge adulte moyen) correspondant à l'entrée dans la 2ème partie de la vie.

1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis subissent injections, gavages, huit prélèvements sanguins, neuf séances d'imagerie et des mesures de tumeur, avant d'être tuées pour les analyses. Le porteur reconnaît une douleur liée à la croissance tumorale, souvent associée à une perte de poids. Il présente la souris comme "le modèle de choix et de référence" pour valider in vivo un agent censé renforcer les lymphocytes T contre le cancer.

Objectifs

Ces dix dernières annéees, les immunothérapies ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant nos défenses immunitaires à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards de chimiothérapie et radiothérapie. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus in vitro montrent une potentialisation des outils cellulaires à la base des immunothérapies dans le contexte du cancer.

Procédures

Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : - 8 prélévements sanguins (1 goutte), la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 9 séances d'imagerie, la durée de ce geste est évaluée à 3 minutes - 6 mesures de la tumeur à l'aide d'un pied à coulisse, la durée de ce geste est évaluée à 2 minutes - 4 administrations par gavage, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes - 9 injections intrapéritonéales, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 injection sous-cutanée, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 séance de rasage du flanc droit à l'aide d'un rasoir électrique, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes - 1 injection intraveineuse, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute

Impact sur les animaux

Des nuisances potentielles pourraient résulter du stress généré lors des injections et plus globalement par la manipulation hebdomadaire des animaux, mais également de la douleur résultant de la croissance tumorale qui est souvent associée à une perte de poids

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.

Remplacement

Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une potentialisation des fonctions antitumorales après traitement par un inhibiteur pharmacologique nouvellement identifié. Le recours aux modèles animaux permettra de valider in vivo, dans des modèles précliniques, le gain résultant de l'utilisation de cet inhibiteur sur des approches d'immunothérapies au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par palpation des tumeurs et par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d'étude sont faits le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base de nos travaux antérieurs et de la littérature montrant que 18 à 24 souris par groupe permettent de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les interventions (injections intraveineuses et prélèvements sanguins) seront précédées d'une anesthésie générale, afin de prévenir la douleur. Nous utiliserons l'imagerie pour un suivi de la charge tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basé sur cette approche pour les études ultérieures. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entraina une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix et de référence pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Les modèles murins permettent en effet d'apprehender la complexité de la réponse tumorale. Ces modèles permettent notamment d'apprehender la possibilité de rencontre des cellules de l'immunité et des cellules tumorales au sein de l'organisme. Ces modèles permettent également de prendre en compte la survie des cellules immunes et le maintien de leur activité antitumoral au sein du microenvironement tumorale, qui le plus souvent met en place des mécanismes pour inhiber la réponse immune. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).

2 904 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent injections répétées, régimes gras, mises à jeun, tests métaboliques avec prélèvements sanguins et hébergement en cage calorimétrique, pour développer une cholangite sclérosante ou une stéatose hépatique, avant mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur qualifie l'induction de ces maladies de "strictement nécessaire" et présente les pathologies comme asymptomatiques. Il affirme que la complexité cellulaire du foie ne peut être répliquée in vitro et qu'il faut un "organisme entier".

Objectifs

La cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non-alcoolique sont des maladies ne disposant d’aucun traitement pharmacologique formel validé. La stéatose hépatique non-alcoolique va devenir la première cause de transplantation hépatique et la cholangite sclérosante primitive est une maladie dont les mécanismes moléculaires sont très mal caractérisés, il est dit d’elle que c’est la dernière boîte noire de la médecine qui s’intéresse à l’étude du foie. Ce projet a donc pour objectif de mieux caractériser rôle de la mort des différentes populations cellulaires dans le développement de ces maladies. Il permettra d’identifier et de cibler des populations clés dans le développement de la maladie. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques dans ces pathologies pourra constituer la base d’un dépôt de brevet.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux caractériser des maladies du foie sans traitement pharmacologique disponible actuellement. D’un côté la cholangite sclérosante primitive, maladie rare mais grave exposant au risque de cirrhose et de cancer. Actuellement, le seul traitement efficace de cette maladie est la transplantation hépatique. Or ce traitement est réservé aux patients avec une maladie avancée et n’est pas toujours possible en cas de cancer. Il est donc primordial d’étudier d’autres pistes thérapeutiques. De l’autre côté, la stéatose hépatique non alcoolique est la maladie hépatique la plus commune car elle suit la courbe de progression de l’obésité. Bien que sa prévalence explose, aucun traitement n’est disponible à ce jour, et le nombre de patients au stade terminal de la maladie (c’est-à-dire cirrhose) nécessitant une transplantation hépatique est en croissance perpétuelle. Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique de l’inhibition de la mort cellulaire sur le développement de ces maladies.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de pathologies hépatiques et à leurs traitements. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les différentes séries de gestes réalisés sur les souris pourront être au choix selon les questions scientifiques : 1-Injections intrapéritonéale (1x/j/pendant 5 jours/5 sec animal vigile)+Utilisation de régimes spéciaux (8 à 16 semaines de régime)+Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests - 2 tests par mois espacé d’une semaine minimum - 4 fois maximum)+Mesure de la composition corporelle (5-10 minutes animal vigile ) et cages calorimétrie (maintien 5j maximum)+ Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 2-Injections intrapéritonéale (1x/j/pendant 5 jours/5 sec animal vigile)+Utilisation de régimes spéciaux (1 à 8 semaines de régime)+Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 3-Injections intrapéritonéale (1x/j/pendant 5 jours/5 sec animal vigile)+Utilisation de régimes spéciaux (1 à 8 semaines de régime)+Administration d’inhibiteurs via l’aliment (de 8 à 16 semaines)+ Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 4-Utilisation de régimes spéciaux (8 à 16 semaines de régime) )+Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests - 2 tests par mois espacé d’une semaine minimum - 4 fois maximum)+Mesure de la composition corporelle (5-10 minutes animal vigile ) et cages calorimétrie (maintien 5j maximum)+ Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). Chaque point représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. L’induction de ces pathologies est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet et trouver des thérapies innovantes. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement des pathologies du foie étudiées avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités puisque les molécules sont bien tolérées par les souris. Les administrations par gavage, les injections intra-péritonéales, et les prélèvements sanguins nécessaires durant les tests métaboliques peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. De façon extrêmement rare, ils peuvent induire des microlésions ou des irritations. Les tests métaboliques effectués peuvent également induire un stress pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun ou encore l’isolement en cas d’utilisation de cage métabolique. De même, le transport des animaux qui pourra être mis en œuvre sera également source de stress pour les animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=2904) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

L’animal dans son intégrité est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de la cholangite sclérosante primitive ou la stéatose hépatique non-alcoolique, la complexité cellulaire ne pouvant être répliqué in vitro. Nous avons besoin étudier spécifiquement l’influence de l’inactivation de nos gènes d’intérêts dans un type cellulaire donnée, sur les autres types cellulaires dans le développement de la maladie. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Un total de 2904 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires qui sont malheureusement nécessaires pour mener à bien ce projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement des pathologies étudiées avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités puisque les inhibiteurs sont bien tolérés par les souris. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et le vétérinaire pourra être sollicité, le cas échéant.

Choix des espèces

JJustification de l’espèce/modèle : Le projet a pour objectif d’étudier le rôle de la nécroptose dans les processus physiopathologiques aboutissant à la cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non-alcoolique. Afin de répondre à cet objectif, l’expression de certains gènes d’intérêts dans les modèles animaux utilisés doit être altérée génétiquement dans des types cellulaires choisis, ce qui justifie le choix de cette espèce (souris). Justification des stades : Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 et 8 semaines pour chaque procédure. Cela correspond à l’âge adulte, deux semaines après le temps du sevrage. De plus, les variations entre les souris sont minimales ce qui permet de diminuer la variabilité (aspects métaboliques) entre animaux avant le début des traitements. Cet âge de départ permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Justification du sexe : Nous favoriserons l’utilisation des deux sexes (idéalement 50/50) afin de ne pas introduire un biais dans nos études notamment lors des tests d’inhibiteurs pharmacologiques dans le développement des maladies étudiées. En effet, il est maintenant établi que lors des expérimentations et autres tests médicamenteux, les souris mâles sont plus exploitées que les souris femelles. Cela introduit donc un énorme gap puisque les femelles peuvent réagir différemment sur le plan de toxicité, du métabolisme ou encore de la biodisponibilité. Étant donné que notre but est de proposer de nouveaux traitements, il nous apparait essentiel d’analyser les deux sexes afin que les résultats puissent être transposés à l’homme.

100 cailles japonaises, 40 adultes et 60 jeunes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées pour d'autres projets ou confiées à une association. Elles sont exposées à de la musique et observées lors de tests comportementaux quotidiens, les adultes subissant en plus deux prélèvements sanguins. Le porteur cherche à savoir si la musique favorise les comportements sociaux et si cet effet dépend des capacités d'apprentissage vocal, en comparant plusieurs espèces d'oiseaux et de primates. Il affirme que l'observation d'animaux libres de leurs mouvements "exclut tout remplacement" par un autre modèle.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans une étude visant à explorer les origines et fonctions évolutives de la musicalité (c’est-à-dire les capacités liées à la perception, l'appréciation et la production de la musique) ainsi que les liens entre musique et comportements sociaux. Il existe une théorie selon laquelle la musicalité serait apparue au cours de l’évolution parce qu’elle renforcerait les liens sociaux et la cohésion du groupe. Plusieurs études ont en effet révélé que les activités musicales conjointes favorisent la prosocialité chez les enfants, c’est-à-dire les comportements de souci de l'autre, et notamment d'aide, dirigés vers des personnes inconnues ou en difficulté. De plus, écouter de la musique favorise les interactions sociales positives à la fois chez les enfants d’âge préscolaire et chez les perruches callopsittes. Ainsi, la musicalité pourrait avoir émergé au moins deux fois au cours de l’évolution, chez les humains et chez les oiseaux, avec des fonctions adaptatives similaires. Cependant, d’importantes questions demeurent concernant (i) le rôle de facilitation que les capacités d’apprentissage vocal ont pu jouer dans l’évolution de la musicalité, et (ii) les circonstances dans lesquelles la musique influence le comportement social. L’apprentissage vocal, démontré à ce jour chez trois groupes d’oiseaux (les psittacidés, les oscines et les colibris), pourrait avoir joué un rôle de pré-requis à l’évolution de la perception musicale. Cette capacité étant généralement considéré comme plus limitée chez les primates non-humains, cela pourrait expliquer leur musicalité également moins développée. Cette hypothèse sera testée en comparant l’influence de la musique sur les comportements sociaux chez différentes espèces d’oiseaux (perruches callopsittes, diamant mandarins, canaris, cailles japonaises) et de primates (humains, gibbons, ouistitis) possédant différents degrés de capacités d’apprentissage vocal. Le projet portera sur les cailles japonaises, espèce dont l’apprentissage vocal est limité et chez laquelle nous nous attendons donc à avoir des effets plus limités de la musique que chez les espèces capables d’apprentissage vocal par imitation.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de l’étude visant à explorer les origines et fonctions évolutives de la musicalité, ainsi que les liens entre musique et comportements sociaux, le projet permettra d’évaluer le rôle de facilitation que les capacités d’apprentissage vocal ont pu jouer dans l’évolution de la musicalité. La comparaison des résultats obtenus chez la caille japonaise avec ceux obtenus chez d’autres espèces animales ayant des capacités d’apprentissage vocal plus ou moins développées permettra de déterminer si la musique a ou non des effets plus prononcés sur les interactions sociales chez les espèces ayant les capacités les plus devéloppées. La caille japonaise étant un animal domestique utilisé dans des élevages en captivité, le projet devrait aussi ouvrir des pistes pour développer l’utilisation de la musique pour favoriser le bien-être et les interactions sociales positives chez les animaux en captivité.

Procédures

Des observations et tests comportementaux seront réalisés tous les jours pendant 5 jours, pendant 5 semaines avec 40 cailles adultes et 4 semaines avec 60 cailleteaux. Des prélèvements sanguins seront effectués sur les 40 cailles adultes. Chaque caille fera l’objet de 2 prélèvements de maximum 1ml chacun, à 2 jours d’intervalle, sur 1 semaine.

Impact sur les animaux

Les éléments qui sont susceptibles de perturber les animaux et de les stresser sont le déplacement et l’éventuel isolement lors des tests, la confrontation à des environnements nouveaux (arène de test), la diffusion de stimuli musicaux, et la réalisation de prélèvements sanguins. Des séances de familiarisation progressive à la diffusion de musique seront organisées avant le début des expériences pour limiter les risques de stress. La musique sera diffusée dans l’environnement habituel des oiseaux, à un volume sonore limité et contrôlé à l’aide d’un sonomètre (maximum 60 décibels, ce qui est largement inférieur au volume sonore pouvant être atteint par les vocalisations des cailles, i.e. 100 décibels). Les tests nécessiteront de capturer les individus et de les déplacer de leur cage de vie jusqu’à une arène de test située dans une autre pièce. Les tests réalisés par groupe de 2 ou 3 individus vivant habituellement ensemble dureront 7 minutes et seront réalisés une fois par jour pendant 5 jours. Les tests nécessitant un isolement ne seront réalisés qu’une fois et ne dureront pas plus de 10 minutes. Les animaux seront tous habitués à être manipulés par la personne qui réalisera les expériences.

Devenir

Le projet n’implique aucune atteinte à l’intégrité physique et comportementale des animaux. Ceux-ci pourront donc être, soit gardés au laboratoire pour de futurs projets, soit confiés à une association de réhabilitation des animaux de laboratoire pour placement en refuge ou en famille d’accueil.

Remplacement

Le projet consiste à observer le comportement d’animaux vivants libres de leurs mouvements et de leurs réactions, ce qui, par essence, exclut tout remplacement par des modèles autres que ces animaux.

Réduction

Nous avons décidé d'utiliser un minimum de 8 individus par condition, ce qui fait un total de 40 cailles adultes et 60 cailleteaux. Ce nombre devrait nous permettre de réaliser des tests statistiques fiables. Chaque individu étant observé dans chaque condition à des moments différents, nous obtiendrons ainsi des mesures répétées où chaque animal est son propre contrôle, ce qui garantit des résultats plus robustes, avec un nombre plus limité d’animaux que dans le cas de mesures non répétées.

Raffinement

Tout sera fait pour limiter les manipulations des animaux. Les tests nécessiteront néanmoins de déplacer les animaux et de les isoler de façon ponctuelle et limitée dans le temps (pas plus de 10 minutes par jour). Les animaux vivront, à 2 ou 3, dans des cages enrichies de 100x74x63 cm munies de mangeoires et d’abreuvoirs avec nourriture et eau à volonté, et d’un substrat leur permettant de faire des bains de poussière. Ils disposeront d’un abri leur permettant de se cacher. Ils seront soignés et observés tous les jours. La détection de tout changement de comportement, d'une blessure (plaie, abcès...) ou d'une perte de poids supérieure à 10% conduira à isoler l'individu (et donc à le retirer du protocole expérimental) et à le placer dans un environnement favorisant son rétablissement afin de l’observer et de le soigner si nécessaire, l’objectif étant de pouvoir le remettre dès que possible dans ses conditions de vie habituelles. Les animaux ne seront euthanasiés que s'il est impossible de les soigner et qu'aucune amélioration n'est notée, et dès que des signes comportementaux de souffrance (vocalisations, postures...) seront détectés. Nous mettrons en place des séances de familiarisation progressive pour chaque élément potentiellement source de stress (diffusion de sons, manipulation, déplacement dans les arènes de tests). Le volume des stimuli sonores diffusés sera limité à 60 db.

Choix des espèces

L’un des objectif du projet consiste à comparer l’influence de la musique sur les comportements sociaux chez différentes espèces ayant des capacités d’apprentissage vocal variables. Celles-ci sont connues pour être importantes ches les oscines (dont les canaris et les diamants mandarins) et les psittacidés (dont les perruches callopsittes). De plus, plusieurs espèces de psittacidés, dont les perruches callopsittes, sont connues pour leur sensibilité à la musique. Au contraire, les capacités musicales semblent plus limitées d’après la littérature chez les primates non humains et chez les gallinacés, qui feront l’objet des expériences menées dans le projet. Les cailles étant connues pour avoir des capacités d’apprentissage vocal limitées, nous nous attendons à observer chez elle un effet moindre de la musique que chez les espèces capables d’apprentissage vocal par imitation (comme les espèces étudiées par les partenaires du projet). Comparer ces différentes espèces permettra de tester l’hypothèse de l’apprentissage vocal comme prérequis à l’évolution de la musicalité et de mieux comprendre l’évolution de ce trait au cours de l’histoire du vivant. Nous utiliserons 40 cailles femelles adultes et 60 cailleteaux (non sexables). Ces deux stades de vie correspondent à des stades pendant lesquels les cailles sont habituellement sociales et développent des liens sociaux avec leurs congénères. Néanmoins, les liens ne sont pas les mêmes entre cailles adultes et entre cailleteaux. Nous pourrons donc tester les effets de la musique sur deux stades sociaux différents et ainsi déterminer si ces effets sont plus ou moins marqués lors d’un stade plutôt que l’autre.

164 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une chirurgie crânienne de quatre à six heures avec ouverture d'un volet crânien et implantation d'électrodes, puis des enregistrements répétés pendant le sommeil, certaines étant soumises à un conditionnement associant un lieu à des stimulations électriques de la paupière avant d'être tuées pour localiser les électrodes. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie, d'infection du tissu cérébral et de prostration liée au conditionnement aversif, tout en indiquant que les animaux disposent de zones de repli. Il décrit ces travaux sur la mémoire comme "incontournables" et juge la souris "centrale" faute de modèle in vitro ou invertébré équivalent.

Objectifs

La mémoire est une faculté essentielle qui permet d’acquérir et de stocker des informations pour ensuite adapter un comportement en fonction de l’expérience. De nombreuses études ont montré que les oscillations cérébrales jouent un rôle crucial dans la consolidation de la mémoire pendant le sommeil. Étudier ces mécanismes permet de mieux comprendre le rôle des différents états de vigilance afin de préserver nos capacités cognitives dans un contexte général de réduction du temps de sommeil, mais aussi pour envisager des pistes thérapeutiques aux pathologies telles que l’insomnie chronique. Les techniques standards d’enregistrement de l’activité cérébrale pour l’étude du sommeil sont l’IRM fonctionnelle chez l’homme et les primates non-humains d’une part, et les enregistrements électrophysiologiques dans les modèles rongeurs, d’autre part. Ces deux techniques présentent des inconvénients de taille : l’IRM fonctionnelle est coûteuse et bruyante, tandis que l’électrophysiologie souffre d’une faible résolution. Une nouvelle modalité, l’imagerie ultrasonore fonctionnelle, permet de mesurer les variations de flux sanguin cérébral dans plusieurs régions du cerveau simultanément, avec une bonne résolution spatiotemporelle. Elle est facile à mettre en place, portable et abordable. A ce jour, l’imagerie ultrasonore couplée à l’électrophysiologie est tres prometteuse pour observer finement l’ensemble des régions cérébrales activées lors des processus de consolidation. Les études précédentes en imagerie ultrasonore fonctionnelle ont été réalisées sur des rats vigiles ou pendant le sommeil paradoxal : nous manquons donc de données précises sur le sommeil lent. Or, c’est précisément pendant le sommeil lent que les mécanismes de consolidation mnésique (appelés réactivations) ont été mis en évidence. Les corrélats à grande échelle de ces réactivations n’ont été examinés que chez le singe, d’où la pertinence de ce projet. Le but de ce projet est donc double : 1- imager les réseaux associés aux réactivations à l’échelle du cerveau entier et 2- examiner les dynamiques spatiotemporelles de l’apprentissage aversif/appétitif, qui module fortement ces réactivations. Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes de consolidation de la mémoire sur le plan fondamental, ainsi que le développement de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de pathologies comme le syndrome de stress post-traumatique ou la maladie d’Alzheimer

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes électrophysiologiques impliqués dans la consolidation de la mémoire notamment dans le cas de la mémoire émotionnelle. Ces travaux apparaissent comme incontournables afin de pouvoir améliorer notre compréhension de la dynamique spatiale et temporelle de la consolidation de la mémoire, mais aussi des régions cérébrales associées spécifiquement la mémoire aversive et la mémoire appétitive. Les données acquises dans le cadre de ce projet permettront à court terme de mettre en lumière de nouvelles régions d’intérêt pour l’étude de circuits par des techniques comme l’optogénétique ou l’électrophysiologie et dans le long terme pour l’évaluation de troubles mentaux permettant d'anticiper leur apparition et d'améliorer la prise en charge des patients. Par l'utilisation du modèle rongeur, nous serons donc en mesure de mettre nos résultats en lien avec une littérature fournie et de constituer une nouvelle base de données pour d’autres laboratoires. De plus, l’anatomie du modèle souris étant bien décrite, nous serons en mesure de transposer les résultats de nos travaux non seulement aux patients atteints de troubles mentaux, mais aussi à d'autres espèces animales comme les animaux de production ou domestiques. En effet, les résultats de ces travaux pourront également permettre une meilleure évaluation de l'état émotionnel de l'animal, thématique d'importance croissante dans l'amélioration du bien-être animal.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet subiront une chirurgie sous anesthésie générale comprenant une implantation d’électrodes ainsi qu’un volet crânien, pour une durée moyenne de 4h à 6h. Une période stricte de récupération de 7 jours sera observée au cours de laquelle un suivi et une prise en charge de la douleur post-opératoire sera effectué. A l’issue de cette période, un premier groupe d’animaux ne subira aucun enregistrement réel, mais des enregistrements simulés avec une ‘fausse’ sonde afin d’évaluer les effets du port répété de celle-ci. Un suivi longitudinal permettant d’évaluer visuellement la qualité du volet crânien, la stabilité de l’implant et le comportement de l’animal sera effectué, ainsi qu’un suivi de la douleur. Pour un autre groupe, à l’issue de cette période d’habituation de 2 à 5 jours, les animaux suivront un protocole d’enregistrement de 2h30, pendant leur sommeil directement dans leur cage et du comportement dans un labyrinthe enrichi, ce qui permettra d’établir des cartes d’activations associées au sommeil. La durée maximale de ces enregistrements sera de 8 semaines au total (10 semaines après la chirurgie). Un dernier groupe d’animaux subira à la place un protocole d'association d'un endroit de l’environnement à des stimulations agréables, désagréables ou mixtes. Les stimulations agréables seront des récompenses directes comme de l’eau chocolatée (selon les préférences individuelles). Les stimulations désagréables seront des stimulations électriques calibrées (stimulation électrique bénigne de la paupière) n’occasionnant qu’un inconfort bref et générant un comportement de fuite caractéristique puis de ‘freezing’. Les animaux bénéficieront toujours d’une large zone neutre vers laquelle se réfugier pour ne plus subir de stimulation désagréable. Ils seront ensuite replacés dans leur cage afin d’étudier les réactivations associées à cette expérience. La durée maximale de ces enregistrements sera de 8 semaines au total (10 semaines après la chirurgie). Tous les animaux seront enfin euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes.

Impact sur les animaux

Pour réaliser les travaux de ce projet, il est nécessaire de réaliser des procédures invasives sur les animaux impliquant notamment une procédure chirurgicale. Les autres effets indésirables sont liés au protocole d’enregistrement et à l’isolement des animaux. Cela implique donc un suivi longitudinal soutenu et une évaluation quotidienne de la douleur de l’animal. Les effets indésirables liés à la chirurgie sont, à court terme, liés aux risques per-opératoires (hémorragie, hypovolémie, etc.) et à moyen terme, aux risques de complications post-opératoires et d’infection locale du tissu cérébral. Dans une moindre mesure, le tissu cérébral (bien que protégé) est plus vulnérable aux chocs mécaniques, en l’absence de barrière osseuse au-dessus de la zone d’imagerie. A long terme, les effets indésirables majeurs sont liés au poids et à la taille de l’implant, ainsi qu’au stress mécanique pouvant résulter des chocs répétés contre les parois de la cage. Les effets indésirables liés au protocole d’enregistrement lui-même sont limitées en termes de douleur : le matériel d’enregistrement étant miniaturisé, le poids sur la tête de l’animal est réduit. Cependant, l’utilisation d’un câble, même souple, restreint la liberté de mouvement de l’animal et peut occasionner son enroulement, ce qui augmente l’inconfort de l’animal. La répétition de sessions d’enregistrement quotidiennes peut aussi détériorer la stabilité de l’implant, ce qui peut, à terme, diminuer la qualité des enregistrements et favoriser les risques cités plus-haut. Enfin, le protocole de conditionnement aversif implique d'utiliser des stimulations désagréables (ou très légèrement douloureuses) pour l'animal (nécessaire afin d’étudier la mémoire aversive) ce qui peut modifier le comportement de l’animal sur le long terme et occasionner des comportements telle que la prostration. Ces animaux bénéficieront cependant toujours de larges zones de « repli » dans lesquelles ils ne subiront pas de stimulations.

Devenir

A l'issue des procédures 1, 2 et 3, les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes ainsi que les caractéristiques (niveau d'activation, nombre, localisation) des neurones qui ont été réactivés.

Remplacement

Notre objectif est d’étudier les réactivations neuronales à l’échelle du cerveau entier suivant un apprentissage spatial neutre, ou aversif. Ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro, ex vivo ou in silico. Ces études ne peuvent pas non plus être réalisées chez les invertébrés, qui ont une structure cérébrale et un comportement trop simple. De plus nous souhaitons étudier à la fois les réponses électrophysiologiques et vasculaires mais aussi les paramètres physiologiques comme la respiration ou le rythme cardiaque pour pouvoir faire un parallèle avec l’Homme (notamment pendant l’apprentissage). Enfin, les tests comportementaux, mécanismes de la consolidation mnésique et disponibilité des modèles génétiquement modifiés rende le modèle souris central a l’étude de la mémoire. C’est donc le seul modèle réunissant tous ces critères.

Réduction

Afin de minimiser l’utilisation d’animaux dans chacun des groupes, nous améliorerons l’efficacité de la procédure chirurgicale et le suivi longitudinal des animaux. Le nombre d'animaux requis pour ces expériences sera réduit au minimum nécessaire, pour pouvoir réaliser des tests statistiques, à partir de nos résultats. Les comparaisons entre groupes expérimentaux seront réalisées avec des tests paramétriques (student ou Anova). Si les données ne suivent pas une loi normale, nous utiliserons des tests équivalents non-paramétriques (Mann- Whitney, Friedmann). Dans la littérature ainsi que selon nos précédentes publications, le nombre d’animaux requis pour obtenir des résultats significatifs au niveau histologique est de 5 animaux/groupe pour les groupes contrôle et de 15 animaux/groupe pour les groupes test. Étant donné que nos résultats dépendent de l’efficacité des implantations d’électrodes et de la qualité des images obtenues, de l’efficacité de l’apprentissage spatial et de la volonté des souris à explorer l’environnement, nous nous attendons à 50% de succès, pour l’approche histologique, soit un nombre total d’animaux de 10/groupe pour les groupes contrôles et de 30/groupe pour les groupes où une quantification histologique sera effectuée. Pour les études comportementales couplées à l’électrophysiologie, il est cependant préférable de disposer d’au moins 12 animaux/groupe. Pour améliorer l’utilisation des animaux, nous utiliserons des analyses basées sur des réseaux de neurones artificiels qui nécessitent 3 sous-groupes : pour entrainer le réseau de neurones, adapter les hyper- paramètres et pour obtenir les résultats. Il est donc nécessaire de disposer d’un nombre suffisant d’animaux pour chaque sous-groupe (le nombre minimum est de 4), mais la puissance des analyses en sera très fortement augmentée. De plus plusieurs hypothèses sur les modifications des réseaux de neurones pourront être testées sans avoir besoin de refaire des expériences sur de nouvelles souris. En plus des 50% de succès décrits précédemment d’autres facteurs limitant interviennent. L’implantation optimale des électrodes, le maintien de l’intégrité du connecteur et de la fenêtre crânienne diminuent le taux de succès des expériences comportementales de 30% supplémentaires. Les lots d'animaux expérimentaux à prévoir pour la tâche 2 comprendront donc 36 animaux/groupe.

Raffinement

Nos procédures seront optimisées afin de minimiser la douleur et la souffrance des animaux. Les chirurgies se feront en conformité avec la règlementation (anesthésie et analgésie appropriées). Le contact entre l’animal et l’expérimentateur sera facilité par une période d’habitation et de manipulation simple (2 expositions quotidiennes pendant 5 jours) permettant de réduire le stress de l’animal au contact de l’expérimentateur et donc la variabilité des résultats expérimentaux. Les animaux recevront un soin optimal après les chirurgies. Tout au long de leur hébergement, les animaux ont accès dans leur cage à des objets d’enrichissement (dôme, tubes). Le suivi par le personnel de l'animalerie est quotidien dans un contexte général et le suivi post-chirurgie est assuré par l'expérimentateur quotidiennement pendant une semaine avec relevé de signes potentiels de douleur et prise en charge analgésique si nécessaire.

Choix des espèces

Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour l’étude du comportement et de ses bases physiologiques, car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionnelle transposables aux humains. Le modèle souris est en particulier adapté aux études comportementales pour sa rapidité d’adaptation. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle nous avons le plus de données électrophysiologiques préexistantes et pour laquelle l’outil pharmacogénétique et les modèles génétiques sont les plus développés ce qui permettra de faire le lien avec les études existantes et réduire in fine le nombre d’animaux. Nous utiliserons des souris sauvages C57Bl/6. La procédure de fenêtre crânienne et de stéréotaxie nécessite d’utiliser des animaux dont la croissance de l’os du crâne est stabilisée. C’est pourquoi, en accord avec la littérature, nous choisirons un âge compris entre 8 et 10 semaines pour réaliser les implantations d’électrodes. Les enregistrements seront réalisés jusqu’à 4 mois après l’implantation.

112 souris, dont des invalidées pour le gène du récepteur au froid, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant quatre mois un régime riche en sucres et en gras destiné à provoquer prise de poids et dysfonction cardiaque, puis subissent tests d'effort sur tapis, échocardiographie sous anesthésie, tests de tolérance au glucose et à l'insuline et prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour analyser le cœur et des marqueurs inflammatoires. Le porteur indique n'avoir constaté aucun effet indésirable sur seize semaines, tout en attendant une prise de poids importante et un mauvais fonctionnement du cœur. Sur le remplacement, il affirme devoir prouver l'effet protecteur du récepteur dans une étude sur "organisme vivant", les travaux in vitro ayant seulement établi son potentiel.

Objectifs

Le diabète est en pleine expansion dans notre société. Or, le diabète entraine très souvent des complications cardiaques avec notamment l’apparition d’un mauvais fonctionnement du cœur, appelé cardiopathie diabétique, et pouvant mener à l’insuffisance cardiaque. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette dysfonction représente un challenge important pour les chercheurs et les cliniciens afin d’améliorer la qualité de vie des patients. Ce projet vise à comprendre le rôle du récepteur au froid dans l’apparition des complications cardiaques au cours d’un syndrome métabolique. En effet, nos derniers résultats ont montré un lien entre le métabolisme des graisses et le récepteur au froid. Nous avons pu montrer que lorsqu’on diminuait la quantité de récepteur au froid, cela induisait une augmentation des graisses insaturées. Nous pensons que le récepteur au froid pourrait jouer un rôle clé dans la modulation des complications cardiaques de la cardiomyopathie diabétique. Plus précisément nous nous attendons à une meilleure résistance des animaux invalidés au récepteur au froid dans l’apparition des complications cardiaques au cours du syndrome métabolique. La cardiopathie diabétique est la conséquence des altérations de structure et de fonction du tissu cardiaque survenant chez les diabétiques indépendamment des facteurs de risque. Nous allons utiliser un régime riche en sucres et en gras pour mimer cette pathologie, comparé à un régime contrôle. Les symptômes attendus sont une prise de poids importante, une fatigue accrue et un essoufflement plus important à l’effort. Des souris invalidées ou non pour le récepteur au froid seront soumises à un régime riche en sucres et en gras pendant 4 mois. Cette procédure permettra d’évaluer l’effet de l’absence du récepteur au froid sur la fonction contractile sous régime riche en sucres et en gras, par un test d’effort sur tapis de course, une échocardiographie sous anesthésie gazeuse, ainsi que sur le profil diabétique des souris par des tests de tolérance à l’insuline et au glucose et un test de signalisation à l’insuline. L'inflammation dans le sang et dans les tissus sera évaluée après mise à mort des animaux, en mesurant les taux sanguins de marqueurs inflammatoires et l’infiltration des cellules immunitaires (monocytes, neutrophiles et lymphocytes) dans le tissu cardiaque.

Bénéfices attendus

A moyen terme, ce projet nous permettra de comprendre le lien entre le métabolisme des graisses et le récepteur au froid dans la cardiomyopathie diabétique. A plus long terme, ce travail pourrait ainsi proposer l’utilisation des modulateurs pharmacologiques du métabolisme des graisses, ainsi que des substituts pharmacologiques du récepteur au froid, permettant de rétablir une contraction normale cardiaque chez les patients diabétiques.

Procédures

Le protocole dure au total 16 semaines. Toutes les 2 semaines un suivi du poids et de la glycémie sera effectuer sur les souris (prise de la glycémie ~1min). Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline seront effectués à 8 et 16 semaines (durée d’un test : 1h). Deux tests d’endurance seront également effectués à 16 semaines sur tapis de course, avec 5 jours d’intervalle (de repos) entre les deux tests (durée de chaque test : 1h maximum). Une échographie sera effectuée à 16 semaines sous anesthésie (durée anesthésie générale :30min) et un prélèvement de sang de 50uL sera réalisé à la fin de la 24ème semaine de régime (durée : 2mn).

Impact sur les animaux

Comme précisé dans le déroulé du projet, nous nous attendons, en réponse au régime riche en sucres et en gras, à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un dysfonctionnement cardiaque, raison de l’étude. Nous n’avons pas constaté d’effets indésirables sur les animaux sur la période considérée (16 semaines). Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) réalisés sous anesthésie générale.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire et cellulaire) des différents organes

Remplacement

Le récepteur au froid dont il est question dans ce projet a été étudié in-vitro depuis de nombreuses années. Ces études ont permis d’établir le potentiel de ce récepteur au froid comme cible thérapeutique. Nous devons désormais prouver que l’implication de ce canal dans la modulation du métabolisme lipidique a un effet protecteur au cours de la cardiomyopathie diabétique, dans une étude physiologique sur organisme vivant.

Réduction

Les effectifs ont été calculés au plus juste pour permettre l’obtention de résultats statistiquement exploitables. En outre, l’expérience et le recul de l’équipe concernant les régimes alimentaires utilisés et les examens prévus, permettent de prévoir un très faible taux de mortalité et d’échec. Par ailleurs, nous utiliserons les souris mâles et femelles pour optimiser les animaux issus de l’élevage. Ceci constitue en outre un effort de réduction à long terme, car les conclusions de ce projet permettront à l’avenir aux utilisateurs de cette lignée de clarifier l’effet du sexe sur la régulation du récepteur au froid au cours de la cardiopathie diabétique

Raffinement

Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisés sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis.

Choix des espèces

Les modèles pathologiques développés chez la souris de cardiopathie diabétique miment très bien les pathologies humaines et permettent l’étude des mécanismes d’intérêt par les modèles génétiquement modifiés (animaux invalidés pour le gène du récepteur au froid). De plus, au sein de notre laboratoire et dans la communauté scientifique, le fond génétique dont il est question dans ce projet est le plus utilisé pour les maladies cardiovasculaires, ce qui supporte notre choix (les animaux transgéniques utilisés dans ce projet ont d’ailleurs été développés sur ce fond génétique). Les animaux auront entre 6 et 8 semaines lors de la mise en place de la diète pour 4 mois, menant à un âge de 22-24 semaines à l'issue de la procédure. Le fait de réaliser des échographies sur des sujets jeunes va permettre de limiter l’intensité des cônes d’ombres dus aux côtes pendant les examens d’échocardiographie.

242 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles inhalent du styrène ou des isomères du xylène six heures par jour, cinq jours par semaine, pendant une à quatre semaines, et une partie subit une chirurgie du crâne pour implanter un système de contention à vis destiné à mesurer les mouvements oculaires, avant la mise à mort et le prélèvement des oreilles. Le porteur indique que les fortes concentrations peuvent déprimer le système nerveux et provoquer des effets narcotiques et des troubles de l'équilibre. Il présente l'étude comme la validation in vivo d'une toxicité déjà suggérée in vitro, en vue d'un éventuel test de criblage des polluants industriels.

Objectifs

Ce projet vise à étudier la potentielle toxicité de quatre solvants aromatiques présents dans l’industrie, le styrène et les trois isomères du xylène, sur l’organe périphérique de l’équilibre, le vestibule, situé dans l’oreille interne. Il s’agit également de comparer cette potentielle toxicité à celle décrite avec ces solvants sur la cochlée, organe périphérique de l’audition, également situé dans l’oreille interne.

Bénéfices attendus

La toxicité vestibulaire de certains solvants aromatiques a été suggérée précédemment par une étude in vitro. La présente étude permettra de valider (ou d’infirmer) ces informations grâce à une approche in vivo. Si les résultats in vivo confirment les résultats obtenus in vitro, alors ce test pourra potentiellement être proposé comme test de criblage afin d’identifier les polluants industriels susceptibles de perturber l’équilibre des salariés.

Procédures

Les animaux seront exposés par inhalation à différentes doses de styrène ou d’un des 3 isomères du xylène. Cette exposition durera entre une et quatre semaines, à raison de 6 heures / jour, 5 jours par semaine. Afin de déterminer les effets de ces différentes substances sur l’oreille interne, l’audition et l’équilibre des animaux seront testées avant exposition, à la fin de l’exposition puis 4 semaines après. L’audition sera estimée par la mesure des produits de distorsion, une méthode non invasive utilisée pour le dépistage des surdités chez les nouveaux nés. Chez le rat, elle nécessite une anesthésie médicamenteuse légère. L’équilibre sera estimé par des tests comportementaux et par la mesure de la persistance des saccades oculaires après rotation (nystagmus post-rotatoire). Cette dernière mesure demande une contention de la tête, qui nécessite l’implantation à demeure d’un système de contention (pas de vis). Cette chirurgie crânienne est réalisée, une seule fois, 4 semaines avant le début de l’exposition. Chez la moitié des animaux, un prélèvement sanguin à la queue sera réalisé sous anesthésie gazeuse en sortie d’exposition. Au terme des expérimentations, les animaux seront mis à mort et les oreilles prélevées pour observer les dommages causés par les expositions aux solvants.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront opérés afin de recevoir un dispositif de contention pour mesurer les mouvements oculaires. Afin d’éviter les douleurs post-chirurgicales, un antalgique morphinique sera délivré avant de réaliser l’anesthésie. Par ailleurs, il n’est pas exclu, que les animaux recevant une anesthésie par voie générale ou gazeuse, dans le but de réaliser des tests auditifs ou des prélèvements sanguins, ressentent du stress. Néanmoins, celui-ci devrait être mineur car les animaux sont habitués à être manipulés et les gestes sont opérés par du personnel qualifié. Les tests comportementaux, mais également la mise en rotation des animaux lors de la mesure des saccades oculaires, pourraient générer chez les animaux, pendant un court instant, un désagrément se traduisant par des troubles de l’équilibre. Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant 6 heures/jour, 5 jours par semaine durant 4 semaines. Ces concentrations élevées pourront avoir un effet dépresseur sur le système nerveux central et des troubles sensori-moteurs comme des effets narcotiques pourront alors être observés. Néanmoins, ces troubles ne devraient pas persister dans l’heure qui suit la sortie des chambres d’inhalation.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques.

Remplacement

La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études sur l’animal et par des approches épidémiologiques en entreprise. En revanche, les effets de ces substances sur le vestibule (récepteur de l’équilibre), qui se trouve également dans l’oreille interne, n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu'un modèle de culture de l’organe récepteur, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données in vitro doivent être confirmées par une étude in vivo avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces subtances sur cet organe. La présente étude se propose d’exposer des rates au styrène et aux différents isomères du xylène par inhalation. L’évaluation de la toxicité se fera par des mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui permettront de comparer de manière objective les effets toxiques sur la cochlée et sur le vestibule. Des analyses histologiques seront également réalisées post mortem. Cette étude évalue donc la fonction de deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être appliquées que sur des organismes vivants. D’autre part, pour modéliser la toxicité de ces agents chimiques chez l’Homme, il est nécessaire qu’ils soient métabolisés par des organismes vivants

Réduction

La démarche consiste à tester dans une première phase expérimentale (phase 1) les effets vestibulaires d’une forte concentration de styrène pendant une exposition courte (5 jours). Si celle-ci ne génère pas d’effet vestibulaire, une nouvelle exposition à la même concentration sera réalisée pendant 4 semaines (phase 2). Si aucune vestibulotoxicité n’est observée, la recherche de seuil d’effet (phase 3) ne sera bien évidemment pas réalisée, et les expérimentations seront stoppées. Dans le cas contraire, la phase expérimentale 3 sera menée en exposant les animaux à des concentrations de styrène plus faibles (la durée dépendra des résultats des phases 1 et 2). Enfin, la phase 4 s’attachera à évaluer la vestibulotoxicité de chacun des isomères du xylène (la durée de l’exposition dépendra une nouvelle fois des résultats des phases 1 et 2). Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures des saccades oculaires après rotation ne permettant pas les mesures des produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront prévus. Ainsi pour chaque solvant et concentration, 2 groupes expérimentaux seront prévus, l’un pour la mesure des saccades oculaires après rotation et l’autre pour les mesures de comportement suivies des mesures des produits de distorsion acoustique (idem pour les contrôles). Lors de chaque campagne, un maximum de conditions expérimentales seront testées simultanément afin de limiter le nombre de groupes contrôles associés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance (logiciel G-Power). Le résultat de ce calcul est de 10 animaux par groupe. 22 animaux surnuméraires (soit 10% de l’effectif prévu) seront nécessaires en cas de mortalités (anesthésie, perte de casques...). L’étude nécessitera au maximum 242 rates (dont les 22 surnuméraires). Ce nombre pourrait être réduit si les résultats des phases 1 et 2 sont négatifs.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les rates seront placées dans les conditions standard d’hébergement pour cette espèce (température, hygrométrie). Aucune expérimentation ne sera réalisée lors de la première semaine afin de laisser le temps aux rates de s’habituer à leur nouvel environnement. Par ailleurs, les rates, animaux nocturnes, seront placées en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h afin de réaliser les expérimentations pendant leur phase d’activité. Elles seront stabulées à 2 ou 3 par cage pour permettre les liens sociaux de s’établir. Les animaux seront habitués à être manipulés en amont des expérimentations. Les animaux soumis à une intervention chirurgicale recevront une médication adaptée à savoir une analgésie pré-opératoire avant de réaliser l’anesthésie et des anti-inflammatoires seront administrés en post-opératoire. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance ou une perte de poids trop importante nécessitant une prise de décision immédiate. Ils seront hébergés en cage individuelle pendant deux semaines afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose et leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton ou du « sizzle nest » pour constituer des nids. Pendant les phases d’exposition par inhalation aux solvants, les rates seront également surveillées toutes les deux heures afin de déceler d’éventuels signes cliniques traduisant un mal-être de l’animal qui nécessiterait d’isoler immédiatement l’animal. Des fiches de suivi seront renseignées à cet effet.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle recommandé pour les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l'Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne, comme chez l'Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l'audition et de l'équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Des femelles ont été choisies pour réaliser les expérimentations car celles-ci grossissent moins avec l’âge que les rats mâles et le dispositif pour enregistrer le mouvement oculaire après mise en rotation de l’animal ne permet pas de faire ces mesures sur des animaux de plus de 300 g. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l'âge adulte entre 16 et 18 semaines car l'oreille interne ainsi que les enzymes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie abdominale reproduisant une ischémie-reperfusion rénale, plusieurs anesthésies générales, des injections et des prélèvements sanguins, avant la mise à mort pour prélever organes et tissus. Le projet étudie une molécule censée limiter les lésions rénales lors d'une transplantation. Le porteur annonce des atteintes transitoires de la fonction rénale et une perte de poids, et affirme que seul un protocole in vivo reproduit la complexité de ces mécanismes.

Objectifs

La transplantation rénale est le traitement de choix de l’insuffisance rénale terminale. Lors d’une transplantation, les phénomènes liés à l’ischémie-reperfusion (séquence indissociable de la transplantation d’organes solides) sont à l’origine de lésions qui peuvent contribuer au dysfonctionnement et au rejet du greffon. L’ischémie correspond à la phase où l’organe est privé de la circulation sanguine et donc des apports en oxygène et en métabolites (tels que le glucose et le lactate). La reperfusion de l'organe se traduit par la reprise de la circulation sanguine et donc des apports en métabolites et oxygène. Il est nécessaire de développer des thérapies afin de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion, tels que les troubles métaboliques (notamment la dérégulation des voies du métabolisme énergétique dépendantes du glucose et du lactate), et donc d’améliorer la qualité du greffon. Des travaux récents ont montré qu’un traitement avec une molécule thérapeutique, ayant une action sur la régulation du métabolisme du lactate, a permis de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion et ainsi améliorer la qualité du greffon rénal. L’objectif de notre projet est de décrypter le mécanisme d’action, en lien avec le lactate et ses transporteurs, induit par le traitement thérapeutique. Nous proposons de réaliser cette étude dans un modèle d’ischémie reperfusion rénale chez la souris.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes cellulaires et tissulaires mis en jeu par un traitement avec une molécule protectrice des lésions l’ischémie-reperfusion. A plus long terme, ce projet nous permettra d’identifier de nouvelles voies et cibles thérapeutiques permettant de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion et donc d’améliorer notamment les taux de réussite en transplantation rénale. Ces résultats pourront être étendus à d’autres organes, tels que le foie, le cœur, le cerveau. Ces cibles thérapeutiques pourront ensuite être évaluées dans d’autres contextes pathologiques impliquant une ischémie/hypoxie, tels que l’infarctus, l’accident vasculaire ischémique ou la chirurgie vasculaire chez l’homme.

Procédures

Chez les animaux vigiles : 2 à 13 pesées par animal, acte d’une durée de 1 minute. 1 à 5 injections sous-cutanées d’antalgique par animal, acte d’une durée de 1 minute. 2 à 5 anesthésies générales par voie gazeuse par animal, avec : Sur animal sous anesthésie générale par voie gazeuse + anesthésie locale : 1 à 2 injections intraveineuses d’un traceur fluorescent et 1 à 2 poses et retraits d’un capteur cutané de fluorescence par animal, pour analyse de la fonction rénale, acte d’une durée de 2 fois 10 min. 2 prélèvements sanguins par voie intraveineuse par animal, acte d’une durée de moins de 1 minute et 1 injection sous-cutanée de sérum physiologique par animal, acte d’une durée de moins de 1 minute. 1 injection intraveineuse d’une molécule thérapeutique par animal, acte d’une durée de 1 minute. Et sur animal sous anesthésie générale par voie gazeuse + antalgie locale : 1 chirurgie abdominale par animal (au cours de laquelle sera réalisée l'ischémie-reperfusion) avec 2 injections d’anesthésique local par voie dermique, acte d’une durée de 1 heure.

Impact sur les animaux

L’acte de pesée et l’injection sous cutanée d’analgésique sur animal vigile pourront induire un léger stress très transitoire. Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un inconfort transitoire au réveil. Suite à la chirurgie et à l’ischémie/reperfusion rénale, les effets indésirables attendus sur les animaux sont : une atteinte partielle de la fonction rénale, une mobilité très légèrement réduite, ainsi qu’une légère perte de poids, ces effets indésirables seront transitoires et ne dureront pas plus de 72h après chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Des prélèvements d’organe et tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

L'étude de l'ischémie-reperfusion in vitro est limitée par l'absence de vascularisation des cellules en culture et l'impossibilité d'étudier les multiples conséquences qui impliquent des interactions entre les différents types cellulaires. A ce jour, il existe des modèles in silico ou in vitro permettant de recréer un rein, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire parfaitement la physiologie rénale notamment associée à une modulation du métabolisme d’un rein vascularisé. Seul un protocole in vivo peut reproduire la complexité des mécanismes physiologiques impliqués lors d’une séquence d’ischémie-reperfusion. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux, défini pour répondre aux objectifs du projet, est réduit au minimum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Il s’agit d’un nombre maximum d’animaux qui pourra être réduit; en effet certaines procédures ne seront pas réalisées selon les premiers résultats obtenus. Les tissus prélevés chez les animaux seront placés dans une banque d'organes/tissus murins afin de mutualiser les échantillons au sein du laboratoire.

Raffinement

Durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse. Pour ce faire, les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Les animaux feront l’objet d’un suivi de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement, cicatrisation) et des « actions » seront mises en place en cas de « problème(s) » observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Les prélèvements sanguins, les injections intraveineuses et les chirurgies seront réalisées en asepsie stricte sous anesthésie générale + anesthésie locale et/ou antalgie sur tapis chauffant, une prise en charge antalgique sera mise en place en post-chirurgie. Durant toute la procédure, les animaux seront manipulés par la même personne afin de diminuer leur stress (personnel compétent et expérimenté à l’expérimentation animale).

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion rénale chez la souris, est un modèle validé et adapté pour répondre aux objectifs du projet. 2) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. La procédure débutera chez des souris mâles âgées d'environ 11 semaines, puis la chirurgie sera réalisée chez des souris âgées d'environ 12 semaines, ce qui correspond à un âge adulte approprié pour l’expérimentation.