Recherche fondamentale

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un morceau d'os du crâne leur est retiré par chirurgie, puis elles reçoivent trois injections. Le porteur reconnaît des douleurs post-opératoires liées au défaut osseux, à la coupe du périoste et aux sutures. Il indique qu'il faut prélever l'os pour l'analyser, ce qui impose de tuer les animaux, et présente le modèle du défaut de crâne comme largement validé.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre comment l'os se répare physiologiquement, afin de pouvoir à plus long terme créer des solutions efficaces pour la réparation osseuse de fractures qui ne se réparent pas seules. Dans un premier temps, des ablations d'un morceau de calvaria (crâne) seront réalisés sur des souris adultes. Les "trous" seront soit laissés vides, soit comblés avec un morceau d'os de calvaria contenant des cellules ostéocytes, soit comblés avec un morceau de calvaria sans ostéocytes, car les cellules seront tuées grâce à une technique de changement de température à plusieurs reprises. L'efficacité et la rapidité de la réparation de ces trous sera comparée à de l'os natif, sur des animaux qui n'auront pas subi de chirurgie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre si les ostéocytes jouent un rôle dans la réparation osseuse. Des études récentes montrent que tel est le cas. Les données apportées par ce travail permettront de créer des biomatériaux et des solutions thérapeutiques efficaces pour mieux traiter les défauts osseux critiques chez les patients malades ou atteints de trauma. Les ostéocytes ont été peu étudiées, bien qu'elles représentent 90 à 95% des cellules osseuses, et les différents biomatériaux permettant de réparer l'os à l'heure actuelle ne sont pas très efficaces.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 5 minutes environ ) et à 3 injections intra-péritonéales à différents temps (durée 1 minute pour chaque injection, espacées de plusieurs jours).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir du stress lors de l'anesthésie au gaz (phase d'induction dans la boite) avant la chirurgie et des douleurs pourront être perçues après la chirurgie, dues au défaut osseux réalisé, à la coupe du périoste et/ou aux points de suture réalisés pour refermer la peau.

Devenir

Nous travaillons sur la réparation osseuse. Nous avons donc besoin des pièces osseuses pour pouvoir les analyser. De ce fait, comme il n'est pas possible de prélever les os de calvaria et de laisser les animaux vivants ensuite, ils seront tous euthanasiés avant le prélèvement.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'étude in vivo par de l'in vitro. Des expérimentations in vitro seront menées en même temps sur de la co-culture de cellules mais cela ne remplacera pas la compréhension in vivo de la réparation osseuse et ne permet pas de comprendre le rôle des ostéocytes dans ce processus complexe, faisant intervenir différents types de cellules à différents temps de la réparation.

Réduction

Afin d'utiliser moins d'animaux, deux défauts seront créés sur chaque animal, de chaque côté de la suture sagittale. Nous effectuerons les deux premières études sur des mâles et des femelles car leur physiologie est différente. Pour les études suivantes, et afin de nous affranchir du rôle des hormones sexuelles qui affectent l'os, nous utiliserons uniquement des mâles. Cela évite de doubler le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, qui nécessitera beaucoup de temps d'analyse par la suite. Les femelles âgées et transgéniques seront étudiées dans un projet ultérieur.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et dans des cages avec de l'enrichissement naturel afin de leur offrir le meilleur cadre pendant l'étude. Nous utiliserons du gel lacrymal si les chirurgies durent plus de 5 minutes. Celles-ci seront réalisées sous anesthésie au gaz avec de l'isoflurane car le réveil est ensuite très rapide. Afin de diminuer le temps de la chirurgie, nous utiliserons le fait que la souris C57Bl6 est une lignée syngénique. Ainsi, les premiers volets osseux du groupe 3 (défauts laissés vides) seront traités (congélation/décongélation) par une tierce personne présente dans la salle de chirurgie, et réimplantés sur des souris du groupe 1 opérées ensuite. Ainsi, nous éviterons l'attente d'une quinzaine de minutes nécessaire pour tuer les ostéocytes du volet osseux. Il n'y aura pas de couverture chauffante car la table de chirurgie contient des plaques chauffantes que nous règlerons sur 37°C. La douleur sera réduite au maximum grâce à l'utilisation d'analgésique avant et après l'opération si besoin (buprénorphine). Une anesthésie locale type lidocaine pourra également être utilisée ainsi que des AINS. Cette analgésie multimodale sera discutée en SBEA avec le vétérinaire référent. Le stress sera également réduit en manipulant régulièrement les animaux avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. En cas de signes de douleurs persistantes en dépit des analgésiques, un score sera établi grâce à une échelle spécifique tenant compte des signes d'apparence, de comportement, d'hydratation et de signes cliniques bien spécifiques. Si le score est supérieur à 14 sur un total de 19 points, ce seuil limite entraînera l'euthanasie de l'animal pour abréger ses souffrances.

Choix des espèces

Le défaut de calvaria (ablation d'une petite partie de l'os du crâne) chez le rongeur est un modèle largement utilisé au laboratoire et validé dans la littérature. Ce sont des modèles de choix pour étudier l'influence des cellules et biomatériaux sur la réparation osseuse. Plusieurs lignées de souris seront utilisées dans ce projet: animaux avec ou sans mutations génétiques. Les mutations génétiques utilisées servent à voir les vaisseaux en vert en microscopie et d'autres animaux permettront de comprendre le rôle de la contrainte mécanique sur la réparation osseuse. Nous travaillerons sur des animaux adultes, et âgés car ce sont dans ces populations que l'on retrouve le plus de problèmes de réparation osseuse chez l'homme, en raison de trauma ou d'opération visant à extraire des tumeurs cancéreuses.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes chargés en phosphate, passent deux fois 24 heures en cage métabolique et reçoivent des injections de tétracycline. Le porteur décrit ces contraintes comme des stress légers déjà bien supportés lors d'un projet antérieur. L'objectif se limite à confirmer des résultats précédents et à tester si la source du phosphate alimentaire modifie le métabolisme phospho-calcique.

Objectifs

Le premier objectif est de confirmer les résultats issus des études précédentes réalisées dans le laboratoire sur l’homéostasie du métabolisme phospho-calcique. La première étude était constituée de souris sauvages et génétiquement modifiées (pour l’expression de protéines impliquées dans la régulation de la minéralisation osseuse) pour la BSP (Bone Sialoprotein) et/ou l’OPN (Osteopontin), ces souris recevaient un régime classique. La seconde étude a été réalisée avec ces mêmes souris, cependant, les souris recevaient des régimes avec diverses concentrations de phosphate (Pi) : standard, riche ou pauvre en Pi. Etonnamment, la régulation du métabolisme phospho-calcique des animaux a été impactée par le type de régime reçu : régime classique ou régime standard. Pourtant dans ceux-ci, la quantité de Pi est sensiblement égale (0.55%vs0.58%), mais, la source d’apport du Pi était différente (minérale vs organique). De ce fait, nous souhaitons valider que la source de Pi alimentaire (organique/minérale) modifie le contrôle du métabolisme phospho-calcique dans nos modèles. Le second objectif est de visualiser l’impact du fond génique des souris sur la régulation du métabolisme phospho-calcique. En effet, l’absorption intestinale est la voie d’entrée du Pi dans la circulation sanguine générale. Elle peut être effectuée par voie paracellulaire ou transcellulaire, le choix de la voie est dépendant de la charge alimentaire en Pi. En effet, la littérature démontre, qu’en condition d’apport faible en Pi, la voie transcellulaire domine, via une activation majeure d’un transporteur de Pi dans l’intestin : Npt2b. Lors d’une étude antérieure nos souris ont reçu un apport alimentaire faible en Pi, cependant le niveau d’expression du récepteur Npt2b a été réduite par rapport à un apport de Pi dit standard. Cette observation est donc en total contradiction avec les résultats de la littérature obtenus sur des souris C57Bl/6. Plusieurs hypothèses : la source de Pi du régime (minérale ou organique – objectif 1), ou alors le fond génique des souris (CD1/129sv) ne possède pas les mêmes mécanismes de régulation du métabolisme du phosphate. Pour répondre à cette hypothèse, des souris contrôles (C57Bl/6) et des souris (CD1/129sv) seront soumis aux mêmes régimes dans les mêmes conditions. Si la régulation est différente, cela signifie que le fond génique impact la réponse aux changements de l’apport alimentaire en phosphate.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de valider nos résultats préalablement obtenus sur les souris sur fond génique CD1/129sv, mais également de déterminer si les données divergentes avec la littérature, proviennent du fond génique ou de la source de phosphate dans l’alimentation.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une charge alimentaire en phosphate via des régimes spécifiques. De plus, les animaux passeront par deux, 24h en cage métabolique de manière à récupérer les urines et les fèces pour doser les marqueurs du métabolisme phospho-calcique. De plus, les animaux recevront deux injections de Tétracycline en intrapéritonéale (5 secondes par injections-30mg/kg) à 5 jours d’intervalle. La tétracycline est un antibiotique utilisée comme marqueur en histologie (marquage des fronts de minéralisation).

Impact sur les animaux

Les injections de tétracycline par voie intrapéritonéale, le passage en cage métabolique inférieur à 24h et le changement de régime alimentaire peuvent êtres des sources de stress pour les animaux. On s’attend donc à une légère modification du comportement (agitation/baisse de la consommation de la nourriture). Cependant, ces expériences ont déjà été effectuées lors de projet antérieur, et tous les paramètres (contrôle du poids/comportement) indiquent que les animaux supportent très bien les différents stress légers de ce projet. Enfin, la mise à mort des animaux sera effectuée par une personne habilitée et compétente et sur des animaux préalablement anesthésiés (anesthésie gazeuse (Isoflurane)) pour qu’aucune douleur ne soit ressentie.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissu biologique et de sang.

Remplacement

Nous souhaitons investiguer la régulation du métabolisme phospho-calcique, et ce contrôle est effectué à travers divers organes : l’intestin, l’os et le rein. La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme minéral et surtout celui du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.

Réduction

5 génotypes de souris seront nécessaires à l’étude et 4 régimes seront testés : classique, standard, pauvre et élevé en phosphate. Il y a donc 4 conditions par génotype et 5 génotypes ce qui fait 20 groupes expérimentaux. D’après nos études antérieures, un nombre de 8 points est jugé robuste et suffisant, mais sachant que les souris sont placées par 2 en cage métabolique pour réduire leur stress (permettant une meilleure homogénéisation des données, et une amélioration du bien-être notamment en réduisant la sensation de froid des animaux), il faut donc 16 souris par groupe. De ce fait, 16*4 (régime)*5 (génotype)= 320 animaux. En prenant compte, des expériences complémentaires/répétées qui pourront être nécessaires, 400 animaux seront nécessaires. Ainsi, le nombre d’animaux est réduit au juste nécessaire pour obtenir une puissance statistique robuste en tenant compte de la variabilité inter-individu.

Raffinement

Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. Les actes qui pourront produire un stress chez les animaux (cage métabolique/injections) seront réalisés dans des salles dédiées et par un expérimentateur habilité. La nourriture et l’eau seront à volonté. L’acte de mise à mort sera réalisé sur des animaux préalablement anesthésiés (Isoflurane) et réalisé rapidement par un manipulateur expérimenté. Les animaux qui proviennent de fournisseur agréé recevront la même attention que les animaux issus de l’élevage interne. De plus, ils seront inclus dans l’étude uniquement après une période d’acclimatation dans l’animalerie.

Choix des espèces

Les précédentes études de notre laboratoire ont été effectuées sur ces même souris avec le fond génique CD1/129 sv. L’ajout des souris sur fond génique C57BL/6 provient des résultats obtenus dans les données de littérature. L’étude sera menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population. De plus, c’est à cet âge que les précédentes expériences ont été menées.

2 528 souris vont être utilisées, tuées à l'issue ou mourant en cours d'étude pour les cohortes de longévité, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent injections, gavages, régimes gras sur plusieurs mois, tests métaboliques avec jeûne et prélèvements sanguins répétés, et passages en cage de calorimétrie. Le porteur reconnaît que régime gras, jeûnes, contention et transport sont des sources de stress. Il justifie l'espèce par l'espérance de vie courte de la souris, qui permet une étude de vieillissement en cinq ans, et présente le bénéfice thérapeutique comme lointain.

Objectifs

L’étude de la longévité et de l’espérance de vie en bonne santé est un enjeu actuel majeur. En effet, de par leurs forts impacts sur la santé publique, le vieillissement et les maladies chroniques font parties des thématiques prioritaires en recherche. Réduire le vieillissement et étendre l’espérance de vie en bonne santé est un enjeu économique majeur, en diminuant les maladies chroniques associées à l’âge. Ce projet de recherche s’inscrit dans cette thématique, en décrivant de façon originale le rôle méconnu des glucocorticoïdes (hormones circulantes impliquées notamment dans le métabolisme glucidique) dans le vieillissement des tissus sensibles à l’insuline, en particulier le tissu adipeux et le muscle squelettique ; et dans le vieillissement physiologique. Notre projet vise donc à définir l’impact des glucocorticoïdes sur le vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra in fine de proposer une approche thérapeutique ciblée afin de limiter l’impact métabolique néfaste des glucocorticoïdes et traiter les troubles métaboliques liés à l’âge pour étendre l’espérance de vie au global et/ou l’espérance de vie en bonne santé. De plus, ce projet déterminera si l’âge modifie la sensibilité aux glucocorticoïdes, notion importante sachant que les individus de plus de 65 ans sont surreprésentés dans la population traitée par les glucocorticoïdes.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront exposés à différents gestes techniques afin de répondre aux objectifs scientifiques. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les différentes séries de gestes réalisés sur les souris pourront être au choix selon les questions scientifiques : 1-Injections intrapéritonéale (1 fois par jour pendant 5 jours, 5 sec animal vigile), Administration de traitement dans l’eau de boisson (4 semaines maximum), Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte), 2h pour chaque tests, 2 tests espacé d’une semaine minimum), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 2-Injections intrapéritonéale (1 fois par jour pendant 5 jours, 5 sec animal vigile), Administration de traitement dans l’eau de boisson (4 semaines maximum), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 3-Utilisation de régimes spéciaux (20 semaines de régime maximum), Mesure de la pression artérielle (30 minutes pendant 5 jours, 2 fois au cours de la vie), transport optionnel vers un autre établissement, Mesure de la composition corporelle (5 à 10 minutes, animal vigile) et cages calorimétrie (5 jours maximum), Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests, 2 tests espacé d’une semaine minimum), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 4-Deux prélèvements sanguins espacés de 7 jours (20 secondes par prélèvement, 2 fois au cours de la vie sur animal vigile), Injection intrapéritonéale unique (5 sec par animal sur animal vigile), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 5-Etude de longévité incluant uniquement le maintien des animaux à long terme en conformité avec la réglementation et incluant un suivi avec établissement d’un score (5 min par animal, 1 fois toute les 6 semaines à partir de 18 mois et jusqu’à la fin de vie) Chaque point représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet les animaux seront impliqués dans différents actes pouvant induire un stress ou une douleur qui sera systématiquement prise en compte. Pour la quasi-totalité des animaux du projet, les administrations/prélèvements entraineront une contrainte/stress liée à la contention, au gavage et/ou à la piqure de l’aiguille pour les injections qui sont légers et de courte durée. Certains animaux seront exposés à des traitements aux glucocorticoïdes ou seront exposés à un régime gras pouvant induire une obésité et/ou une insulino-résistance. Ils seront également amenés à suivre des challenges métaboliques pouvant entrainer un stress ou des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie. Les animaux seront impliqués dans des mesures de la composition corporelle, de la pression artérielle et aux mesures de calorimétrie qui peuvent induire un stress de courte durée lié à leur placement en boites de contention ou de durée plus longue lors de l’isolement en cage de calorimétrie. De même, le transport possible des animaux vers un autre établissement qui pourra être mis en œuvre sera également source de stress pour les animaux. Enfin, les animaux inclus dans les cohortes de longévité pourront ressentir une contrainte/stress liée à la contention lors de l’évaluation de l’index de fragilité. Les animaux seront également exposés aux effets indésirables inhérent au vieillissement.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour limiter la souffrance animale et pour l’étude histologique ou biochimique des tissus sensibles à l’insuline des animaux. Dans le cadre de l’étude de vieillissement certains animaux seront susceptibles de décédés naturellement au cours de cette procédure de longévité ou seront euthanasiés par une méthode règlementaire en cas d’atteinte des points limites définis.

Remplacement

Il s’agit d’un travail de physiologie intégrée qui permettra de comprendre les communications inter-organes et les régulations métaboliques entre différents tissus. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire les interactions inter-organes et la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. D’un point de vue évolutif, le récepteur aux glucocorticoïdes apparait chez les vertébrés terrestres et plus particulièrement chez les mammifères, justifiant l’utilisation d’un modèle mammifère dans ce projet. Enfin, l’utilisation d’un modèle rongeur tel que la souris, se justifie par l’espérance de vie relativement courte de ces animaux, permettant la réalisation du projet dans le temps imparti (5 ans).

Réduction

Le projet impliquera un total de 2528 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte-tenu des données de la littérature et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. En effet, les procédures expérimentales et les tests statistiques ont été validées dans des études précédentes. L’effet de l’âge sur la mortalité des animaux et la variabilité des résultats a été pris en compte en augmentant le nombre d’animaux dans les groupes les plus âgés afin d’obtenir des résultats valides. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de leur vie grâce à une surveillance attentive (scoring, points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Nous avons inclus dans les protocoles de longévité des grilles d’évaluation spécifique, incluant des observations cliniques détaillées et le suivi du poids des animaux. Les animaux fragiles identifiés seront suivis avec une vigilance accrue. En cas d’atteinte d’un point limite préalablement défini, cela entrainera l’euthanasie de l’animal dans les plus brefs délais afin de limiter la contrainte au maximum.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Le récepteur aux glucocorticoïdes, tel que présent chez l’homme, est spécifique des mammifères et ne permet pas l’utilisation d’autres organismes modèles plus simples. Les expériences de longévité justifient l’utilisation de petits mammifères présentant une espérance de vie courte, tels que la souris. Plusieurs modèles murins transgéniques seront utilisés au cours de notre projet afin de répondre aux différentes questions scientifiques. Justification des stades de développement : Des souris commerciales et transgéniques seront utilisées de 10 semaines à 60 semaines afin d’étudier les adaptations métaboliques des animaux en cours de vieillissement. De plus, des animaux « gériatriques » (24 mois et plus) seront utilisés afin d’évaluer l’espérance de vie maximale des individus et leur sensibilité aux glucocorticoïdes. Justification du sexe : Les glucocorticoïdes sont connus pour induire un dimorphisme sexuel. Nous étudierons donc dans ce projet des animaux des deux sexes afin de déterminer si le dimorphisme sexuel en réponse aux corticoïdes est présent aussi avec l’âge.

660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur des voies aérodigestives leur est implantée, puis traitée par des virus oncolytiques et des anticorps, avec prélèvements sanguins répétés. Le porteur reconnaît que la croissance des tumeurs peut provoquer un inconfort et une perte de poids. Il présente ces données précliniques comme un jalon "indispensable" avant un éventuel passage chez l'Homme.

Objectifs

Les cancers des voies aérodigestives supérieures (VADS) affectent plus de 500 000 patients par an dans le monde. Ils sont souvent liés à la consommation de tabac et/ou d’alcool et, plus récemment, à l’infection par certains papillomavirus humains. D’une manière générale, ces cancers présentent un mauvais pronostic avec une survie à 5 ans d’environ 50%. Les traitements par chirurgie, radiothérapie ou chimiothérapie restent insuffisamment efficaces et sont associés à d’importants effets secondaires du fait notamment de la localisation de ces cancers. Ces données soulignent l’urgence de la mise au point de nouveaux traitements. Parmi ceux-ci, la virothérapie consiste en l'injection d'un virus dont le génome est modifié pour se répliquer sélectivement dans les cellules tumorales et les tuer tout en épargnant les tissus normaux. Ainsi, il a été montré que l’adénovirus oncolytique pouvait lyser des lignées de cellules de carcinomes de VADS et conduisait à une réduction de la croissance tumorale dans un modèle murin de xénogreffes de tumeurs humaines. Ces résultats ont été obtenus dans un modèle murin immunodéficient ce qui ne permettait pas d’aborder la question des propriétés immunostimulantes des adénovirus oncolytiques. Nos objectifs sont d’évaluer l’efficacité thérapeutique de différents adénovirus oncolytiques dans un modèle murin immunocompétent de tumeurs de VADS. Nous émettons l’hypothèse que l’administration in situ des adénovirus oncolytiques en (1) induisant la destruction des cellules tumorales et donc le relargage des antigènes tumoraux et en (2) reprogrammant le microenvironnement tumoral devrait favoriser l’induction de réponses immunitaires contre les antigènes tumoraux. De plus, (3) l’immunité préexistante contre l’adénovirus pourrait être mise à profit pour recruter et rediriger des lymphocytes au sein de la tumeur.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à apporter la preuve de concept de la capacité des adénovirus oncolytiques à déclencher, du fait de leur réplication dans les tumeurs, un remodelage de l’environnement tumoral dans les VADS et à favoriser l’établissement de réponses immunitaires anti-tumorales. Il permettra également de tester si une immunité anti-adénovirus préexistante peut être redirigée vers une, réponse immune anti-tumorale. Enfin, le projet permettra également d’établir l’intérêt de combiner la virothérapie à base d’adénovirus oncolytique avec une immunothérapie à base d’anticorps anti-point de contrôle du système immunitaire. Les données pré-cliniques obtenues dans les modèles murins syngéniques sont un jalon indispensable avant de pouvoir envisager l’utilisation chez l’homme, dans les cancers des voies aérodigestives supérieures, de combiner la virothérapie à base d’adénovirus oncolytique avec une immunothérapie à base d’anticorps.

Procédures

Tous les animaux recevront une injection de cellules tumorales après dépôt d’un anesthésique topique (durée 1 minute). Certains animaux auront des prélèvements de sang sous anesthésie à l’isoflurane (durée 3 minutes). Ces prélèvements auront lieu toutes les semaines avec un maximum de 4 prélèvements . Certains animaux auront d'autres injections après dépôt d’un anesthétique topique (durée 1 minute). Ces injections seront répétées sur 3 jours consécutifs et ensuite une fois par semaine . Certains animaux recevront une administration d’adénovirus ou d’anticorps après dépôt d’un anesthésique topique (durée 1 minute). Cette administration sera unique pour le virus et répétée chaque semaine pour les anticorps (avec un maximum de 3 injections).

Impact sur les animaux

Toutes les procédures impliquent l’administration de lignées tumorales chez la souris. Les injections de cellules tumorales ou de virus se faisant après anesthésie à l’isoflurane ou anesthésie locale à la lidocaïne, il n’est pas attendu de souffrance des animaux à ces étapes. Le développement de tumeurs après l’administration des lignées tumorales va conduite à la croissance de tumeurs. Ces tumeurs peuvent, lorsqu’elles atteignent une certaine taille, conduire à des effets secondaires, un inconfort, voire une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront tous porteurs de tumeurs, ils devront donc tous être euthanasiés.

Remplacement

Le but de ce projet est de déterminer l'efficacité d'injections intratumorale d’adénovirus oncolytiques couplés ou non à des administrations d’anticorps afin de tuer les cellules tumorales et de remodeler l’environnement tumoral pour générer des réponses immunitaires anti-tumorales. Comme il n’est pas possible à ce jour de reproduire toutes les fonctions des molécules et cellules du système immunitaire du corps entier par des méthodes alternatives, l’utilisation de d'animaux vivants est indispensable.

Réduction

Dans toutes les expériences, nous avons cherhcé à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Compte tenu de la littérature et de notre expérience de l’utilisation des adénovirus et des modèles de tumeurs, nous avons pu déterminer le nombre mnimal d'animaux à utiliser par condition testée. Ce nombre nous permettra d’évaluer la significativité des résultats obtenus (comparaison entre plusieurs groupes faite par une analyse de variance suivie d’un post-hoc test pour les comparaisons entre 2 groupes). Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les différentes procédures seront mises en œuvre séquentiellement. Ainsi, la première procédure permettra d’établir les paramètres de croissance des lignées et les procédures suivantes ne seront mises en œuvre pour une lignée tumorale donnée que si la première procédure a été concluante.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un environnement enrichi (nid, maison, tunnel). Toutes les injections réalisées seront réalisées sous anesthésie locale. Les prélèvements sanguins seront tous réalisés sous anesthésie générale . Dans la mesure du possible, les souris seront déplacées de leur cage vers l’appareil à anesthésie en utilisant des tunnels pour éviter de les prendre par la queue. Les souris seront suivies quotidiennement. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le modèle murin (souris), avec son génome similaire au génome humain à 99%, constitue, après les primates non humains, un modèle de référence pour les pathologies humaines. L’espèce utilisée est la souris. Le choix de cette espèce pour ce projet se base sur 2 arguments : - la disponibilité des lignées cellulaires caractéristiques nécessaires à ce projet, qui ont été développées dans cette espèce de souris ; - la possibilité d’analyser les réponses immunitaires anti-tumorales. Les animaux commandés seront des adultes de 6 à 8 semaines ce qui correspond à des animaux avec un système immunitaire mature. Ces animaux seront acclimatés durant une semaine avant d'être inclus dans le protocole.

112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 62 tuées pour prélèvements et 50 ramenées en élevage. La moitié est isolée pendant sept jours pour accroître leur agressivité avant un test où les animaux peuvent se battre et se blesser, l'autre test mesurant l'anxiété. Le porteur reconnaît le risque de blessures physiques et le stress social de l'isolement. Il justifie l'usage d'un "organisme entier" par la détection de phéromones, l'application visée étant une apaisine commercialisable pour l'élevage et les animaux de compagnie.

Objectifs

Les phéromones apaisantes maternelles sont des substances chimiques libérées par les glandes sébacées situées dans la région mammaire de la mère, peu après la mise-bas et durant la lactation. Il a été montré que ces phéromones ont des effets apaisants sur la progéniture, et également à l’âge adulte. Leur identification a permis une application pratique de ces « apaisines » en élevage ou chez les animaux de compagnie, pour faciliter la gestion de situations stressantes.. Préciser et comprendre comment ces phéromones agissent, notamment au niveau neurobiologique, immunologique, et de l’expression des gènes est un axe de recherche important dans lequel s’inscrit ce projet et qui nécessite le choix d’un modèle animal sur lequel plusieurs études fondamentales peuvent être facilement menées compte-tenu des outils d’analyse disponibles et des connaissances scientifiques actuelles. La souris est apparue comme le meilleur modèle au vu de l’existence de kits de dosages de neurohormones utilisables et validés, de kits de séquençage des gènes préconçus et la connaissance de plusieurs gènes de référence, et de l’anatomie fonctionnelle du cerveau et du système immunitaire de cette espèce. Au préalable, il est nécessaire d’évaluer/vérifier l’effet des substances chimiques composant la formule des apaisines sur le comportement des souris, notamment leur anxiété et agressivité. Si cette étude s’avère concluante et qu’un tel effet apaisant est confirmé, le projet devrait être poursuivi afin d’investiguer les impacts des apaisines sur la physiologie des souris et les mécanismes qui y sont liés. Outre les connaissances biologiques apportées par une telle recherche sur le plan fondamental, le projet a également un but applicatif plus direct. En effet, les souris comptabilisent près de 64% des animaux utilisés pour la recherche dans des conditions de vie potentiellement anxiogènes (milieu de vie relativement pauvre, stress dû aux manipulations…). Pour une meilleure fiabilité des données scientifiques et pour des raisons tout simplement éthiques, il est important de s'assurer de leur bien-être et de raffiner au mieux leur qualité de vie : l’installation de diffuseurs de phéromones apaisantes dans les animaleries expérimentales pourrait contribuer à l’amélioration de leur bien-être. L’utilisation des apaisines pourrait également être étendue à la sphère domestique pour les souris détenues comme animaux de compagnie.

Bénéfices attendus

Ils sont de 2 natures. Au niveau fondamental, cette étude permettra ensuite la réalisation d’autres études visant à investiguer le mécanisme d’action des apaisines et plus généralement de la communication chimique. Les mammifères terrestres s’appuyant sur la détection et l’interprétation des signaux chimiques de leur environnement pour guider leur comportement, notamment sociaux, cela est primordial pour leur survie et leur reproduction. Il est donc essentiel de connaître et comprendre les mécanismes d’action de la communication chimique. Cela est aussi nécessaire pour conforter l’utilisation actuelle des apaisines chez les animaux de compagnie et de rente. Au niveau appliqué, la confirmation de l’effet apaisant des substances testées permettra de développer une apaisine de souris qui pourra être ensuite directement utilisée dans les élevages à des fins scientifiques ou dans la sphère domestique pour les souris détenues comme animaux de compagnie. En effet, en France, 64% des animaux utilisés à des fins scientifiques sont des souris. S’intéresser au bien-être des individus hébergés dans ce cadre est essentiel : les raisons sont non seulement éthiques, mais elles concernent également la validité des résultats scientifiques – tout stress pouvant influer sur l’état mental et physique d’un individu et ainsi biaiser les résultats obtenus. De plus, assurer le bien-être des animaux utilisés à des fins de recherche est une exigence réglementaire. En fonction des recherches menées sur les animaux (limitant plus ou moins l’enrichissement du milieu de vie), diverses améliorations peuvent être mises en place ; c’est notamment dans ce cadre que s’inscrit la présente étude. En effet, si celle-ci confirme les effets apaisants de la formule de phéromone testée sur les souris (en diminuant leur anxiété et agressivité), le produit pourrait être diffusé dans les animaleries de recherche et ainsi contribuer au raffinement des conditions de vie. Il est également possible d’étendre l’utilisation des apaisines à la sphère domestique, par exemple lorsqu’un particulier adopte une nouvelle souris, afin de faciliter son adaptation à son nouvel environnement.

Procédures

La moitié des animaux (n=56) seront exposés au traitement apaisine, pendant toute la durée de l'étude (7 semaines), mais il n'est pas attendu de nuisances suite à cette exposition. Tous les animaux (n=112) subiront une fois chacun deux tests comportementaux (l’un durant 10 min et mesurant le niveau d’anxiété, l’autre durant 5 min mesurant le niveau d’agressivité) : ils peuvent être source d'angoisse/anxiété, stress psychologique, voire blessures, même si des dispositions sont prises pour éviter ces dernières. La moitié des animaux (n=56) subiront un isolement rapport à leur condition d'hébergement pendant 7 jours, qui peut être source de stress psychologique, mais qui est nécessaire en amont du test comportemental mesurant l’agressivité Une partie des animaux (n=62, 12 provenant de l'étude pilote et 50 provenant de l'étude principale) subiront une anesthésie générale par voie gazeuse au cours de laquelle sera effectué un prélèvement sanguin juste avant leur mise à mort. Cette intervention ne devrait pas durer plus d'une minute.

Impact sur les animaux

Durant la présente étude, les souris sont hébergées dans des conditions standards de laboratoire, ce qui peut engendrer plus ou moins de stress en fonction des individus dépendant de leur sensibilité et de la compatibilité des groupes formés. Certaines souris (n=56) font exception, étant isolées pendant sept jours pour les besoins du test comportemental mesurant l’agressivité dans des cages similaires mais plus grandes : cet isolement peut engendrer un stress social également, ces animaux étant sociaux et ayant toujours vécu en groupe. Cette durée a été choisie car conseillée dans la littérature afin d’accroître leur territorialité et donc leur agressivité envers un intrus. Ce test dure cinq minutes et constitue un stress social aigu. L’agressivité probable des souris faisant consensus dans une telle situation, les individus peuvent se battre plus ou moins violemment ; il y a donc un risque de blessures physiques. L’autre test comportemental a quant à lui été conçu pour évaluer l’anxiété des souris : celles-ci seront donc dans un état potentiellement anxieux durant les dix minutes du test, le fait que le dispositif soit surélevé avec deux branches non protégées par des murs constituant une source d’anxiété. Durant les essais, il y a également un stress de manipulation à prendre en compte, les souris appréciant peu le contact humain Le traitement lui-même, diffusé dans les salles, n’est pas sensé créer d’effet indésirable sur les souris, bien que cela soit surveillé tout au long de l'étude. La manipulation précédant l’anesthésie gazeuse pourrait être source de peur et représenter une nuisance, de courte durée cependant avant la perte de conscience de l’animal.

Devenir

Tous les animaux de l’étude pilote (n=12) sont immédiatement mis à mort à la suite du 2nd test comportemental pour les besoins de la suite du projet, c’est-à-dire la mise au point de méthodes de dosages à partir du volume de sang prélevé. Pour l’étude principale, les 50 souris qui auront subi un isolement rapport à leur condition d'hébergement pendant 7 jours sont mises à mort immédiatement à la suite du 2nd test comportemental, pour l’évaluation des paramètres du projet c’est-à-dire la réalisation des dosages de corticostérone et sérotonine. Les 50 souris ayant continué à être hébergées en conditions standard sont gardées en vie : elles seront ramenées en élevage après le 2nd test comportemental et seront utilisées ultérieurement pour de nouvelles mises au point méthodologiques, en fonction des résultats obtenus dans la présente étude.

Remplacement

Il s’agit notamment d’une étude de recherche fondamentale investiguant les mécanismes d'action physiologiques de la phéromone apaisante maternelle (apaisine). En tant qu'étude de physiologie, elle doit nécessairement porter sur des êtres vivants, qui représentent des systèmes biologiques intégrés, où de multiples organes/tissus fonctionnent de façon associée et coordonnée. En effet, l’utilisation de traitement phéromonal est une stimulation sensorielle par exposition à des phéromones qui nécessite l’utilisation d’organisme entier pouvant détecter et réagir aux composés testés. La détection de ces composés peut engendrer une cascade de réactions physiologiques pouvant mener à une modification du comportement ou de la physiologie de l’animal. Cela ne peut être obtenu et observé que sur animaux entiers pouvant pleinement exprimer leurs comportements et physiologies naturels. Il n'existe pas actuellement de méthodes de remplacement pouvant simuler ces changements suite à une stimulation sensorielle. Cela nécessite donc l’implication d’êtres vivants, dans ce cas des souris.

Réduction

L’effectif des animaux utilisés a été défini grâce à des tests statistiques de calcul de taille d’échantillons nécessaires, avec une puissance statistique de 90%, à partir de données issues d’études publiées. Selon ces calculs, en moyenne, en fonction des données mesurées, un effectif de 44 souris par traitement doit permettre d’observer une différence significative (si elle existe) entre les 2 groupes de l’étude principale (placebo vs. apaisine). 6 souris par condition ont été ensuite ajoutées pour pallier les pertes qui pourraient survenir pendant l’élevage, aboutissant à 50 animaux/groupe, soit 100 animaux au total pour l’étude principale. Une étude pilote est aussi prévue en amont, permettant l’entraînement et l’ajustement logistique et organisationnel des équipes sur un petit nombre d’animaux, qui vise à optimiser les chances de réaliser un essai probant scientifiquement : un effectif de 6 souris/groupe est estimé suffisant pour s’entrainer à la procédure, soit 12 souris au total pour l’étude pilote. Un effectif total de 112 souris est donc nécessaire. Aussi, du matériel biologique prélevé sur les souris de l’étude pilote étant utilisé pour mettre au point les méthodes d’analyse, cela maximise l’utilisation des animaux et contribue à la réduction du nombre d’animaux impliqués dans la recherche.

Raffinement

Concernant l’hébergement, les cages sont nettoyées 1 fois/semaine et aménagées pour répondre aux besoins de l’espèce, comprenant notamment de la litière (copeaux), eau et nourriture ad libitum, des enrichissements comme brique en bois pour ronger, tunnel et cabane en carton pour se cacher, fibres de kraft et coton pour nidifier, et des tapis anti-bruit dans les salles d’élevage. Grâce à une grille d’évaluation du bien-être, les animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié afin de s’assurer d’un état clinique normal et de l’absence de signes de souffrance (par exemple : état du pelage, évaluation de la nidification, présence du comportement fouisseur, absence de comportement anormaux). Un arbre décisionnel basé sur les critères d'arrêt de souffrance est mis en place au cas où des signes de souffrance seraient constatés et les points limites adaptés atteints. Pour manipuler les souris, l’utilisation d’un tunnel de manipulation a été choisie pour limiter le stress. Toutes les manipulations ont lieu pendant la période d’activité des souris au laboratoire (après-midi), et sous lumière rouge (imperceptible) pour respecter leur activité nocturne. Une période d’habituation pré-test à la salle de 30min est réalisée. La présence physique des expérimentateurs dans les salles d’expérimentation sera réduite à son minimum au cours des observations comportementales qui seront vidéo-enregistrées. La ponction sanguine est réalisée sous anesthésie générale. La mise à mort est effectuée sur animal anesthésié en emmenant chaque souris dans une pièce dédiée du laboratoire, hors de la vue/ouïe/odorat de congénères pour éviter toute communication de stress entre individus.

Choix des espèces

L’objectif est de valider les effets comportementaux (anxiété et agressivité) des phéromones apaisantes maternelles (apaisines) sur les souris, pour étudier ensuite leur mode d’action, notamment au niveau neurobiologique, immunologique, et de l’expression des gènes. La souris est apparue comme le meilleur modèle au vu de l’existence de kits de dosages de neurohormones utilisables et validés, de kits de séquençage de gènes préconçus et de la connaissance de plusieurs gènes de référence, de l’anatomie fonctionnelle du cerveau et du système immunitaire de cette espèce. Développer des apaisines chez cette espèce revêt également un intérêt. La souche choisie est connue pour son caractère plus manipulable, moins anxieux et agressif pour limiter les risques de blessures lors des tests comportementaux. Elles ont un comportement maternel plus prononcé, ce qui, pour les apaisines, semble plus pertinent. Aussi, rapport aux études immunologiques envisagées ensuite, ces souris développent une réponse immunologique plus variée et représentative. Les souris impliquées dans l’étude sont des adultes. Elles ont 2 mois pour 56 d’entre elles et 3 mois pour les 56 autres. Le fait qu’une partie d’entre elles soient plus âgées devrait permettre à ces souris d’être plus grosses et plus dominantes envers les autres, et donc d’exprimer plus fortement le comportement agressif/territorial recherché. Le choix de sélectionner des adultes permet également d’étudier des souris susceptibles d’exprimer une diversité de comportements de leur espèce. De plus, ces animaux auront déjà une expérience sociale : ainsi, un isolement pour les besoins du test comportemental mesurant l’agressivité aura hypothétiquement moins d’effets délétères que sur des souris tout juste sevrées; cependant, les recherches sur l’impact d’un isolement à cet âge sur le bien-être des individus manquent à ce jour pour confirmer cette hypothèse.

Pour caractériser la pharmacocinétique de produits destinés à la mise sur le marché, médicaments ou agents de contraste, 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit le produit testé une ou plusieurs fois, par la veine, sous la peau, dans le muscle, l'abdomen, la trachée, le nez, l'œil ou par la bouche, le porteur disant faire "un effort" pour ne pas dépasser cinq injections. Dans l'œil, l'injection peut provoquer un glaucome ou une perte de vision, et dans le coussinet de la patte, elle peut gêner la marche jusqu'à l'eau et la nourriture. Pour une partie des études, une souris peut subir le premier jour jusqu'à dix acquisitions d'imagerie sous anesthésie générale, puis trois par jour les trois jours suivants, une par jour jusqu'au dixième jour et deux par semaine ensuite. Le porteur juge l'expérimentation animale "nécessaire" faute de méthode capable de reproduire la biodistribution "dans un organisme vivant", et résume le bénéfice attendu en une phrase : contribuer "à la mise sur le marché de nouveaux produits".

Objectifs

L’autorisation de mise sur le marché (AMM) d’un produit (médicament, agent de contraste…) nécessite au préalable de caractériser notamment sa pharmacocinétique et sa pharmacodynamique. La pharmacocinétique consiste à évaluer l’absorption, la diffusion, la métabolisation et l’excrétion du produit par l’organisme. Elle permet notamment d’améliorer les dosages et la posologie du produit par l’étude de sa concentration sanguine au cours du temps. Elle permet également de déterminer les voies d’administrations optimales selon la métabolisation du produit dans l’organisme. La pharmacodynamique consiste quant à elle à évaluer les effets du produit sur l’organisme. Ce projet a pour objectif de caractériser la pharmacocinétique et la pharmacodynamique après administration de produits chez la souris. Le recours à l’imagerie médicale (imagerie à rayons X ou imagerie optique) dans ce projet permettra de suivre au cours du temps la distribution de produits radio-opaques, rendus fluorescents ou bioluminescents de manière quantitative et spatiale. Cette méthode d’analyse présente l’avantage d’être non-invasive, nécessitant seulement une anesthésie générale. Elle permet également de suivre un même animal au cours du temps et donc de diminuer l’impact de la variabilité individuelle sur les résultats et de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Il n’existe pas de méthode alternative à l’heure actuelle permettant de modéliser de manière fiable l’évolution et les effets d’un produit dans un organisme vivant. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire à l’objectif de ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à la mise sur le marché de nouveaux produits.

Procédures

Les animaux recevront une injection unique ou répétée (selon la voie) du produit test par voie intravasculaire (intraveineuse) ou extravasculaire (sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale, intratrachéale, intranasale, per-os ou intravitréenne) en respectant les volumes d’injections recommandés. Lors d’injections répétées, un effort sera fait pour ne pas excéder 5 injections maximum par animal. Sur animaux vigiles, les injections sont réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute), en comptant l’anesthésie la durée est d’environ 5 minutes. Des examens micro-scanner ou d’imagerie optique pourront également être réalisés sous anesthésie générale. Un examen micro-scanner peut aller jusqu’à 20 minutes, celui de fluorescence est d’en moyenne 5 minutes, la fréquence des examens sera de : - maximum 10 acquisitions par jour le premier jour puis, - maximum 3 acquisitions par jour pendant les 3 jours suivants puis, - maximum 1 acquisition par jour jusqu’au 10ème jour puis, - maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude pour la procédure n°1. - Maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude pour la procédure n°2. Pour les examens de bioluminescence, la durée est d’en moyenne 5 minutes, les fréquences seront de : - maximum 2 acquisitions par jour les 3 premiers jours puis, - maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude pour la procédure n°1. - Maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude pour la procédure n°2. Une injection de luciférine sera faite avant chaque acquisition de bioluminescence. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 1 fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude en respectant les volumes éthiques. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration, pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (risque de déshydratation et pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies répétées, inflammation des sites d’injection). Certaines voies d’administration sont plus inconfortables que d’autres et nécessitent une prise en charge analgésique pré et post injection : sous-cutanée dans le coussinet du pied qui peut gêner la locomotion de l’animal et donc l’accès à l’eau et la nourriture et les injections intravitréennes pouvant altérer la vision (glaucome ou perte de vision de l’œil injecté). Dans tous les cas, des mesures adaptées sont mises en place.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole. Tout organe pertinent pourra être prélevé après mise à mort de l’animal afin de réaliser une quantification des produits par imagerie ex-vivo (micro-scanner ou imagerie optique) ou par d’autres techniques in-vitro.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser la pharmacocinétique et notamment la biodistribution d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la biodistribution d’un produit dans un organisme vivant.

Réduction

L’avantage de l’imagerie médicale est de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier la biodistribution du produit testé, des groupes d’au moins 6 animaux seront constitués. Si nécessaire, des études pilotes pourront être réalisées sur un nombre limité d’animaux (3 par groupe minimum) afin de confirmer la visualisation d’un produit marqué en in-vivo par exemple.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 6 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en cage de manière collective durant toute la durée de l’étude (sauf exception en cas de bagarre ou blessure et pour les animaux background (BKG)), avec des enrichissements appropriés (abris, matériel de nidation, bois à ronger…). Selon les études, les animaux BKG pourront être hébergés collectivement ou individuellement. Les souris BKG sont des animaux contrôles (généralement non injectés) utilisés comme référence pour mesurer le bruit de fond des acquisitions d’imagerie optique. En cas d’hébergement individuel, les cages seront organisées de manière à permettre à minima un contact visuel avec les animaux adjacents et un enrichissement supplémentaire (ex : mouchoir) sera apporté. Ce type d’hébergement présente l’avantage de mieux vérifier la prise alimentaire et l’abreuvement de chaque animal, et ainsi vérifier leur état général. Au cours de l’étude, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible, les mesures nécessaires : mesure de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc…) ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Le poids des animaux sera mesuré tout au long des études et pourra être complété par un scoring des signes cliniques généraux (comportement général de l’animal pour déceler une éventuelle apathie, la réponse à la stimulation, l’état de son pelage (soyeux ou en pilo-érection), présence d’écoulement nasaux et oculaires, difficultés respiratoires) ou en lien avec la voie d’administration pour les injections dans les coussinets (inflammation, lésion, nécrose du site d’injection, difficulté dans la locomotion et le déplacement pour atteindre l’eau et la nourriture) et intravitréenne (inflammation, lésion au site d’injection, gêne à l’œil injecté : œil-mi-clos, fermé ou glaucome). Ces observations serviront à établir un score total permettant d’évaluer l’état de santé général des animaux. Des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (injection de fluides, analgésiques, antibiotiques, etc…) dans la mesure où les actions n’interfèrent pas avec les produits injectés (en fonction des connaissances des produits).

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi : - Pour sa taille réduite et parce qu’il permet l’utilisation de technique d’imagerie du corps entier, - Car il s’agit d’une espèce couramment utilisée pour étudier la pharmacocinétique et pharmacodynamique en expérimentation animale et permettant de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). Des souris de plus de 6 semaines seront utilisées au cours de ce projet (stade jeune adulte) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal et d’avoir des animaux présentant un poids d’environ 20g.

1 158 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées au plus tard 30 heures après leur infection. Sans anesthésie, chacune reçoit dans l'abdomen une injection d'Escherichia coli résistantes aux antibiotiques, qui déclenche une septicémie dès deux heures, puis une injection d'antibiotique sous la peau du cou toutes les deux heures pendant 24 heures. Les antibiotiques testés, dont le céfidérocol, sont déjà utilisés chez l'humain en dernier recours, et l'équipe veut vérifier qu'ils restent efficaces contre de grandes quantités de bactéries. Sa grille de points limites cote la posture voûtée, le poil hérissé et la prostration, et le porteur écrit qu'"Aucune douleur n'est à attendre".

Objectifs

Il est urgent de développer de nouvelles molécules antibiotiques pour lutter contre les bactéries ultrarésistantes. Parmi elles, Escherichia coli (E. coli) est la bactérie la plus fréquemment responsable d’infections urinaires et digestives et d’infections généralisées (septicémies) chez l’homme. Elle est aussi parmi les plus touchées actuellement par la résistance aux antibiotiques, avec parfois plus aucun antibiotique efficace (bactéries ultrarésistantes). De nouveaux antibiotiques ont été très récemment développés et ont montré leur efficacité pour tuer certaines bactéries ultrarésistantes. Ces antibiotiques ont montré leur efficacité au laboratoire dans des tubes à essai contre des souches de E. coli ultrarésistantes, mais chez l’homme, faute de données d’efficacité suffisamment nombreuses et du fait d’échecs de traitement rapportés chez certains malades, ces antibiotiques ne peuvent être utilisés qu’en dernier recours et lorsque le recours aux autres options disponibles n’est pas envisageable. On dispose actuellement de très peu de travaux de recherche sur l’utilisation de ces nouveaux antibiotiques, notamment peu de choses sur leur efficacité quand il y a une quantité importante de bactéries (appelé « inoculum important »). L’étude de l’efficacité des antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes se fait au laboratoire « in vitro » c’est-à-dire dans des tubes à essai, mais l’utilisation de modèles vivants sont pour l’instant indispensables pour prendre en compte aussi les défenses immunitaires des êtres vivants et des paramètres de distribution dans le corps de l’antibiotique. C’est pourquoi avant de les tester chez l’homme il est nécessaire de faire des expériences chez l’animal, en l’occurrence la souris. L’objectif de notre travail est l’analyse de l’efficacité de ces nouveaux antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes (ou inoculum différent) pour s’assurer qu’ils restent efficaces même pour tuer de grandes quantités de bactéries. Nous utilisions pour ces expériences un modèle d’infection intra abdominale de la souris qui provoque une septicémie et avec lequel on peut faire varier la quantité de bactéries. L’efficacité des antibiotiques sera évaluée en termes de survie des animaux infectés et nombre de bactéries présentes apres traitement au niveau de la rate des animaux (qui correspond à ce qui se trouve dans le sang).

Bénéfices attendus

Les résultats de ce travail pourront permettre de mieux définir les conditions de l’utilisation de ses molécules chez l’Homme et comprendre pourquoi parfois elles ne marchent pas.

Procédures

Les souris seront infectées par une injection dans le ventre (intra péritonéale) à l'aide d'une aiguille fine de 250μL contenant un mélange de bactéries sur animal vivant non anesthésié (durée du geste environ 5 secondes) et traitées par antibiotiques par une injection sous la peau du cou de 0,2mL toutes les deux heures (durée du geste 5 secondes). Elles seront surveillées de façon très rapproché puis euthanasiées si elles montrent le moindre signe de souffrance avant la fin de l'expérimentation. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur souris vivante. Un prélèvement stérile de liquide péritonéal (2mL) et de la rate seront réalisés après euthanasie de la souris. Un prélèvement sanguin (2mL) par ponction intra-cardiaque sera également réalisé après l’euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce modèle représente un modèle de sévérité modérée d’infection péritonéale bactérienne avec septicémie qui apparait à partir de 2h après l’inoculation bactérienne. Aucune douleur n’est à attendre, en revanche les souris peuvent être stressées, avec des signes tels que les poils hérissés et une fatigue.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de l'experimentation ou avant en cas d'atteinte d'un point limite pour limiter au maximum des souffrances inutiles. La durée totale est de 30h au maximum (2h infection + 24h traitement + 4h post traitement). Tous les animaux seront mis à mort, car nous aurons à faire des prélèvements des organes et du sang, qui ne peut se faire sur animal vivant.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes se fait au laboratoire « in vitro » c’est-à-dire dans des tubes à essai, mais l’utilisation de modèles vivants sont pour l’instant indispensables pour prendre en compte aussi les défenses immunitaires des êtres vivants et des paramètres de distribution dans le corps de l’antibiotique. C’est pourquoi, avant de les tester chez l’homme, il est nécessaire de faire des expériences chez l’animal. En effet, la complexité d'une infection in vivo rend pour l’instant le remplacement de ce modèle expérimental par des modèles in vitro (tube à essai) non réalisable.

Réduction

De nombreuses analyses seront réalisées en amont pour réduire les conditions testées et les animaux utilisés. Les analyses déjà réalisées au sein de l’équipe seront une base pour cibler les doses des traitements antibiotiques nécessaires, permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Toutes les molécules testées sont des antibiotiques. Pour le cefiderocol, une étude de dose (pharmacocinétique) sera nécessaire car cette molécule n’a jamais été utilisée dans le modèle ; en revanche pour l’avibactam et aztreonam l’étude a déjà été réalisée dans notre laboratoire et ne sera donc pas refaite, pour limiter le nombre de souris utilisées. Des souris dites "contrôles", c'est a dire traitées avec des antibiotiques dont on sait qu'ils sont efficaces, seront utilisées, mais ces contrôles ne seront pas répétés à chaque experimentation pour limiter le nombre de souris utilisées. Les organes (rate, liquide péritonéal) seront congelés et conservés à -80°C pour permettre une analyse ultérieure en cas de besoin sans devoir recourir à nouveau à l'expérimentation chez la souris.

Raffinement

En ce qui concerne le raffinement, il sera obtenu grâce au respect d’un délai d’au moins 72h entre l’arrivée des souris au laboratoire et le début de l’expérimentation animale, le respect des conditions optimales d’hébergement des souris en animalerie en portoirs ventilés, c'est à dire en cages adaptées bien ventilées (5 souris par cage) et la surveillance des animaux toutes les 2 heures pendant toute l’expérimentation, avec accès facile à l’eau et à la nourriture. L’apparition de signes chez l’animal de souffrance avec un score de points limites sera surveillée de près. Les délais entre l’infection par les bactéries et le traitement antibiotique sont réduits à deux heures pour limiter le risque de souffrance. L’euthanasie sera programmée 4h après la fin du traitement antibiotique qui dure 24 h, sans attendre de décès spontané, ou avant si des signes de souffrance apparaissent (torpeur, poil hérissé ...). Un score de points a été établi, prenant en compte 3 paramètres, avec à chaque fois une gradation de 0 à 4: la posture normale voutée, voutée+ et voutée ++, la mobilité: normale, altérée, altérée + et prostrée et le poils: sans atteinte, hérissés, hérissés + et hérissés ++. Le point limite est atteint si la somme des points est > ou = à 6 ou si le score de 3 est atteint pour la mobilité ou la posture. En cas d’atteinte du point limite, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est un animal vertébré dont l’anatomie et la physiopathologie de l’infection intrapéritonéale sont suffisamment proches de celle de l’homme pour autoriser l’étude des thèmes mentionnés plus haut. La souris est l’espèce la plus utilisée par la communauté scientifique internationale dans la thématique de l’infection intra-péritonéale. Les souris utilisées ont 8 semaines (environ 25 grammes). Ce sont des animaux adultes pour utiliser des souris de poids suffisant.