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Mécanismes neuropathogéniques des infections congénitales par le cytomégalovirus
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 40 modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie pour injecter le cytomégalovirus dans le cerveau de leurs embryons, puis les ratons sont soumis au test du réflexe de retournement et au test d'éloignement du vide et suivis pour des crises d'épilepsie. Le porteur indique que 60 à 80 % des ratons infectés présentent une hyperextension des membres et que 25 à 40 % font des crises généralisées, les petits étant tués au plus tard au dix-septième jour. Il affirme que ces mécanismes ne peuvent être modélisés ni in vitro, y compris sur cérébroïdes, ni in silico.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'explorer si une voie moléculaire connue pour être impliquée dans des processus inflammatoires, influence dans le cerveau en cours de développement, l'apparition et la sévérité de différents types de problèmes post-nataux, notamment neurologiques, constatés préalablement, ou anticipés, après infection du cerveau en développement par le cytomégalovirus (CMV). Outre une meilleure connaissance des évènements influençant les troubles neurologiques causés par ces infections congénitales dans l'espèce humaine, notre étude ouvrirait la voie vers de potentielles applications, cette voie moléculaire pouvant être modulée par de nombreuses molécules déjà existantes ou par d'autres stratégies thérapeutiques adaptées au ciblage de cette voie dans certains types de cellules cérébrales.
Bénéfices attendus
Les infections congénitales par le cytomégalovirus sont fréquentes (0.7 à 1% des naissances) et représentent une cause majeure de pathologie neuro-développementale, avec des conséquences médicales sévères et un impact socio-économique important. Cependant, les mécanismes restent mal compris et peu abordés. Les difficultés à générer un vaccin efficace et l'absence de traitement satisfaisant rendent nécessaires l'identification et l'exploration de nouvelles pistes mécanistiques. De ce point de vue, notre projet, en proposant l'implication de mécanismes inflammatoires dans la neuropathogénèse de ces infections, doit apporter des informations importantes pour la compréhension de la pathologie, tout en ouvrant la possibilité de cibler une voie moléculaire bien connue et pour laquelle de nombreuses molécules et stratégies d'intervention existent, sont améliorables et adaptables, ou peuvent être envisagées. Ainsi, la disponibilité d'un modèle récapitulant certains aspects-clés de la pathologie humaine et sa complexité, permettra à terme, à travers la compréhension de certains mécanismes-clés, d'obtenir des preuves de faisabilité pour la mise au point de telles stratégies d'intervention.
Procédures
Des femelles gestantes au 15ème jour de gestation subissent une chirurgie sous anesthésie générale, afin d’accéder aux embryons. Dépendant du nombre d’embryons à injecter, la durée de la chirurgie varie entre 30 et 45 minutes. Ceci nous permet de réaliser des injections intracérébroventriculaires de CMV directement dans le cerveau des embryons. Une seule injection par embryons est réalisée. A la fin de la procédure d’injection, les cornes utérines sont replacées dans la cavité abdominale de la femelle gestante puis réhydratées à l’aide d’une solution saline tempérée à 38°C. Le muscle et la peau sont suturés. La cage est placée sur un tapis chauffant. Le réveil des animaux, comme leur récupération post-opératoire, font l’objet d’un suivi attentif. Après l’intervention, les embryons poursuivent leur développement. En général, la cicatrisation de la femelle gestante est bonne, et la mise-bas se produit au stade attendu. Après la chirurgie, les rates gestantes font l'objet d'un suivi régulier et attentif, elles sont examinées quotidiennement pour guetter l'apparition éventuelle de signes et paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques (les animaux font l’objet d’un suivi journalier reporté dans un registre, y compris les weekends et jours fériés). Au premier jour postnatal, les ratons d’une même portée sont déposés dans une cage placée sur un tapis chauffant. Chaque raton est identifié par un tatouage au niveau des pates avant et/ou arrière, et une biopsie (1 à 2 mm du bout de la queue) est prélevée pour identifier leur génotype. Les ratons sont l’objet d’un suivi attentif quotidien au cours des deux premières semaines de vie postnatale, ce qui nous permet d’évaluer leur état général (croissance pondérale, posture), le développement du système sensorimoteur (test du réflexe de retournement lorsque l’animal est placé sur le dos, réalisé dès le 1er jour postnatal, test du réflexe d’éloignement du vide lorsque la tête de l’animal est dans le vide, l’animal étant posé sur une plateforme élevée d’environ 8 cm, réalisé dès le 4eme jour postnatal), et la survenue de crises généralisées d’épilepsie. Chaque animal effectuera donc ces sessions de tests quotidiennement, d’une durée maximale de 2 à 3 minutes, après quoi il sera déposé délicatement dans le nid avec sa maman.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes subissent une laparotomie sous anesthésie générale pour accéder aux cornes utérines et réaliser des injections intracérébroventriculaires de CMV ou de solution contrôle dans le cerveau des embryons. L'anesthésie des femelles gestantes peut engendrer des dépressions respiratoires, une hypothermie, une déshydratation. La chirurgie elle-même peut engendrer en post-opératoire sur des temps courts (1 à 3 jours maximum) de rares et faibles hémorragies vaginales, des avortements partiels, des douleurs abdominales, une diminution de la mobilité / inactivité, une perte de poids, une inflammation des sutures. Les femelles gestantes sont isolées lors de la période post-opératoire jusqu'à la mise bas. Leur bien-être après chirurgie est évalué quotidiennement par mesure de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques (voir la fiche de suivi post-opératoire en annexes). La majorité des femelles gestantes (>97%) récupèrent très bien après la chirurgie et la gestation se poursuit normalement jusqu’à la mise bas. Concernant les animaux infectés in utero par le CMV, nous avons déjà établi dans notre modèle que cette infection cérébrale provoque un ensemble de phénotypes observables à partir de 4-5 jours après la naissance. Le suivi quotidien des ratons au cours des deux premières semaines de vie postnatale a mis en évidence la survenue d'hyperextension des membres inférieurs (ce symptôme a été observé à partir de P5 (5ème jour de vie postnatale) dans 60-80% des ratons infectés), la survenue de crises d'épilepsie (des crises d'épilepsie généralisées tonico-cloniques déclenchées par la manipulation ont été observées à partir de P7 jusque vers P15 dans 25-40% des ratons infectés), un défaut de développement de réflexes sensorimoteurs évalués par le test d'éloignement du vide (cliff aversion test) et le test de retournement (rigthing reflex) (la plupart des ratons infectés échouent à réaliser ces tests, ou les réalisent avec un certain délai, à partir de P4-P5).
Devenir
Les femelles gestantes récupèrent en général bien après la chirurgie, et le développement embryonnaire se poursuit normalement jusqu’à la mise bas. Dans cette situation, les nouveaux-nés, qui feront l’objet d’un suivi quotidien pendant les 2 premières semaines postnatales, sont laissés avec leur mère. A l’issue de cettre période, les mères sont mises à mort. Les femelles ne sont en aucun cas réutilisées pour d’autres expériences, ou pour le maintien de la colonie (les cornes utérines et les muscles abdominaux ayant déjà fait l’objet d’une manipulation et d’une chirurgie), ce qui évite tout trauma supplémentaire. Tous les ratons utilisés pour évaluer les conséquences cliniques de l’infection au CMV sont mis à mort à l’issue des sessions de tests permettant d’évaluer les phénotypes postnataux in vivo et in vitro, soit au plus tard à P17. Nous n’envisageons pas dans le présent projet de réaliser des tests à plus long terme chez des animaux adultes, bien que cela soit techniquement possible.
Remplacement
Les mécanismes neurophysiopathologiques des infections congénitales par le CMV reposent de manière inhérente sur des interactions développementales multiples, entre la dynamique de l'infection virale elle-même, celle des réseaux neuronaux, et celle du système immunitaire cérébral (microglies, infiltrations par des cellules périphériques). Il est évident que certains de ces évènements, ainsi que leur complexité, et leurs relations réciproques, et évidemment leurs conséquences phénotypiques comportementales, ne peuvent être modélisés in vitro, y compris en utilisant des cérébroïdes, et encore moins in silico. Lorsque cela était possible, nous avons décidé de réaliser une partie de nos expériences d'enregistrements des activités épileptiques in vitro, sur des tranches aigues de cerveau, afin de réduire l’expérimentation sur l’animal vivant.
Réduction
Nous avons basé le nombre minimal d'animaux nécessaires sur la base de nos résultats antérieurs obtenus sur des portées sauvages (non mutées), et sur des calculs classiques de puissance statistique pour les tests les plus prévisibles. Nous optimisons la réduction des animaux utilisés de plusieurs manières : - chaque gestation et tous les embryons injectés in utero sont utilisés : ainsi, les croisements hétérozygotes utilisés génèrent les trois génotypes à comparer, ce qui homogénéise les résultats en diminuant les risques de biais de portées, diminuant ainsi la variabilité des résultats et donc le nombre d'animaux à utiliser pour atteindre une significativité statistique. - par ailleurs, un même animal est utilisé pour l'ensemble des tests (un animal passe tous les tests de la période néonatale, puis est utilisé pour les enregistrements in vitro à partir de P14 ; ceci a de plus l'avantage de permettre d'établir d'éventuelles corrélations entre plusieurs anomalies chez les mêmes animaux.
Raffinement
Le bien-être des animaux est évalué quotidiennement chez les femelles gestantes et chez les ratons nés après infection au CMV par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques adaptés, y compris les weekends et jours fériés. Le tout est enregistré dans un registre. Tous les détails sont donnés en annexes (fiche de suivi post-opératoire pour les femelles gestantes, qui permet d'établir un score, et fiche de suivi des cohortes de ratons injectés au CMV) Chaque rate gestante et sa portée est hébergée dans une cage, avec nourriture et eau à volonté. L’environnement est enrichi avec des matériaux souples (rouleaux de papier foisonnant, litière en carrés de cellulose vierge) permettant la confection d’un nid et avec un tunnel en carton. Les femelles gestantes subissent une intervention chirurgicale, qui est réalisée sous anesthésie générale, sur un tapis chauffant. Le rythme respiratoire des animaux est surveillé en permanence, et une injection intra-péritonéale de sérum physiologique est réalisée en fin d’intervention. Après leur réveil, les femelles sont placées sur un tapis chauffant pendant au moins 30 minutes. Un suivi post-chirurgical est réalisé (voir fiche de suivi en annexe permettant d'établir un score post-opératoire) en particulier une surveillance de la cicatrisation (nettoyage de la plaie et nouvelles sutures si détérioration), de l’absence d'hémorragie vaginale, de la mise bas (euthanasie si retard de la mise bas supérieur à 1 jour), de la perte de poids (euthanasie si > à 20%), de l'hypothermie (froid au touché), des signes de douleur (prostration, agressivité, absence de réaction aux stimuli). En fonction du score obtenu, une injection d'analgésique ou d’anti-inflammatoire peut être pratiquée. Un suivi des ratons infectés avec le CMV est également réalisé (voir fiche de suivi des ratons injectés au CMV en annexe), avec notamment une surveillance quotidienne de leur état général et de leur prise de poids, et l’observation des phénotypes caractéristiques de notre modèle (échec aux tests de développement sensori-moteurs, hyperextension des membres inférieurs, crises généralisées tonico-cloniques).
Choix des espèces
Les animaux que nous utilisons, en l'occurrence les rats, sont des rongeurs de petite taille et d’élevage facile, avec une gestation d'une durée adaptée aux exigences des travaux de recherche. Ils possèdent un système nerveux central dont le développement présente de nombreuses similitudes avec celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est cependant suffisamment complexe pour être représentative. D'une manière générale, ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes pathologiques du développement cérébral. Le rat est particulièrement adapté à des études électrophysiologiques, cognitives et comportementales. Dans le projet présenté ici, le choix de l'espèce est aussi orienté par l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus de rat recombinante, car les cytomégalovirus, y compris ceux de rat, sont spécifiques d'espèce. Les rates gestantes seront âgées d'environ 10 semaines à 6 mois. Les infections in utero seront réalisées à E15, donc au début du dernier tiers de gestation, ce stade d'infection tenant compte de l'état de développement cérébral et des microglies notamment, d'impératifs méthodologiques (chirurgie des cornes, injection des ventricules cérébraux embryonnaires), et conduisant à reproduire les conséquences neurologiques postnatales rappelant la pathologie humaine modélisée ici. L'étude quotidienne des phénotypes post-nataux sera réalisée entre P1 et P14 (sur animaux non sevrés, donc), compte tenu de nos observations préalables. Pour l'étude des activités épileptiformes in vitro, des tranches de neocortex seront prélevées autour de P15 (entre P14 et P17), période classique où le cerveau immature, correspondant à la période néonatale chez l'homme, présente une plus forte susceptibilité aux activités épileptiques.
Rôle de la protéine 1 dans les maladies chroniques du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 640 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 60 mises à mort sous anesthésie sans réveil. Rendues obèses par un régime gras sur trois à six mois, elles subissent des prises de sang répétées, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, puis une chirurgie de prélèvement des cellules du foie au cours de laquelle elles meurent. Le porteur indique que les injections intrapéritonéales peuvent provoquer des comportements de gêne ou de souffrance et des lésions au site d'injection. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro reproduisant les interactions entre organes et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer des maladies du foie. Ces complications hépatiques ont augmenté dramatiquement en France, et affectent essentiellement les individus obèses. Aucun traitement n’est disponible. Il est crucial de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués pour proposer des approches thérapeutiques. Le premier stade de ces complications hépatiques est la stéatose hépatique (« foie gras »), de bon pronostic. Avec les années, les complications hépatiques peuvent progresser vers des stades graves (comme la cirrhose). Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l’évolution de ces maladies restent peu clairs. Parmi les mécanismes impliqués, l'activation d'une voie de stress à l'intérieur des cellules du foie jouerait un rôle crucial. Cette voie est transmise au niveau moléculaire par 3 protéines. Une sur-activation hépatique de ces voies a été mise en évidence dans le développement des complications hépatiques à la fois au sein de modèles murins et de chez l’homme grâce à des prélèvements (biopsies du foie). Nos résultats préliminaires publiés indiquent une activation de la voie de la protéine transmembranaire 1 dans la stéatose et sa transition vers les complications hépatiques, que nous souhaitons étudier dans ce projet. L’objectif est d’étudier spécifiquement son rôle dans les cellules du foie, lors du développement des complications hépatiques Ainsi, nous analyserons si l'absence de la protéine transmembranaire 1 dans les cellules du foie de souris protège du développement de la maladie. Nous prévoyons d'utiliser 700 souris sur une période de 5 ans. La règle des 3Rs est donc prise en compte ici de la façon suivante : pour satisfaire à la réduction, chaque procédure prévoit d'utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à des études statistiques pertinentes. Pour le raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés et les personnes réalisant les procédures sont autorisées et appliqueront les règles d'éthiques. L'environnement sera enrichi pour diminuer le stress. Le suivi sanitaire régulier permettra d'identifier, le plus rapidement possible, les souris souffrantes et de prendre les mesures nécessaires. Enfin, conformément au principe de remplacement, notre hypothèse a été précédemment éprouvée in vitro. Il faut l'étudier dans un contexte plus physiologique, or il n'existe pas de modèle in vitro qui pourrait remplacer ces aspects.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo, nos résultats préliminaires obtenus in vitro. Nous pourrons ainsi mieux appréhender les mécanismes moléculaires (inflammation, métabolisme, mort cellulaire dépendants de la protéine transmembranaire 1) et comprendre leur impact dans la progression des complications hépatiques. Il n'existe pas de traitements des maladies hépatiques chroniques. La compréhension de ces mécanismes permettrait d'identifier des nouvelles cibles thérapetiques (IRE1 elle-même mais aussi des voies moléculaires qu'elle pourrait réguler).
Procédures
Pendant les régimes de 3 à 6 mois, les animaux seront soumis à 3 prises de sangs, de quelques minutes. Pour les tests de tolérance au glucose et à l’insuline, 1 seule injection est réalisée (avec le glucose ou avec l’insuline) puis le niveau de sucre dans le sang (glycémie) est mesuré 7 fois (une goutte de sang, lecture instantanée) pendant 2 heures. Le jour de la mise à mort, 1 prise de sang sera réalisée. Après l’injection unique de l’antibiotique, une seule prise de sang est réalisée avant la mise à mort de la souris. Pour la procédure chirurgicale permettant de récupérer les cellules du foie, l’animal est injecté une seule fois avec un mélange anesthésique/analgésique. L’animal meurt pendant la procédure. Après l’injection unique du composé inflammatoire, une seule prise de sang est réalisée avant la mise à mort de la souris.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la prise de poids chez l’animal. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, ...).
Devenir
Tous les animaux sont morts à la fin de chaque procédure. Le foie et les autres organes indiqués (tissu adipeux..) seront prélévés pour analyse histologique et moléculaire.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests statistiques paramétriques). En utilisant ces tests, nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande de projet un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique (niveau de significativité 0.05) quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience. Si un résultat significatif est obtenu (niveau de significativité 0.05), une seconde expérience ne sera pas réalisée. Cet effectif prédictif est confirmé par G-Power.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, leur bien-être est scrupuleusement pris en compte dans toutes les procédures en termes de conditions d'élevage (température et de l'hygrométrie). L'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique avec présence de tige en coton et d'igloo dans les cages. De plus, les souris seront hébergées en groupe (6 souris par cage, et 5 souris par cage si plus une souris fait plus de 30g). Les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières (au moins une fois par semaine ou par jour en fonction des procédures) nous permettront d'identifier précocement tout changement physique (blessure), ou de comportement : animal prostré, animal manquant de soin (qui ne fait pas sa toilette) qui sont des signes de stress et de souffrance, d'appliquer les points limites que nous avons définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
La souris est une espèce utilisée dans les études du métabolisme, particulièrement les maladies du foie pour ce projet. Le modèle murin est donc un modèle de choix, bien établit, pour l'étude de ces pathologies hépatiques. De plus, le modèle murin transgénique permet d'étudier précisément notre protéine d'intérêt et de répondre à la question de sa relevance thérapeutique. C'est un modèle disponible et utilisable, de surcroit doté d'une natalité importante. Notre laboratoire a des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. La similitude de son patrimoine génétique, avec celui de l’Homme, permet dans la mesure du possible, d'extrapoler les résultats à l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses biologiques, ainsi que protéiques, génomiques et histologiques. Compte tenu de tous ces arguments, il semblerait que ce soit le modèle le plus approprié dans notre cas. Dans toutes les procédures les souris seront âgées de 8-10 semaines. Le modèle animal de l’obésité nutritionnelle utilisé dans notre laboratoire consiste à mettre les animaux sous régime riche en lipides (à l’âge de 8-10 semaines) pour une durée allant de 12 semaines (3 mois : temps requis pour induire la stéatose) à 24 semaines (6 mois: temps requis pour induire la NASH).
Étude de l’implication de la protéine Pax6 dans l’inflammation du système nerveux à l’aide d’un modèle de souris de sclérose en plaques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections pour supprimer la protéine Pax6, puis on leur induit une encéphalomyélite proche de la sclérose en plaques, jusqu'à une paralysie des pattes arrière qui déclenche leur mise à mort. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de démontrer le rôle de Pax6 dans un modèle animal et que les données ne peuvent être obtenues autrement. Il attend que la suppression de Pax6 aggrave la maladie et en avance l'apparition.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’implication de la protéine Pax6 dans l’inflammation du système nerveux à l’aide d’un modèle de souris de sclérose en plaques. La protéine Pax6 est essentielle à la formation du cerveau embryonnaire. Nos données récentes non publiées indiquent que cette protéine est importante pour contrôler l’inflammation du système nerveux, ce qui laisse penser que sa régulation puisse aider à traiter certaines maladies neurodégénératrices. La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique inflammatoire du système nerveux central ou la gaine protectrice des neurones est détruite par des cellules immunitaires. Cela conduit à la dégradation des neurones et la perte de communication entre le cerveau et les organes périphériques. Les cellules immunitaires du cerveau qui participent à la réparation de la gaine protectrice, sont défectives chez les patients atteints de SEP. Toutes les données originales que nous venons d'accumuler des expériences réalisées sur des cellules suggèrent que la protéine Pax6 est présente dans ces cellules immunitaires du cerveau et a un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation dans ces cellules. Afin de confirmer ce lien, il est indispensable de le démontrer dans un modèle animal. Pour la première fois, nous testerons des souris qui présentent une inflammation sévère de type sclérose en plaques en présence ou non de la protéine Pax6.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de comprendre le rôle de la protéine Pax6 dans la régulation de l’inflammation du système nerveux. Elle ouvrira de plus des perspectives concernant toutes les pathologies neuroinflammatoires, de type Alzheimer, Parkinson, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et autres. Les données que nous obtiendrons permettront d'identifier de nouveaux outils pronostics et peut-être thérapeutiques pour ces maladies du système nerveux.
Procédures
- Les souris recevront une injection dans le ventre pendant 4 jours consécutifs d’un produit qui permet de supprimer la protéine Pax6 dans les souris qui ont une modification génétique spécifique pour ceci. Cette injection dure moins de 2 minutes. - Les souris recevront au moins 8 jours plus tard, deux injections en dessous de la peau et dans le ventre d’une combinaison des substances qui produisent le modèle de sclérose en plaques chez l'animal (EAE). Ce traitement consiste à injecter deux produits qui induisent une inflammation du système nerveux. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées pour ne pas induire du stress chez la souris. Toutes les souris seront quotidiennement observées pour le niveau de gravité de la pathologie et ceux qui présentent une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou souffrent de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pates avant seront immédiatement sacrifiées et analysées. Les autres seront sacrifiées au bout de 30 jours pour analyse.
Impact sur les animaux
Les souris permettant d’obtenir les souris étudiées après injection du produit, vivent normalement. Il a été démontré que ces souris continuent à vivre normalement après l’injection avec le produit et ne présentent aucune souffrance. Cependant, l’injection du produit pendant 4 jours consécutifs peut être une source de stress pour les animaux. Par la suite, l'induction de la maladie peut entraîner des souffrances aux animaux si la paralysie complète des pattes arrières et partielle des pattes avant est atteinte. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées et analysées. Enfin, nous nous attendons que la suppression de Pax6 après injection du produit dans les souris, va probablement induire la maladie plus tôt avec des symptômes plus forts.
Devenir
Les 120 souris étudiées (souris d’intérêts et souris contrôle) seront euthanasiées à la fin de l’étude, sauf celles qui présentent une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou souffrent de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pattes avant qui seront immédiatement euthanasiées et analysées. Toutes les souris seront euthanasiées. Des études post-mortem seront réalisées sur les cellules immunitaires prélevées à partir de cerveaux de ces souris.
Remplacement
Toutes nos données réalisées dans des cellules montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine Pax6 est exprimé par les cellules immunitaires du cerveau. Pax6 est connue comme essentielle au développement normal du cerveau et nos travaux récents démontrent qu'il régule aussi la réponse inflammatoire du cerveau. Nous utilisons une lignée de souris qui permet de supprimer la protéine Pax6 chez l'adulte car sa suppression au cours du développement de l'embryon est létale. Par ailleurs, le modèle de sclérose en plaques que nous utilisons chez la souris est simple expérimentalement. Il permet de mimer au mieux la sclérose en plaques chez l’homme, une des maladies sévères du système nerveux qui est liée à une inflammation des cellules immunitaires du cerveau. Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être actuellement obtenues par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique du développement de l’inflammation du système nerveux. La suppression de la protéine Pax6 ne peut être fait que chez l'animal et la complexité du cerveau et des interactions entre les nombreux types cellulaires impliqués (neurones, cellules immunitaires) ne peut être reproduit par des cultures en trois dimensions à partir des cellules souches.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. D'après la littérature du domaine, le nombre d’animaux pour le modèle de sclérose en plaques que nous proposons est normalement fixé à 10 par groupe de témoins et d’animaux d’intérêt avec au moins 2 expériences reproductibles. Cependant, compte tenu de la variabilité de l’efficacité de la suppression de la protéine Pax6 par le produit injecté, nous avons besoin d'augmenter sensiblement le nombre de souris traitées pour obtenir suffisamment de souris à comparer en présence et absence de Pax6. Donc, nous allons utiliser 10 souris par groupe pour 4 expériences indépendantes. Si dans la première expérience, l’efficacité du produit injecté et le développement de la maladie présentent peu de variabilité, nous pourrons réduire le nombre d’expériences. De plus, pour réduire le nombre total de croisement et donc de souris, nous utiliserons aussi bien des femelles que des mâles, le modèle de sclérose en plaques ne montrant pas de différence dans le développement de la maladie due au genre.
Raffinement
Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des portoirs ventilés, 5 individus par cage. La température, l'hygrométrie, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec 1 bâtonnet en bois, des cotons et du kraft. Avant les injections sous la peau, les souris seront anesthésiées, pour éviter l’induction de stress. Des points limites suffisamment précoces et prédictives ont été définis pour éviter toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux. Ces points limites concernent l’apparence, le poids, le comportement et les signes cliniques de chaque animal. D’ailleurs nous avons choisi une dose des substances injectées pour induire la maladie, qui permet un bon développement des symptômes sans induction de douleur et sans perte significatif de poids. A partir du moment où les souris présentent une queue molle et faiblesse des pattes postérieures après l’induction de la maladie, nous veillerons à disposer de la nourriture dans la cage sous forme d’hydrogel (gel rempli d'eau). Cela permettra aux souris de continuer de s’hydrater et s’alimenter sans difficulté. Dans des cas rares des petits ulcères formés sur les sites d’injection, ceux-là seront traités avec une pommade cicatrisante après désinfection. Le suivi quotidien de l'état des souris permettra de réagir immédiatement en cas de souffrance par leur mise à mort dès la détection d’une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pates avant. Ces points limites seront surveillés 1 fois par jour (état général et pesée). Enfin, nous nous attendons à ce que la suppression de Pax6, qui est un facteur anti-inflammatoire, va probablement induire la maladie plus tôt avec des symptômes plus forts. Si notre hypothèse est correcte, nous allons raccourcir la durée de l’expérience.
Choix des espèces
Nous travaillons sur la souris car c’est le meilleur modèle pour réaliser des animaux avec des mutations génétiques et comparer les phénotypes de ces animaux avec les pathologies humaines. Les souris avec des mutations génétiques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques des différentes maladies. L’objectif du projet est d’étudier le développement de l’inflammation du système nerveux en présence ou absence de la protéine Pax6 grâce à un modèle de sclérose en plaques chez la souris. Toutes nos données obtenues dans des expériences réalisées sur des cellules démontrent que la protéine Pax6 est présente dans les cellules immunitaires du cerveau. Cette protéine a un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation dans ces cellules. Afin de confirmer ce lien, il est indispensable de le démontrer dans un modèle animal. Nous utilisons une lignée de souris qui permet de supprimer la protéine Pax6 chez l'adulte, alors que sa suppression à la naissance est létale (développement précoce anormal du cerveau). Par ailleurs, le modèle de sclérose en plaques chez la souris est simple expérimentalement. Il permet de mimer au mieux la sclérose en plaques chez l’homme, une des maladies sévères du système nerveux qui est liée à une inflammation des cellules immunitaires du cerveau. Toutes les souris seront adultes, âgées de 6-8 semaines pour le traitement avec le produit. L’efficacité de la suppression de la protéine Pax6 induite par le produit aura atteint son maximum 8 jours après la dernière injection, donc les souris auront de 7 à 12 semaines au moment d'induire la maladie.
Manipulation des enzymes de synthèse de la dopamine en conditions inflammatoires et dimensions motivationnelles
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont maintenues à 90 % de leur poids pendant environ huit semaines, subissent une chirurgie stéréotaxique de quatre-vingt-dix minutes, un régime hypercalorique de treize semaines puis une injection de lipopolysaccharide, pour étudier le lien entre inflammation, dopamine et "fatigue". Le porteur indique que le lipopolysaccharide provoque un comportement de maladie avec fièvre et perte d'appétit pendant une douzaine d'heures. Il affirme que ces dimensions comportementales ne sont pas modélisables in vitro ou in silico.
Objectifs
De nombreuses études cliniques montrent que l'inflammation peut conduire au développement de symptômes dépressifs, en particulier la "fatigue". Ce projet vise à déterminer si et comment la manipulation d'enzymes de la voie de synthèse de la dopamine sélectivement au sein de la voie mésocorticolimbique est suffisant pour restaurer les troubles motivationnels induits par un état inflammatoire.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de comprendre comment l'inflammation perturbe la transmission dopaminergique, et si manipuler la voie de synthèse de la dopamine mésocorticolimbique pourrait permettre de réverser les troubles motivationnels induits par l'inflammation.
Procédures
Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) durant environ 8 semaines - 1 chirurgie stéréotaxique d'environ 90 minutes- Exposition chronique à des régimes hypercaloriques pendant environ 13 semaines- Administration aigue de lipopolysaccharide (quelques secondes).
Impact sur les animaux
Une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) a des effets très limités pour l'animal. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. L'exposition chronique à des régimes hypercaloriques conduit au développement d'une obésité. L'administration aigue de lipopolysaccharide induit un comportement dit "de maladie" (fièvre, perte d'apétit, etc..) pendant une douzaine d'heure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de tous les animaux de la descendance et comparerons les mâles et les femelles. Du fait de cette stratégie, tous les animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes.
Raffinement
Tous les efforts seront faits pour réduire la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage: - Perte de poids anormale (15% score 1, 15-20% score 2) - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...) score 3 - Signes neurologiques score 2 Si un score entre 9 et 12 persiste pendant plus de 48h les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale suivie de décapitation. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations de la synthèse de dopamine sur le cerveau mature.
Raffinement d’une technique chirurgicale pour l’étude du développement cérébral chez la souris EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des femelles gestantes subissent une électroporation in utero de trente minutes, puis des animaux sont anesthésiés et mis à mort par injection intracardiaque d'un fixateur, l'objet du projet étant de comparer des méthodes de mise à mort pour prélever du tissu cérébral. Le porteur indique que l'électroporation peut entraîner jusqu'à 10 % de mortalité fœtale et de rares difficultés de mise bas. Il présente ce travail comme un "raffinement" servant aussi le bien-être des animaux non-humains, tout en le classant en gravité sévère.
Objectifs
Le cortex cérébral est la région du cerveau responsable des fonctions cérébrales les plus élevées comme par exemple la perception sensorielle, le langage, la mémoire, les actions volontaires et la motricité. L’organisation du cortex cérébral repose sur des milliards de cellules appelées neurones, qui forment des connexions appelées synapses. L’étude de la formation du cortex cérébral pendant le développement embryonnaire est essentielle pour comprendre le fonctionnement cérébral dans des conditions normales, mais également pour comprendre pourquoi le cerveau dysfonctionne dans un certain nombre de maladies telles que l’épilepsie ou le retard mental, qui touchent presque 1 enfant sur 100 dans les pays industrialisés. Ce projet entre dans le cadre général d'études du développement du cortex cérébral, et en particulier de la fonction de gènes qui participent à la régulation de la production d’énergie neuronale. Pour atteindre ce but, il est nécessaire de prélever des tissus neuronaux chez des embryons de souris ou chez des souriceaux. Ce projet a pour but de raffiner la méthode par laquelle nous réalisons la mise à mort de souris pour prélever du tissu cérébral au laboratoire. afin d’identifier la méthode qui minimise la souffrance des animaux, tout en garantissant des résultats scientifiques de qualité.
Bénéfices attendus
Ce projet répond à une problématique scientifique et une problématique de bien-être animal. Il permettra d’optimiser les conditions expérimentales pour une expérience utilisée par de nombreux laboratoires en neurosciences, afin de garantir la robustesse et la validité des résultats scientifiques. Par ailleurs ce projet permettra de choisir les conditions expérimentales minimisant les souffrances subies par l’animal, constituant en cela un raffinement de la procédure expérimentale.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Des animaux seront anesthésiés et mis à mort par injection intracardiaque d'un agent de fixation histologique (durée entre 5 et 10 minutes selon la méthode testée).
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale avec réveil, sous anesthésie, une seule fois, d’une durée de 30 minutes. Dans de rares cas, nous pouvons observer une difficulté à la mise bas. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées. L’électroporation peut entraîner une mortalité fœtale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons électroporés). La procédure n’a pas de conséquence sur le développement du souriceau et il est impossible de distinguer après la naissance les souriceaux électroporés de souriceaux non électroporés, en dehors de l’expression de protéines fluorescentes.
Devenir
Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.
Remplacement
L’étude des tissus par microscopie est indispensable pour comprendre l’organisation d’un tissu complexe tel que le cortex cérébral. Puisque ce projet a pour but de raffiner lune méthode réalisée sur l'animal, il est impossible de remplacer ce projet par une méthode alternative n'utilisant pas l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base de notre expérience préalable. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation de la fluorescence au moyen d’une lampe LED au moment de la naissance, ce qui permettra de détecter très tôt un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne pas réaliser de procédure de perfusion intracardiaque inutilement sur un souriceau qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude. Pour ce projet, il nous faudra réaliser au minimum deux chirurgies. Ces deux premières portées seront analysées immédiatement pour déterminer si nous atteignons le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement en réalisant d’autres chirurgies. L’histologie cérébrale sera réalisée en aveugle, et les paramètres mesurés seront comparées par des tests statistiques appropriés. Nous tirerons par conséquent un maximum d’information des animaux inclus dans l’étude.
Raffinement
Ce projet a pour finalité de définir les conditions de mise à mort des animaux pour obtenir un résultat robuste. Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information pour chaque animal. Le transport des souriceaux de la zone d'élevage à la zone d'expérimentation est rapide et sera adapté pour limiter le stress subi par les animaux.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des maladies du neurodéveloppement. Nous avons choisi un modèle de souris car il présente les avantages suivants : - une structure proche du cortex cérébral humain, - un développement embryonnaire rapide (21 jours) et un développement postnatal court (21 jours pour des circuits neuronaux « matures »), - une petite taille adaptée à des préparations histologiques (embryon entier) sur une seule lame. Par ailleurs, la méthode chirurgicale que nous souhaitons raffiner est bien établie chez la souris ce qui nous assure que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines, selon la disponibilité des animaux chez le fournisseur agréé. Les souriceaux seront utilisés au moment du sevrage (21 jours), correspondant à l’âge utilisé classiquement lors de l’essentiel des études de connectivité corticale.
Caractérisation de l’efficacité de nouveaux agents bloquant les récepteurs CB1R sur l’obésité induite par un régime gras et sur la néphropathie induite par la Streptozotocine chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les unes reçoivent de la streptozotocine par injection cinq jours de suite pour induire un diabète, les autres un régime gras pour devenir obèses, puis toutes sont gavées douze jours avec trois composés bloquant les récepteurs CB1. Le porteur indique un risque important de déshydratation chez les animaux diabétiques et une possible dermatite chez les animaux obèses. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur l'organisme entier et qu'aucun modèle cellulaire ne peut se substituer totalement au modèle animal.
Objectifs
L’obésité et ses conséquences métaboliques sont de plus en plus répandues et souffrent d’un manque de traitements pharmacologiques fiables. Les pathologies liées à l’obésité sont nombreuses et incluent le diabète lui-même facteur de risque de néphropathie. La néphropathie diabétique (ND) consiste en une perte de fonction rénale pouvant déboucher sur insuffisance rénale chronique touche des millions de patients dans le monde et malgré les efforts de recherches, peu d'options thérapeutiques sont disponibles. Récemment, 3 composés visant à bloquer une nouvelle cible (A , B et C) ont été sélectionnés pour être testés in vivo après avoir démontré une absence de toxicité à travers plusieurs approches de modélisation informatique et de tests in vitro. Ainsi, notre objectif est de tester l’efficacité in vivo de ces 3 composés chez 2 modèles animaux différents. Procédure 1 : chez un modèle de souris diabétique de type 1 Procédure 2 : chez un modèle de souris rendue obèse suite à une alimentation riche en graisse.
Bénéfices attendus
Le diabète et l’obésité représentent un véritable enjeu de santé publique ; ces pathologies étant classées parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir l’évolution de ces pathologies et de leurs complications. L’étude, le développement et la caractérisation de nouvelles cibles et de nouveaux agents pharmacologiques apparaît donc primordial afin de remédier à ce besoin médical non satisfait. Les bloqueurs des récepteurs aux cannabinoïdes 1 présentent un intérêt certain, l’un d’eux est d’ailleurs actuellement en cours d’évaluation au sein d’une étude clinique de phase II avec comme indication, la ND.
Procédures
Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et n’aura lieu que 2 fois par animal pour la procédure 1 et 7 fois pour la procédure 2. Les injections intrapéritonéale de streptozotocine auront lieu quotidiennement pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. Pour chaque injection, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes. Pendant les 12 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage. Pour chaque gavage, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes.
Impact sur les animaux
Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses et des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que ces pathologies ne soient pas des points limites, les conséquences qu’elles génèrent peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont très importants chez les animaux diabétiques et nécessite une attention particulière. Pour le modèle d’obésité, une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peux également entraîné le développement passager de dermatite.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.
Remplacement
L’obésité et le diabète sont des pathologies multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.
Réduction
Pour le modèle STZ, la sévérité de la pathologie est estimée par la mesure du degré d’hyperglycémie et d’albuminurie développé par les animaux. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney. Le minimum d’animaux par groupe pour atteindre la significativité de différence de traitement est de 8-10. Toutefois, ce nombre pourra être réduit dès que la significativité sera atteinte. Pour le modèle d’obésité, la même approche sera employée en analysant la perte de poids et la diminution de quantité de graisse contenue dans le foie.
Raffinement
Depuis leur arrivée en provenance du fournisseur, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 4 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Tout au long de ce projet, plusieurs mesures de raffinement sont prévues.
Choix des espèces
L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Son métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction du diabète et de l’obésité sera réalisée chez des souris de 6 semaines. Pour le modèle STZ (streptozotocine), les souris seront âgées de 20 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 22 semaines lors de la mise à mort. Pour le modèle d’obésité, les souris seront âgées de 22 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 24 semaines lors de la mise à mort. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.
Modélisation des malformations corticales génétiques épileptogèneses chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 488 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 4 368 d'entre elles et sévère pour 1 120. Des femelles gestantes subissent une chirurgie pour induire des mutations chez leurs embryons, puis les petits reçoivent des électrodes intracrâniennes et développent une épilepsie avec plusieurs crises par jour, avant des traitements par injection, gavage ou injection intracérébrale. Le porteur décrit une possible agressivité envers les congénères, des douleurs après la chirurgie et un risque de rejet des petits par la mère. Il affirme que ni la modélisation informatique ni la culture cellulaire ne reproduisent les crises d'épilepsie et revendique le recours à des "organismes entiers".
Objectifs
L'épilepsie touche plus de 50 millions de personnes dans le monde. Les épilepsies focales sont parmi les plus fréquentes et sévères des épilepsies, et sont souvent liées à une malformation cérébrale. Parmi elles, les dysplasies focales corticales (DCF) sont caractérisées par une désorganisation locale du cortex cérébral et la présence de cellules neurales anormalement grande. Ces anomalies du développement sont responsables d’épilepsies qui résistent aux traitements médicamenteux et sont associées à des retards du développement et des déficits cognitifs. Notre laboratoire s’intéresse aux causes génétiques des DCF et a déjà montré l’implication de plusieurs gènes de la voie de signalisation cellulaire mTOR qui régule de nombreuses fonctions cellulaires (croissance, prolifération, métabolisme,…). Ces anomalies du développement cérébral peuvent être dues à des mutations génétiques présentes uniquement dans une population neuronale restreinte et apparaissant précocement au cours du développement du cerveau. Il est nécessaire de mieux comprendre l’origine des crises épileptiques suite à ces mutations afin de pouvoir développer de nouveaux médicaments antiépileptiques ciblés, et potentiellement proposer une médecine personnalisée. Afin de modéliser ces épilepsies focales d’origine génétique, nous proposons d’induire ces mutations au cours du développement du cerveau chez la souris afin d ‘étudier les crises d’épilepsie et tester des molécules antiépileptiques. Ce travail de recherche permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des crises épileptiques en fonction des différents gènes mutés et d’identifier des cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche permettra de créer de nouveaux modèles d’épilepsie induits par des variants génétiques. Ces pathologies sont rares, graves et orphelines. En effet, la majorité des patients atteints par ces mutations présente une épilepsie pharmacorésistante qui nécessite donc le recours à une chirurgie invasive pour contrôler les crises. Il est donc urgent d’utiliser des modèles reproduisant la physiopathologie de ces maladies afin de : - tester des thérapies ciblées sur les voies moléculaires en cause afin de permettre à court terme de diminuer le recours à ces chirurgies mais également de proposer une thérapie aux patients présentant une forme non opérable. - découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter à la fois l’épilepsie mais également les comorbidités associées à ces pathologies (autisme, dépression, troubles de l’hyperactivité, …) - Mieux comprendre les mécanismes qui sont à l’origine des crises d’épilepsies et autres comorbidités.
Procédures
Chirurgie sous anesthésie et analgésies sur les mères gestantes pour induire les mutations, afin de générer les groupes d’animaux. Durée maximale 1h, une seule fois. Après le sevrage des souriceaux, les femelles seront euthanasiées. Groupe exploratoire : Chirurgie sous anesthésie et analgésie pour l’implantation d’électrodes (1h maximum) puis isolement et enregistrement des crises sur animal vigile (session d’1 semaine séparé par 1 semaine de repos, jusqu’à l’apparition de crises ou à un âge maximal d’un an). Les souris seront ensuite euthanasiées. Traitement ip : Chirurgie sous anesthésie et analgésies pour l’implantation d’électrodes (1h maximum) puis isolement et enregistrement des crises sur animal vigile (session d’1 semaine séparée par 1 semaine de repos, jusqu’à l’apparition de crises ou à un âge maximal de 6 mois) PUIS injection intrapéritonéale de molécules thérapeutiques (1 injection de 30s tous les 2 jours pendant 2 semaines), PUIS enregistrement des crises sur animal vigile (4 sessions d’1 semaine séparées par 1-2 semaine de repos). Les souris seront ensuite euthanasiées. Traitement par gavage : Chirurgie sous anesthésie et analgésie pour l’implantation d’électrodes (1h maximum) puis isolement et enregistrement des crises sur animal vigile (session d’1 semaine séparée par 1 semaine de repos, jusqu’à l’apparition de crises ou à un âge maximal de 6 mois) PUIS Gavage de molécules thérapeutiques (1 gavage de 1 min tous les 2-3 jours pendant 3 semaines maximum), PUIS enregistrement des crises sur animal vigile (4 sessions d’1 semaine séparées par 1-2 semaine de repos). Les souris seront ensuite euthanasiées. Traitement par injection intracérébrale : Chirurgie sous anesthésie et analgésie pour l’implantation d’électrodes + injection en même temps (1h10 maximum) puis isolement et enregistrement des crises sur animal vigile (4 sessions d’1 semaine séparées par 1-2 semaine de repos). Les souris seront ensuite euthanasiées.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1) Pour la laparotomie subie par la femelle gestante : Isolement préopératoire et jusqu’à la naissance de embryons. Risques de déficience respiratoires, cardiovasculaires et hypothermiques durant l’anesthésie. Douleur au niveau du site d’ouverture et utérin, inconfort général durant les heures suivant la chirurgie, perte d’embryon(s), mise bas prématurée à E18 (jour embryonnaire 18). Possible risque d’infection au niveau du site d’ouverture. 2) Induction d’un phénotype épileptique : Le développement prédit d’un phénotype épileptique avec plusieurs crises par jour. Possible agressivité des souris envers leurs congénères. 3) Pour la chirurgie due à l’implantation intracrânienne d’électrodes : Risques respiratoires, cardiovasculaires et hypothermiques durant l’anesthésie. Douleur, inconfort général, isolement des animaux durant la période suivant la chirurgie. Possible risque d’infection au niveau du site d’ouverture. Risque de non acceptation post-chirurgie par la mère des animaux implantés avant sevrage. 4) Injection chronique IP : stress durant les contentions, perte de poids et possible douleur (œdème) dus à l’insertion répétée de l’aiguille sur le site d’injection. 5) Gavage oral : stress durant les contentions, perte de poids et possible douleur au niveau de l’œsophage due à l’insertion répétée de la sonde dans le système digestif.
Devenir
(1)Induction de mutations : les femelles gestantes seront euthanasiés dès qu’un point limite sera atteint, ou après le sevrage des souriceaux. Elles ne peuvent être réutilisées pour des accouplements à cause de la chirurgie. Les souris GFP négatives suite à l’induction de mutations ne peuvent être utilisées en procédure 2 à 5 du fait de leur génotype et elles ne peuvent être utilisées dans un autre projet car il est impossible de savoir si elles n’ont pas été induites (du fait de leur inaccessibilité lors de la chirurgie) ou si elle n’a pas été suffisamment efficace (ce qui pourrait induire un phénotype léger). (2)Enregistrement des crises et traitements : les animaux seront euthanasiés dès qu’un point limite sera atteint, ou à la fin de la procédure, dans la limite d’un an d’âge si aucune crise ne survient. Les animaux étant implantés avec des électrodes, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux.
Remplacement
Les résultats attendus de cette étude ne peuvent être obtenus par modélisation informatique car celle-ci nécessite des données expérimentales encore manquantes. De même, la culture cellulaire ne reproduit pas les interactions cellulaires, les voies de migration cellulaires, ni les crises d’épilepsie. La modélisation in vitro n’est donc pas indiquée dans notre type d’étude. De plus, nous ne pouvons éthiquement pas reproduire les modifications cérébrales nécessaires à notre étude chez des patients sains, ni tester nos traitements expérimentaux sur les patients atteints de ces troubles sans études précliniques préalables. Enfin l’utilisation d’organismes entiers, à la physiologie proche de l’humain et communément utilisé en étude préclinique nous permettra de tenir compte de la pharmacodynamie et de la pharmacocinétique de nos potentiels traitements. Nous pourrons ainsi rapporter les éventuels effets indésirables, la durée de traitement, la dose efficace et les effets attendus de nos traitements lors de nos discussions avec les cliniciens en charge des patients atteints de ces troubles avec lesquels nous travaillons étroitement.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences en testant préalablement la faisabilité des expériences, en combinant différents protocoles au cours d’une même expérience et en réalisant une exploitation maximale des données à l’aide de l’utilisation appropriée de tests statistiques fiables. Le calcul du nombre d’animaux est fait suivant les recommandations internationales. Il nous faut donc au moins 10 souris par groupe traitement. Ce calcul de puissance sera ajusté selon les premiers résultats, car nous ne pouvons pas encore prédire les différences de moyennes entre nos groupes. Nous utiliserons un premier groupe exploratoire afin de déterminer le stade le plus propice à notre étude et limiter ainsi le nombre d’animaux dans les autres procédures. De plus, pour les traitements administrés par injection et par gavage, chaque animal sera son propre contrôle : le phénotype épileptique sera comparé avant et après traitement, ce qui augmente la puissance statistique. Nous avons prédit 10 animaux par groupe soit 1120 souris si nous réalisons toutes les procédures décrites. Pour générer ces souris il est nécessaire d’utiliser des femelles gestantes. Nous avons choisi d’utiliser préférentiellement une souche de souris largement décrites dans la littérature scientifique. Cette souche offre aussi l’avantage de concevoir un nombre optimal d’embryons pour l’induction de mutations génétiques, d’être peu sensibles au stress et d’avoir peu de perte d’embryon ou de souriceaux entre l’induction de mutations et le sevrage. Nous avons prévu d’utiliser au maximum 336 souris gestantes. Parmi les souris issues de ces mères, une partie ne sera pas génétiquement modifiée (inaccessibilité des embryons lors de la chirurgie ou induction de mutations inefficace). Nous avons prévu un nombre maximum de 4032 souris générées mais négatives. Le nombre maximal de souris utilisées en procédure sera donc de 5488.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées (maximum 6 par cage), enrichies d’un nid de coton. En cas d’animaux isolés (souris gestantes, inconfort, ou opération chirurgical), la cage sera enrichie d’une maison et de coton afin de diminuer le stress des animaux impliqués. Nous n’avons pas encore caractérisé le phénotype de nos lignées. Si un animal fait une crise épileptique de plus de 15 minutes, ou présente une posture hypertonique après une crise, nous l’euthanasierons pour abréger ses souffrances. De même lors des enregistrements des crises: si un animal fait plus de 15 crises par jour. Les animaux feront donc l'objet d'une surveillance étroite par le personnel de soin animalier. Le poids, l'apparence physique et des changements de comportement seront les facteurs pris en compte. Suite à la chirurgie nécessaire à l’induction de mutation, les animaux feront l'objet d'un suivi postopératoire avec une surveillance rapprochée de l'expérimentateur jusqu'au réveil complet de l'animal et surveillance quotidienne étroite de l'expérimentateur et du personnel de soin animalier pendant les deux semaines suivant la chirurgie, ou jusqu’à la mise bas des souriceaux. Les mouvements, le poids, la respiration et les réflexes tels que le retrait de la patte seront observés. En cas de signe de souffrance on administre un analgésique toutes les 24h jusqu’à la mise-bas des souriceaux. Si les signes de douleur persistent malgré l’analgésie, l’animal sera euthanasié. Après cette mise-bas, nous surveillerons les signes de douleur de la femelle, et si les souriceaux sont bien nourris. Suite à la procédure d’implantation d’électrodes, on administre de la un analgésique toutes les 12h. Ce traitement pourra être prolongé jusqu’au rétablissement de l’animal. L'expérimentateur pèsera les animaux chaque jour suivant la chirurgie pendant une semaine, puis une fois par semaine, et évaluera objectivement l'apparence physique de l'animal (convulsions, dos voûté) et son comportement (lenteur des mouvements) au moins une fois par semaine. Si une perte de poids supérieure à 20 pourcent chez l'animal adulte ou des signes de douleur sont notés, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Nous travaillerons sur une espèce animale: la souris. Notre choix a été motivé par des raisons scientifiques: (1) Nos études portent sur des modèles génétiques d'épilepsie nécessitant des modifications génétiques ciblées, possibles chez ces animaux. (2) L'établissement de lignées pures avec un fond génétique stable et homogène utilisées dans les laboratoires du monde entier permet la reproductibilité et la comparabilité des résultats et donc la réduction du nombre d’animaux. (3) Ces deux souches sont majoritairement utilisées pour modéliser les crises d’épilepsies. Elles ont donc été explorées de manière exhaustive de la molécule au comportement, permettant une solide base scientifique sur laquelle baser nos travaux. (4) Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. Les femelles gestantes seront utilisées à l’âge adulte (plus de 2 mois). Leurs embryons seront génétiquement modifiés à E14.5, afin de cibler la couche corticale 2-3. Pour les implantations et traitement, les animaux seront utilisés après sevrage (plus de P21), une fois que les souris sont autonomes afin de caractériser au plus tôt leur phénotype prévu épileptique.
Etude des fonctions des structures cérébrales des poissons téléostéens cichlidés
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
900 poissons cichlidés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie cérébrale d'environ une heure avec ouverture du crâne et lésion d'une structure, puis des tests comportementaux, avant euthanasie vingt jours plus tard pour prélever le cerveau. Le porteur reconnaît une récupération possiblement difficile après la longue anesthésie et des déficits moteurs liés à la lésion. Il affirme que ces trois espèces ne peuvent être remplacées et que la taille de leur cerveau, contrairement au poisson zèbre, rend la chirurgie possible.
Objectifs
Certains poissons téléostéens comme les Labres et les Cichlidés présentent des comportements semblables à ceux de l’utilisation des outils, l’utilisation du miroir (reconnaissance de soi), la reconnaissance individuelle, et une communication multimodale complexe. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau des cichlidés, en particulier les espèces Amatitlania nigrofasciata (A. nigrofasciata), Neolamprologus brichardi (N. brichardi), et Pseudotropheus zebra (P. zebra). Ces trois espèces ont des origines géographiques, une taille et des comportements différents. Les cerveaux des poissons téléostéens sont organisés de façon très différente par rapport aux cerveaux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. En particulier, une structure de la partie ventrale du cerveau, le lobe inférieur, n'existe que chez les téléostéens, et n’est pas retrouvée chez les mammifères ou les oiseaux. Les fonctions de cette structure demeurent inconnues, et nos travaux précédents suggèrent qu’elle pourrait être impliquée dans les fonctions cognitives remarquables des cichlidés et des labres. Mieux connaître la fonction du lobe inférieur chez les poissons téléostéens permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux aussi différents que ceux des téléostéens ont pu permettre l’émergence de comportements complexes. Cette étude permettra donc de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Bénéfices attendus
Les cichlidés présentent des comportements assez complexes incluant certaines capacités cognitives dites de « haut niveau ». Cependant, les structures cérébrales impliquées demeurent méconnues. Afin d’expliquer comment les cerveaux des poissons produisent ces comportements, des études lésionnelles sont nécessaires. Nos études précédentes montrent que l'organisation globale du cerveau de poissons téléostéens est très différente de celle des tétrapodes, et que le lobe inférieur, une structure unique aux téléostéens, pourrait être impliquée dans ces comportements complexes. Cette étude lésionnelle permettra de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Procédures
Procédures chirurgicales durant environ une heure, puis tests comportementaux. Les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement du cerveau 20 jours après la chirurgie.
Impact sur les animaux
En plus de l'intervention chirurgicale, deux nuisances post opératoires potentielles sont attendues : une récupération potentiellement difficile dues à l'effet de la longue anesthésie ; et l’effet de la chirurgie elle-même : douleur potentielle, déficit moteurs liés à la lésion cérébrale.
Devenir
L'euthanasie des individus est nécessaire au prélèvement de leur cerveau pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet, permettant de visualiser précisément le site de chaque lésion.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées. Notre étude nécessite un échantillonnage d'espèces qui ont un grand cerveau avec des capacités cognitives de haut niveau, et qui possèdent un lobe inférieur développé, ce qui est le cas des cichlidés. Les tests comportementaux prévus ne peuvent être réalisé que sur ces animaux. Les trois espèces que nous souhaitons utiliser, A. nigrofasciata, N. brichardi, P.zebra, ont des comportements très différents et des cerveaux organisés de façon différentes. De ce fait, il est pertinent et nécessaire d'utiliser ces trois espèces de cichlidés.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses, et nous privilégierons des tests statistiques non-paramétriques (Mann Whitney U test, Kruskal Wallis, Wilcoxon) qui permettront de limiter le nombre d’individus nécessaires. Des études précédemment publiées chez les téléostéens nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être sera particulièrement observé par des zootechniciens compétents. La température de la pièce ainsi que son taux d’humidité seront surveillés. Lors de la chirurgie, après l'induction de l'anesthésie, une injection est pratiquée dans les muscles entourant la boite crânienne afin d'analgésier localement la zone avant la craniotomie (attendre 2 minutes avant incision). Après la chirurgie cérébrale, le bien-être des animaux est plus attentivement surveillé par des expérimentateurs compétents jusqu'à l’euthanasie des animaux (20 jours maximum après la chirurgie). Aussi, une communication entre le personnel de zootechnie et les expérimentateurs permettra un suivi adéquat des animaux. Pour surveiller la santé des animaux, des points limites seront utilisés, prenant en compte des comportements ou signes visibles. Dans le cas où des animaux montreraient des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Selon la gravité de ces signes, les animaux pourront être soignés via une analgésie dans l’eau de nage, ou si ce n'est pas possible de soigner, ils seront euthanasiés dans les délais les plus brefs. L’analgésie par bain plutôt que par injection en post opératoire a été choisi pour réduire le stress de l’animal, puisqu’une injection demanderait la manipulation du poisson (sortie de son aquarium, anesthésie, puis injection), ce qui produirait un stress trop important pour un poisson déjà en souffrance. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement avant l'opération chirurgicale pour fournir de l'enrichissement. Un contact visuel entre les poissons sera possible avant et après l’opération puisque les aquariums seront placés les uns à côté des autres. En revanche, aucun enrichissement n'est prévu au niveau de l'hébergement pour des raisons de sécurité lors de la récupération post-opératoire. En effet, les enrichissements traditionnels (tubes, cachettes), pourraient être utilisés par les poissons après leur chirurgie pour se frotter ou essayer de "gratter" le site de la chirurgie. Dans ce cas, le risque serait présent d'une réouverture de la plaie.
Choix des espèces
Les poissons téléostéens ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses anatomiques étudiant les structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez A. nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra, mais chaque espèce présente des comportements particuliers et qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude neuroanatomique de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser les chirurgies nécessaires à ce projet. L’utilisation de cichlidés, et en particulier de ces trois espèces, dont la taille du cerveau permet la chirurgie, semble donc toute indiquée. Nous travaillerons sur des jeunes adultes (taille du corps à partir de 3 cm) car il nous est nécessaire d’étudier un cerveau pleinement développé.
Cibler les astrocytes pour promouvoir la plasticité cérébrale
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
1 620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Selon les lots, elles subissent une injection abdominale chez la femelle gestante, la suture d'un œil, une injection intracérébrale, un AVC provoqué par coagulation d'un vaisseau à travers le crâne, ou une imagerie cérébrale, chaque geste réalisé une fois. L'objet est d'étudier le rôle des astrocytes dans la plasticité du cerveau, avec des applications annoncées pour l'amblyopie, l'autisme et la récupération après AVC. Le porteur reconnaît qu'une des lignées utilisées est considérée comme dommageable, ses effets n'ayant pas été étudiés.
Objectifs
La plasticité cérébrale décrit la capacité du cerveau à remodeler ses connexions en fonction des expériences vécues par l'individu. Cette plasticité est maximale dans l’enfance, où elle participe à l’apprentissage. Elle diminue ensuite chez l’adulte, mais peut être réactivée au décours d’une lésion cérébrale comme un AVC pour faciliter la récupération des fonctions perdues. Par ailleurs, une altération de cette plasticité au cours du développement cérébral peut être responsable de maladies comme l’amblyopie (défaut d’acquisition de la vision d’un des yeux chez l’enfant) ou l’autisme. Des études récentes ont montré que certaines cellules du cerveau, appelé « astrocytes », jouaient un rôle fondamental dans la plasticité au cours du développement. Notre projet a pour but d’explorer comment les astrocytes et les autres cellules du cerveau régulent cette plasticité. Ceci permettra de mieux comprendre les troubles du neurodéveloppement de l’enfant d’une part, et de trouver de nouvelles façons de stimuler la plasticité chez l’adulte, notamment après un AVC, d’autre part.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, ces travaux doivent enrichir nos connaissances concernant le rôle des astrocytes et des autres cellules du cerveau dans la régulation de la plasticité. D’un point de vue plus biomédical, ces travaux doivent offrir de nouvelles pistes de compréhension des troubles du développement cérébral chez l’enfant (tels que l’amblyopie et l’autisme). Ils ouvriront également de nouvelles perspectives thérapeutiques : promouvoir la plasticité chez l’adulte permettrait de faciliter la récupération après une lésion cérébrale comme un AVC.
Procédures
Injection dans la cavité abdominale chez la femelle gestante (environ 5 minutes, une seule fois par souris). Suture d'un seul oeil (environ 15 minutes, une seule fois par souris). Injection intracérébrale (environ 30 minutes, une seule fois par souris). Procédure de photothrombose, c'est-à-dire coagulation d’un vaisseu cérébral par la lumière pour reproduire un AVC (environ 30 min, une fois par souris). Imagerie cérébrale chez l’animal vivant (environ 2h, une seule fois par souris).
Impact sur les animaux
L’injection dans la cavité abdominale peut induire une douleur et un stress légers à la piqure. La suture d’un œil sous anesthésie générale peut s’accompagner d’une douleur légère autour de l’œil au réveil et une plaie superficielle dûe au grattage est possible dans les jours suivants. Au long cours, la fermeture d’un œil a une incidence modérée sur le bien-être de l’animal. L’injection intracérébrale sous anesthésie générale nécessite d’inciser la peau du crâne et de réaliser une ouverture dans ce-dernier. Au réveil, des douleurs post-opératoires modérées peuvent être présentes sur une courte durée. La procédure de photothrombose pour reproduire un AVC se fait par par illumination à travers le crâne, sous anesthésie. Elle nécessite d’inciser la peau au-dessus du crâne mais pas d'ouvrir ce-dernier. Au réveil, des douleurs post-opératoires modérées peuvent être présentes sur une courte durée. La lésion d’AVC en elle-même a une incidence modérée sur le bien-être de l’animal (perte de sensibilité sans perte de motricité). L’imagerie cérébrale chez l’animal vivant se fait également par illumination à travers le crâne, sous anesthésie. Elle nécessite d’inciser la peau au-dessus du crâne et de réaliser une ouverture dans ce-dernier dans certains cas seulement (quand un colorant aura été préalablement injecté). Deux lignées de souris génétiquement modifiées seront utilisées dans le projet. Pour la première (lignée "PrismPlus"), il n'a pas été rapporté de nuisance sur la santé, le comportement ou le bien-être de l'animal dans la littérature. Pour la deuxième (lignée "Aldh1l1-Cre"), les conséquences des modifications génétiques sur la santé, le comportement ou le bien-être de l'animal n'ont pas encore été étudiées. Elles sont donc a priori considérées comme dommageables.
Devenir
Les animaux ne pourront être réutilisés à l'issue de chaque procédure et seront donc mis à mort.
Remplacement
Nos travaux précédents réalisés chez la souris ont montré que les astrocytes jouent un rôle crucial dans la régulation de la plasticité cérébrale. Dans ce projet, nous utiliserons ces résultats pour tenter de stimuler cette plasticité. Pour cela, il n’est pas possible de remplacer les enregistrements du cerveau intact par des simulations ou par des cultures de cellules du cerveau.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la taille des lots en accord avec la littérature existante. De plus, pour plusieurs analyses, un même animal sera utilisé pour l’étude de plusieurs types de cellules. Enfin, dans plusieurs expériences, un animal sera son propre contrôle en comparant un hémisphère cérébral à l’autre hémisphère, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de façon significative.
Raffinement
Durant les procédures expérimentales, nous utiliserons des médicaments anesthésiques et antidouleurs appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Suite à la suture d’un oeil, l’injection intracérébrale ou la lésion d’AVC, les animaux seront surveillés quotidiennement en prenant en compte leur apparence et leur comportement. De plus, la technique d'imagerie cérébrale et la technique d’AVC sont minimalement invasives et ne nécessitent pas de chirurgie lourde. Par défaut, les animaux seront logés à plusieurs dans des cages contenant du coton pour faire leur nid et boisson et nourriture à volonté. Dans certaines expériences étudiant l’effet d’un environnement enrichi sur la plasticité du cerveau, différents jeux seront en outre installés dans des cages avec plusieurs étages pour stimuler les souris. Un tel environnement a un effet bénéfique sur le bien-être de l’animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car leur développement est proche de celui de l’homme et les mécanismes de leur plasticité cérébrale ont très bien été étudiés. Ceci permettra une meilleure comparaison avec les résultats décrits dans la littérature. De plus, notre équipe utilise couramment cette espèce et possède une expertise technique sur ces animaux. Par ailleurs, la période de gestation est courte et le nombre de souris par portée important, ce qui nous permet de générer suffisament d’animaux pour plusieurs expériences avec relativement peu de parents. Enfin, les souris permettent de nombreuses manipulations génétiques non disponibles chez d’autres mammifères. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés à l’âge adulte, plus de 100 jours après la naissance. Pour les procédures 5 et 8, les animaux seront utilisés à différentes étapes du développement pour étudier l’évolution de la plasticité : 21ème jour, 28ème jour, 50ème jour, 100ème jour après la naissance.
Etude de nouveaux traitements de la maladie coeliaque réfractaire de type 2 dans un modèle de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
1 576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales issues de patients, puis des traitements par gavage, dans l'eau de boisson ou par voie intrapéritonéale, avec une imagerie hebdomadaire, avant sacrifice pour analyser l'infiltration tumorale. Le porteur indique que l'injection de cellules tumorales peut provoquer une perte de poids rapide et une hépatite, et vise à tester des traitements contre un lymphome intestinal compliquant la maladie cœliaque. Il affirme que la réponse des cellules malignes ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
La maladie coeliaque est une maladie intestinale inflammatoire fréquente induite par l’ingestion de gluten un protéine présente dans les farine (blé, orge, seigle). Une complication rare mais sévère est l’émergence de lymphomes intestinaux chez des patients ne répondant pas au régime sans gluten. L'accumulation de lymphocytes intestinaux peut donner naissance, chez certains patients coeliaques à un lymphome intestinal aussi appelé maladie coeliaque réfractaire de type II. Les cellules formant le lymphome contiennent des mutations hautement récurrentes augmentant l'activité d'une enzyme et/ou d'un facteur de transcription ainsi qu’un spectre de complémentaire d’autres mutations. Notre hypothèse est que ces mutations confèrent un avantage dans l’environnement intestinal inflammatoire des patients coeliaques. Le clone de cellules mutées pourrait ainsi s’expandre aux dépends des cellules normales et aboutir à un lymphome intestinal. Ce lymphome évolue initialement à bas bruit mais peut dans 40-50% des cas évoluer vers un lymphome invasif de très mauvais pronostic. Un objectif important est la mise au point de traitements capables d’éliminer les cellules mutées précocement avant l'aggravation de la maladie. Il semble en particulier important de tester les inhibiteurs spécifiques de l'enzyme et du facteur de transcription muté. Néanmoins la présence d’un nombre important de mutations additionnelles expose au risque de résistance des cellules au traitement. Notre but est de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques dans un modèle de souris obtenu par injection de lignées cellulaires malignes issues des biopsies intestinales de patients atteints de maladie coeliaque réfractaire de type II. Nous chercherons à évaluer leur efficacité sur le développement tumoral mais aussi le risque de sélection de cellules tumorales résistantes aux traitements, ceci afin d’évaluer les bénéfices et risques des traitements pour les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de tester l’efficacité des différentes molécules ciblant les voies de signalisations impliquées sur le développement des cellules tumorales et de tester un possible échappement. Seules des drogues déjà autorisées en clinique humaine seront utilisées, suggérant qu’il n’y aura pas de toxicité excessive. A terme, ce projet pourrait permettre de développer des traitements permettant de prévenir ou stopper le développement de lymphomes chez les patients coeliaques.
Procédures
Injection de cellules tumorales de patient (réalisée sur 1576 souris) : Les lignées cellulaires humaines transduites ou non seront injectées par voie intraveineuse rétro-orbitaire avec des seringues menues d’aiguilles à insuline(durée de l’injection : 5 secondes). Administration de traitements (réalisé sur 1176 souris) : - un traitement délivré en per os dans l’eau de boisson tous les deux jours (réalisé sur 294 souris) (durée de l’injection : 5 secondes) - deux traitements administrés par gavage oral tous les jours à l’aide d’une aiguille de gavage d (réalisé sur 588 souris) (durée de l’injection : 5 secondes). - un traitement administré par voie intra-péritonéale deux fois par semaine (réalisé sur 294 souris) (durée de l’injection : 5 secondes). Imagerie intra-vitale (réalisée sur 616 souris) : Les souris seront imagées à l’aide de l’IVIS spectrum 1 fois par semaine depuis l’injection des cellules tumorales jusqu’au sacrifice. Le temps d’imagerie dépend de la puissance du signal mais ne dépasse pas 30 min par animal.
Impact sur les animaux
Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Les souris génétiquement modifiées que nous souhaitons utiliser ne présentent pas de phénotype dommageable dans nos conditions d'utilisation. L'injection de cellules tumorales humaines est succeptible d'entrainer une perte de poids rapide ainsi qu'une hépatite.
Devenir
Les animaux seront tous sacrifiés à la fin de chaque procédure afin d'analyser l'infiltrat de cellules tumorales dans les différents organes (rate, foie, sang, rein et intestin).
Remplacement
La réponse de cellules malignes à un traitement est un mécanisme complexe qui ne peut être récapitulée in vitro. Nous avons dans un premier temps utilisé des cultures primaires in vitro pour cerner les drogues d’intérêt, nous permettant de réduire fortement l’utilisation d’animaux. Les cellules de patients étant fragiles et difficiles à cultiver in vitro, l’utilisation de modèle murin nous permettra de les amplifier dans un contexte riche en IL-15 afin de tester plusieurs stratégies thérapeutiques et de déterminer les effets de ces molécules sur les cellules transformées et d’évaluer le risque d’échappement tumoral favorisant leur progression vers des lymphomes invasifs.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible en tenant compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse, incluant pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles et de la nécessité de reproduire les résultats. Le nombre de 5 souris/lot est choisi pour permettre les analyses statistiques. Afin de limiter le nombre de souris, la viabilité cellulaire sera quantifiée avant toute injection pour optimiser la prise de greffe.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, mâles et femelles séparés, et le nombre d’individus par cage limité entre 2 et 5 individus pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes d'agréssion ou de stress engendrés par une population trop importante. Nous serons aussi très attentifs au bien-être des animaux. Nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement par la mise à dispositionde boules de coton, de maisonnettes en carton, de bâtonnets à ronger et d’un tunnel. La surveillance du bien-être des animaux sera assurée au quotidien par le personnel de l’animalerie et hebdomadaire par les expérimentateurs. Les expériences et en particulier l’injection de cellules seront réalisées par des personnes expérimentées et qualifiées afin d'éviter toutes fausses manipulations ou un éventuel stress pour les animaux. Les procédures d’injection sont peu douloureuses mais l’utilisation d’anti-inflammatoires ou analgésiques pourrait compliquer l’interprétation des résultats sur la progression tumorale. Les animaux seront alors particulièrement surveillés lors de ces procédures. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux souris, les prélèvements de sang se dérouleront sous anesthésie locale avec de la tétracaïne et les injections de cellules malignes humaines sous anesthésie générale . Le réveil se déroulera dans un environnement calme et silencieux. Des points-limite ont été établis, consuisant à la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera surveillé de façon quotidienne et selon la progression des symptômes observés via une grille d’évaluation, la prise de greffe et les variations de poids corporel.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes constituent un modèle d’étude reconnu pour la réalisation de greffes humaines. L’expression d'un facteur de croissance humain que nous savons indispensable à l’expansion des cellules malignes in vitro et qui assurera l'expansion des cellules de patients après injection chez la souris immunodéficiente. Les souris utilisées seront des souris adultes d’environ 8 semaines.
Rôle des autoinducteurs, molécules impliquées dans le Quorum sensing, dans l’assemblage néonatal du microbiote intestinal chez le raton
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
224 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des mères reçoivent un antibiotique dans l'eau de boisson et leurs ratons subissent des gavages quotidiens entre le vingt-deuxième et le trente-cinquième jour de vie, avant mise à mort pour accéder au contenu de leur gros intestin. Le porteur indique que les mères ne peuvent être réutilisées et sont tuées après le sevrage, et prévoit d'utiliser les portées surnuméraires pour une étude annexe sur l'appétence au lait de soja. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de la colonisation du tube digestif.
Objectifs
Il est établi que, chez l’adulte, le microbiote intestinal interagit, de façon variable selon sa composition, avec la santé de l’hôte. Les données récentes suggèrent que ceci serait également vrai en période néonatale avec d’éventuelles répercussions sur le risque de maladie tout au long de la vie. Comprendre les mécanismes qui contrôlent la composition et l’assemblage du microbiote en période néonatale constitue donc un enjeu majeur en termes de prévention à long terme de la santé. Nous supposons que certaines molécules secrétées par les bactéries dénommées « auto-inducteurs » (AIs) sont impliquées puisqu’elles permettent la communication inter-bactérienne et peuvent interagir avec la composante immunitaire de l’hôte, qui participe au contrôle de l’assemblage du microbiote. Notre objectif est donc de démontrer l’implication de ces auto-inducteurs dans la modulation de l’assemblage néonatal du microbiote intestinal. Pour ce faire, nous évaluerons i) l’influence d’une modulation de la composition des microbiotes néonataux, induite par antibiothérapie transitoire des mères, sur la production des autoinducteurs par le microbiote des descendants au cours de son assemblage et ii) la capacité d’aliments modèles, enrichis en différents autoinducteurs, à moduler le microbiote non stabilisé.
Bénéfices attendus
Le projet établira la contribution des AIs au contrôle de l’assemblage du microbiote intestinal chez le rat. Ce résultat revêt un intérêt en termes de transposabilité à d’autres couples hôte/microbiote (ex microbiote intestinal chez l’homme, microbiotes cutané, vaginal, …). En outre, en identifiant les AIs majoritairement impliqués, il contribuera à accroître la connaissance des mécanismes d’interaction hôte-microbiote et à garantir la sécurité des aliments fermentés dont certains contiennent naturellement des AIs. De telles avancées ouvrent la voie à de nouvelles stratégies de modulation des microbiotes ce qui revêt un intérêt majeur au vu de l’implication du microbiote dans la régulation de la santé de l’hôte.
Procédures
Tous les animaux inclus dans ce projet seront soumis à manipulation lors de la constitution des portées ou des suivis pondéraux. Certains d’entre eux (i.e. les 64 ratons élevés par les 8 mères dont l’eau de boisson sera supplémentée en antibiotique) seront soumis à un traitement antibiotique indirect alors que d’autres (ie les 80 ratons inclus dans la procédure 2) seront soumis, quotidiennement entre leur 22e et 35e jour de vie, à des gavages intra-stomaccaux réalisés sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Pour les animaux inclus dans ce projet, les nuisances induites par les 2 procédures qui relèvent des classes de sévérité « légère » ou "modérée" devraient se limiter au stress généré par les séparations mères/portées ponctuelles et par la manipulation lors de leurs pesées, gavages et mises à mort puisque les traitements qui seront appliqués ne devraient entraîner aucun effet indésirable spécifique. En effet, le traitement antibiotique qui sera appliqué est d’usage courant en médecine vétérinaire et la supplémentation d’aliments modèles enrichis en AIs mime des situations usuelles puisque les AIs sont des composés naturellement présents dans l’alimentation humaine.
Devenir
Compte tenu de l’influence connue du nombre de gestations vécues sur la physiologie et le comportement maternel, les rates utilisées pour générer les portées au sein de chacune des 2 procédures ne peuvent être réutilisées dans nos expérimentations animales et seront mises à mort une fois leurs ratons sevrés. Dans chacune des 2 procédures, l’accès aux contenus du gros intestin, segment intestinal dans lequel l’implication des AIs est la plus probable, est indispensable. De ce fait, la mise à mort des ratons en fin de mise en place du microbiote intestinal est inévitable.
Remplacement
Aucun des modèles in vitro existant ne permet de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques et immunitaires mis en jeu lors de la colonisation du tube digestif par les bactéries en période périnatale. L’étude in vivo est donc irremplaçable pour d’atteindre l’objectif de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé en tenant compte des différences entre mâles et femelles, des nombres d’individus statistiques nécessaires ainsi que des risques de non fécondation des rates ou d’obtention de portées naturelles de taille insuffisante. En absence de données de concentrations luminales en AIs, les nombres d’individus statistiques ont été déterminés par calcul d’effectif réalisé à partir de données décrivant l’impact d’une antibiothérapie au cours de la gestation sur diverses caractéristiques du microbiote des descendants. La procédure n°1 repose sur le traitement de rates allaitantes : l’individu statistique indépendant correspond donc à la portée. Ainsi, 18 rates saillies de l’avant-veille seront commandées afin de garantir l’obtention de 16 portées de 8 ratons (4 mâles et 4 femelles) à subdiviser entre les 2 groupes expérimentaux. L’utilisation à différents stades de développement des 128 ratons mâles et femelles issus de ces portées valorisera au mieux les animaux obtenus à la mise bas. Pour la procédure n°2, les traitements seront appliqués aux descendants sevrés, chacun de ceux-ci constitue un individu statistique pertinent. De ce fait, 10 rates saillies de l’avant-veille seront commandées afin de garantir l’obtention de 8 portées de 10 ratons (5 mâles et 5 femelles), ces 80 descendants seront ensuite repartis (1 male et 1 femelle de chaque portée) dans les 5 groupes expérimentaux pour générer un effectif final de 8 males et 8 femelles consommant chacun des 5 suppléments testés. Pour éviter un gaspillage des animaux, les mères gestantes surnuméraires obtenues dans chacune des procédures (au maximum 4) et leurs descendants excédentaires seront utilisés pour une étude ancillaire destinée à évaluer la possibilité d’un projet futur en mesurant l’appétence des ratons nouvellement sevrés pour les boissons végétales à base de soja. Ces portées seront alors élevées sans traitement spécifique tout au long de la lactation. Après leur sevrage, les ratons, à qui sera proposé le lait de soja en parallèle de leur eau de boisson, feront l’objet d’un suivi de croissance et de consommationjusqu'à leur mise à mort (35e jour de vie). Cette valorisation des portées surnuméraires sera possible puisque pour chacune des procédures, le nombre de portées surnuméraires sera connu dès la mise bas alors que les traitements spécifiques seront appliqués soit au 5e jour de lactation (procédure 1) soit à l’issue du sevrage des ratons (procédure 2).
Raffinement
Le stress généré par les procédures en particulier par la manipulation des portées qui interférera avec les soins maternels et, dans le cas de la procédure 2, par des gavages sera limité du fait de leur mise en œuvre rapide mais sans brusquerie par un personnel compétent et entraîné, dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et des recommandations relatives aux volumes administrables par gavage. En outre, la sélection d’une souche de rat présentant de bonnes qualités maternelles (Sprague-Dawley), l’usage de tapis chauffants sur lesquels positionner les portées séparées de leurs mères, l’enrichissement des cages à l’aide de matériau cellulosique pour le nid et de tunnels et l’hébergement par 2 pendant la majeure partie de la gestation et après sevrage contribueront à minimiser le stress des mères et des ratons. L’absence de nuisance durable sur le bien-être animal sera néanmoins vérifiée par observation des animaux lors des visites qui seront effectuées quotidiennement, y compris le week-end. L’évaluation de l’état des animaux qui sera alors effectuée conditionnera les éventuelles décisions d’administration d’analgésique dans le cas d’observation de signes attestant d’une souffrance (dos vouté, ventre rétracté, facies contracté, aggressivité, vocalisation).
Choix des espèces
Le choix du rat comme modèle d'étude résulte du fait que son microbiote intestinal s’établit au cours des premières semaines de vie, qu'il presente un développement rapide, qu'il est omnivore et que son coût est modéré. En outre, comparativement à la souris, sa moindre susceptibilité au stress le rend plus adapté à la manipulation des descendants au cours de la lactation et sa taille facilite la collecte de contenus intestinaux en quantité adaptée aux besoins de l’étude. De plus, l’expérience acquise par notre unité de recherche sur ce modèle renforce l’intérêt pour ce modèle animal dans le cadre de ce projet particulier.
Etude de l’efficacité d’un nouveau dispositif expérimental sur le traitement de plaies cutanées chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie est créée chirurgicalement sur leur dos sous anesthésie, puis irradiée par lumière visible chaque jour jusqu'à cicatrisation, l'appareil étant maintenu par un harnais qui impose un hébergement individuel. Le porteur reconnaît que l'isolement peut être source de stress, atténué selon lui par des cages transparentes laissant un contact visuel. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne permet un suivi prolongé du processus de cicatrisation.
Objectifs
Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants de par la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. Les objectifs de ce projet sont, à la suite des essais préliminaires effectués in vivo chez le rat, d’évaluer l’efficacité du traitement de plaies cutanées à l’aide du nouveau dispositif expérimental utilisant les effets thérapeutiques de la lumière visible conçu pour le traitement de celles-ci. Les essais effectués chez le rat sans induction d’une plaie cutanée ont permis de s’assurer du maintien de la partie du dispositif expérimental appliquée sous anesthésie directement sur le dos, laissé en place pendant 5 heures sur le rat sans anesthésie à l’aide d’un harnais conçu spécifiquement et sur mesure. Ces essais ont également permis de d’assurer du maintien de la connexion avec le module de contrôle placé en dehors de la cage d’habitation, du contrôle en continu de la température corporelle au niveau de la zone d’application du dispositif expérimental et de celle du dispositif expérimental, ainsi que de la tolérance locale au niveau de la peau saine suite à l’irradiation lumineuse à l’aide de ce dispositif expérimental et sur 48 heures par la suite. Le dispositif expérimental va donc être utilisé pour traiter des plaies cutanées induites chez le rat. Des irradiations longues pendant 5 heures, ou séquentielles pendant 7 minutes 30 toutes les 15 minutes sur 5 heures, vont être utilisées pour le traitement des plaies cutanées, quotidiennement jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. Ces durées d’irradiations ont été déterminées suite à la réalisation d’études menées chez le rat dans le cadre d'un projet européen. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. Ce projet constituera la toute première évaluation de ce nouveau dispositif médical pour le traitement de plaies cutanées chez le rat.
Bénéfices attendus
La cicatrisation des plaies cutanées est un phénomène naturel de reconstruction de la barrière cutanée mais si les plaies sont mal soignées, cela peut aboutir à des complications. La cicatrisation cutanée fait intervenir différentes phases qui entrainent la disparition de la lésion et le remplacement des cellules atteintes par des cellules saines. Les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les plaies chirurgicales,les ulcères du pied chez le diabétique, les ulcères veineux… représentent un fardeau pour les patients, les professionnels de la santé et les systèmes de soins de santé, affectant plus de 40 millions de patients et induisant des coûts d’environ 50 milliards d’euros annuellement, et avec un taux de mortalité plus élevé que dans la population générale, pouvant atteindre jusqu’à 20% en fonction de la pathologie considérée. Il est donc très important de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements ou de développer de nouveaux dispositifs médicaux sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de ces plaies, surtout les plaies chroniques. Nous allons donc évaluer l’efficacité d’un nouveau dispositif expérimental tout d’abord sur un modèle de plaie simple, dans la perspective de réalisation par la suite d’études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques et infectées ou non chez le rat sain et diabétique. Ce dispositif expérimental pourrait ainis à terme, être utilisé chez l’Homme, pour le traitement de plaies chroniques qui ne cicatrisent pas ou très difficilement.
Procédures
Les 50 rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 5 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis 6 heures après celle-ci, et si nécessaire 12 voire 24 heures après. Les plaies cutanées seront traitées quotidiennement jusqu’à cicatrisation complète, pendant 7 minutes 30 sous anesthésie gazeuse, ou 5 heures en fractionné ou en continu sans anesthésie. Les plaies cutanées, protégées par un pansement et un harnais, seront observées et photographiées 3 fois par semaine lors du renouvellement du pansement, effectué en 10 minutes environ. Un suivi quotidien des rats sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. En cas d’inflammation sévère du tissu cutané au niveau de la plaie cutanée traitée par irradiation lumineuse, le protocole d’irradiation serait systématiquement arrêté. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent le harnais, le pansement et surtout le dispositif expérimental de traitement des plaies cutanées placé dans le harnais, mais avec des briques d’Aspen placées dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.
Impact sur les animaux
L’induction d’une plaie cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture analgésique. Les changes de pansement, effectués également sous anesthésie générale gazeuse de courte durée, environ 5 à 10 minutes, n’engendreront quant à eux aucune douleur. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le harnais, le pansement et surtout la partie de dispositif expérimental placé dans le harnais. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.
Devenir
Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 50 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort par injection intrapéritonéale d’une surdose d'euthanasiquel effectuée sous anesthésie gazeuse profonde, et un prélèvement de peau correspondant à la zone traitée par la lumière sera effectué pour réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de cette étude mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs quant aux objectifs envisagés selon notre expérience et les résultats obtenus d’études précédentes sur ce modèle de plaie cutanée. S’agissant en effet de la toute première étude menée chez l’animal avec ce dispositif expérimental, il ne nous est pas possible de définir un effectif minimal nécessaire à l’aide d’un test de puissance statistique. Les résultats qui seront obtenus, et le traitement statistique des données générées en analyse non paramétrique, le permettront pour les études suivantes.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors de la réalisation de chaque irradiation lumineuse. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine lors de chaque change de pansement et observation des plaies cutanées. Si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal ou de plus de 10% entre 2 prises de poids est observée, ou si des signes d’infection de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront placés en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie) et respecter également la période de réalisation des traitements appliqués pour être dans des conditions similaires à celles qui seront utilisées chez l’Homme. Des briques de bois seront placées dans chaque cage de rat comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes permettra de maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille et de celle du dispositif expérimental qui va être utilisé (2x2 cm pour la partie au contact direct de la peau), et également en raison de sa facilité de manipulation. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations, avec un poids de 175-200 g. Cela correspond au poids de rat nécessaire afin d’avoir une surface corporelle suffisante pour mettre en place le harnais et le dispositif expérimental d’irradiation lumineuse (2x2 cm pour la partie au contact direct de la peau).