Recherche fondamentale

1 584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur, des prélèvements de sang hebdomadaires et l'injection d'une molécule d'ADN, pour étudier le lien entre microbiote intestinal et efficacité des immunothérapies anticancéreuses. Le porteur décrit une gêne modérée liée aux tumeurs sous la peau et affirme qu'un animal vivant et "entier" est "indispensable" faute de reproduire l'immunité antitumorale in vitro. Il présente un effet possible sur la survie des patients résistants comme une retombée majeure attendue.

Objectifs

Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements au cours d’une dysbiose intestinale suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin. L’altération de l’expression de cette protéine conduit donc à une accumulation de ces cellules immunosuppressives dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. Afin de montrer le lien de causalité entre la présence des cellules impliquées et la perte d’efficacité des traitement d'immunothérapie, nous souhaitons dans un contexte traitement antibiotiqueou par la colonisation intestinale par certaines bactéries être en mesure d’induire une forte expression de la protéine d'intérêt à distance de la tumeur afin de capter certaines cellules d'importance. Nous envisageons donc d’administrer une molécule induisant l’expression la protéine d'intérêt dans le foie. Le rationnel de ce projet est de confirmer l’effet délétère de ces cellules importantes recirculantes au cours d’une modification du microbiote intestinal en forçant leur rétention dans le foie plutôt que dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons montrer qu’en l’absence de ces cellules d'intérêt d'origine intestinales dans la tumeur, nous sommes en mesure de restaurer l’efficacité des traitements par immunothérapie, malgré le contexte de changement de microbiote intestinal. Cela aurait donc un impact très important sur la survie des patients résistants aux traitements par immunothérapies.

Procédures

Greffes de tumeur: une injection sous anesthésie locale, durée 1 minute. Prélèvements de sang sous anesthésie générale (1 fois/semaine, durée 3 minutes) - Injection du produit (molécule d'ADN d'intérêt) sous anesthésie générale (1 fois, durée 3 minutes), prostration de courte durée suite à l'injection.

Impact sur les animaux

Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs, d’administration orale de bactéries et l’injection du plasmide, ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons définis un nombre maximal théorique de 18 animaux par groupe. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes entre eux. Le nombre d'animaux par groupe pourra être diminué à 12 (analyses en cours de procédure) si nous obtenons une résultat statistique. Ce résultat statistique sera basé sur la réduction du nombre de cellules a4b7 dans la tumeur ou leur augmentation dans le foie en présence du plasmide. Enfin, les dernières procédures envisagées se seront réalisées que si les premières procédures donnent les résultats attendus.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être, avec enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement (prostration, auto-agressions, etc). Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Les points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. - Génétique proche de celle de l’Homme et bien connue - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines.

Toutes les souris subissent une chirurgie d'environ 15 minutes destinée à provoquer des microhémorragies disséminées dans tout le cerveau, par des cyclodextrines à forte dose qui ouvrent la barrière hématoencéphalique en "érodant" les membranes cellulaires, puis une IRM de 30 minutes sous anesthésie sept jours après l'injection. Les 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont des souris de lignées hémophiles ou atteintes de la maladie de von Willebrand, pour observer si leurs microhémorragies se transforment en hémorragie cérébrale. Le porteur présente l'hémorragie intracérébrale comme "le type d'Accident Vasculaire Cérébral (AVC) le plus dévastateur", et n'envisage chez les souris opérées qu'une possible "gêne" : perte d'appétit, de motivation, anxiété accrue. Toutes sont mises à mort à la fin de la procédure, et leur cerveau est prélevé pour des analyses histologiques et immunohistochimiques.

Objectifs

Notre projet repose sur l'utilisation d'un modèle pré-clinique de microhémorragies cérébrales (MHC) disséminées dans tout le cerveau du rongeur, modèle se rapprochant ainsi des cas cliniques retrouvées dans certaines maladies neurodégénératives. Ce modèle repose sur l’utilisation de cyclodextrines (CD) qui, à forte dose, ouvrent les barrières biologiques comme la barrière hématoencéphalique (BHE), en « érodant » les membranes cellulaires endothéliales jusqu'à obtenir des MHC disséminées. Ce modèle a été validé chez la souris. Les MHC sont des constructions radiologiques qui se présentent sous la forme de foyers hypointense visibles et qui sont prédicteurs d'une future hémorragie intracérébrale (HIC), le type d'Accident Vasculaire Cérébral (AVC) le plus dévastateur sans traitement validé à ce jour. Le but de ce projet est d'évaluer dans quelles mesures les troubles hémostatiques influencent l'incidence des MHC et leur transformation en HIC. L'existence d'un trouble hémostatique favorise-t-il la transformation en macro-saignement? Par quels mécanismes? Les anomalies hémostatiques congénitales telles que l'hémophilie et la maladie de von Willebrand sont des situations uniques, dans lesquelles l'HIC est fréquente et dévastatrice. Grâce à l'utilsation de lignées murines d'hémophilie et de maladie de Von Villebrand, nous explorerons la transformation potentielle des MHC en HIC et étudierons le rôle de ces défauts hémostatiques sur la réponse inflammatoire autour du saignement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'influence de troubles de l'hémostase (défaut de coagulation ou de l'hémostase primaire) sur la fréquence et la taille des MHC, ainsi que les mécanismes impliqués dans leur transformation en HIC, notamment sur la réponse inflammatoire autour du saignement. L'identification des facteurs prédictifs d'une future hémorragie cérébrale est de la plus haute importance chez les personnes atteintes de graves déficiences hémostatiques et peut conduire à une modification du régime de traitement préventif des patients, et peut aussi, en cas d'HIC, leur permettre de bénéficier de traitements innovants pour lesquels ils sont actuellement exclus par principe de précaution. A partir d'un scénario plutôt caricatural d'une maladie génétique rare, ces nouvelles connaissances peuvent également profiter à tous les patients présentant d'autres anomalies hémostatiques (par exemple les personnes traitées par anticoagulants oraux).

Procédures

Tous les animaux subiront la chirurgie permettant d'induire les MHC (environ 15 min par intervention), ainsi qu'une IRM à 7j de l'injection (chaque IRM dure 30 min).

Impact sur les animaux

L'induction des MHC chez les animaux se fait par une chirurgie réalisée sous anesthésie. Malgré nos précautions, il se peut que que cela entraine une gêne chez l'animal à plus ou moins long terme (perte d'appétit, de motivation, augmentation de l'anxiété). De même, les animaux subiront une IRM nécessitant une anesthésie non invasive sous isoflurane pouvant entrainer un stress et un mal-être chez l'animal mais qui reste proche de l'induction et dont les effets sont minimes et à court terme. La mise en place d'une surveillance rapprochée et de points limites permettra de limiter au maximum ces gènes potentielles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Le cerveau sera ensuite prélevé dans le but de réaliser des études histologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

L’expérimentation proposée vise à comprendre les mécanismes impliqés dans la survenue de MHC dans un contexte de troubles hémostatiques Il s’agit de l’étude d’un modèle physiopathologique intégré faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux mécanismes donc la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro.

Réduction

L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 450 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie.

Raffinement

Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une vigilance particulière sera réalisée sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront mis à mort dans une salle dédiée. La structure BEA (Bien-Etre Animal) ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air) et de l'enrichissement dans les cages.

Choix des espèces

Le retentissement des conséquences neurologiques induites par cette ces procédures varie en fonction des espèces choisies. En accord avec ces données de la littérature et surtout afin de stabiliser la reproductibilité des lésions cérébrales contribuant à terme à réduire le nombre d’animaux opérés, nous avons choisi des souris C57bl6 homozygotes stables. Le choix de cette espèce de rongeurs repose sur les recommandations STAIR et est adapté à l’évaluation expérimentale. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois, âge nécessaire pour permettre la mise en place des troubles hémostatiques.

1 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, un suivi de la croissance tumorale trois fois par semaine au pied à coulisse et des injections de traitements, pour étudier l'épuisement des lymphocytes T face aux tumeurs. Le porteur indique que la croissance tumorale et les injections peuvent provoquer stress et douleurs de courte durée. Il affirme que la complexité de l'étude des tumeurs interdit de la reproduire in vitro et espère identifier des cibles pour surmonter la résistance aux immunothérapies.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires développées contre les cancers sont souvent insuffisantes. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires. Ce phénomène est en partie lié à l’expression par les lymphocytes T de protéines bloquant leurs fonctions, aussi appelés «points de contrôle ». Depuis une dizaine d’années, le développement de traitements dirigés contre ces points de contrôle a permis d’améliorer considérablement le pronostic de certains cancers. Malheureusement, seule une fraction des patients répond à ces traitements. Certaines molécules sécrétées en contexte inflammatoire contribuent au développement d’un épuisement des réponses immunitaires, notamment via la baisse d'expression d'une protéine aux fonctions multiples. L'objectif est d'identifier les molécules de l'inflammation responsable de cet épuisement, ainsi que les acteurs associés afin d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles permettant d'améliorer l'efficacité des traitements existants.

Bénéfices attendus

Au terme de ce projet, nous pourrons déterminer si le traitement testé pourrait avoir une efficacité anti-tumorale. De plus, nous espérons que ces nouveaux traitements permettent de rattraper une résistance éventuelle aux thérapies existantes.

Procédures

Injection sous-cutanée de cellules tumorales (30 secondes/injection/souris). Mesure trois fois par semaine de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse pendant 3 semaines environ (1 minute/mesure/souris). Pour certains animaux seulement, injection intrapéritonéale de un ou deux traitements (30 secondes/injection/souris) pendant 4 à 5 injections espacées de 3 jours, soit 15 jours de traitement au total.

Impact sur les animaux

Les injections sous-cutanées peuvent entraîner une douleur légère de courte durée. Les injections par voie intrapéritonéale peuvent entraîner un stress et une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress de courte durée chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever les organes pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.

Remplacement

La complexité inhérente à l'étude des tumeurs ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie, et minimum trois fois par semaine par le responsable du projet. Des mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre si nécessaire (mise à mort et analyse des animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier l’impact des traitements sur le développement tumoral.

530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de deux formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles reçoivent des injections de vecteurs viraux dans la moelle épinière ou les muscles des pattes arrière, puis passent des tests locomoteurs nommés rotarod, gait, Von Frey et grip, pour évaluer une thérapie génique. Le porteur décrit des injections à faibles effets et une classification modérée liée au cumul du phénotype et des tests. Il renvoie les retombées cliniques au conditionnel et au long terme, et affirme que seuls des modèles souris permettent d'établir la preuve de concept.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester des approches de thérapie génique sur des modèles souris de la maladie de Charcot Marie Tooth (CMT). Il s'agit notamment de déterminer l'effet bénéfique d'injection ciblée de vecteurs viraux médicaments exprimant un gène thérapeutique.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si les approches de thérapie génique proposées ont un effet bénéfique pour améliorer ces deux formes de Charcot Marie Tooth (CMT). Il s'agit d'une étude préclinique qui permettra, en cas de bénéfices thérapeutiques, d'établir la preuve de concept de l'efficacité de ce type d'approche de thérapie génique ciblée pour la maladie de Charcot marie tooth (CMT). A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT et déboucher sur des essais cliniques pour les patients atteints de CMT.

Procédures

L'ensemble des animaux (n=530) subiront des injections ciblées au niveau de la moelle épinière ou dans les muscles des pattes arrières. Ces interventions sont de courte durée (de l'ordre de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les deux types d’injections se feront sous courte anesthésie gazeuse. Ces injections seront réalisées au moyen de fines seringues à insuline et ne nécessite pas d’incision de la peau ou du muscle au préalable. En se basant sur notre expérience et celle de nos collaborateurs ,ces injections entrainent peu d'effets indésirables. Nous espérons notamment retarder voire prévenir l'apparition des symptômes grâce à l'approche thérapeutique que nous proposons. Néanmoins, elles peuvent occasionallement induire une inflammation locale ou légères irritations et ainsi un léger inconfort qui sera surveillé dans les jours suivants l’intervention. Par la suite, les fonctions locomotrices de ces souris seront évalués au cours du temps au moyen de 3 ou 4 tests permettant d'analyser la démarche de la souris tels que le rotarod et le gait, la sensibilité de ces pattes avec le test VonFrey ou encore la force de ces muscles avec le test du grip. Ces tests entrainent peu d’inconfort aux souris. L’ensemble de ces tests pour un stade donné, seront effectué sur 3 ou 4 semaines afin de ne réaliser qu’un test par semaine et assurer une récupération aux animaux. Une grille de score sera utilisée pour évaluer différents critères (poids, apparence, comportement général, blessure etc.) rendant compte de l'état de santé général de l'animal. La classification modérée des procédures prend en compte le cumul du phénotype de la souris CMT et des injections et tests effectués chez ces animaux.

Devenir

A l'issu des études comportementales l'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de déterminer l'effet bénéfique des thérapies proposés au niveau cellulaire sur les tisssus atteints dans la pathologie de Charcot Marie Tooth (CMT) (diminution de la dégénérescence axonale, réduction des défauts de myéline, etc.).

Remplacement

Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann) et particulièrement les cellules de Schwann qu'il est impossible de différentier à partir de cellules pluripotentes humaines. Ainsi seuls des modèles souris nous permettent à l'heure actuelle d'établir la preuve de concept des thérapies que nous proposons pour envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion, force musculaire et vitesse de conduction nerveuse. De plus il s'agit d'une étude longitudinale c'est-à-dire que les mêmes groupes d'animaux seront suivis à différents stades (3,6 et 12 mois) afin de suivre à long terme l'effet bénéfique des thérapies

Raffinement

Afin d'améliorer le bien être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture à volonté, enrichissement (maisonnette et sizzle pad), stabulation en petit groupe, analgésiques avant et après injection ainsi que réalisation des expériences sous anesthésie. Des points limites seront définis et les animaux seront mis à mort lorsqu'ils atteindront le critères d'interruption.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont identiques). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, les lignées utilisées pour la CMT2A et la CMT4H reproduisent de manière progressive (entre 6 mois et 1 an) la majorité des anomalies cellulaires et comportementales, observés chez ces patients telles que une dégénérescence axonale, des défauts locomoteurs et des anomalies de myéline.

1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène et une alimentation à la doxycycline, après une biopsie digitale pratiquée dès l'âge de 7 à 10 jours pour les génotyper, afin de suivre le devenir des noyaux des cellules musculaires marqués par fluorescence. Le porteur ne décrit comme nuisance que la biopsie et affirme que le tamoxifène ne fait pas plus mal qu'une injection d'anesthésique, sans détailler d'autre atteinte pour une gravité classée modérée. Il conclut que ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro et que seule la souris permet cette étude.

Objectifs

L'homéostasie tissulaire est maintenue par la génération de nouvelles cellules et la perte de cellules existantes. La génération de nouvelles cellules est généralement assurée par les cellules souches des tissus, qui se divisent continuellement et dont les cellules filles se différencient en cellules matures. Les cellules musculaires ont un défi très particulier à relever pour maintenir l'homéostasie tissulaire car elles possèdent des centaines de noyaux dans un cytoplasme partagé. En outre, les noyaux musculaires se différencient pour remplir des fonctions spécialisées, comme les cellules mononucléées différenciées des tissus ordinaires. Lorsque les cellules souches musculaires se divisent, des cellules filles fusionnent avec une cellule musculaire existante pour former de nouveaux noyaux. Malgré cette propriété intrigante, nous ne connaissons pas le sort des noyaux des cellules souches musculaires et des noyaux musculaires existants : que deviennent les noyaux musculaires nouvellement fusionnés ? quelle est la cinétique de la perte des noyaux musculaires pour chaque sous-type nucléaire spécialisé ? Dans ce projet, nous voulons répondre à cette question en marquant les noyaux des cellules souches et des muscles avec des protéines fluorescentes et en suivant leur devenir.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet donneront un tout nouvel aperçu de la façon dont nous pensons à l'homéostasie des tissus musculaires. Ceci, à son tour, aura un large impact sur la compréhension des maladies musculaires ou des mécanismes de l'exercice.

Procédures

Le groupe expérimental d’animaux A recevra une injection intrapéritonéale (IP) de tamoxifène par jour pendant 5 jours. Le groupe B sera nourrit avec une alimentation contenant de la doxycycline pendant 1 mois. Et le groupe C sera nourrit avec une alimentation contenant de la doxycycline pendant 1 mois puis recevra une injection IP de tamoxifène par jour pendant 5 jours et continuera d’avoir une alimentation contenant de la doxycycline. Les injections IP sont faites très rapidement en quelques secondes. Tous ces animaux auront été préalablement identifiés et génotypés par le prélèvement d’une biopsie digitale à l’âge de 7 à 10 jours. Cet acte est très rapide, il ne dure que quelques secondes.

Impact sur les animaux

La seule nuisance attendue est celle provoquée par le prélèvement de biopsie digitale pour l’identification et le génotypage : Il s'agit d’une procédure très rapide qui prend moins d'une minute par animal et qui sera faite très tôt sur les animaux âgés de 7 à 10 jours par du personnel qualifié. Les souris seront remises dans leur cage après l'expérience où elles seront surveillées pendant leur rétablissement. L'alimentation à la doxycycline est supposée ne provoquer aucune gêne. L’injection intrapéritonéale de tamoxifène ne sera pas plus douloureuse qu’une injection intrapéritonéale d’anesthésique qui correspond à la douleur causée par l’aiguille.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçerons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

Notre projet porte sur la dynamique cellulaire entre les myofibres et les cellules souches musculaires et nécessite la présence des cellules souches musculaires, des myofibres, des tendons (pour la JMT) et des motoneurones (pour la JNM) fonctionnels dans des conditions physiologiques normales. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites actuellement in vitro, ce projet ne peut être étudiée que chez des animaux vivants.

Réduction

Nous prendrons des mesures permettant de minimiser le nombre d'animaux utilisés. 1. Dans un premier temps des analyses histologiques approfondies seront effectuées pour déterminer à quels périodes après la dernière injection IP de tamoxifène ou après un mois sous doxycycline réaliser le séquençage d’ARN de noyaux uniques. 2. Nous collecterons tous les tissus musculaires pertinents de chaque souris.

Raffinement

L’alimentation à la doxycycline est supposée ne provoquer aucune gêne et les injections IP de tamoxifène ne seront pas plus douloureuse qu’une injection IP d’anesthésique qui correspond à la douleur causée par l’aiguille. Aucune mesure particulière n’est jugée nécessaire. Néanmoins d’une manière générale, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente, dans ce cas un analgésique sera administré à la souris et elle sera sous surveillance. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront surveillés régulièrement. Ils seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Les souris seront surveillées régulièrement et plus particulièrement après les injections IP de tamoxifène. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés).

Choix des espèces

Nous utiliserons plusieurs stratégies de marquage des lignées pour suivre le devenir des noyaux des cellules musculaires et des noyaux des CSM. Tous ces marquages ont été développés dans des modèles de souris et nécessitent la création de lignées mutantes. La souris est donc le meilleur choix pour mener cette étude. Comme notre projet porte sur la régulation de la dynamique cellulaire dans le muscle mature, nous devons utiliser des souris dont le développement est terminé. Par conséquent, l'âge de 10 semaines (avant administration de doxycycline et injection de tamoxifène) est l’âge le plus approprié.

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont gavées et subissent des prélèvements de sang à la sous-mandibule ou en arrière de l'œil toutes les trois semaines, avec une privation d'eau et de nourriture de quatre heures avant chaque gavage, pour comparer l'effet inflammatoire d'émulsions stabilisées par des émulsifiants dits durables. Le porteur qualifie lui-même ces gestes de stressants mais "nécessaires" à l'expérimentation. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité du tube digestif et que seul l'animal permet une approche intégrée.

Objectifs

Les vitamines liposolubles sont essentielles pour la santé. Malheureusement, apports et statuts inadéquats en vitamines liposolubles sont très courants. Les émulsions huile dans eau sont souvent utilisées pour encapsuler et délivrer ces vitamines. La plupart des études disponibles reposent sur des études in vitro et mettent en jeu des émulsifiants tels que le polysorbate 80, la carboxyméthylcellulose ou l'hydroxypropylcellulose. Bien qu'il s'agisse d'émulsifiants largement utilisés par l'industrie alimentaire, leur utilisation dans les produits de consommation courante fait l'objet d'une certaine controverse car certaines données suggèrent que ces émulsifiants ont un impact négatif sur le microbiote intestinal, en augmentant sa capacité à pénétrer la couche de mucus normalement stérile, et qu'ils peuvent être à l'origine d'une inflammation intestinale et d’états pathologiques associés. Parallèlement à cette controverse, l'intérêt pour une transition vers des aliments et des ingrédients plus durables est apparue ces dernières années, tant dans la communauté des chercheurs que dans l'industrie alimentaire. Les régimes alimentaires durables sont des régimes alimentaires ayant de faibles conséquences sur l’environnement, qui contribuent à la sécurité alimentaire et nutritionnelle ainsi qu’à une vie saine pour les générations présentes et futures. Ce projet de recherche vise donc à évaluer l'effet inflammatoire/anti-inflammatoire d’émulsions stabilisées par des émulsifiants « durables » (protéines de pois, arabinoxylanes), sans et avec vitamines liposolubles, chez la souris et de comparer leurs effets à ceux induits par une émulsion stabilisée par des polysorbates.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de clarifier plusieurs questions scientifiques, à savoir : • Connaître l'effet inflammatoire/anti-inflammatoire et l’effet sur la perméabilité intestinale de nouveaux émulsifiants « durables » et voir si les vitamines peuvent réguler cet effet inflammatoire.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins à la sub-mandibule, ou rétro-orbitaux au début puis 1 fois toutes les 3 semaines pendant la procédure. La durée de chaque prélèvement sanguin est calculée autour de 5 minutes. Le gavage sera réalisé avec les animaux en état de vigile. La procédure de gavage est estimée à 2 minutes hors la préparation de la seringue.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont : 1) Stress lié à la manipulation pendant les prélèvements, pesées hebdomadaires et des changements de litière 2) Stress pendant les prélèvements sanguins submandibulaires ou retro-orbitaux 3) Stress pendant le gavage. 4) Stress lie à la privation d’eau et de nourriture pendant 4h avant les gavages, et la séparation des individus pendant le temps nécessaire pour collecter les matières fécales (approximativement 1 h) Malheureusement il s’agit de gestes nécessaires pour l’expérimentation.

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques et en micronutriments) pour évaluer les effets des émulsifiants sur l’inflammation.

Remplacement

Les modèles in vitro (culture cellulaire, chambre d’Ussing) ne reproduisent pas la complexité biologique du tube digestif (mucus, mouvement, échange entre organes, présence d’un microbiote). Le recours au modèle animal demeure la meilleure approche pour étudier l’inflammation puisque (actuellement) seul un modèle animal permet d’avoir une approche intégrée du phénomène d’absorption et inflammation intestinale.

Réduction

Ce projet est constitué de 13 conditions au maximum. Ce nombre est choisi en se basant sur les résultats préliminaires physicochimiques qui ont permis d’éliminer les conditions non pertinentes et donc de réduire drastiquement le nombre d’individus. Pour chacune de ces conditions, et compte tenu de la variabilité interindividuelle existant chez la souris et de la difficulté de la mise en place du protocole, des groupes de 10 individus sont nécessaires pour assurer la validité statistique du phénomène observé. Un nombre plus restreint d’animaux ne permettrait pas une finesse suffisante des résultats pour répondre à nos objectifs de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 2 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Le début des régimes aura lieu après 7 jours d’adaptation dans l’animalerie. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. L’enrichissement sera actualisé toutes les semaines afin d’apporter de la nouveauté aux souris. L’enrichissement sera fait avec des igloos, des tubes, des cabanes, du papier kraft, de la cellulose, du bois ou du foin. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Tout animal présentant des signes de mal-être sera mis à mort. Une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Les souris seront observées 15 minutes après la procédure pour détecter des signes de douleur ou de détresse. Dans le cas d’une fausse route lors du gavage ou d’un mal-être des souris, les animaux seront mis à mort. Toutes les procédures invasives (prélèvement sanguins, mis à mort) seront réalisées sous anesthésie générale. Lors des prises de sang, si le saignement venait à ne pas s'arrêter, l'animal serait immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les expériences de biodisponibilité des micronutriments et évaluation de l’inflammation sont le plus souvent réalisées chez la souris, dont le système de digestion et d’absorption est anatomiquement proche de celui de l’Homme. En effet, les modèles cellulaires disponibles (Caco2) ne disposent pas de couche d’eau non-agitée et de mucus, qui sont très importants dans le contexte des études de l’absorption et de l’inflammation intestinale. Les co-cultures Caco2/ HT29 permettent de reproduire partiellement une couche de mucus mais dans des quantités souvent insuffisantes. Ces modèles cellulaires ne permettent pas non plus d’évaluer l’impact des émulsifiant via le microbiote. Le modèle de souris offre des avantages comme la facilité de la mise en œuvre et le faible coût. Enfin, les souris constituent un modèle in vivo de référence pour l’étude de l’effet d’émulsifiants par rapport à d’autres animaux. L’utilisation de ce modèle permettra la comparaison avec des études scientifiques. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement et rester comparable avec les études déjà faites, qui utilisent aussi de jeunes adultes.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte des cellules tumorales puis des composés immunomodulateurs testés pour des laboratoires clients, avec suivi de la tumeur et prises de sang répétées, l'étude n'autorisant ni anti-inflammatoire ni analgésique jugés incompatibles avec les molécules évaluées. Le porteur affirme que les doses injectées n'induiront aucun effet indésirable et que des points limites précoces limiteront la gêne liée à la tumeur. Il indique devoir se placer à l'échelle de l'"organisme entier" et écarte toute méthode substitutive.

Objectifs

Le domaine d’expertise de notre unité de service est centré sur la caractérisation et l’étude fonctionnelle des populations du système immunitaire murin en conditions normales, inflammatoires ou dans un contexte tumoral. En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. L’objectif principal du projet décrit dans cette demande, est l’évaluation de la réponse immunitaire suite au développement d'une tumeur dans des souris contrôles ou génétiquement modifiées, en présence ou non d'un traitement thérapeutique de composés immunomodulateurs. Les essais thérapeutiques récents utilisant des composés immunomodulateurs ont donné des résultats extrêmement prometteurs sur certains types de cancers comme les Mélanomes métastatiques. Certaines immunothérapies ont des effets spectaculaires sur l’inhibition de la croissance tumorale. La recherche s’intéresse donc de très près à la caractérisation de nouveaux composés immunomodulateurs et aux thérapies combinatoires pour atteindre un taux de succès plus élevé. Ce projet s’inscrit non seulement dans la validation de nouveaux anticorps thérapeutiques mais également dans la description exhaustive de toutes les cellules immunes infiltrant la tumeur et leur rôle dans le contrôle de la pousse tumorale sous l'effet d'un traitement immunothérapeutique. Dans cette dernière optique, nous envisageons de caractériser de façon plus précise les cellules ayant infiltrées la tumeur et les cellules nouvellement circulantes qui viennent de rentrer dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer de façon qualitative et quantitative la capacité d’un modèle murin à rejeter une tumeur après traitement immunothérapeutique en comparaison avec des animaux contrôles sans traitement. Ainsi, nous pourrons valider de nouveaux candidats dans le cadre d'immunothérapies anti-tumorales. Nous pourrons également déterminer l'action anti-tumorale de ces nouveaux composés grâce à l'étude du système immunitaire et définir la dose optimale à administrer. Ces études présenteront une avancée majeure dans le traitement des cancers par immunothérapie.

Procédures

Les souris seront régulièrement manipulées lors de ce projet à raison d’un jour sur deux pour différentes raisons : 1/ Les suivis de poids et de mesures tumorales : les souris seront manipulées à l’état vigile pour être déplacées dans une balance à pesée dynamique puis contenues par un manipulateur pour la mesure du volume tumoral au moyen d’un pied à coulisse. La contention sera la plus courte possible (inférieure à une minute au total par souris pour une pesée+mesure) pour limiter les contraintes subies par l’animal. 2/ Les injections de cellules tumorales (injection unique) : une contention sur souris vigile sera réalisée pour l’injection de l’anesthésique (15 à 30 secondes maximum par souris). Les souris seront ensuite manipulées une fois endormies pour l’injection des cellules tumorales et de l’Antisedan qui permettra d’écourter le temps total d’endormissement à environ 15 minutes, afin de permettre une meilleure récupération des souris. L’anesthésie par voie chimique permet d’assurer une reproductibilité de l’injection des cellules tumorales et d’éviter les grattages au niveau du site d’injection qui pourrait impacter l’implantation de la tumeur. 3/ Les injections de composés immunomodulateurs ou d’anticorps conjugué à un fluorochrome : Ces injections seront réalisées soit sur souris vigile, soit sur souris anesthésiée par voie gazeuse. Les injections pourront être réalisées de façon hebdomadaire, bi-hebdomadaire ou journalière en fonction du mode d’administration choisi ainsi que des recommandations des laboratoires porteurs de projet. Sur souris vigile, le temps de contention et d’injection n’excèdera pas 30 secondes. Selon la voie d’injection, une boite de contention pourra être utilisée. Le temps de contention sera alors le plus bref possible compte-tenu du temps de mise en place de l’animal dans la boite de contention et du temps d’injection. Sur souris anesthésiée, la phase d’induction de l’endormissement durera 3 minutes. Après sortie de la boite, le temps de manipulation et d’injection sur souris endormie sera de 10 à 20 secondes maximum. La souris se réveillera au bout de 30 secondes. 4/Les prélèvements sanguins : Les animaux seront soumis à l’état vigile à quatre ou cinq prélèvements sanguins au cours de la procédure expérimentale. La durée d’un prélèvement n’excèdera pas 30 secondes par souris. Tous les gestes techniques seront réalisés par un manipulateur expérimenté afin de limiter la durée de contention et le stress subi par l'animal.

Impact sur les animaux

Les tests de toxicité des composés immunomodulateurs seront effectués en amont par les laboratoires demandeurs. Les doses injectées n'induiront donc aucun effet indésirable sur les animaux dans le cadre de ce projet. Les effets indésirables liés à la croissance tumorale seront limités grâce à la mise en place de points limites précoces pour limiter la gêne et l'inconfort des animaux dû à la présence de la tumeur. Cette étude ne permet pas l’addition d’anti-inflammatoires ou d’analgésiques, incompatibles avec les immunomodulateurs testés et l’étude de la réponse immunitaire associée. Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress (pesée, anesthésie, injections ou mesure tumorale). Les contentions seront réalisées par du personnel expérimenté et expert dans ces actes afin de limiter les contraintes subies par l’animal.

Devenir

Pour les deux procédures expérimentales, quel que soit le protocole choisi, tous les animaux sélectionnés pour l'Immunophénotypage seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des organes et à leur analyse. Les animaux ne rentrant pas dans les critères de sélection définis dans les procédures expérimentales seront également mis à mort. Dans le cas où une expérience de rechallenge serait envisagée, une partie des animaux ayant rejetés la tumeur (6 maximum par groupe à la fin de la première expérience d'immunophénotypage) seront maintenus pendant 60 jours au minimum (post-injection tumorale) avant de procéder au rechallenge tumoral. Après le rechallenge, les animaux seront soit maintenus 60 jours maximum pour vérifier le rejet tumoral puis euthanasiés, soit euthanasiés 3 jours après le rechallenge pour le prélèvement des organes et leur analyse.

Remplacement

Concernant le principe de « Remplacement », dans ce modèle il n’est pas envisageable d’utiliser une méthode alternative et/ou substitutive. En effet, nous devons nous placer à l’échelle de l’organisme entier pour permettre la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de modèle ainsi que pour caractériser la réponse immunitaire des animaux.

Réduction

Concernant le principe de « Réduction », les méthodes de standardisation développées au sein de notre laboratoire nous permettent de réduire le nombre d’animaux tout en ayant des résultats statistiquement significatifs. Cette standardisation est caractérisée par l’utilisation d’automates et d’instruments de mesure calibrés ainsi que d’outils d’analyse automatisés limitant les variations liées aux manipulateurs. En se basant sur ces procédures standardisées, le bio-informaticien de notre service a ainsi déterminé un calcul de puissance nous permettant de définir le minimum de souris nécessaires pour caractériser les différentes populations d’intérêt pour chaque mutation étudiée et chacune des conditions testées. De plus, certains animaux seront conservés dans plusieurs étapes des protocoles définis pour éviter d’avoir à générer à chaque fois une nouvelle cohorte d’animaux.

Raffinement

Pour ce qui est du principe de « Raffinement », les souris seront hébergées par groupe de 5 au maximum, l’aliment et l’eau seront distribués ad libitum et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout d'un carré de coton et d'un bâtonnet de papier ou « Enrichment Diamond Twists » que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Un temps d’adaptation d’une semaine minimum sera également respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Pour permettre aux souris un meilleur réveil et une meilleure récupération après l’anesthésie, de l’Antisedan sera administré aux animaux à la fin de la greffe des cellules tumorales. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de zootechnie formé et qualifié et des points limites précoces seront préalablement établis. En ce sens, une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation expérimentale (aspect et volume tumoral). Des points limites terminaux sont établis pour chaque observation (valeur maximale de la grille de score) qui entraîneront la mise à mort de l’animal s’ils sont atteints.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles. Nous avons en effet à notre disposition un grand nombre d'anticorps marqués par une grande variété de fluorochromes permettant un phénotype du système immunitaire à très haut contenu. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux adultes de 10 à 12 semaines avec un poids supérieur ou au minimum égal à 22g. Les animaux doivent en effet avoir un système immunitaire mature et un poids suffisant pour être stable au début du protocole et éviter les variations physiologiques non dues à la procédure expérimentale.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés par gavage quotidien jusqu'à cinquante jours, passent des tests de reconnaissance d'objet, de labyrinthe à quatre bras et de labyrinthe en Y, puis sont mises à mort par décapitation pour des enregistrements sur coupes de cerveau, afin de tester des composés contre la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique de possibles signes d'inconfort et une perte de poids après administration. Il affirme que les tests de mémoire et l'électrophysiologie sur coupes ne peuvent être reproduits en culture cellulaire.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) se caractérise par une perte progressive de la mémoire et des capacités de notre cerveau qui nous permettent d'être en interaction avec notre environnement : percevoir, se concentrer, acquérir des connaissances, raisonner, s'adapter et interagir avec les autres. La zone du cerveau impliquée dans l'apprentissage et la mémoire est l'hippocampe. Dans ce projet, afin d’évaluer l'effet des composés testés par voie orale, des tests comportementaux seront utilisés pour quantifier les déficits de mémoire chez les souris âgées. Puis l’effet des composés testés par voie orale sera évalué sur l’activité électrique des cellules neuronales par la technique d’électrophysiologie, sur coupes cérébrales, chez des rongeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet scientifique associé à notre plateforme d'électrophysiologie et de comportement permettra de mieux comprendre la physiologie des cellules neuronales, dans le but de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme afin de traiter les pathologies cérébrales et notamment la maladie d’Alzheimer.

Procédures

-Administration quotidienne jusqu’à 50 jours, 1 à 2 maximum/jour par voie orale avec une sonde alimentaire de taille adaptée à l’espèce : 10 secondes -Test de reconnaissance d’objet dans une arène, 3 séances à 24h d’intervalles de 10 minutes avant la fin de l’étude -Test du labyrinthe des 4 bras, 1 séance de 5 minutes 48 h avant la fin de l’étude -Test du labyrinthe en Y, une séance de 15 minutes d’entrainement puis 24 h après une séance de test de 5 minutes avant la fin de l’étude. -Anesthésie pour prélèvement sanguin : anesthésie de la souris par inhalation (induction : 4-5% isoflurane) (maximum 3 minutes) -Prélèvement sanguin : 10 secondes jusqu’à 1 fois par semaine (maximum 5 prélèvements sur animal vigile ou anesthésié) et le dernier jour d’étude sur animal anesthésié : 10 secondes - Euthanasie : Administration intrapéritonéale du mélange d’anesthésiques/analgésiques (10 secondes), ou anesthésie de la souris par inhalation (induction : 4-5% isoflurane, maximum 3 minutes), décapitation (3 secondes)

Impact sur les animaux

Suite à l’administration des composés à tester, il se peut que des signes d’inconfort ou d’intolérance se manifestent (baisse d’activité, perte de poids, poils hérissés, modification des selles...). Dans tous les cas, un suivi quotidien de l’état général des animaux et une pesée hebdomadaire seront réalisés afin de repérer tout signe de mal-être. Les 3 tests comportementaux différents seront réalisés 48h, 24h avant et le jour de l’euthanasie et ne dureront pas plus de 15 minutes chacun. Aucune nuisance n’est attendu pendant ces tests comportementaux qui sont de l’exploration d’objets ou de territoire.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrales sur ces coupes.

Remplacement

Les tests de comportement nécessitent l’utilisation d’animaux vivants pour quantifier les déficits d’apprentissage et de mémoire. L'organisation des réseaux neuronaux peut être étudiée sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Ces expériences ne peuvent pas être reproduites, ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour nos animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect de l'éthique animale.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations. Les tests comportementaux et les enregistrements électrophysiologiques seront fait sur les mêmes animaux afin de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux plus âgés pourront être placés individuellement pour éviter le risque de bagarre dès leur arrivée, suite à un retour d’expérience et aux recommandations de l’éleveur. Ils resteront toujours en contact visuel et olfactif. Avant toute administration, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué sans exception (Week-ends & jours fériés), les animaux seront pesés une fois par semaine dès la fin de la période d’acclimatation par les expérimentateurs pour suivre l’état de santé général . En particulier, ils seront observés après chaque geste technique (administration, prélèvement), afin de s’assurer de l’absence d’effet indésirable inattendu. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et il sera soigné selon les recommandations du vétérinaire et en accord avec le directeur d’étude. Ce suivi nous permettra de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. Les animaux seront évalués grâce à la fiche d’observation /points limites et l’atteinte d’un point limite entrainera les actions documentées dans cette fiche. Un entrainement (première exposition dans l’arène ou labyrinthe, présentation des objets) sera réalisé une fois, 24h avant de réaliser un test comportemental afin de diminuer le stress de l’animal et de rendre des résultats fiables. Lors des prelevement sanguins réalisées par du personnel compétent et qualifié, les animaux pourront être sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour la communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes du fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 3 semaines à 95 semaines, afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent de la cuprizone dans leur nourriture pour détruire leur myéline pendant quatre à douze semaines, puis une injection létale afin de prélever leur cerveau, pour étudier le rôle du récepteur RXRg dans la remyélinisation. Le porteur affirme que la cuprizone n'entraîne ni douleur ni inconfort et laisse un comportement normal, tout en déclarant le projet en gravité modérée. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la remyélinisation, processus dynamique qui ne pourrait selon lui être observé que chez l'animal vivant.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune affectant le système nerveux central (SNC). Causée par une dysfonction du système immunitaire, elle engendre des lésions de la myéline qui provoquent des perturbations motrices, sensitives, cognitives, visuelles et autres. Les traitements actuels sont insuffisants pour empêcher la progression du handicap à moyen terme. La myéline est une gaine qui entoure les fibres nerveuses. Cette gaine est nécessaire pour une bonne conduction de l’influx nerveux. Lorsque la myéline est dégradée, elle doit être reformée par des cellules spécialisées. Toutefois, dans la SEP, la myéline est la cible du système immunitaire qui engendre une réaction inflammatoire excessive. A long terme, cette inflammation empêche la myéline de se reformer conduisant aux symptômes cités précédemment. Il est important de comprendre pourquoi la myéline n’est pas reformée. En effet, une stratégie thérapeutique serait de stimuler la régénération de la myéline. Grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées, nous étudierons comment la myéline se forme et comment différents facteurs peuvent stimuler sa régénération dans la SEP.

Bénéfices attendus

La myéline est une gaine biologique qui entoure les fibres nerveuses dans le système nerveux central. Cette gaine est nécessaire pour la transmission des informations entre les neurones. La dégradation de la myéline et son remplacement sont un processus physiologique naturel, toutefois chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP) la myéline est la cible du système immunitaire ce qui entraine différents troubles neurologiques tels que des troubles moteurs, et une réaction inflammatoire importante. Une des conséquences de cette réaction inflammatoire est d’empêcher la régénération de la myéline et donc de contribuer à la maintenance des troubles cités. Différents acteurs ont été identifiés comme facteurs stimulant la formation de myéline dans la SEP. En utilisant des souris modifiées génétiquement, nous déterminerons l’implication de ces facteurs dans la formation de myéline en conditions pathologiques. Ceci pourrait mettre en lumière un mécanisme de remyélinisation précis qui pourrait également ouvrir une nouvelle voie de recherche dans la SEP et vers de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Ici, n=300 animaux recevront un régime alimentaire comprenant de la Cuprizone pour générer une perte de myéline pendant différents temps (4, 5, 6, 12 semaines et un groupe deux fois 4 semaines). A l’issue de ces différents temps de consommation, les animaux ayant consommé la Cuprizone ainsi que les contrôles (n=30) non nourris à la Cuprizone pendant 5 semaines recevront une injection létale d’anésthésique et seront mis à mort. Le cerveau de ces animaux sera prélevé pour réaliser des analyses immunohistochimiques.

Impact sur les animaux

La cuprizone est un traitement introduit dans la nourriture qui induit une démyélinisation des neurones et une activation du système immunitaire. Ce traitement n’entraîne pas de douleur ou d’inconfort chez l’animal, et les symptômes moteurs liés à ce traitement, telle que la coordination motrice, sont faibles. De plus, le traitement à la Cuprizone n'engedrera aucune modification du comportement animal, les animaux auront un comportement tout à fait normal. Toutefois, au début de la consommation, une légère perte de poids peut être observée chez la souris bien qu'il y ait une absence de faim/soif chez l'animal. L’effet de la Cuprizone est également réversible, c’est-à-dire que l’arrêt de sa consommation entraîne la restauration de la myéline. Un dernier effet attendu est le léger stress généré chez l’animal par les injections intrapéritonéales d’anesthésique/analgésique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les organes pour réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les modèles murins par un modèle in vitro dans cette étude pour trois raisons principales : (i) la myélinisation développementale ou remyélinisation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités de types cellulaires différents et ne peut être reproduit que chez un animal vivant dans son intégrité; (ii); une analyse de remyélinisation est espèce-dépendant, cependant la souris reste un très bon modèle de la myélinisation chez l’Homme; (iii) la souris est notre modèle de référence dans la recherche sur les récepteurs de vitamine A car c’est dans ce modèle que nous avons déjà identifié des programmes moléculaires contrôlés par ces récepteurs ainsi que des traitements pharmacologiques pour les futurs développements de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus, ce projet émane des nombreuses analyses menées préalablement in vitro sur des cultures primaires des oligodendrocytes, microglie ou des neurones qui nous ont amenées à proposer ce projet et tester in vivo nos hypothèses de travail.

Réduction

Dans ce projet, nous prévoyons d’utiliser 10 animaux par lot de chaque sexe. Ces effectifs tiennent compte de la variabilité inter-individus ainsi que de potentielles différencies liées au sexe. Les analyses seront réalisées avec des tests statistiques adaptés. Si des différences liées au sexe sont mises en évidence, des études plus poussées seront réalisées dans un second temps. Dans l’éventualité où des complications apparaissent durant l’expérience, 10 % d’animaux supplémentaires par lignée seront prévus (soit n=10 par lignée) afin de conserver un nombre suffisant de réplicat pour réaliser des analyses statistiques. Ceci représente un ajout de n=10 animaux/lignées, soit 30 animaux en plus. A des fins de réduction, les animaux générés en plus pourront servir aux différents temps de consommation de Cuprizone si besoin est. Il est possible que peu voire aucun animal ne meurt durant l’expérience. Dans ce cas, les 10% d'animaux supplémentaires prévus par lignée ne seront pas utilisés.

Raffinement

En vue de raffiner les procédures, les animaux sont hébergés en groupe dans des conditions optimales (dans des portoirs ventilés et avec un nid) et ils font l’objet d’un suivi adapté et régulier et de soins vétérinaires au besoin. Ici, nous ne nous attendons pas à engendrer une douleur/souffrance aux animaux. En effet, la Cuprizone est faiblement concentrée, les dégradations de myéline seront mineures et principalement localisées dans le corps calleux, ce qui ne devrait pas générer de phénotype durant le suivi expérimental. Quelques troubles de coordination motrices peuvent cependant être observés en début de traitement. De plus, une légère perte de poids peut être observée au début de la consommation de Cuprizone. Le poids corporel des animaux sera alors contrôlé avant, pendant, et après consommation de Cuprizone. Si une perte de poids comprise entre 5 % et 10 % est observée, de la nourriture gélifiée sera mise à disposition de la souris pour faciliter sa prise alimentaire. Si une perte de poids supérieure à 10 % est observée, l’animal sera exclu de la procédure. A l’issue de la consommation de Cuprizone, la procédure expérimentale sera réalisée sous anesthésie générale par injection d'un mélange d'anesthésique : analgésique afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. Les injections sont peu douloureuses également, et génèrent principalement un stress à l'animal. A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort par un manipulateur expérimenté en minimisant le stress animal.

Choix des espèces

La myéline est une gaine biologique qui entoure les neurones assurant ainsi leur protection d’une part, et la transmission des messages nerveux d’autre part. La dégradation de la myéline et son remplacement sont un processus physiologique naturel. Cependant, chez des patients atteints de sclérose en plaques (SEP), la myéline est dégradée par le système immunitaire ce qui engendre différents troubles moteurs et cognitifs, et une réaction inflammatoire importante. Cette dernière va empêcher la régénération de myéline et donc maintenir les troubles cités précédemment. Une stratégie thérapeutique serait de stimuler la régénération de myéline. Pour comprendre comment la remyélinisation se met en place, nous utiliserons le modèle murin puisque ce modèle récapitule très bien la myélinisation chez l’Homme. De plus, les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet nous permettent d’étudier des programmes moléculaires importants dans la régénération de myéline, et différents traitements pharmacologiques ciblant ce programme ont déjà été validés chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes (âgées de 8 semaines) pour évaluer la régénération de la myéline dans des conditions pathologiques mimant la sclérose en plaques.