Recherche fondamentale

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intra-péritonéale d'un composé qui enflamme le péritoine et un prélèvement sanguin, avant d'être mises à mort pour prélever leurs organes et caractériser leur système immunitaire. Le projet répond à des prestations pour des laboratoires privés et publics qui veulent mesurer l'effet de modifications génétiques sur la réponse immunitaire. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune méthode substitutive ne placerait dans des conditions physiologiques similaires, le modèle devant selon lui être évalué à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact d’une inflammation sur le système immunitaire suite à la modification de gènes cibles. L’objectif de ce projet est d’évaluer la réponse immunitaire après l’induction d’une inflammation temporaire dans le péritoine de souris contrôles ou d’animaux génétiquement modifiés. Nous caractériserons les différentes populations du système immunitaire des organes de ces souris afin de déterminer l’impact de la modification génétique sur la réponse immunitaire suite à l’inflammation. Les cohortes de souris génétiquement modifiées que nous caractériserons seront produites indifféremment par notre animalerie ou des laboratoires partenaires extérieurs. Les animaux contrôles pourront quant à eux provenir également d’un fournisseur extérieur agréé. Le présent projet ne concerne que les étapes d’induction de l’inflammation et de caractérisation fonctionnelle des populations du système immunitaire après réception des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet est mis en oeuvre dans le cadre général de la validation de modèles animaux génétiquement modifiés pour des études précliniques in vivo. Il vise donc à évaluer de façon qualitative et quantitative la capacité d’un modèle murin à répondre à une inflammation.

Procédures

La procédure expérimentale consiste en l’injection unique d’un réactif provoquant l’inflammation du péritoine. Cette injection est rapide et dure moins d’une minute par animal. Le jour de la mise à mort des animaux pour l’étude du système immunitaire, un unique prélèvement sanguin est réalisé pour quantifier l’état inflammatoire des souris et pour la récolte du plasma sanguin. Le prélèvement sanguin sera réalisé dans le respect du bien-être animal et ne dure que 30 secondes. Les souris seront ensuite mises à mort pour le prélèvement des organes en vue de de la caractérisation des populations du système immunitaire.

Impact sur les animaux

L’induction de l’inflammation du péritoine par injection intra-péritonéale de composé inflammatoire engendre un phénotype modéré chez la souris pendant les premières 24H, se traduisant par un ralentissement de l’activité des animaux. Au-delà de ces premières 24H, un retour à la normale est observé avec une reprise d’activité des animaux. Pour les animaux génétiquement modifiés étudiés, la sévérité du phénotype est évaluée pendant toute la procédure et comparée à celle des animaux contrôles. La non reprise d’une activité normale à 24H entraînera une observation particulière, bi-journalière des animaux pour les 3 jours suivants selon une grille de score et des points limites préétablis. De plus, le prélèvement sanguin avant la mise à mort des animaux pourra engendrer un stress de courte durée. Tous les actes techniques seront réalisés par du personnel technique formé et expert dans le respect du bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’experience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle inflammatoire testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 5 animaux par génotype et par lot expérimental. Trois lots sont quantifiés et comparés, correspondants aux différents temps après induction de l’inflammation : soit 4 jours après inflammation, soit 1 jour après ou soit sans inflammation. Il faudra donc 30 souris au total par expérience (15 animaux par génotype) pour permettre une évaluation complète de l’ensemble du recrutement des populations myéloïdes suite à l’inflammation.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier, que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des injections et la surveillance journalière des animaux en expérimentation est assurée par du personnel de zootechnie formé et qualifié.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles. Nous avons en effet à notre disposition un grand nombre d'anticorps marqués par une grande variété de fluorochromes permettant un phénotype du système immunitaire à très haut contenu. Nous utiliserons des souris adultes uniquement, à partir de 8 semaines pour une analyse du système immunitaire mature. L’étude d’un système immunitaire en développement ou vieillissant ne fait pas l’objet de ce projet.

Chaque souris reçoit sous anesthésie une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, puis, une fois la tumeur développée, une injection intraveineuse de nanoparticules lipidiques porteuses d'un ARNm de luciférase, une injection de luciférine dans l'abdomen et une séance d'imagerie. Les 625 souris, dépourvues de thymus pour faciliter la prise des tumeurs, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont mises à mort après l'imagerie pour un prélèvement d'organes. L'équipe veut savoir si ses vecteurs concentrent les nanoparticules dans les tumeurs en limitant leur accumulation dans les autres tissus, et le porteur cite parmi les effets possibles des chocs anaphylactiques, des détresses cardio-respiratoires et la gêne due à la tumeur, mesurée deux fois par semaine. Il ne nomme pas les lignées tumorales et ne fixe aucun volume tumoral maximal.

Objectifs

Ce projet est centré sur l'adressage sélectif de nanoparticules lipidiques vectorisés (LNP-V) vers des tumeurs afin d’en améliorer leur diagnostic/traitement. L’imagerie par bioluminescence permet la détection et la quantification/accumulation in vivo de conjugués ou de cellules développées pour présenter une activité bioluminescente. L'objectif principal de ce projet est donc d’utiliser cette technique pour étudier les effets de l'utilisation de différents vecteurs sur la biodistribution et l'accumulation plus spécifique dans les tumeurs de LNP-V en limitant leur accumulation non spécifique dans les autres tissus. En effet un ARNm codant pour l'enzyme luciferase sera encapsulée dans les LNP-V et servira de read out de l'accumulation des différents LNP-V dans les tumeurs.

Bénéfices attendus

L'utilisation de nanoparticules lipidiques vectorisées (LNP-V) permets de protéger la molécule thérapeutique de la dégradation et de permettre une distribution plus spécifique. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos molécules constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Chaque souris sera implantée avec un modèle de cellules tumorales par une injection en sous cutanée sur le flanc de l’animal anesthésié. Après croissance tumorale, les souris recevront une injection par i.v. de nanoparticules lipidiques (LNP) vectorisées (V) contenant un ARNm codant pour la luciférase (protéine émettant de la lumière en présence de son substrat la luciférine), en solution isotonique stérile, sous anesthésie gazeuse. Vingt-quatre heures après, pour induire la bioluminescence, une injection intrapéritonéale de luciférine sera réalisée sous anesthésie, juste avant l’imagerie. Les imageries bioluminescentes dureront environ 10-15min et les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant la totalité de l'acquisition.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en sous-cutanées (réalisé une seule fois) sous anesthésie, les injections en i.v. des molécules (réalisé une fois) et en i.p du susbtrat Luciferine (réalisé une fois) sous anesthesie, ainsi que le développement de la tumeur primaire chez l’animal en tant que pathologie. Ce developpement de la tumeur en sous cutanée peut entrainer une gène physique, avec de possibles grattages et demangeaisons. Les animaux seront soumis à la mesure bi-hebdomadaire des volumes tumoraux. La pousse de la tumeur peut eventuellement entrainer chez l'animal une gêne physique au déplacement ou à la toilette par exemple. Les LNP-V peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des troubles comportementaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure d'imagerie les animaux seront mis à mort et certains organes seront prelevés afin de valider ex vivo la biodistribtuion des LNP-V.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos LNP-V ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice. L'utilisation de rongeurs (ici, n= 125 souris/an) impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations et cahier des charges.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le nombre total de souris pour cette étude s'élève à 625 souris. Il tient compte du suivi des modèles expérimentaux développés dans le projet et de la variabilité de développement des tumeurs qu’il peut exister dans les différents modèles. L’optimisation de nos vecteurs in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure. Le nombre total d’animaux répartis sur des études necessitants 25 souris chacune sera de 625 souris décomposé en 5 études de 25 individus/an sur 5 ans. Ce nombre sera suffisant pour appréhender la détection et l'accumulation de nos molécules dans les tumeurs. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Ce nombre d'animaux pour ces procédures nécessaire à l'obtention d'une significativité statistique a été défini en déterminant le test statistique et l'effet biologique et la dispersion escomptés.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal, appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien, personne dument qualifiée, pour exercer dans le respect des 3R. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Dès leur arrivées les souris sont placées dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et alternance d'enrichissement, dômes, tubes, fibres pour faire des nids. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en experimentation animale) réalisera les injections des cellules tumorales qui se feront sous anesthésie gazeuse (Sévoflurane). Une observation bi-hebdomadaire des animaux par les expérimentateurs (poids, douleurs/souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs, en plus de leur observation quaotidienne par les animaliers. Toute perte de poids, signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthesie ou au cours du developpement tumoral constituera un point limite. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs de deux fournisseurs extérieurs.

Choix des espèces

- Facilité d'utilisation en général, espèce athymique (sans thymus) comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de lignées cancéreuses, c’est à dire des souris athymiques « jeunes adultes » âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection du candidat imagerie) en fonction de la taille des tumeurs.

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, des séances d'irradiation localisée et des injections répétées d'immunothérapie, avant leur mise à mort pour analyser les tumeurs, afin d'étudier l'association d'une radiothérapie à faible dose et d'une immunothérapie. Le porteur renvoie au conditionnel d'éventuels bénéfices pour les patients réfractaires à l'immunothérapie. Il présente cette association comme une "source d'espoirs" contre les cancers métastatiques.

Objectifs

Il y a trois objetifs. 1) Evaluer l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie délivrée à faible dose en combinaison avec une immunothérapie en utilisant un modèle préclinique de lignée tumorale murine greffée chez des souris immunocompétentes. 2) Etudier les mécanismes par lesquels la radiothérapie à faible-dose est capable d'induire une réponse immunitaire anti-tumorale potentialisée par l'immunothérapie et ainsi expliquer l'effet synergique du traitement associant radiothérapie à faible dose et immunothérapie. 3) Déterminer le rôle des macrophages dans l'efficacité de la combinaison thérapeutique associant radiothérapie faible dose et immunothérapie.

Bénéfices attendus

Malgré une amélioration sans précédent du pronostic de nombreux cancers grace à l'immunothérapie, de trop nombreux patients présentent une réponse insuffisante à ces nouvelles thérapies. L'optimisation et la compréhension des traitements combinés associant une radiothérapie à faible dose et une immunothérapie pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie et présentant un cancer à un stade avancé inaccessible à une radiothérapie standard qui serait trop toxique pour les organes et tissus sains adjacents. Dans ce cadre, la mise au point du meilleur schéma de radiothérapie faible dose à utiliser en combinaison à l'immunothérapie, ainsi que la compréhension des mécanismes à l'origine de l'efficacité d'une telle association doivent être recherchés sur modèle animal préclinique avant une transposition au patient.

Procédures

Irradiation sur la tumeur uniquement : 1 à 2 séances d'environ 1 minute chacune. Injections sous-cutanées de cellules tumorales: 1 seule injection, 1 minute. Injections intra-péritonéales d'immunothérapie ou d'IgG contrôle : 1 injection d'une minute tous les 3 jours pendant un total de 9 jours, soit 4 injections au total. Injections intra-tumorales : 1 minute, 1 injection unique/souris

Impact sur les animaux

Ils sont liées aux injections en intrapéritonéales ou sous-cutanées sous anesthésie locale, aux injection intra-tumorales après anesthésie gazeuse et aux séances d'irradiations localisées. Les séances d'irradiation seront effectuées sur la tumeur uniquement grâce à des caches adaptés, le risque de dommages aux tissus et organes sains adjacents est donc très limité. Aucun effet indésirable de ces irradiations localisées n'est donc à prévoir.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses de laboratoire sur les tumeurs prélevées.

Remplacement

Le cancer est aujourd’hui la 1ère cause de décès chez l’homme et la 2ème chez la femme en France. Malgré la révolution thérapeutique que constitue l’immunothérapie, seul un nombre limité de patients présente une réponse tumorale significative aux inhibiteurs de checkpoints immunitaires utilisés seuls. Un nombre croissant de données suggère que de faibles doses de radiothérapie délivrées sur la tumeur pourraient augmenter la réponse anti-tumorale induite par l’immunothérapie, le tout avec un excellent profil de tolérance. La compréhension des mécanismes soutenant cette stratégie d’association est source d’espoirs pour de nombreux patients atteints de cancers métastatiques présentant une réponse insuffisante à l’immunothérapie et un pronostic réservé. Le recours à un modèle animal est nécessaire car les interactions entre radiothérapie, immunothérapie, tumeur et système immunitaire de l'hôte font appel à des processus cellulaires et moléculaires complexes impossibles à reproduire de façon fiable sur des modèles alternatifs. De plus, l’étude de l’efficacité de l’association entre radiothérapie à faible dose et immunothérapie sur une tumeur constituée ne peut se vérifier que sur un modèle in-vivo.

Réduction

Nous allons tester plusieurs schémas d’irradiation à faible dose délivrés en 1 ou 2 séances, associés ou non à une immunothérapie anti PD-L1. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaire, nous avons réalisé une analyse statistique à priori à l’aide du logiciel GPower, version 3.1. Afin de calculer le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives, nous avons choisi le test ANOVA avec les paramètres suivants : effect size f = 0.25 ; puissance = 0.9 ; risque d’erreur α = 0.05. En considérant un total de 48 lots, nous avons besoin de 25 souris par lot, soit 1200 souris au total : 1) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 1 fraction associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée). 2) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 2 fractions associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle) 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul) 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée) 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée). 3) Influence des macrophages sur l'efficacité de la combinaison thérapeutique associant radiothérapie faible dose et anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec anti PD-L1 + injection intra-tumorale de PBS, 1 lot non-irradié avec anti PD-L1 et injection intra-tumorale de clodronate, 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée) + injection intra-tumorale de PBS, 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée) + injection intra-tumorale de clodronate. Dans le but d’utiliser le moins d’animaux possible, une analyse statistique a été effectuée a priori. Celle-ci a estimé le nombre de souris nécessaire à 1200.

Raffinement

Des stratégies d’expérimentation et d’observation visant à réduire au minimum la souffrance des animaux ont été instaurées. Dans ce cadre, les administrations d’immunothérapie s’effectueront sous anesthésie locale pour réduire le risque de stress et de douleur. L'administration intra-tumorale de clodronate sera effectuée après anesthésie gazeuse à l'isoflurane 3%. Par ailleurs, les souris seront hébergées en groupe, avec nourriture et eau ad libitum, ainsi qu’un environnement enrichi en coton et nids en carton pour respecter leur bien-être. Une surveillance du poids et du volume tumoral sera effectuée régulièrement. Le respect des points limites et d’un volume tumoral limite seront strictement observés.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, utilisée dans la quasi-totalité des études dans ce domaine. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues, ce qui facilite le transfert en clinique des résultats acquis lors des expérimentations précliniques dans cette espèce. Les animaux seront utilisés entre l’âge de 8 et 10 semaines bien après sevrage, âge à partir duquel les souris peuvent supporter les rayonnements ionisants.

750 esturgeons européens juvéniles vont être utilisés, maintenus vivants puis relâchés en milieu naturel, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issus de reproduction en bassin, ils sont capturés puis opérés sous anesthésie pour l'implantation chirurgicale d'un émetteur acoustique, afin de suivre par télémétrie leurs déplacements en vue d'une réintroduction de l'espèce. Le porteur situe les bénéfices sur le "long terme", pour la faisabilité de cette réintroduction. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au suivi télémétrique et qu'il est nécessaire de doter chaque individu d'un émetteur.

Objectifs

L'objectif principal de l'étude est de mieux comprendre les fonctionnalités des zones estuariennes et des deltas pour la réintroduction de l'esturgeon européen (Acipenser sturio). Selon les lignes de l'UICN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature) pour les translocations de conservation, une analyse de la qualité de l'habitat et de son utilisation par l’espèce est obligatoire avant que la réintroduction ne puisse commencer. Pour étudier les mouvements de juvéniles d'esturgeons européens marqués, un réseau de suivi des esturgeons comprenant 70 récepteurs a été mis en place. Des recherches télémétriques dans ces zones permettront d'observer la distribution, les voies de migration, et d'identifier les zones d'alimentation et de repos des esturgeons juvéniles.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de cette étude est de renforcer l'évaluation de la faisabilité d'une future réintroduction de l’esturgeon européen dans un bassin versant. Par ce lâcher expérimental et ce suivi individuel à grande échelle par télémétrie, nous visons à identifier les possibilités et les problèmes potentiels pour les juvéniles d'esturgeons européens.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. L'anesthésie ne durera que quelques minutes. Au préalable les animaux sont soumis à une capture dans des bassins d'élevage.

Impact sur les animaux

Les esturgeons juvéniles seront marqués avec de petits émetteurs acoustiques. Ces émetteurs respectent le ratio de 2% du poids du poisson, n'entrainant aucune perturbation dans le comportement. Au fur et à mesure que le poisson grandit, le poids de ce petit émetteur interne sera de moins en moins perceptible par le poisson. Le comportement des individus une fois remis à l'eau pourra être perturbé par le stress du transport de longue durée, et les changements d'eau. L'impact des captures dans les bassins est minime puisque la capture se fait avec l'aide d'un plongeur professionnel qui va chercher les poissons délicatement. La chirurgie est réalisée par du personnel formé, et est faite sous anesthésie en limitant au maximum le stress des poissons.

Devenir

Tous les animaux marqués seront conservés vivants, et relâchés dans le milieu naturel, tel que prévu dans le cadre du Plan National d'Actions pour la sauvegarde de l'esturgeon européen 2020-2029, et plus spécifiquement son volet en lien avec la coopération internationale.

Remplacement

L'esturgeon européen était autrefois naturellement présent sur le bassin concerné. L'espèce est révélatrice d'un système fluvial amélioré en ce qui concerne la qualité de l'habitat et la migration. En raison de la quasi-absence d'esturgeons européens dans le système étudié, les esturgeons issus de ces lâchers expérimentaux fourniront un aperçu du comportement migratoire local, annuel et saisonnier et des zones d'utilisation de l'habitat par l’espèce. A cette fin, une utilisation spécifique est faite du suivi télémétrique des individus dans ce milieu. Il n'y a pas d'alternative disponible pour cela. Il est nécessaire de doter ces individus d'un émetteur ; il s'agit donc d'une expérimentation animale pour laquelle l’espèce-cible ne peut être remplacée.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser ne peut pas être déterminé par des modèles ou des méthodes statistiques existants, car l'étude est menée dans un environnement non contrôlé. Le nombre d'animaux est choisi sur la base de l'expérience pratique et des résultats de la littérature, notamment en termes de mortalités attendues. Les expérimentations précédentes mettent en avant un nombre trés faible de mortalités après lâchers en milieu naturel. L'esturgeon européen est une espèce protégée, il est important de réduire au maximum le nombre d'individus utilisés. 750 individus permettront d'avoir des retours intéressants et permettant de conclure sur les capacités de migration. Le nombre a été établi en lien avec des études précédentes réalisées sur d'autres territoires, et en lien avec la multiplication des connections et des voix de migration. Les reproductions assistées sont complexes à mettre en oeuvre, et le nombre d'individus disponibles ne peut être supérieur en l'état actuel du succès des reproductions assistées.

Raffinement

Basé sur des recherches antérieures, la télémétrie est la méthode de suivi la plus appropriée pour mieux comprendre les routes de migration et les zones d'alimentation et de croissance des espèces en milieu naturel. En ce qui concerne l'animal, on veillera lors de l'implantation chirurgicale de l'émetteur à ce que les poissons aient des poids (ou tailles) minimales afin de respecter le ratio convenu des 2% pour limiter au mieux les problèmes de flottabilité, les biais de comportement et les risques de surmortalités. Le protocole a été établi sur la base des rapports de la littérature et de l'expérience pratique, et garantit que le risque d'altération du bien-être de l’animal dû à l'émetteur implanté est minime. Afin de limiter le stress chez les animaux et de favoriser leur récupération physiologique, les animaux seront marqués à la station d'élevage en France. Avant l'insertion de la marque, les animaux seront placés en phase d'anesthésie profonde (dose chirurgicale). Les animaux seront ensuite observés quotidiennement durant 4 semaines pendant leur récupération.

Choix des espèces

Il s'agit d'une étude d'évaluation de faisabilité pour la réintroduction de l'esturgeon européen dans le delta et estuaire des rivières concernées. C'est pourquoi cette étude est dédiée à cette espèce. Les animaux impliqués dans le projet seront des juvéniles âgés de 6 à 12 mois, issus de reproductions assistées en bassin. L'âge exact des individus sera défini en fonction de leur taux de croissance sur le site d'élevage. Il faudra qu'ils fassent a minima 100g pour pouvoir être marqués avec les marquées définies. A ce stade, les esturgeons européens se déplacent normalement en eau douce et en eau saumâtre ; pourtant, d'autres individus de cet âge sont déjà tolérants au sel et se déplaceront vers la mer. Les questions de recherche tiennent compte des déplacements de ces poissons dans la zone d’étude : a) La disponibilité de zones d'eau saumâtre dans le port, pour l'acclimatation des poissons. b) La disponibilité des aires d'alimentation dans la zone d'étude

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales avec injection de virus et pose d'une fenêtre crânienne pouvant durer deux heures, une restriction d'eau et de nourriture et une contention de la tête, pour étudier la mobilité de récepteurs au glutamate dans la plasticité des synapses. Les objectifs restent une meilleure compréhension du fonctionnement des synapses, sans application annoncée. Le porteur affirme qu'il est nécessaire de passer par des animaux vivants pour observer le cerveau en fonctionnement.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier le rôle de la mobilité et de la nano-organisation des récepteurs à glutamate hétérotétramère formé de quatre sous-unités dans la physiologie des synapses, les fonction cérébrales et le comportement. Dans ce but nous utiliserons des outils moléculaires et génétiques qui permettent d'induire l'immobilisation de récepteurs à glutamate contenant les sous-unités A2 ou A1 . Précédemment, nous avons démontré que la diffusion de surface de ces recepteurs est impliquée dans la régulation de la potentialisation synaptique à long terme et de la mémoire dépendante de l'hippocampe. Nous voulons étudier ce phénomène plus précisément et premièrement, examiner l'implication de la diffusion latérale des AMPAR dans différentes formes de plasticité synaptique comprenant non seulement la plasticité synaptique à long terme mais aussi la plasticité synaptique à court terme, dans différentes régions du cerveau. Deuxièmement, nous voulons également identifier d’autres acteurs moléculaires, répertoriés comme protéines auxiliaires de ces récepteurs, impliqués dans la régulation de leurs mobilités et pouvant modifier la plasticité synaptique. Troisièmement, nous voulons étudier les processus physiologiques qui agissent sur la mobilité de ces derniers pour réguler la plasticité synaptique. Enfin, nous voulons rechercher des paradigmes comportementaux qui sont régulés par la mobilité des recpetuerus à glutamate in vivo.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons découvrir le rôle et la régulation de la mobilité de surface des AMPAR dans la plasticité synaptique et la fonction cérébrale, ce qui contribuera à une meilleure compréhension de la manière dont la transmission synaptique est régulée dans le cerveau. Grâce à l'approche expérimentale conçue, nous voulons découvrir comment les effets de la mobilité de la surface des AMPAR sur la plasticité synaptique sont régulés dans le tissu cérébral intact et in vivo. De manière générale, cela nous permettra de mieux comprendre la fonction des synapses dans le cerveau.

Procédures

Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 10 et 20 min - procédure chirurgicale avec implantation fenêtre crânienne : entre 1 et 2H- régime avec contrôle de la consommation hydrique et alimentaire

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 2/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte 3/Risque de perte de poids qui ne depassera pas 10% du poids initial de l'animal

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Le concept de l’importance de la mobilité des récepteurs dans les phénomènes de plasticité synaptique a été identifié par notre équipe avec des approches in vitro de culture de neurones de souris de type sauvage comme de neurones de nos lignées transgéniques. Pour vérifier ce concept dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement.

Réduction

La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du systéme nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.

310 lézards des murailles vont être utilisés, maintenus vivants puis relâchés sur leur lieu de capture, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Adultes capturés dans la nature et juvéniles nés en captivité sont marqués individuellement, transportés et hébergés en vivariums, certains déplacés entre un site d'altitude et un site de plaine, pour mesurer les effets des températures nocturnes sur cette espèce à sang froid. Le porteur situe les retombées pour la biologie de la conservation sur le "long terme". Il affirme ne pas pouvoir remplacer ce modèle par un modèle non vivant pour étudier une réponse au changement climatique en milieu naturel.

Objectifs

Ce projet vise à mesurer les effets de la température sur l'ensemble des traits observables d'un organisme à sang froid (ectotherme), en l'occurrence sur le lézard des murailles, adultes (1) et leurs progénitures (2) dans un contexte de réchauffement climatique. Le lézard des murailles est une espèce circumméditerranéenne opportuniste et thermophile, qui remonte en altitude à la faveur du réchauffement climatique. Espèce très opportuniste, il est communément observé dans la majorité de l’Europe et occasionnellement colonise les montagnes jusqu’à 2400m d’altitude, milieux pauvres en oxygène. Au cours des dernières décennies, les températures nocturnes ont joué un rôle insoupçonné dans le réchauffement global de la planète. Il s’avère que les modèles climatiques futurs prédisent une augmentation moyenne supérieure pour les températures minimales (donc nocturnes). De nombreuses études ont été réalisées sur les plantes et les insectes (souvent ravageurs), révélant des réponses physiologiques changées, rendement photosynthétique accru, renouvellement des générations plus court, croissance plus forte, initiées par le contexte actuel du réchauffement climatique et de l’agronomie. En revanche très peu d’études ont cherché à comprendre l’impact des températures nocturnes sur les reptiles et les vertébrés ectothermes en général. Une seule étude réalisée sur le lézard vivipare a vu le jour, et ses résultats préliminaires mettent en avant des effets significatifs des températures nocturnes plus élevées sur la physiologie de l’espèce à court terme.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour but de mieux comprendre l’impact d’une hausse des températures nocturnes sur la physiologie des ectothermes. Elle permettra sur le long terme de fournir des données qui seront utiles pour mieux comprendre les adaptations à un nouvel environnement et la résilience de l’espèce face aux changements climatiques. Ces études permettront d'alimenter les connaissances sur la recherche fondamentale et celles liées à la biologie de la conservation des ectothermes. Notre projet scientifique s’inscrit dans une volonté de compréhension des effets locaux du changement climatique sur la biodiversité, essentielle à l’orientation des politiques environnementales et de gestion des espaces naturels. Nous travaillons en collaboration avec une association de protection et de valorisation de la nature à l’échelle régionale. Le projet permet également le suivi des populations de lézard des Pyrénées et lézard des Murailles qui sont de par leur mouvement indicateur du réchauffement climatique. Ces partenariats avec les associations de protection de la nature permettront d’assurer la continuité entre la recherche et les gestionnaires de la biodiversité, qui est très importante pour la sauvegarde de la biodiversité.

Procédures

Le nombre total de lézards dans ce projet est de 310 individus, comprenant : 210 adultes capturés en milieu naturel divisés en 3 lots; 90 mâles adultes (Lot n°1) + 90 femelles (Lot n°3) provenant de populations de basses altitudes et 30 mâles adultes (Lot n°2) provenant de populations de hautes altitudes et enfin + 100 juvéniles nés en captivité (Lot n°4). Les animaux adultes seront capturés et marqués individuellement (

Impact sur les animaux

Tout sera mis en œuvre afin de réduire le stress des animaux lié au transport (sac en toile dans une boite isolée, Les convoyeurs/expérimentateurs ont été formé le 04 et 05 novembre 2021 au transport d'animaux sauvages par CAPAFORMA (‘Centre de formation professionnelle de la faune sauvage et domestique’) et ont également été formé au maintien d'animaux en captivité (FORMATION A L'UTILISATION D'ANIMAUX DE LA FAUNE SAUVAGE NON HEBERGEE A FINS SCIENTIFIQUES). Les conditions de captivité offrent les éléments nécessaires à la diminution du stress des animaux (cachettes, photopériode de saisons, lampes chauffantes). La santé des animaux est étroitement surveillée en captivité (1 passage par jour, le matin, par des personnes étant formées au niveau concepteur en FORMATION A L'UTILISATION D'ANIMAUX DE LA FAUNE SAUVAGE NON HEBERGEE A FINS SCIENTIFIQUES), en utilisant à la fois des observations qualitatives (vérification de l'activité des animaux) et des mesures quantitatives (suivi de la masse corporelle tous les 15 jours). Si des comportements particuliers sont observés sur plus de 48H (points limite : prostration, refus de s'alimenter, mutilation, mue fréquente, régurgitation, tentative de fuite), le ou les individu(s) sera (seront) isolé(s) temporairement de la population dans un vivarium opaque et une attention particulière lui (leur) sera portée: consistant en des contrôles visuels plus fréquents, relâché précoce en milieu naturel une fois la vérification vétérinaire réalisée.

Devenir

Les animaux sont relâchés en milieu naturel, sur leur lieu de capture, quand les conditions climatiques seront optimums (autour de 20°C sans pluie)

Remplacement

Notre objectif étant d’étudier la réponse d’un ectotherme face au changement climatique dans son milieu naturel, nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle non vivant. Les connaissances empiriques relatives à ces espèces ne peuvent être remplacées par d’autres types de connaissances, ni obtenues par d’autres moyens d’acquisition de connaissances car très peu d'études ont été faite sur ce sujet. L'approche expérimentale est nécessaire pour définir les paramètres éco-physiologiques des populations qui permettront la création de modèles mathématiques.

Réduction

Les effectifs d'animaux utilisés ont été définis comme le nombre minimal, découlant de projets passés, afin de permettre d'obtenir des analyses statistiques représentatives afin que les résultats soient publiables et utilisables par la communauté scientifique. Ces effectifs ont été soigneusement affinés dans un triple but, afin de minimiser l'impact sur les populations, assurer une robustesse statistique, et enfin pour des raisons de simple logistique (capacité des locaux, personnels et matériels). Pour limiter l’impact sur les populations locales, les individus seront prélevés dans différentes populations (< 30 individus par population) et tous les animaux seront relâchés à la fin des expérimentations.

Raffinement

Dans un but de raffinement, ces animaux seront maintenus dans des conditions de captivité optimales respectant la réglementation européenne ainsi que leurs exigences biologiques (maintien en captivité dans des vivariums individuels adaptés à l’espèce (30/26 cm (h) x 50/38 cm (L) x 40/23 cm (l)), gradient de température permettant une thermorégulation active, température des pièces contrôlées, litière et abris, mise à disposition d'eau et de nourriture en illimité. Le substrat en copeaux de bois permet aux animaux de creuser, se cacher et surtout de rechercher les nourritures de façon active. Quant au point chaud du vivarium, l'intermittence des lampes mime le passage de nuages et incite les animaux à exprimer un comportement de thermorégulation naturel, une lampe chauffante de 28 watts permettant une thermorégulation libre le jour, créant un point chaud à environ 35°C et un point froid à 18-24°C. L’apport d’UV est important à l’espèce lors de toute période de captivité. L’apport d’UV sera donc implémenté par l'utilisation de lampes dédiées UVB. Le personnel compétent veillera à ce qu’un passage journalier soit effectué afin de vérifier les conditions de captivité des animaux et de mettre en place des protocoles adaptatifs lorsqu'il est nécessaire. Nous appliquerons le principe de précaution, c’est-à-dire que toute manipulation se fera en limitant un maximum le stress, la douleur et l’angoisse des animaux. Les animaux seront maintenus dans des conditions de captivité proches de leurs exigences écologiques. La description de plusieurs points limites (perte de la queue, comportement de fuite, refus de s'alimenter, mues excessives, régurgitation par exemple) permettra de rester vigilant au regard des conditions de captivité des animaux. La photopériode sera de 12h de lumière et 12h d’obscurité. La pièce expérimentale est maintenue à 20-22°C durant les expériences, n'induisant pas de forte différence thermique avec le terrarium de captivité. Des personnels titulaires du certificat de capacité pour l'élevage des lézards sont présent sur le site pour superviser les élevages.

Choix des espèces

Au cours des dernières décennies, la hausse des températures nocturnes a joué un rôle disproportionné dans le réchauffement global de la planète. C’est un phénomène négligé dans les études faites sur la biologie des populations naturelles. Chez les ectothermes (98% des animaux), les performances physiologiques sont influencées par les conditions thermiques environnantes, une augmentation de la température nocturne de seulement 2°C est suffisante pour induire une augmentation exponentielle des dépenses métaboliques. Des nuits plus chaudes peuvent élargir la gamme thermique de ces espèces et ouvrir de nouvelles opportunités pour des activités prolongées et améliorer l'efficacité de la recherche de nourriture. Cependant, une activité accrue peut également avoir des effets délétères sur l'équilibre énergétique si l'exposition à des nuits plus chaudes réduit les périodes de repos et augmente la consommation d’énergie au repos. Cette augmentation du taux métabolique au repos, auquel l’animal ne peut échapper, peut entrainer de forts changements sur les organismes ectothermes, il est important d’en étudier ces conséquences afin d’évaluer le potentiel de résilience des populations face aux futures conditions environnementales. Afin de limiter notre impact sur la population de capture, nous ne prélèverons que des adultes, dont des femelles gestantes afin de récupérer les œufs post ponte et travailler sur les impacts des températures nocturnes sur le développement des juvéniles. Après la ponte, les œufs seront maintenus en incubation. Des tests de performances physiques, de préférence thermique et de l’activité du métabolisme respiratoire de repos des juvéniles seront réalisés. A l'issue des expériences, tous les individus (adultes et juvéniles) seront relâchés sur leur site de capture ou sur celui de leur mère. Il est à souligner que l’incubation d’œufs de lézard en captivité est bien plus efficace que dans la nature – les taux de survie des œufs et des jeunes sont beaucoup plus élevés, car sont retirés les aléas liés au climat (chaleur, froid, dessiccation ou moisissure) et à la prédation. L’ensemble des animaux étant relâchés à la fin de l’expérimentation, cela permet de limiter largement l’impact général de l’étude sur les effectifs naturels.

1780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales avec injections stéréotaxiques et pose de fibres optiques ou de lentilles, une restriction d'eau pouvant leur faire perdre jusqu'à 20 % de leur poids sur quatre semaines et un isolement pouvant durer deux mois, pour étudier des circuits neuronaux de l'apprentissage olfactif. Les retombées thérapeutiques évoquées contre les maladies neurodégénératives restent lointaines. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo.

Objectifs

Ces dernières années, de nombreuses études ont mis en évidence l’existence d’un phénomène de production de nouveaux neurones dans le cerveau adulte, dont la déficience semble être liée à des maladies neurodégénératives ou à certaines formes de dépression. De plus, il a été mis en évidence que ces cellules étaient impliquées dans des phénomènes d’apprentissage et de mémoire. Ces découvertes ont suscité un grand espoir dans la communauté biomédicale, celui de pouvoir un jour développer des thérapies basées sur cette capacité du cerveau à produire de nouveaux neurones fonctionnels à tout âge. En particulier, le bulbe olfactif, premier relai central du système olfactif et le gyrus denté de l’hippocampe sont des structures où la neurogenèse à l’âge adulte peut être identifiée dans les conditions constitutives du cerveau sain chez la plupart des mammifères. En conséquence, parmi tous les systèmes sensoriels, le système olfactif se distingue par sa grande plasticité, comprenant entre autres la capacité de renouvellement de ses constituants cellulaires, et ceci y compris à l’âge adulte. Chez les rongeurs, des dizaines de milliers de nouveaux neurones sont intégrés chaque jour dans le bulbe olfactif. Ces cellules sont générées à partir d’une région précise, la Zone Sous Ventriculaire, puis acheminées vers le bulbe olfactif par un Courant de Migration Rostral, pour se connecter avec les circuits bulbaires. De nombreuses études ont décrit les modalités de transmission du message olfactif de l’épithélium olfactif au cerveau, permettant notamment l’établissement d’une mémoire olfactive par l’apprentissage d’une odeur, souvent associée à un autre stimulus sensoriel de contexte pouvant lui-même posséder une valeur émotionnelle. Ainsi, une fois une odeur associée à une situation, une nouvelle rencontre avec celle-ci pourrait raviver les souvenirs inscrits dans les circuits neuronaux et permettre de reconnaître ce même contexte. Nous cherchons donc à déterminer pourquoi les neurones générés chez l’adulte dans le bulbe olfactif jouent un rôle si particulier dans l’apprentissage olfactif et comment ils permettent de modifier la perception ultérieure d’une odeur déjà rencontrée.

Bénéfices attendus

De nombreuses études expérimentales ont étudié les modalités de transmission du message olfactif de l’épithélium olfactif au cerveau, permettant notamment l’établissement d’une mémoire olfactive par l’apprentissage d’une odeur, le plus souvent associée à un autre stimulus sensoriel de contexte pouvant lui-même posséder une valeur émotionnelle. Ainsi, une fois une odeur associée à une situation, une nouvelle rencontre avec celle-ci pourrait raviver les souvenirs inscrits dans les circuits neuronaux et permettre de reconnaître ce même contexte. Dans notre équipe de recherche, nous nous intéressons à un aspect particulièrement inexploré de ces mécanismes : Pourquoi les neurones générés chez l’adulte dans le bulbe olfactif jouent-ils un rôle si particulier dans l’apprentissage olfactif et comment permettent-ils de modifier la perception ultérieure d’une odeur déjà rencontrée ? Pour cela, nous souhaitons étudier une sous-population de neurones inhibiteurs du cortex olfactif innervant les neurones nouvellement générés du bulbe olfactif et leur potentielle modification à la suite d’un apprentissage associatif. En effet, un contrôle à distance de l’activité des nouveaux neurones pourrait être le substrat permettant de définir une nouvelle forme de perception subjective, propre à chaque individu et découlant des expériences personnelles antérieures de chacun. Finalement, une meilleure connaissance des mécanismes de neurogenèse adulte pourrait alors permettre dans le futur la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrôler cette production neuronale, dans le but de restaurer les fonctions cérébrales de patients accidentés ou atteints de maladies neurodégénératives ou psychiatriques. Dans le domaine complexe des neurosciences modernes, un défi majeur des chercheurs est alors de comprendre précisément les mécanismes qui assurent l’intégration fonctionnelle de ces nouvelles cellules dans un réseau neuronal actif, et de déterminer les conséquences physiologiques de cette production neuronale permanente.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales (injections stéréotaxiques, implantations de fibres optiques ou de lentilles à visée micro-endoscopiques dans le cerveau). Ces interventions ne durent pas plus de 2hs et chaque animal sera soumis à un maximum de deux interversions séparées par un minimum de 30 jours. Ils seront également soumis à des tâches d’apprentissage olfactif de type associatif avec renforcement positif. Ce type d’apprentissage a une durée maximal de 1 mois, avec une session de 30 à 60 minutes par jour, chaque jour.

Impact sur les animaux

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal. Cependant, au cours de nos expériences les animaux pourront subir quelques effets indésirables comme le stress hydrique, la perte de poids associée (< a 20% du poids original pendant un maximum 4 semaines) et le stress dû à l’isolement (maximum 2 mois). Des implants seront introduits par chirurgie sous anesthésie générale chez les animaux. La présence de ces implants pourrait générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort (maximum 2 mois). Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans l’apprentissage olfactif. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal.

Réduction

L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes avec un risque de p=0.05 et une puissance statistique >80. L’électrophysiologie sur tranche de cerveau permet de changer rapidement le milieu dans lequel baignent les cellules. Il est donc possible d’appliquer successivement et/ou de rincer plusieurs molécules au cours de l’enregistrement d’une cellule donnée. Ceci permet de réaliser des tests statistiques appariés et de réduire le nombre de cellules nécessaire à l’évaluation de l’effet d’un agent pharmacologique. Pour cette partie, deux personnes travailleront en parallèle sur deux postes d’électrophysiologie, ce qui permettra d’optimiser l’utilisation des tissus, de doubler le nombre de cellules enregistrées, et de réduire d’autant le nombre d’animaux nécessaires. Dans la même optique, les expériences d'imagerie permettent d’analyser l'activité des neurones avant et après l’apprentissage, permettant l’utilisation des tests statistiques appariés et le nombre de cellules nécessaire à l’évaluation de l’effet, et ainsi le nombre d’animaux utilisés dans le projet.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. La durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour notre projet qui est principalement basé sur le comportement : il est nécessaire que l’animal puisse effectuer une tâche de comportement sans biais. Les animaux seront donc observés minimum deux fois par semaine, et tous les jours en post-opératoire. Cette surveillance sera coordonnée entre l’expérimentateur et le personnel de l’animalerie. Pour les souris montrant des signes de douleur (absence de toilettage, posture anormale, défaut de nidification, défaut dans le comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage, accompagnée ou non d’une perte de poids >20%), l’administration de l’antalgique sera renouvelée 12 et 24h après la chirurgie. Ces animaux seront l’objet d’une surveillance quotidienne accrue. En cas de détresse après l’administration des antalgiques les animaux seront mis à mort (événement très rare). Pour réduire le stress associé à l'isolement (parfois nécessaire lors de combats entre les individus ou en présence d’implants), les cages d’hébergement seront enrichies (igloo, coton extra). Dans le cas des souriceaux, après la chirurgie, le poids de chaque animal sera mesuré deux fois par semaine pour vérifier la bonne croissance des animaux. Le comportement maternel vis-à-vis des souriceaux après la chirurgie sera aussi évaluée (allaitement, toilettage, nidification, signes d’agressivité).

Choix des espèces

On étudie le phénomène de contrôle afférent chez l’adulte dans le système olfactif des souris car ce système est impliqué dans une modalité sensorielle très importante chez les rongeurs : l’olfaction. En conséquence, l’utilisation de cette espèce nous permettra d’obtenir des résultats éthologiquement satisfaisants. De plus, les stimuli olfactifs peuvent participer à l’enrichissement de l’environnement des animaux et donc favoriser leur bien-être durant le temps des expériences. Notre objet d’étude étant les fibres afférentes qui contrôlent l’activité des cellules produites par la neurogenèse chez l’adulte, on utilise dans ces expériences des jeunes souris adultes (8 semaines). Cependant, il faudra comparer l’impact de ces fibres sur les cellules produites dans le cerveau post-natal (neurogenèse post-natale). Pour ce faire, des souriceaux de 6 jours seront utilisés.