Recherche fondamentale

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie cérébrale, des tests sanguins après jeûne, un examen vaginal quotidien pour les femelles, et sont hébergées seules du début à la fin du projet. Le porteur reconnaît que l'isolement et le jeûne sont des sources de stress et de perte de poids. Il affirme que les interactions entre le cerveau et les organes ne peuvent être modélisées in vitro, l'objectif restant de comprendre le rôle d'un gène dans l'obésité.

Objectifs

Dans le cerveau, un liquide stérile circule dans des cavités appelées ventricules. Dans une region particulière du cerveau, la paroi du ventricule est constituée de cellules particulières que l’on nomme tanycytes. Or, les tanycytes jouent un role dans la balance énergétique, à savoir l’équilibre entre la prise, le stockage et et la dépense de calories, qui détermine le poids corporel. Ce rôle est particulièrement intéressant dans un contexte d’épidémie mondiale d’obésité. En outre, ces cellules produisent une molécule appelée Tbx3, dont le dysfonctionnement dans d’autres types cellulaires est connu pour favoriser le développement de l’obésité et du diabète. Cependant, le rôle de Tbx3 dans les tanycytes est encore mal connu. Notre objectif dans cette étude est d’empêcher la production de Tbx3 par les tanycytes, afin d’en étudier les conséquences sur le poids, la prise alimentaire et le contrôle de la glycémie (taux de sucre dans le sang), en particulier en situation d’alimentation hypercalorique. Nous souhaitons également en étudier les effets sur la maturité et le comportement sexuels, qui sont des fonctions biologiques influencées par les tanycytes.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de Tbx3 dans les tanycytes dans le développement de l'obésité et du diabète, en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements moléculaires associés au niveau cérébral. De plus, les tanycytes sont présents aussi bien chez la souris que chez l’Homme, ce qui renforce la portée translationnelle de ces résultats. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de restauration de la fonction des tanycytes pour lutter contre l’obésité, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Les 400 souris de ce projet sont concernées par l’ensemble des gestes suivants (sauf indication contraire) : 1) Neuro-chirurgie : cette technique est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 1 heure. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée durant toute l’étude. 2) Examen vaginal : cet examen d’une durée d’environ 10 secondes, légèrement invasif, est réalisé quotidiennement pendant 2 semaines, sur des souris adultes vigiles. Seules les femelles sont concernées, pour des raisons évidentes. 3) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite l’immobilisation de la souris dans un appareil, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris ne subiront cette analyse qu’une fois au cours de leur vie. 4) Tests sanguins : après un jeûne de 3 heures, les souris reçoivent une injection, puis 7 prélèvements sanguins (espacés d’au moins 15 min). Ces tests sont réalisés sans anesthésie. Deux tests seront réalisés sur les mêmes souris, séparés d’une semaine. 5) Hébergement : les souris de cette étude seront hébergées de manière individuelle. L’isolement débutera une semaine avant la chirurgie et se pousuivra jusqu’à la fin du projet.

Impact sur les animaux

L’hébergement individuel des animaux peut être sour ce de stress. Un stress d’immobilisation est également à prévoir lors de l’analyse de la composition corporelle. Les tests sanguins nécessitent au préalable un jeûne de 3 heures, pouvant engendrer une perte de poids le jour suivant. Les prélèvements sanguins réalisés à l’extrémité de la queue peuvent générer une légère douleur et un inconfort. Enfin, des douleurs post-opératoires sont attendues après la neurochirurgie.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort pour des pour réaliser des études moléculaires et biochimiques sur certains organes.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre l’effet de Tbx3 dans les tanycytes sur un ensemble de phénomènes, tels que le poids, la composition corporelle, la régulation de la glycémie, le cycle menstruel et les comportements sexuels. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec différents organes (foie, pancréas, organes sexuels…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante d’une communication entre tous ces acteurs. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire et sexuel nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé nos différentes expériences sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 semaines et seront habitués pendant au moins 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres, de sorte que chaque souris garde un contact visuel avec ses congénères. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une neuro-chirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de modification de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le contrôle de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, les tanycytes sont un type cellulaire présent à la fois chez la souris et chez l’Homme, ce qui renforce le potentiel translationnel de nos résultats. Toutes les souris de cette étude arriveront dans notre animalerie juste après leur sevrage (3 semaines). Pour certaines souris, les expériences débuteront au début de leur adolescence (4 semaines) alors que pour d’autres, nous attendrons l’âge adulte (9 semaines), afin de différencier les résultats obtenus à ces différents stades de développement.

76 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée, des injections, l'insertion d'électrodes à aiguille sous la peau avec stimulation électrique, et sont contenues dans un cylindre fermé pendant qu'on leur diffuse des sons jusqu'à 110 décibels. Le porteur décrit plusieurs tests comportementaux, dont un test des capacités de filtrage sensoriel et un test cognitif avec eau acidifiée sur quatre semaines, pour modéliser un syndrome humain rare. Il indique que le comportement des patients ne peut pas être reproduit in vitro.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux (NDD) sont des maladies complexes et hétérogènes présentant des symptômes associés à un développement anormal du cerveau pouvant entraîner plusieurs déficits comportementaux, tels des troubles de l'attention/hyperactivité, les troubles du spectre autistique, une déficience intellectuelle, l'épilepsie ou encore les troubles d'apprentissage. Les NDD englobent plusieurs dysfonctionnements cérébraux développementaux, qui se manifesteront par des troubles neuropsychiatriques ou une altération de la fonction motrice, de l'apprentissage, du langage ou de la communication non verbale avec une grande variabilité et différents degrés de gravité. Des études récentes ont révélé un rôle essentiel du développement cortical embryonnaire dans la physiopathologie des NDD, mais la génétique et les mécanismes sous-jacents sont encore méconnus. En particulier, un gène joue un rôle crucial dans le développement du cerveau. Des mutations sur ce gène entraine l’apparition du syndrome Bosch-Boonstra-Schaaf optic atrophy (BBSOA), qui est une maladie génétique rare, décrite pour la première fois en 2014. Les patients présentent une multitude de symptômes neuronaux et comportementaux, y compris, un retard développemental, une déficience intellectuelle, un trouble du spectre autistique, un trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité, des convulsions, une déficience visuelle et auditive. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les mutations de ce gène peuvent causer le syndrome BBSOA. Certains des symptômes observés chez les patients BBSOA fournissent déjà des indices importants sur le rôle de ce gène dans le développement du cerveau. En outre, des corrélations entre la génétique et le comportement commencent à être caractérisées chez les patients atteints de BBSOA. Néanmoins il est nécessaire d’étudier de façon approfondie des modèles animaux qui permettront de reproduire les mutations génétiques décrites chez l’Homme. Au cours de ce projet nous caractériserons le comportement de 3 lignées de souris présentant des différentes mutations sur ce gène. Cela nous permettra de mieux comprendre comment les mutations contribuent aux différentes anomalies du développement neurologique chez les patients atteints du syndrome BBSOA.

Bénéfices attendus

Les troubles neurologiques du développement sont des maladies neuro-développementales qui impliquent un dysfonctionnement de l’apprentissage, la mémoire, la perception, le langage, la résolution de problèmes et/ou l’interaction sociale. Ces troubles sont principalement d’origine génétique et se manifestent au cours de la petite enfance. Ce projet de recherche expérimentale se focalise sur un gène dont le rôle clé pendant le développement cortical est bien connu et dont plusieurs mutations conduisent au syndrome appelé BBSOA. Les enfants atteints de cette maladie présentent des déficits cognitifs et comportementaux, des crises d’épilepsie au jeune âge et montrent des retards dans l’apprentissage et dans le langage. La majorité des patients (>80%) diagnostiquée présente des troubles du spectre autistique (TSA). Les études récentes à ce sujet ont permis de mettre en évidence des anomalies cérébrales, notamment dans les régions du cerveau impliquées dans le langage et l’abstraction. Pour approfondir la compréhension de l’impact fonctionnel des mutations de ce gène, le projet global vise à mieux caractériser les mécanismes dans le cerveau qui sous-tendent les déficits cognitifs des enfants malades. En particulier, cette étude comportementale qui sera comparée avec celle clinique permettra d’étudier l’impact fonctionnel des mutations du gène dans le contexte des TSA avec le but à long terme de déboucher sur des pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation sous-cutanée d'une puce de radiofréquence sera faite sur les animaux pour enregistrer leurs interactions sociales dans un test comportemental. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes) - Injection intra-péritonéale d'anesthésique (durée = moins d'une minute) (deux fois). -Etude de la structure de l'oeil par histologie in vivo (durée = 10 minutes). - Mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (durée = 10 minutes), insertion d'électrodes à aiguille + stimulation électrique (0,1 ms, 8mA). Les aiguilles sont insérées à travers la peau de l'animal à une profondeur de 1 à 2 mm. - Injection sous-cutanée d'antidote de l'anesthésique (durée = moins d'une minute). -Un test comportemental cognitif où l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test durera 4 semaines. - Contention des animaux dans un cylindre fermé lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information. Dans ce test des sons de 110 dB pour une durée de 40 msec et d'autres plus faibles (65-70-75-85-90 dB ; durant 10 msec) sont présentés à l'animal. Chaque type de stimulus est présenté 10 fois aléatoirement durant le test. Un intervalle de 20 sec sépare 2 stimuli. Avec 11 types de stimuli présentés 10 fois, une session dure environ 45 min.

Impact sur les animaux

Ce projet comprend une implantationd'une puce d'identification par radiofréquence en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse, une douleur locale post-opératoire peut apparaitre au niveau du site d'implantation. Pour le test d'altérations des capacités de filtrage de l’information, l’animal est placé dans un cylindre fermé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude comportementale sera complémentaire d'études in vitro sur des cellules de patients BBSOA porteurs des différentes mutations. Ceci permettra de décrypter les anomalies cellulaires et moléculaires à la base du trouble du développement BBSOA. Néanmoins, la présence d’anomalies comportementales des patients ne pourra pas être reproduite in vitro et nécessite donc l’utilisation d’animaux pour mieux comprendre l’impact/ le lien des mutations sur le phénotype neurodéveloppementale.

Réduction

Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, et les mêmes animaux seront utilisés dans les différents tests comportementaux. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux seulement 2 groupes contrôles seront utilisés pour 3 groupes expérimentaux présentant des mutations.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test, afin de réduire le stress auquel seront exposés les animaux. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. De la même manière lors de l'Electromyographie et de la Tomographie par Cohérence Optique une anesthésie sera faite pour éviter tout stress. Les animaux seront injectés en sous-cutané avec un antagoniste de l'anesthésique après les tests et placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu’à leur réveil. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage d’hébergement et surveillés quotidiennement.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'Homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’introduire des mutations génétiques chez la souris et modéliser donc une maladie génétique humaine chez la souris. Les manipulations génétiques nous permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront nous être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes et âgés de 6 à 9 semaines. Cet âge a été choisi car le développement du cortex est terminé, mais ce dernier est encore plastique. De plus les systèmes visuels et auditifs sont aussi matures.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent sous anesthésie une chirurgie d'ischémie du membre inférieur par ligature de l'artère fémorale, suivie de la pose d'un stent, pour évaluer un stent recouvert de vésicules biologiques. Le porteur reconnaît une douleur prise en charge par la buprénorphine et un stress lié aux manipulations. Il annonce un dépôt de brevet et renvoie l'essai chez des patients au long terme, jugeant qu'aucune alternative in vitro ne teste le bénéfice global d'un stent.

Objectifs

L'angioplastie et la pose de stents sont les principales approches thérapeutiques pour permettre la revascularisation des artères bouchées qui sont responsables d’AVC ou d’infarctus du myocarde. Les stents disponibles actuellement peuvent entraîner des complications graves chez certains patients et nécessitent souvent une thérapie médicamenteuse anti-agrégante associée afin de limiter les éventuelles complications. Nous proposons de tester des nouveaux stents bioactifs et recouverts de vésicules biologiques ayant déjà montré des propriétés anti-inflammatoires et cardioprotectrices dans des modèles animaux après injection intraveineuse. L’intérêt sera d’amener directement ces vésicules sur le site/artère bouchée via le stent. L’objectif est donc de tester les bénéfices thérapeutiques de ce type de stent dans un modèle expérimental de maladies cardiovasculaires, sur 40 rats, nombre nécessaire afin de conclure de manière statistique sur le bénéfice.

Bénéfices attendus

Ce projet fera l’objet d’un dépôt de brevet auprès de la SATT avant publication des résultats. Au final, ce projet vise à développer des stents actifs « coatés » avec des CD146-EV afin de diminuer les thromboses de stent et les resténoses intra-stent dues à la composante inflammatoire résiduelle de la paroi vasculaire. A plus long terme, nous envisageons de tester les bénéfices de ces nouveaux stents biologiques actifs dans des cohortes de patients recrutés dans les services de cardiologie interventionnelle.

Procédures

Une procédure chirurgicale par animal d'une durée de 40 minutes sous anesthésie générale gazeuse.

Impact sur les animaux

Les animaux devront subir sous anesthésie générale gazeuse, des injections d’analgésie, une chirurgie d'ischémie du membre inférieur par ligature de l'artère fémorale puis seront implantées dans la foulée avec le stent déposé au niveau de l'artère obstruée, avant réveil. Les expérimentations prévues entraînent une douleur qui sera prise en charge par l’administration de buprenorphine. Les animaux pourront également subir une angoisse générée par les manipulations (pesée, mise en cage d’induction anesthésique).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyse des bénéfices du stent biologiquement actif après ischémie.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucune autre alternative à l'utilisation d'un modèle animal pour tester le bénéfice global d'un stent biologiquement actif sur artère obstruée après ischémie, l'évaluation des effets indésirables hors-cibles ne pouvant pas se faire in vitro.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux sera utilisé pour atteindre le seuil statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés au moins par 2 dans des cages contenant de l’enrichissement, type carrés de coton et dômes, et auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Aussi, si les animaux présentant des symptômes type infection visible cliniquement donc essentiellement cutanée (dermatite), ils seront écartés des protocoles. Nous serons attentif à toute souffrance animal lors de l'élevage. En effet, si l'animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait l’analgésie peut être envisagée par administration de carprofène par voie sous-cutanée à 5 mg/kg, 1 injection par jour et si les signes de douleur persistent, l’avis du vétérinaire référent sera demandé.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation d'un modèle animal de pathologie athéroscléreuse tel que ApoE KO qui est très bien décrit et exploré avec le modèle murin ou le rat. Ici, la pose de stent nécessite des vaisseaux les plus larges possibles, donc le choix s'est porté sur le rat ApoE KO. Les animaux seront utilisés au stade adulte à un âge avancé d’environ 20 semaines. En effet, les AVC et les infarctus du myocarde touchent le sujet humain adulte. Il faut donc utiliser le modèle adulte pour ces protocoles. Par ailleurs, il est beaucoup plus aisé de réaliser les protocoles sur des rats de taille adulte et ainsi d’effectuer les bons gestes, ce qui justifie d'utiliser les rats au stade adulte.

1 499 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à trois craniotomies sous anesthésie, avec injection de vecteurs viraux ou implantation, une restriction alimentaire et des tests comportementaux, pour visualiser et moduler les circuits de la mémoire. Le porteur qualifie la chirurgie de douloureuse et limite la perte de poids à 10 %. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne modélise la mémoire et renvoie les thérapies contre Alzheimer ou le stress post-traumatique au long terme.

Objectifs

L'étude de la mémoire et de ses bases neuronales est essentielle pour comprendre ses mécanismes et pouvoir, à partir de ces analyses, traiter les troubles qui y sont liés, comme la maladie d'Alzheimer, le syndrome de stress post- traumatique et d'autres types d'amnésie. Dans ce projet, nous proposons d'utiliser un modèle animal pour étudier comment la mémoire est stockée et rappelée à court et long terme. Cela nous permettra de comprendre les modalités d’activation des régions impliquées, et, en visualisant et en modifiant leur activité, de comprendre dans quelle mesure ces régions influencent le maintien de souvenirs spécifiques. En particulier, nous utiliserons une tâche de conditionnement classique pour former et étudier des souvenirs émotionnels, positifs et négatifs. Par ce projet, nous souhaitons répondre à quatre questions principales : quels sont les changements d'activité observés au niveau des cellules individuelles (1) ou du cerveau entier (2) lorsqu'un animal apprend et se souvient d'un événement passé ? La manipulation artificielle de ces régions identifiées peut-elle influencer le comportement de l'animal (3) et l'activité des régions cérébrales qui leur sont liées (4) ?

Bénéfices attendus

Le modèle souris est un excellent modèle translationnel, qui nous permet d’étudier la complexité des fonctions cognitives telles que la mémoire. Il nous permet, grâce à des techniques invasives, de tester par la manipulation et la visualisation in vivo les dynamiques neuronales qui sous-tendent la formation et le rappel de la mémoire, et ce à différentes échelles. A court terme, le projet permettra d’élucider le fonctionnement de la formation et du rappel des souvenirs à court et long termes, chez la souris mais également de façon translationnelle chez l’Humain. A plus long terme, ces connaissances pourront conduire à la découverte et au développement de thérapies plus ciblées et efficaces pour lutter contre divers troubles de la mémoire, et donc avoir un impact clinique concret. Nous utilisons le modèle souris en particulier car la reproduction est rapide et mène à un grand nombre d’animaux dans chaque portée, ce qui facilite l’obtention rapide de résultats statistiquement significatifs. Par ailleurs, l’ensemble de l’équipe est formé sur ce modèle, ce qui permet la réduction maximale du nombre d’animaux utilisés, et la littérature sur la mémoire est très riche pour cette espèce (par comparaison, par exemple, au modèle rat).

Procédures

Au cours de chaque phase de ce projet, les animaux peuvent passer par : - Un régime alimentaire de maximum 5 jours (et de maximum 2 fois par animal, à plusieurs semaines d'intervalle) pendant lequel l'animal reçoit une quantité restreinte de nourriture. Chaque jour, les animaux sont surveillés et si leur poids diminue trop, les quantités de nourriture mises à disposition sont modifiées en conséquence ; - Des tests comportementaux pour étudier leur mémoire et leur niveau de stress. Ces tests sont très courts et durent entre 5 et 10 minutes. - Des opérations chirurgicales sous anesthésie générale qui durent entre 30 et 50 minutes. Si un animal subit plusieurs interventions chirurgicales (dans tous les cas, 3 au maximum par animal), celles-ci sont espacées d'au moins 1 semaine. - Dans certains cas spécifiques, les animaux seront maintenus en isolement depuis l'intervention chirurgicale jusqu'à la fin des expériences comportementales, qui dureront au maximum deux mois à compter de la date de l'opération.

Impact sur les animaux

Pour ces études, la technologie de pointe utilisée nécessite des procédures d'implantation invasives à l'intérieur du cerveau de l'animal. Les animaux subiront donc une ou deux craniotomies, suivies d’une injection d’un vecteur viral ou d’une implantation. Cette procédure, douloureuse, sera donc effectuée sous anesthésie générale et durera un peu moins d’une heure. Les implants n'affectent toutefois pas le comportement normal et le bien-être de l'animal une fois implantés. Certains animaux devront subir une privation de nourriture partielle, procédure indispensable à leur motivation pour certaines tâches comportementales. La quantité de nourriture qu'ils ingèrent chaque jour sera limitée, mais de manière à ne pas dépasser une perte supérieure à 10% de leur poids normal afin d’éviter tout stress superflu ou malnutrition, ce qui serait non seulement préjudiciable à l'animal mais aussi contre-productif pour nos expériences, qui exigent que l'animal soit en parfaite santé et non stressé ou même malade, car cela fausserait les résultats de nos recherches. Pour les expériences employant l’électrophysiologie, la fragilité des implants ne permet pas de replacer les souris dans la même cage que leurs congénères, et ceci cause un stress émotionnel modéré à fort. Néanmoins, cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisé, en réduisant au maximum les risques que l’implant ne tienne pas dans la durée. Par ailleurs, cet isolement n’est pas le cas pour tous les autres implants utilisés. Par ailleurs, ce projet étudiant les souvenirs émotionnels, certains animaux devront subir un conditionnement aversif, induisant une douleur moyenne brève, ainsi qu’un stress passager d’intensité modérée.

Devenir

Tous les animaux subiront l’euthanasie. Celle-ci interviendra alors que l’animal sera profondément anesthésié. Ceci est absolument nécessaire pour les études histologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

Du fait des approches intégratives de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants reste incontournable. En effet, à l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données sur ces processus cognitifs, bien trop complexes pour envisager toute simulation informatique. Par ailleurs, de par la nature de nos expérimentations (chirurgie, conditionnement aversif, analyse par immunohistochimie), il nous est impossible d’employer directement des sujets humains. Le modèle souris se révèle alors être idéal du fait de la proximité fonctionnelle entre son système nerveux central et celui de l’humain quant à ses capacités à créer des souvenirs émotionnels simples (auxquels nous nous intéressons, type conditionnement pavlovien) et de sa petite taille. Ceci explique également l’impossibilité d’utiliser des modèles animaux invertébrés, trop éloignés de l’humain pour raisonnablement étudier une réponse émotionnelle à un souvenir ainsi que trop éloignés dans la configuration du système nerveux central, critique à notre étude inter-régions.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au nombre minimal permettant de faire des études statistiquement significatives, nombre choisi sur la base d'expériences présentées dans des articles montrant des analyses similaires. Nous utilisons également les tissus après les expériences, maximisant ainsi l’utilisation de chaque animal.

Raffinement

Afin d’améliorer les conditions de vie des animaux, réduire la douleur, le stress et l’anxiété causés lors des différentes procédures, un certain nombre de mesures sont mises en place : - Les cages seront enrichies d’un tube en carton qui permettra de manipuler les souris sans les soulever par la queue. - Les animaux seront habitués plusieurs jours avant les expériences aux branchements et débranchements de leurs implants afin de réduire leur stress. - Nous avons amélioré la technique d’implantation des optrodes et des plaques de base du miniscope afin de ne plus avoir à isoler les animaux après implantation. - En plus de l’utilisation d'anesthésiques adaptés et d’anti-inflammatoire, nous appliquons également un anesthésique local ainsi qu’un analgésique lors de la chirurgie et après la chirurgie en cas de signes de douleurs.

Choix des espèces

Les comportements que nous souhaitons étudier sont trop complexes pour justifier de l’utilisation d’espèces non-mammifères (drosophile, poisson-zèbre, etc.). De même, les méthodes in silico et in vitro ne sont pas assez développées pour modéliser ni la mémoire, ni le fonctionnement du cerveau à si grande échelle. Par ailleurs, eu égard au nombre d’animaux requis, les rongeurs (et plus particulièrement les souris) s’imposent de par la facilité et la stabilité de leur élevage. La souris a également été préférée au rat pour deux principales raisons: - La littérature relative à la mémoire, incluant tous nos précédents travaux, est bien plus riche chez la souris que chez le rat. - Notre équipe est déjà formée sur la souris, notamment pour la réalisation des chirurgies. Ne pas changer de modèle nous permettra de conserver ce savoir-faire, et ainsi de ne pas sacrifier d’animaux supplémentaires pour adapter les chirurgies à un nouveau modèle animal. Les souris étudiées seront adultes (plus de 7 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

3 chats vont être utilisés, gardés vivants et réutilisés dans un autre projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent, sous anesthésie générale de deux heures trente, l'implantation d'électrodes cérébrales, un transport vers un établissement partenaire et des administrations orales d'une molécule, pour tester un antagoniste du récepteur H2 de l'histamine sur le sommeil. Le porteur reconnaît une douleur post-opératoire d'environ trois jours et le stress du transport. Il présente le chat comme un modèle de référence du sommeil transposable à l'être humain et affirme que seul l'animal "entier" reproduit l'alternance veille-sommeil.

Objectifs

L'être humain est soumis à l'alternance du cycle veille-sommeil. L'éveil est un état permettant la réalisation d'activités vitales et cognitives. Durant l’éveil le cerveau reçoit des informations internes et externes et les analyse pour y répondre de manière adaptée. Inversement le sommeil lent est un état comportemental de repos, permettant à l'organisme d'assurer la récupération physique et fonctionnelle dans des conditions de dépense énergétique minimale. Notre équipe s’intéresse depuis de nombreuses années à l’histamine qui est l’un des neurotransmetteurs majeurs de l’éveil. Les neurones à histamine sont localisés dans une région située sous l’hypothalamus postérieur et émettent des prolongements dans l’ensemble du cerveau. Il existe plusieurs récepteurs à l’histamine, dénommés H1, H2 et H3. Suivant le type de récepteur et sa localisation, l’histamine libérée au cours de l’éveil va avoir des effets activateurs sur ses récepteurs cibles ou inhibiteurs sur ses récepteurs d’autorégulation. Afin de mieux comprendre les mécanismes de déclenchement et de maintien de l’éveil il est important d’identifier précisément l’action de l’histamine sur ces différents récepteurs. Ceci est rendu possible par l’utilisation d‘antagonistes c’est-à-dire des molécules qui vont bloquer sélectivement l’un de ces récepteurs. A l’inverse des récepteurs H1 et H3 dont le rôle sur le sommeil est bien démontré, celui des récepteurs H2 reste peu connu. Dans le cadre d’une autorisation précédente, nous avons obtenu une amélioration du sommeil lent à l’aide d’une nouvelle molécule ciblant spécifiquement ce type de récepteurs, l’effet restant néanmoins à être confirmé statistiquement en raison d’un petit échantillon (n=3). L'objectif de cette étude consiste à finaliser la caractérisation de l’effet de ce nouvel antagoniste H2 sur les états de vigilance et sur l’électroencéphalogramme (EEG) en réalisant des expériences complémentaires sur un nombre réduit d'animaux afin de compléter et confirmer nos premiers résultats.

Bénéfices attendus

Les retombées potentielles de cette étude sont non seulement d’ordre scientifique sur l’animal-modèle (connaissances des mécanismes neuronaux de l’éveil et du sommeil, du rôle des récepteurs centraux H2 de l’histamine) mais aussi transposables à l’Homme et notamment en situation clinique. Les résultats de l’étude pharmacologique vont nous permettre de finaliser la caractérisation du nouvel antagoniste H2 et de ses effets sur les états d’éveil et de sommeil, sur le plan comportemental et de la qualité du sommeil. Ces résultats permettront également de conforter le potentiel translationnel de l’étude. En effet, ce nouvel antagoniste du récepteur H2 a récemment obtenu un statut « cliniquement approprié » après une série de tests réglementaires montrant son innocuité aigue et chronique chez l'animal. Cette étude de preuve de concept chez le chat constitue donc une étape cruciale pour la conception d’une nouvelle thérapie capable d’améliorer le sommeil affecté par les différents types de stress rencontrés dans la vie au cours de l’éveil.

Procédures

L’étude comporte une analyse quantitative et qualitative du sommeil grâce à des enregistrements par électrodes (électroencéphalogramme (EEG), électromyogramme (EMG)) ainsi que des administrations par voie orale de la molécule d’intérêt testée à trois doses contre placebo. La procédure implique pour les animaux les étapes suivantes - une acclimatation d’une durée minimale de deux semaines dans notre établissement - un transport (aller et retour) dans un établissement partenaire d’une durée de 35 minutes - une intervention chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée maximale de deux heures trente visant à implanter les électrodes. - une période post-opératoire de 24h à 48h dans l’établissement partenaire suivie d’une convalescence de deux semaines avec évaluation de la douleur et soins appropriés incluant des injections répétées (2 à 3) d’antalgique sous la peau (1 minute). - des sessions d’enregistrement du sommeil au nombre de 24 (8 enregistrements de référence et 16 enregistrements avec administration orale de la molécule d’intérêt ou du placebo). Les sessions durent chacune 6h et sont séparées d’au moins trois jours pour permettre l’élimination de la molécule. Lors des sessions, l’animal est placé seul dans une pièce expérimentale de 4m^2 équipée comme la salle d’hébergement, avec enrichissement. Il est privé de ses congénères dont la présence et les interactions pourraient affecter la qualité de son sommeil, puis les retrouvent à la fin des sessions. Chaque session débute avec une courte immobilisation de l’animal (30 secondes) pour placer l’émetteur sans fil et introduire la gélule contenant le composé testé par voie orale. Pour un animal donné, l’expérience dure au total onze semaines.

Impact sur les animaux

Lors du transport aller-retour dans l’établissement partenaire, l’animal est susceptible d’éprouver un stress, de l’angoisse passagère et un mal des transports Les animaux subissent une intervention chirurgicale au cours de laquelle un dispositif est implanté pour capter les signaux cérébraux. Cette intervention va être à l’origine d’une douleur post-opératoire susceptible de se prolonger plusieurs jours et de se traduire par une modification de l’état général et du comportement ainsi qu’une réaction au toucher de la zone opérée. Ces douleurs pourront durer plus ou moins longtemps selon l’animal, mais leur durée moyenne est estimée à trois jours environ et font l’objet d’une prise en charge par des injections de médicaments antidouleurs ; ces injections entraineront une douleur transitoire au niveau de la peau du site d’injection et pourront être répétées plusieurs fois. Malgré leur taille réduite, les électrodes d’enregistrement peuvent générer des microlésions cérébrales, un œdème (gonflement) ou un hématome (saignement). Il existe également un léger risque d’infection au niveau de l’implant. Lors des sessions l’animal est placé seul dans une pièce expérimentale, il est momentanément privé de ses congénères et est susceptible d’éprouver un stress lié à l’isolement ou à la nouveauté de la situation. Les sessions débutent avec la pose d’un petit émetteur sans fil sur l’implant et l’administration orale de la gélule contenant le placebo ou la dose du composé testé. Ceci nécessite une contention de l’animal créant un inconfort momentané qui peut se traduire par une réaction de fuite ou de défense s’il n’est pas habitué. Il n’est pas attendu d’effet indésirable avec la molécule testée.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie. Les animaux implantés seront réutilisés dans un autre projet car l'implantation est pérenne dans le temps et les enregistrements sont possibles pendant plusieurs mois. Les animaux non implantés qui n’auront pas été inclus dans l’étude seront proposés à l’adoption par le biais d'une association. La décision est prise en concertation par le responsable du projet et le vétérinaire désigné.

Remplacement

Cette étude fait suite à des travaux préalables in vitro qui ont montré l’implication du récepteur H2 de l’histamine dans l’excitabilité et l’activité neuronale. Elle a pour objet la caractérisation des effets d’un nouvel antagoniste des récepteurs H2 sur les états de vigilance et l’électroencéphalogramme (EEG) ce qui intègre une réponse physiologique et comportementale complexe qui ne peut être obtenue que chez l’animal entier. Il n’existe pas à ce jour de modèle de sommeil in silico ou ex-vivo capable de reproduire les mécanismes neuronaux complexes qui sous-tendent l’alternance des états d’éveil et de sommeil. Les mammifères sont les seuls animaux possédant un cycle veille/sommeil comparable à celui de l’homme.

Réduction

Notre plan d’expérience est conçu pour collecter le maximum de données sur un nombre réduit d’animaux, grâce à des mesures répétées sur un même animal (3 répétitions) et au recueil simultané de données à la fois quantitatives et qualitatives sur le sommeil. Le nombre d’animaux est ainsi réduit au minimum sur la base d’expériences préliminaires et du nombre d’essais complémentaires à réaliser pour obtenir des résultats exploitables et valides d’un point de vue statistique. En outre, l’étude sera menée de façon séquentielle avec un premier animal dont nous analyserons les données avant d’envisager l’ajout d’un second animal ou d’un troisième, uniquement si cela s’avère nécessaire. Les résultats obtenus feront l’objet de tests statistiques pour mesures répétées qui figurent parmi les plus fiables et les plus robustes. L’étude donnera lieu à une publication scientifique ; les enregistrements de sommeil pourront faire l’objet d’un partage avec la communauté scientifique grâce aux plateformes de données ouvertes. La réutilisation par d’autres scientifiques de ces données rares permettra de limiter le recours à de nouveaux animaux.

Raffinement

Les conditions d'hébergement, de soins et les méthodes mises en œuvre dans ce projet ont été définies en collaboration avec des vétérinaires spécialistes et la structure chargée du bien-être animal de façon à réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables : Une période d’acclimatation minimale de deux semaines est prévue, ainsi que des délais de récupération après le transport et l’intervention chirurgicale. L’implantation chirurgicale d’électrodes est réalisée sous anesthésie générale profonde avec analgésie peropératoire dans un établissement vétérinaire offrant des conditions optimales de réalisation ; la prise en charge postopératoire repose sur un protocole de soins post-opératoires qui inclut une évaluation de la douleur, des injections de puissants antalgiques et prévoit des points limites adaptés. Des visites quotidiennes assurent une familiarisation de chaque animal avec l’expérimentateur et les zootechniciens ainsi que le suivi individuel du bien-être au moyen de grilles de score. Notre expérience montre que des visites et manipulations régulières avec chaque individu atténue l’expression de comportement de fuite ou d’agression et les signes de stress. De façon importante, les animaux implantés cohabitent en parfaite harmonie avec des individus non implantés. Les administrations du composé ou du placebo se font par voie orale en gélule et non au moyen d’injections. L’animal est brièvement tenu à la main par l’expérimentateur pour introduire la gélule, il ne subit dont pas l’inconfort et la douleur d’une piqûre. Les enregistrements d’éveil et de sommeil sont limités à 6 heures et sont réalisés à l’aide d’un système sans fil ce qui permet à l’animal d’être complétement libre de ses mouvements. Les sessions se déroulent après une habituation dans une volière séparée et enrichie comme la volière d’hébergement. Un temps de repos est ménagé entre chacune des sessions pendant lequel l’animal est replacé en hébergement commun avec ses congénères.

Choix des espèces

Le chat est un modèle animal de référence pour le sommeil et les théories contemporaines sur l’alternance veille-sommeil. Par rapport aux petits mammifères comme les rongeurs, il a un cerveau de plus grande taille et un électroencéphalogramme dont les caractéristiques sont très proches de celui de l’Homme ; il a de plus une plus grande propension à dormir (environ 70% du temps contre 50% pour les rongeurs) et son sommeil comprend des stades similaires à ceux de l’homme, avec des de sommeil lent et l’activité pontogéniculooccipitale (absente chez le rongeur). Le chat est aussi l’espèce qui nous a permis d’identifier le modafinil et plus récemment, une thérapie histaminergique basée sur le récepteur H3 et utilisée depuis 2016 en Europe et 2019 aux USA pour améliorer l’éveil des patients narcoleptiques et hypersomniaques. Dans la continuité de nos recherches, cette espèce modèle devrait nous permettre d’explorer une nouvelle piste thérapeutique utilisant un ligand H2 en vue d’améliorer le sommeil notamment dans le cadre des troubles du sommeil lié au stress. Chats adultes d'un poids compris entre 3,0 et 5,0kg. Les paramètres étudiés dans cette étude nécessitent des animaux ayant atteint une maturité cérébrale, ainsi qu’une stabilité de l’architecture globale du cycle veille-sommeil, par opposition à des animaux jeunes ou sénescents. Le stade adulte garantit l’implantation reproductible des électrodes aux coordonnées stéréotaxiques prédéfinies.

3 chats vont être utilisés, gardés vivants et réutilisés dans un autre projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent, sous anesthésie générale de deux heures trente, l'implantation d'électrodes cérébrales, un transport vers un établissement partenaire et des administrations orales d'une molécule, pour tester un antagoniste du récepteur H2 de l'histamine sur le sommeil. Le porteur reconnaît une douleur post-opératoire d'environ trois jours et le stress lié au transport. Il affirme que seul l'animal "entier" reproduit l'alternance veille-sommeil et présente le chat comme un modèle de référence transposable à l'être humain.

Objectifs

L'être humain est soumis à l'alternance du cycle veille-sommeil. L'éveil est un état permettant la réalisation d'activités vitales et cognitives. Durant l’éveil le cerveau reçoit des informations internes et externes et les analyse pour y répondre de manière adaptée. Inversement le sommeil lent est un état comportemental de repos, permettant à l'organisme d'assurer la récupération physique et fonctionnelle dans des conditions de dépense énergétique minimale. Notre équipe s’intéresse depuis de nombreuses années à l’histamine qui est l’un des neurotransmetteurs majeurs de l’éveil. Les neurones à histamine sont localisés dans une région située sous l’hypothalamus postérieur et émettent des prolongements dans l’ensemble du cerveau. Il existe plusieurs récepteurs à l’histamine, dénommés H1, H2 et H3. Suivant le type de récepteur et sa localisation, l’histamine libérée au cours de l’éveil va avoir des effets activateurs sur ses récepteurs cibles ou inhibiteurs sur ses récepteurs d’autorégulation. Afin de mieux comprendre les mécanismes de déclenchement et de maintien de l’éveil il est important d’identifier précisément l’action de l’histamine sur ces différents récepteurs. Ceci est rendu possible par l’utilisation d‘antagonistes c’est-à-dire des molécules qui vont bloquer sélectivement l’un de ces récepteurs. A l’inverse des récepteurs H1 et H3 dont le rôle sur le sommeil est bien démontré, celui des récepteurs H2 reste peu connu. Dans le cadre d’une autorisation précédente, nous avons obtenu une amélioration du sommeil lent à l’aide d’une nouvelle molécule ciblant spécifiquement ce type de récepteurs, l’effet restant néanmoins à être confirmé statistiquement en raison d’un petit échantillon (n=3). L'objectif de cette étude consiste à finaliser la caractérisation de l’effet de ce nouvel antagoniste H2 sur les états de vigilance et sur l’électroencéphalogramme (EEG) en réalisant des expériences complémentaires sur un nombre réduit d'animaux afin de compléter et confirmer nos premiers résultats.

Bénéfices attendus

Les retombées potentielles de cette étude sont non seulement d’ordre scientifique sur l’animal-modèle (connaissances des mécanismes neuronaux de l’éveil et du sommeil, du rôle des récepteurs centraux H2 de l’histamine) mais aussi transposables à l’Homme et notamment en situation clinique. Les résultats de l’étude pharmacologique vont nous permettre de finaliser la caractérisation du nouvel antagoniste H2 et de ses effets sur les états d’éveil et de sommeil, sur le plan comportemental et de la qualité du sommeil. Ces résultats permettront également de conforter le potentiel translationnel de l’étude. En effet, ce nouvel antagoniste du récepteur H2 a récemment obtenu un statut « cliniquement approprié » après une série de tests réglementaires montrant son innocuité aigue et chronique chez l'animal. Cette étude de preuve de concept chez le chat constitue donc une étape cruciale pour la conception d’une nouvelle thérapie capable d’améliorer le sommeil affecté par les différents types de stress rencontrés dans la vie au cours de l’éveil.

Procédures

L’étude comporte une analyse quantitative et qualitative du sommeil grâce à des enregistrements par électrodes (électroencéphalogramme (EEG), électromyogramme (EMG)) ainsi que des administrations par voie orale de la molécule d’intérêt testée à trois doses contre placebo. La procédure implique pour les animaux les étapes suivantes - une acclimatation d’une durée minimale de deux semaines dans notre établissement - un transport (aller et retour) dans un établissement partenaire d’une durée de 35 minutes - une intervention chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée maximale de deux heures trente visant à implanter les électrodes. - une période post-opératoire de 24h à 48h dans l’établissement partenaire suivie d’une convalescence de deux semaines avec évaluation de la douleur et soins appropriés incluant des injections répétées (2 à 3) d’antalgique sous la peau (1 minute). - des sessions d’enregistrement du sommeil au nombre de 24 (8 enregistrements de référence et 16 enregistrements avec administration orale de la molécule d’intérêt ou du placebo). Les sessions durent chacune 6h et sont séparées d’au moins trois jours pour permettre l’élimination de la molécule. Lors des sessions, l’animal est placé seul dans une pièce expérimentale de 4m^2 équipée comme la salle d’hébergement, avec enrichissement. Il est privé de ses congénères dont la présence et les interactions pourraient affecter la qualité de son sommeil, puis les retrouvent à la fin des sessions. Chaque session débute avec une courte immobilisation de l’animal (30 secondes) pour placer l’émetteur sans fil et introduire la gélule contenant le composé testé par voie orale. Pour un animal donné, l’expérience dure au total onze semaines.

Impact sur les animaux

Lors du transport aller-retour dans l’établissement partenaire, l’animal est susceptible d’éprouver un stress, de l’angoisse passagère et un mal des transports Les animaux subissent une intervention chirurgicale au cours de laquelle un dispositif est implanté pour capter les signaux cérébraux. Cette intervention va être à l’origine d’une douleur post-opératoire susceptible de se prolonger plusieurs jours et de se traduire par une modification de l’état général et du comportement ainsi qu’une réaction au toucher de la zone opérée. Ces douleurs pourront durer plus ou moins longtemps selon l’animal, mais leur durée moyenne est estimée à trois jours environ et font l’objet d’une prise en charge par des injections de médicaments antidouleurs ; ces injections entraineront une douleur transitoire au niveau de la peau du site d’injection et pourront être répétées plusieurs fois. Malgré leur taille réduite, les électrodes d’enregistrement peuvent générer des microlésions cérébrales, un œdème (gonflement) ou un hématome (saignement). Il existe également un léger risque d’infection au niveau de l’implant. Lors des sessions l’animal est placé seul dans une pièce expérimentale, il est momentanément privé de ses congénères et est susceptible d’éprouver un stress lié à l’isolement ou à la nouveauté de la situation. Les sessions débutent avec la pose d’un petit émetteur sans fil sur l’implant et l’administration orale de la gélule contenant le placebo ou la dose du composé testé. Ceci nécessite une contention de l’animal créant un inconfort momentané qui peut se traduire par une réaction de fuite ou de défense s’il n’est pas habitué. Il n’est pas attendu d’effet indésirable avec la molécule testée.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie. Les animaux implantés seront réutilisés dans un autre projet car l'implantation est pérenne dans le temps et les enregistrements sont possibles pendant plusieurs mois. Les animaux non implantés qui n’auront pas été inclus dans l’étude seront proposés à l’adoption par le biais d'une association. La décision est prise en concertation par le responsable du projet et le vétérinaire désigné.

Remplacement

Cette étude fait suite à des travaux préalables in vitro qui ont montré l’implication du récepteur H2 de l’histamine dans l’excitabilité et l’activité neuronale. Elle a pour objet la caractérisation des effets d’un nouvel antagoniste des récepteurs H2 sur les états de vigilance et l’électroencéphalogramme (EEG) ce qui intègre une réponse physiologique et comportementale complexe qui ne peut être obtenue que chez l’animal entier. Il n’existe pas à ce jour de modèle de sommeil in silico ou ex-vivo capable de reproduire les mécanismes neuronaux complexes qui sous-tendent l’alternance des états d’éveil et de sommeil. Les mammifères sont les seuls animaux possédant un cycle veille/sommeil comparable à celui de l’homme.

Réduction

Notre plan d’expérience est conçu pour collecter le maximum de données sur un nombre réduit d’animaux, grâce à des mesures répétées sur un même animal (3 répétitions) et au recueil simultané de données à la fois quantitatives et qualitatives sur le sommeil. Le nombre d’animaux est ainsi réduit au minimum sur la base d’expériences préliminaires et du nombre d’essais complémentaires à réaliser pour obtenir des résultats exploitables et valides d’un point de vue statistique. En outre, l’étude sera menée de façon séquentielle avec un premier animal dont nous analyserons les données avant d’envisager l’ajout d’un second animal ou d’un troisième, uniquement si cela s’avère nécessaire. Les résultats obtenus feront l’objet de tests statistiques pour mesures répétées qui figurent parmi les plus fiables et les plus robustes. L’étude donnera lieu à une publication scientifique ; les enregistrements de sommeil pourront faire l’objet d’un partage avec la communauté scientifique grâce aux plateformes de données ouvertes. La réutilisation par d’autres scientifiques de ces données rares permettra de limiter le recours à de nouveaux animaux.

Raffinement

Les conditions d'hébergement, de soins et les méthodes mises en œuvre dans ce projet ont été définies en collaboration avec des vétérinaires spécialistes et la structure chargée du bien-être animal de façon à réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables : Une période d’acclimatation minimale de deux semaines est prévue, ainsi que des délais de récupération après le transport et l’intervention chirurgicale. L’implantation chirurgicale d’électrodes est réalisée sous anesthésie générale profonde avec analgésie peropératoire dans un établissement vétérinaire offrant des conditions optimales de réalisation ; la prise en charge postopératoire repose sur un protocole de soins post-opératoires qui inclut une évaluation de la douleur, des injections de puissants antalgiques et prévoit des points limites adaptés. Des visites quotidiennes assurent une familiarisation de chaque animal avec l’expérimentateur et les zootechniciens ainsi que le suivi individuel du bien-être au moyen de grilles de score. Notre expérience montre que des visites et manipulations régulières avec chaque individu atténue l’expression de comportement de fuite ou d’agression et les signes de stress. De façon importante, les animaux implantés cohabitent en parfaite harmonie avec des individus non implantés. Les administrations du composé ou du placebo se font par voie orale en gélule et non au moyen d’injections. L’animal est brièvement tenu à la main par l’expérimentateur pour introduire la gélule, il ne subit dont pas l’inconfort et la douleur d’une piqûre. Les enregistrements d’éveil et de sommeil sont limités à 6 heures et sont réalisés à l’aide d’un système sans fil ce qui permet à l’animal d’être complétement libre de ses mouvements. Les sessions se déroulent après une habituation dans une volière séparée et enrichie comme la volière d’hébergement. Un temps de repos est ménagé entre chacune des sessions pendant lequel l’animal est replacé en hébergement commun avec ses congénères.

Choix des espèces

Le chat est un modèle animal de référence pour le sommeil et les théories contemporaines sur l’alternance veille-sommeil. Par rapport aux petits mammifères comme les rongeurs, il a un cerveau de plus grande taille et un électroencéphalogramme dont les caractéristiques sont très proches de celui de l’Homme ; il a de plus une plus grande propension à dormir (environ 70% du temps contre 50% pour les rongeurs) et son sommeil comprend des stades similaires à ceux de l’homme, avec des de sommeil lent et l’activité pontogéniculooccipitale (absente chez le rongeur). Le chat est aussi l’espèce qui nous a permis d’identifier le modafinil et plus récemment, une thérapie histaminergique basée sur le récepteur H3 et utilisée depuis 2016 en Europe et 2019 aux USA pour améliorer l’éveil des patients narcoleptiques et hypersomniaques. Dans la continuité de nos recherches, cette espèce modèle devrait nous permettre d’explorer une nouvelle piste thérapeutique utilisant un ligand H2 en vue d’améliorer le sommeil notamment dans le cadre des troubles du sommeil lié au stress. Chats adultes d'un poids compris entre 3,0 et 5,0kg. Les paramètres étudiés dans cette étude nécessitent des animaux ayant atteint une maturité cérébrale, ainsi qu’une stabilité de l’architecture globale du cycle veille-sommeil, par opposition à des animaux jeunes ou sénescents. Le stade adulte garantit l’implantation reproductible des électrodes aux coordonnées stéréotaxiques prédéfinies.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Atteintes de mucoviscidose, elles reçoivent des injections de cellules tumorales ou des injections répétées d'uréthane pour induire des cancers, afin d'étudier le sur-risque tumoral lié à la maladie. Le porteur affirme que ses modèles de culture in vitro suffisent pour la majorité des expériences mais qu'une approche sur "organisme entier" reste "nécessaire" pour la tumorigenèse. Il renvoie les développements thérapeutiques à de possibles pistes futures.

Objectifs

Ces dernières décennies, les nouvelles thérapies de transplantation pulmonaire et celles visant à corriger l’expression du gène responsable de la mucoviscidose, ont permis à ces patients de dépasser les 40 ans. L’augmentation de l’espérance de vie des patients a également accentué l’apparition de nouvelles comorbidités associées à cette maladie, dont un risque accru de développer plusieurs types de cancers (cancers digestifs, pulmonaires, cutanés, etc.). Dans ces comorbidités, la composante vasculaire y est affectée mais encore peu étudiée. Néanmoins, nos travaux ont démontré que le gène responsable de la mucoviscidose avait un rôle insoupçonné dans les cellules endothéliales, en promouvant une dysfonction/inflammation endothéliale qui est également impliquée dans les pathologies menant à l’apparition de cancers (ex : obésité, diabète, inflammation chronique de l’intestin). De plus l’expression du gène responsable de la mucoviscidose est souvent réprimée dans de nombreux cancers et un haut taux de ce gène est corrélé à une mauvaise survie des patients. Notre projet vise donc à démontrer l’augmentation de l’incidence de cancer dans un modèle de souris déficiente pour le gène responsable de la mucoviscidose, puis d’expliquer comment une dysfonction des cellules endothéliales serait associée à ce développement tumoral. Nos différents travaux publiés et en cours démontrent l’implication des cellules endothéliales dans ce phénomène, mais dans une optique de transfert vers la clinique requiert le passage dans des modèles animaux vivants qui reproduisent de façon pertinente la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires systémiques associées.

Bénéfices attendus

Les dernières avancées thérapeutiques ont permis aux patients atteints de mucoviscidose de voir leur qualité et espérance de vie augmentées de façon significative. En revanche de nombreuses comorbidités préjudiciables à leur santé sont également apparues. Parmi celles-ci un risque élevé de cancers gastro-intestinaux, qui est maintenant pris en charge par un dépistage précoce chez ces patients. En revanche la cause principale du risque élevé de développer certains cancers n’est pas bien comprise. Grâce à ce projet, l’utilisation de différents modèles tumoraux, et à différents stades de la tumorigénèse, permettra d’ouvrir de nouvelles pistes pour expliquer l’élévation de l’incidence des cancers chez les patients atteints de mucoviscidose, et mettre en lumière de potentiels développements thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales (1 seule injection), ou à des injections intra-péritonéales répétées de traitements (1 injection hebdomadaire pendant 4 semaines). Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 4 injections par animal.

Impact sur les animaux

Les données de la littérature sur le modèle d’induction tumorale par injection intra-péritonéale d’uréthane (4 fois par semaine) ne font état d’aucun effet indésirable notoire pour les animaux lorsque ceux-ci sont euthanasiés au cours du 4ème mois suivant la première injection d’uréthane. Néanmoins, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.

Devenir

Des prélèvements de tissus seront nécessaires pour les études histologiques de nos procédures. De fait, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure. De même, les animaux ne pourront être réutilisés car les procédures précédentes pourraient potentiellement introduire une variabilité indésirable sur les prochaines expérimentations.

Remplacement

Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) et de cellules primaires dérivées de patients qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. Grâce à ces modèles nous avons d’ailleurs validé de nombreux aspects qui soutiennent notre hypothèse. L'approche sur organisme entier nous est en revanche nécessaire pour analyser des processus plus complexe et sur le long terme comme la tumorigénèse.

Réduction

Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons. Notre projet nécessitera 168 animaux au total.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en fin de procédure ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces. - Respiration anormalement rapide et synonyme d’une masse tumorale intrathoracique trop importante (dans le cas des tumeurs thoraciques). •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques : - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.

Choix des espèces

L’objectif principal de notre projet est de déterminer l’impact d’un défaut du gène responsable de la mucoviscidose sur le développement tumoral. Nos précédents travaux publiés ont utilisé le modèle de souris envisagé dans ce projet, et mis en lumière des défaut vasculaires qui pourraient expliquer l’apparition de cancers. De fait, l’utilisation de ce modèle de souris particulier au travers de différents modèles tumoraux nous apparaît pertinente et essentielle pour apporter une preuve solide étayant notre hypothèse. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature