Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude du rôle des mastocytes embryonnaires dans la résistance à une envenimation de la mère
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
156 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les femelles gestantes et leurs petits tués à cinq jours et les mâles reproducteurs transférés vers d'autres expériences. Les femelles reçoivent une injection sous-cutanée de venin de crotale, avec pesées et prises de température rectales répétées, le venin provoquant œdème, hémorragie et nécrose musculaire locale. L'objet est de savoir si les mastocytes de l'embryon protègent le fœtus lors de l'envenimation de la mère. Le porteur affirme que la souris est un modèle incontournable pour cette étude, faute de modèle cellulaire satisfaisant.
Objectifs
Dans la nature, tous les mammifères possèdent des mastocytes, cellules immunitaires innées. Chez la souris et chez l'Homme, les mastocytes apparaissent tôt durant l'embryogénèse et colonisent les tissus dans lesquels ils seront retrouvés chez l'adulte. A l'âge adulte, il a été montré que les mastocytes sont responsables de la détoxification de multiples venins grâce à la sécrétion de protéases (enzymes qui décomposent les protéines et peptides), inactivant les protéines contenues dans ces venins mais, leur fonction dans l'embryon reste à ce jour inconnue. Dans ce projet, nous émettons donc l'hypothèse que l'apparition très précoce de cette population de cellules immunitaires durant l'embryogénèse pourrait conférer un "avantage évolutif" dans la protection des fœtus contre les agressions de type envenimation que pourrait subir la mère. Le but de ce projet sera donc de déterminer le rôle des mastocytes dans la protection du fœtus lors de l'envenimation de la mère et plus globalement comprendre pourquoi nous développons ce type de cellule immunitaire si tôt pendant l'embryogenèse.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait mettre en évidence pour la première fois l'implication des mastocytes du fœtus dans la protection de celui-ci contre une agression de type envenimation, et plus globalement comprendre pourquoi nous développons ce type de cellule immunitaire si tôt pendant l'embryogenèse.
Procédures
Les animaux seront soumis à : des prises de poids journalières 1 fois par jour (procédure d'environ 5 secondes par souris), une seule injection unique en sous cutané de venin de crotale (contention de l'animal puis procédure de 5 secondes) et des prises de température par thermomètre sonde rectale (6 fois pendant l'heure suivant l'injection de venin puis 1 fois toutes les heures pendant les 5 heures suivantes, cette procédure dure environ 10 secondes par prise de température).
Impact sur les animaux
Les doses de venin utilisées ne seront pas mortelles. Elles induisent cependant localement un œdème, une hémorragie et une nécrose musculaire partielles qui guérissent en quelques jours.
Devenir
Les souris mâles utilisées lors de la reproduction seront proposées à la communauté de l'institut afin qu'elles puissent servir à d'autres expérimentations. Les femelles gestantes et les souriceaux seront sacrifiés à J5 après la naissance afin d'analyser l'état d'activation des mastocytes dans différents organes. En effet, grâce à des données préliminaires du laboratoire, nous savons qu'à 5 jours de développement, nous sommes capables d'observer une activation des mastocytes par immunohistochimie si celle-ci a eu lieu.
Remplacement
Ce projet vise à étudier l'effet des mastocytes embryonnaires sur la protection des fœtus lors de l'envenimation par la mère. Il n'existe pas à ce jour de modèle cellulaire satisfaisant qui puisse rendre compte de ce phénomène. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier l'impact des mastocytes, in vivo.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans l'étude de l'effet des venins de serpents nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous effectuerons l'analyse trois fois indépendamment sur la progéniture issue de 3 souris femelles hétérozygotes Sash accouplées à un mâle hétérozygote Sash. Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et une approche statistique). Les souriceaux seront sacrifiés à J5 après la naissance. En effet, grâce à des données préliminaires du laboratoire, nous savons qu'à 5 jours de développement, nous sommes capables d'observer une activation des mastocytes par immunohistochimie si celle-ci a eu lieu.
Raffinement
Lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Nous analyserons les paramètres suivants : poids (prise du poids initial à l'arrivée des animaux puis suivi constant et régulier (tous le jours) lors de la gestation, température (par thermomètre sonde rectale toutes les 10 minutes pendant une heure après injection du venin puis toutes les deux heures jusque 6h après injection), signes extérieurs de stress tels que le comportement, la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine ou bien une perte de température corporelle de - 8°C (un critère courant de morbidité utilisé dans plusieurs modèles), les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, les animaux qui portent la mutation c-kit (souris sash) nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sous un fond C57Bl/6 standardisé et bien contrôlé. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour la première procédure (accouplement) et les souriceaux issus de ces accouplements seront utilisés à J5 de développement. En effet, grâce à des données préliminaires du laboratoire, nous savons qu'à 5 jours de développement, nous sommes capables d'observer une activation des mastocytes par immunohistochimie si celle-ci a eu lieu dans l'embryon.
Role des lymphocytes T régulateurs dans le contrôle de la douleur chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses cellulaires et moléculaires, 270 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour savoir si des lymphocytes T régulateurs contrôlent la douleur par les enképhalines qu'ils produisent. Chacune reçoit cinq injections de tamoxifène dans l'abdomen et passe huit mesures de sensibilité à la pression aux filaments de Von Frey. Selon les groupes, s'y ajoutent sous anesthésie une injection dans le coussinet de la patte, une greffe de tumeur sous la peau ou, pour 126 d'entre elles, une constriction chronique du nerf sciatique. Le porteur écrit qu'"Une douleur modérée sera induite" dans toutes les procédures et exclut tout analgésique opioïde, qui pourrait interférer avec la lecture des résultats. Il prévoit du méloxicam, de la lidocaïne et de la bupivacaïne autour de la chirurgie du nerf, et affirme ailleurs que "L'administration d'analgésique est impossible ici".
Objectifs
Le projet vise à établir le rôle des peptides opiodes générés à partir de la proenképhaline produites par les lymphocytes T régulateurs (Treg) dans la perception de la douleur chez la souris. La signalisation par le TNFR2 pourrait être un facteur clé dans l'expression des enképhalines dans les Treg. Dans un travail publié récemment, le TNFR2 exprimé par les Treg est associé à la perception de la douleur dans le modèle de constriction du nerf sciatique, communément utilisé dans la recherche sur la douleur. Dans ce travail, les auteurs montrent notamment qu'un agoniste du TNFR2 est capable de réduire la sensibilité de la patte lésée mais seulement si les Treg sont présents. L'hypothèse de travail du projet est que le TNFR2 pourrait jouer son rôle sur la douleur par l'intermédiaire des enképhalines.
Bénéfices attendus
En l'absence de production d'enképhalines par les Treg, une douleur exacerbée dans au moins 2 des 3 procédures indiquerait un rôle important des Treg dans le contrôle de la douleur chez la souris. En l'absence du TNFR2 dans les Treg, nous vérifierons que le TNFR2 exerce son action sur la douleur via les Treg dans un modèle sans équivoque. Nous démontrerons alors que l'action du TNFR2 sur la douleur s'exerce via la régulation de la production des enképhalines. Ces résultats pourraient permettre d'améliorer la prise en charge de la douleur chez les patients via une action sur le TNFR2.
Procédures
- Injections intrapéritonéales de Tamoxifène (270 animaux vigiles): cinq injections à un jour d'intervalle. - Injections dans le coussinet plantaire (54 animaux sous anesthésie générale avec de l'Isoflurane): une seule injection. - Injections de tumeurs sous cutanées (90 animaux sous anesthésie générale avec de l'Isoflurane): une seule injection .-Constriction chronique du nerf sciatique ischio-jambier (126 animaux sous anesthésie générale avec Ketamine/Xylazine): chirurgie unique. - Traitement analgésique pré opératoire (126 animaux vigiles): une injection intrapéritonéale de Meloxicam. - Traitement analgésique pré opératoire (126 animaux vigiles): une seule injection locale de Lidocaïne et de Bupivicaïne. - Traitement analgésique post opératoire (126 animaux vigiles): deux injections intrapéritonéales de Meloxicam 24 heures et 48 heurs après la première injection. - Sensibilité à la pression avec les filaments Von Frey (270 animaux vigiles): 8 mesures de 3 à 9 jours d'intervalles. - Injection d'un agoniste de TNFR2 par voie intrapéritonéale (54 animaux vigiles): une seule injection
Impact sur les animaux
Une douleur modérée sera induite chez les animaux dans toutes les procédures. La douleur liée à la chrirugie du nerf sciatique sera prise en charge avec les analgésiques adaptés (Molixicam, Lidocaïne et Bupivicaïne) selon une posologie établie. Aucun analgésique opioide ne sera utilisée, ceux ci pouvant interférer avec la lecture des résultats et compromettre les objectifs du projet.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses cellulaires et moléculaires complémentaires.
Remplacement
Selon la définition de la Douleur par l'Association Internationale de l'Etude de la douleur (1979), " La douleur est une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à un dommage tissulaire présent ou potentiel, ou décrite en terme d'un tel dommage. ", on perçoit le caractère pluridimensionnel et plurifactoriel de la notion de douleur. Au regard de notre thématique faisant appel à des mesures de variation de la nociception, il nous est par conséquent impossible de palier à l’utilisation d’animaux vivants (anesthésiés ou vigiles). Notre projet est basé sur la perception de la douleur chez l'animal sans possibilité de remplacement par des expérimentations in vitro, la douleur n'étant pas quantifiable par des paramètres biochimiques connus.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des analyses des résultats. Nous utiliserons 6 animaux par groupe pour toutes les procédures et on répétera l’expérience 3 fois. Nous utiliserons le test statistique Mann- Whitney de type non paramétrique pour comparer les medianes entre groupes, ou d'analyse de pente par regréssion linéaire pour la croissance des tumeurs. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est aussi de réaliser les expériences sur les deux lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin de les comparer au même groupe témoin.
Raffinement
L’état général des animaux sera suivi de manière journalière par le personnel qualifié de l'animalerie ou par les membres habilités de l'équipe. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Une grille de scores cliniques sera remplie journellement pour déceler les animaux en souffrance qui seront immédiatement euthanasiés. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du carton pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité. Les animaux provenant de l'extérieur seront acclimatés une semaine avant leur inclusion dans les protocoles. Les animaux sont anesthésiés durant les procédures pouvant engendrer de la souffrance. L'administration d'analgésique est impossible ici, celle ci pouvant avoir des effets sur la lecture des résultats. Une grille de score clinique sera remplie journellement pour chaque animal pour évaluer l'évolution de la santé des animaux des procédures et engager l'euthanaise en cas d'atteinte d'un score définissant le point limite.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les espèces animales utilisées depuis de nombreuses années pour ce type d’étude (1). La souris représente un très bon modèle pour réaliser des expériences de comportement, des études de neuroanatomie, de physiologie et de biologie cellulaire et moléculaire. En outre le choix des rongeurs dans les études portant sur la douleur est admis depuis de nombreuses années et les modèles expérimentaux de douleurs chroniques sont bien caractérisés tant du point de vue des études comportementales que des analyses cellulaires ou moléculaires (1). La disponiblité de souris génétiquement manipulées pour les gènes d'intérêt rend aussi l'utilisation de cette espèce indispensable à la réalisation de ce projet. Dans ce projet 3 lignées différentes de souris génétiquement modifiées seront utilisées. Ces animaux sont issus d'élevage réalisés dans notre animalerie. 1 Larson CM, Wilcox GL, Fairbanks CA. The Study of Pain in Rats and Mice. Comp Med 2019; 69: 555–570. Des souris de 8 à 12 semaines d'âge seront utilisées pour travailler avec un système immunitaire mature comportant des niveaux stables de Treg. De plus, des souris adultes résistent mieux à l'anesthésie, ce qui garantit un réveil rapide et sans séquelles. Les souris mutantes sont génotypés par PCR par prélèvement d'un morceau de tissu caudal au moment du sevrage. Les animaux entrant dans les différents groupes sont identifiés par marquaes aux oreilles avec un poinçon dédié (ref: Fine Science Tools 24212-01 ) et désinfecté avec de l'éthanol 70% selon un code interne à l'expérience (absence de marquage, un ou deux marquages de 1mm aux oreilles droites ou gauches) permettant d'identifier les 6 animaux de chaque cage.
Reconstitution d’une réponse IgA dans des modèles murins qui en sont déficients
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Déficientes en anticorps IgA ou en leur récepteur, elles reçoivent des gavages quotidiens pendant dix-huit jours et deux prélèvements de sang, avant mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. L'objet est d'étudier l'effet de ces déficiences sur le microbiote intestinal et de tester un apport oral d'anticorps. Le porteur affirme que les interactions hôte-microbiote ne sont pas reproductibles in vitro et indique qu'aucune alternative n'existe pour ce projet.
Objectifs
Les immunoglobulines A (IgA) et M (IgM) sont abondamment produites dans le chorion de la muqueuse intestinale, avant d'être sécrétées dans la lumière intestinale. Les Immunoglobuline sécrétées (SIg) comprennent donc les SIgA et les SIgM, et façonnent le microbiote intestinal, notamment en offrant une protection contre les pathogènes, en permettant l'implantation de certaines souches bactériennes, et en favorisant l'échantillonnage des bactéries commensales au niveau des plaques de Peyer ; des organes lymphoides secondaires impliqués dans la réponse immunitaire mucosale. Ainsi, la déficience en IgA chez les humains est associée à une baisse de la diversité microbienne dans les fèces, et ce malgré la compensation de cette déficience par une sécretion augmentée de SIgM. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de la déficience en SIgA seules ou en SIgA et SIgM, sur la composition du microbiote intestinal de souris. De plus, la possibilité del'administration passive d'IgA par voie orale Pour cela, nous disposons au laboratoire de deux modèles différents : - Des souris IGHA-/-, de fond génétique BALB/C, qui ne produisent pas d'IgA que ce soit en périphérie ou dans la muqueuse intestinale. De façon similaire à la déficience en IgA chez l'homme, qui est l'immunodéficience humaine la plus commune, les SIgM seront toujours présentes dans la lumière intestinale, mais les SIgA en seront absentes. - Des souris pIgR-/- de fond génétique C57bl/6, qui sont déficientes pour le récepteur pIgR, nécessaire au transport des immunoglobulines vers la lumière intestinale, et donc à la production de SIg. Ces souris n'ont ni SIgA ni SIgM dans la lumière intestinale. Ce modèle reflète plutôt les immunodéficiences transitoires chez l'homme, notamment celles induites par l'utilisation d'immunosuppresseurs. Ces souris transgéniques sont déjà présentes dans l'animalerie du laboratoire. Ces souris sont de fond génétique différent, et il est préférable de comparer chacun des modèle à des souris sauvages du même fond génétique. En effet, des différences basales du système immunitaire pourraient expliquer des variations du microbiote intestinal, qui seraient alors indépendantes de la présence ou non de SIg. Des souris contrôles différentes seront donc utilisées pour chaque modèle. Afin de limiter les différences de microbiote entre les souris, ces dernières seront traitées par antibiotiques puis traitées par transplantation fécale (FMT) à partir de fèces de souris, ou de fèces humaines.
Bénéfices attendus
L'intérêt de ce projet est double : -D'un point de vue fondamental, il permettra de mieux comprendre l'impact de la compensation de la perte des SIgA par les SIgM, en comparant la dysbiose (ou déséquilibre de la flore intestinale) entre les souris pIgR-/- déficientes en SIgM et SIgA et IGHA-/-, uniquement déficientes en SIgA. De plus l'utilisation de modèles murins permet d'étudier la composition du microbiote intestinal dans les fèces, mais aussi directement dans l'intestin, ce qui permet une analyse plus précise que ce qui a déjà était fait chez l'homme. Ces résultats seront complétés par l'étude des métabolites dérivés du microbiote dans les fèces de ces souris. En effet, ces métabolites jouent un rôle important dans le métabolisme de l'hôte et dans la stimulation de son système immunitaire. - Cette étude apporte également un intérêt pour les applications cliniques d'administration orale d'IgA. La possibilité de limiter la mise en place d'un déséquilibre de la flore intestinale par un transfert passif d'IgA par voie orale a un intérêt clinique majeur. Si cette solution se révèle efficace, elle pourra en effet être testée chez des patients déficients en IgA ou sous immunosuppresseurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à des gavages par voie orale réguliers (1 fois par jour pendant 18 jours). La manipulation par animal dure entre 20 secondes et 1 minute. En début et fin d'expérimentation, du sang sera prélevé de chaque animal au niveau de la veine saphène (2 prélèvements à J4 et J18).
Impact sur les animaux
Les mutations portées par les modèles transgéniques pIgR-/- et IGHA-/- n'entachent pas la qualité de vie des animaux. Les gavages oraux réalisés fréquemment seront réalisés par un personnel particulièrement habitué au geste, de façon à ne créer aucune lésion et à diminuer la durée du geste.
Devenir
Les animaux seront sacrifiés par dislocation cervicale après anesthésie à l'isoflurane.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier finement les interactions entre un hôte et son microbiote intestinal. Ce dernier est composé d'une grande quantité de taxons différents, qui peuvent être aérobie ou anaérobie, et qui varient le long du tube digestif. Leur implantation dépend de nombreux facteurs parmi lesquel l'alimentation de l'hôte, la réponse immunitaire, la sécrétion de mucus, la compétition inter-espèces etc. Ces facteurs ne peuvent pas être contrôlés in vitro. Il n'y aucune possibilité de réaliser ce projet sans l'utilisation de modèles animaux.
Réduction
Les effectifs de 6 souris par groupe représentent la quantité minimale de souris nécessaire pour avoir assez de puissance pour conclure.
Raffinement
Les souris sont suivies attentivement par un personnel qualifié. Leur douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont. Les animaux sont hebergés en groupes harmonieux (par 2) et dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). L'eau et la nourriture sont mis à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée pour couvrir les bruits parasites.
Choix des espèces
La souris présente plusieurs avantages pour ce projet. Premièrement, elles produisent des IgA à la structure proche des IgA2 humaines (la sous classe majoritairement retrouvée dans les sécrétions mucosales), ce qui n'est par exemple pas le cas des modèles invertébrés. De plus, la grande majorité des travaux effectués sur les SIgA est conduite chez la souris, et notre travail pourra être analysé plus finement grâce à la vaste littérature qui existe sur ce sujet et avec ce modèle. Enfin, Les modèles IGHA-/- et PIGR-/- sont déjà présents dans notre animalerie, et permettront d'observer l'effet des IgA administrées oralement. Les souris auront entre 5 semaines et 6 mois, car avant 5 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire complet et après 6 mois la réponse immunitaire risque d’être altérée.
Evaluation par RMN de l’effet de la surexpression locale de GDF5 sur le muscle squelettique immobilisé de souris – EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
40 souris femelles vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, réutilisées ensuite dans un autre établissement. Un membre postérieur immobilisé, elles passent un examen d'IRM d'au plus 90 minutes sous sédation, sans injection, puis sont transférées pour une mesure de force musculaire. L'objet est d'évaluer l'effet d'une protéine, GDF5, sur l'atrophie musculaire liée à l'immobilisation, en lien avec la perte de masse observée en apesanteur. Le porteur affirme qu'aucun protocole in vitro n'atteint le niveau d'organisation du muscle et juge les études in vivo indispensables.
Objectifs
Un des problèmes majeurs de santé liés à une expédition humaine longue en orbite est la perte de masse musculaire induite par la microgravité. Cette perte de masse intervient rapidement dès l’induction de la microgravité puis s’aggrave avec le temps. Ce phénomène s’apparente à la perte de masse induite par une inactivité prolongée des muscles comme dans le cadre d’une immobilisation longue durée. Une perte de force significative liée à cette perte de masse peut alors être perçue au retour à la gravité. Il est donc nécessaire de mettre au point des mesures pour palier à cette perte de masse afin de pouvoir envisager des missions spatiales longue durée. Au niveau des mécanismes biologiques, il a été démontré que la protéine GDF5 (Growth Differentiation Factor 5) est impliquée dans les mécanismes de maintien de la masse musculaire. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de la voie caVβ1E/GDF5 sur l’atrophie musculaire induite par l’immobilisation des membres postérieurs de la souris. Pour cela, l’Imagerie par Résonance Magnétique Nucléaire (IRM), méthode non-invasive et atraumatique, représente une méthode de choix pour évaluer la masse musculaire in vivo et est utilisée depuis des décennies dans le diagnostic des maladies neuromusculaires grâce à ses contrastes d’imagerie adaptés à l’évaluation du muscle.
Bénéfices attendus
L'examen RMN permettra une évaluation qualitative et quantitative de l'atrophie musculaire induite par une immobilisation d'un segment de membre. De plus, l'analyse de la texture des muscles permettra de détecter une potentielle involution graisseuse du tissu contractile. Le traitement par GDF5 vise à limiter les effets délétères d'une immobilisation de membre, ou une absence de charge sur le membre comme on peut l'observer en apesanteur (par référence aux vols orbitaux).
Procédures
l'examen RMN est non invasif et atraumatique. chaque animal ne subit qu'un examen et la durée maximum est fixée à 90 minutes.
Impact sur les animaux
les contrastes utilisés en RMN sont des contrastes endogènes révélés par différentes séquence de résonnance magnétiques et ne nécessitent donc pas d'injections. L'examen RMN en lui même est non invasif et atraumatique. La seule nuisance est liée au fait de devoir sédater les animaux afin de maintenir leur immobilité durant l'examen.
Devenir
Tous les animaux (n=40) sont ensuite transférés au CEF (UMS28) pour mesure de force musculaire.
Remplacement
Le muscle est un ensemble organisé de fibres musculaires, cellules hautement différenciées et spécialisées, et du tissu interstitiel. La fonction musculaire est dépendante du fonctionnement des cellules musculaires, mais aussi d’une combinaison des fonctions vasculaire et nerveuse de l’individu. A l’heure actuelle, il n’existe aucun protocole in vitro permettant d’atteindre ce niveau de différenciation et d’organisation, ce qui rend les études in vivo indispensables pour les études sur la structure et le fonctionnement du muscle.
Réduction
Pour répondre au second R de la règle, Réduire, l’IRM apparaît comme étant une méthode de choix par son caractère non-invasif et atraumatique car elle permet la réutilisation des animaux. De plus, nous couplerons l’IRM à haut champ 7 tesla avec la technologie Cryoprobe afin d’atteindre des hautes résolutions en coupe transversales de l’ordre de 40*40 µm² sur une épaisseur de coupe de 200 µm augmentant alors significativement notre précision sur l’évaluation du volume musculaire. La minimalisation de la variabilité entre individus sera effectuée en utilisant qu’un fond génétique C57Bl/6J Rj et un seul sexe, femelle pour tous les animaux. Ces derniers proviendront aussi tous d’un même fournisseur pour minimiser les variations sanitaires.
Raffinement
Pour limiter l’angoisse et la souffrance des animaux, les animaux seront hébergés en groupes dans des cages jetables sur portoirs ventilés avec enrichissement (tube en cartons et papier absorbant pour la confection de nid). Si besoin de la nourriture pourra être déposée dans la cage. Le relevé des paramètres de l’hébergement (température, hygrométrie) ainsi que l’observation des animaux seront faits quotidiennement par du personnel compétent. Pendant les acquisitions, les animaux seront sédatés par inhalation d’un mélange O2/isoflurane et la fréquence respiratoire sera contrôlée tout au long de l’examen grâce à un capteur amagnétique. Enfin la température corporelle de l’animal sera maintenue stable autour de 37°C grâce à un tapis chauffant.
Choix des espèces
Du fait de leur petite taille et de la facilité pour les héberger, les souris sont un ordre animal facile à manipuler. De plus, de nombreux modèles de pathologies neuromusculaires ont été développés chez la souris. Les espèces de l’ordre des souris sont donc appropriées pour la recherche dans le domaine des maladies neuromusculaires. Au laboratoire, un grand nombre d’outils ont été développés pour la recherche en imagerie et en spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour étudier le muscle squelettique des rongeurs, en particulier des souris. De plus, la souris C57Bl6 a déjà été utilisée pour l’évaluation de l’efficacité de l’AAV9-GDF5 sur la trophicité du muscle dans le projet n°30294. Les animaux utilisés dans ce projet auront atteint l’âge adulte. L’âge des animaux qui seront étudiés dans ce projet par IRM sera compris entre 12 et 17 semaines. Cet âge permet de s’affranchir des variations de taille et de poids liées à la croissance de chaque individu. L’identification des animaux sera faite au CEF par marquage des phalanges. Les animaux, dans l’enceinte de notre EU, seront maintenus dans leur groupe d’origine
Investigation des Plasmas Froids Atmosphériques pour le traitement des adénocarcinomes pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
447 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses de tumeurs pulmonaires, elles font l'objet d'un suivi de croissance tumorale, d'apparition de métastases et d'imagerie, avant euthanasie par dislocation cervicale. Le résumé public reste très succinct, la rubrique bénéfices se limitant à la phrase cela permet de travailler sur un organisme entier et la rubrique procédures indiquant seulement l'absence de prélèvement sur animal vigile. Le porteur justifie l'étude d'un récepteur exprimé à la fois par les cellules tumorales et immunitaires par l'impossibilité de le tester in vitro.
Objectifs
Ce projet est justifié du point de vue scientifique au travers de : (1) la validation du projet global par les instances scientifiques qui financent l’expérimentation. Les responsables sont porteurs de différents projets impliquant les protocoles d’expérimentation animal détaillé plus bas qui ont été validés et donc soutenus par différentes instances telles que l’INSERM et SU. (2) la validation au niveau international des protocoles développés à travers la publication d’articles scientifiques dans les journaux à comité de lecture. La participation des responsables dans ce domaine est référencée sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed. (3) Nous avons préalablement montré que TLR7 a un rôle pro-tumoral dans un modèle de tumeur pulmonaire, en sous- cutanée. Les modèles animaux expérimentaux sont les seuls modèles permettant de réaliser cette étude, puisque ce récepteur est exprimé à la fois par les cellules tumorales et les cellules immunitaires, et l'impact de la stimulation de ce récepteur ne peut être testé qu 'in vivo.
Bénéfices attendus
Cela permet de travailler sur un organisme entier
Procédures
Il n'y a pas de prélèvements sur annimaux vigiles ou d'actes chirurgicales
Impact sur les animaux
Les animaux commerciaux auront un temps d'acclimatation de 8 jours avant d'être expérimentés. Les animaux seront observés de façon quotidienne. Les animaux seront gardés en groupes et hébergés dans des cages appropriées offrant suffisamment d’espace vital. Un milieu enrichi adapté est prévu pour l’hébergement des souris pour minimiser l’angoisse. Concernant les conditions de stabulation, notre animalerie a mis en place un programme d’enrichissement qui consiste à placer des nids végétaux dans les cages. La stabulation des animaux sera conventionnelle (litière normale, cages ventilées individuellement, 5 animaux maximum par cage de Type IIL, température 22°C (+/-2°C), éclairage alterné jour/nuit 12h/12h de 7h du matin à 7 h du soir) et ils recevront un régime alimentaire normal (nourriture Mucedola 4RF25 ou 21 ad libitum ainsi que l'eau par biberon). Nous utiliserons un test bilatéral standard de comparaison des moyennes de souris mutées comparées aux contrôles, avec un risque d’erreur de 5%. Notre stratégie d’observation consiste en une surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie d’une part. De plus, nous assurons en plus une surveillance et un contrôle 2 fois par semaine pour les souris dès leurs arrivées à l'animalerie avec recherche de signes d’altération de l’état général (poil mal entretenu, souris isolée et recroquevillée, non réactive, amaigrissement et de difficultés respiratoires (augmentation de la fréquence respiratoire). En cas de signe de souffrance les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale. Afin d’assurer une validité statistique aux expériences, un nombre de 10 souris par groupe sera utilisé pour suivre l’évolution de la croissance tumorale, l’apparition des métastases et l’infiltrat immunitaire. Chaque expérience sera répétée trois fois. Les résultats seront comparés grâce aux tests non paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA.
Devenir
Les animaux seront euthanasiées par dislocation cervicale
Remplacement
Nous menons dans notre laboratoire des études de compréhension des mécanismes impliquant TLR7 conduisant à des effets pro-tumoraux et de résistance au traitement par chimiothérapie chez des souris atteintes de tumeurs pulmonaires. La complexité de ce système ne pouvant en aucun cas être remplacée par des modèles in vitro puisque nous devons étudier les effets de la stimulation de TLR7 dans un organisme où à la fois les cellules tumorales et les cellules de l’hôte peuvent exprimer et être stimulées par ce récepteur. De plus, les souris C57TyrC (albinos) que nous utilisons dans notre modèle sont couramment utilisées en recherche en immunologie des tumeurs, par différents laboratoires, ce qui permet d'échanger et de discuter les résultats obtenus avec les laboratoires qui étudient d’autres aspects du même modèle. De plus, nous avons sélectionnés des souris albinos afin de réduire le bruit de fond lors des acquisitions à l’aide de l'imagerie IVIS (Lumina II - Perkin Elmer).
Réduction
Reduce (Réduire) le nombre d'animaux en expérimentation : les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles. Nous utiliserons un pied à coulisse pour mesurer le volume tumorale et des techniques d'imagerie non invasive pour l’apparition des métastases.
Raffinement
Refine (Raffiner) la méthodologie utilisée, ce qui implique la notion de points limites (critères d'interruption, ou "end- points") : des points limites ont été établis, pour définir à quel moment euthanasier les animaux au cours des expériences, si des signes de souffrances sont visibles. Ceci ne peut donc pas être étudie in vitro. De plus, Les animaux auront un temps d'acclimatation de 8 jours avant d'être expérimentés. Les animaux seront observés de façon quotidienne et seront gardés en groupes de 5 et hébergés dans des cages appropriées offrant suffisamment d’espace vital. Un milieu enrichi adapté est prévu pour l’hébergement des souris.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale adaptée pour conduire nos expériences avant tout dans un souci d’intégration de nos recherches dans un contexte scientifique où toutes les études similaires sont menées chez cet animal. Il s’agit d’une espèce pour laquelle notre animalerie est parfaitement adaptée, qui se manipule facilement et qui permet le recours à des modèles génétiquement modifiés. Nous utilisons des souris C57Bl/6 albinos, provenant du fournisseur Janvier Labs. Cette lignée albinos est une lignée dont la mutation provient d’une mutation spontanée dans la lignée C57Bl/6. Cette lignée est couramment utilisée pour les expériences de bioluminescence Les animaux sont utilisés à l'âge de 7 à 9 semaines. Ce stade de développement a été choisi car les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature. Les animaux sont identifiées au niveau de la queue à l'aide d'un marqueur dès que les tumeurs sont palpables (2 semaines après injection de cellules tumorales)
Rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un gène de l'autophagie invalidé, elles subissent une série de tests de développement puis des tests comportementaux nommés, dont l'activité locomotrice, l'anxiété, la résignation et la communication, avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever le cerveau. L'objet est d'étudier le rôle de l'autophagie dans les troubles du neurodéveloppement comme l'autisme, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que l'effet d'un tel défaut sur le comportement ne peut s'étudier autrement qu'in vivo.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l'année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier à différents âges le développement du système nerveux central chez un modèle souris pour lequel un gène de l’autophagie a été invalidé, par des approches complémentaires d’études du comportement et d’analyses des tissus prélevés. En particulier, nous étudierons le développement sensoriel et moteur chez le jeune animal pendant les trois premières semaines de vie, par la mise en place de tests successifs classiquement utilisés ; puis nous étudierons un ensemble de registres comportementaux individuels ou sociaux chez l’animal adolescent et adulte, tels que le niveau d’activité locomotrice, l’anxiété, les capacités cognitives, les comportements compulsifs, la résignation et les capacités de communication. Les échantillons prélevés nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests de développement ou de comportement non invasifs. Ils sont tous soumis à une procédure sans réveil de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).
Impact sur les animaux
A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans les procédures du présent projet, les animaux subissent exclusivement des tests non invasifs de développement et de comportement, jusqu’à l’euthanasie, pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place.
Devenir
A l’issue des procédures 1, 2 et 3, les animaux sont soumis à la procédure 4 (sans réveil). La procédure 4 décrit une perfusion intracardiaque réalisée afin de prélever les tissus d’intérêt. Les procédures 1, 2 et 3 sont classées en degré de gravité « modéré » et la 4ème est une procédure sans réveil. Les 3 premières procédures concernent chacune 120 animaux, la 4ème est réalisés sur l’ensemble des 360 animaux soumis à l’une des 3 premières procédures modérées. Nous comptons donc dans cette demande d’autorisation de projet 360 animaux en procédure modérée et 0 en procédure sans réveil. Les animaux ne sont donc pas maintenus en vie à l’issue de la procédure 4.
Remplacement
L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 360 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, quand cela est possible, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et la réalisation de séries de coupes par cerveau nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement : La normalité de la distribution des data obtenues sera analysée par le test de Shapiro-Wilk, et des tests paramétriques (ANOVA et test a posteriori de Bonferroni pour les données issues des tests de développement et comportement ou test t de Student pour les analyses des échantillons) ou non paramétriques (test de Kruskal-Wallis puis Mann-Whitney) seront ensuite appliqués. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié par décapitation avant PND14 et dans une chambre à CO2 après PND14. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place (procédure 4). Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en oeuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement (voir 3.3.2). Plusieurs stades de développement seront analysés : nous nous intéressons en effet aux conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, correspondant chacun à un temps d’euthanasie, seront étudiés : jeune (procédure 1 de PND4 à 17), adolescent (procédure 2 de PND25 à 34) et adulte (procédure 3 de PND70 à 89).
Évaluation du potentiel thérapeutique de la stimulation d’une modification protéique, la O-GlcNAcylation, dans le choc hémorragique chez le rat Wistar de 10 – 13 semaines
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
1 128 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, la moitié sous anesthésie sans réveil et la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'environ deux heures trente provoquant un choc hémorragique, un prélèvement de sang à la queue, puis une seconde chirurgie suivie de la mise à mort pour prélever sang et organes. Le porteur décrit un état de choc avec mobilité fortement réduite et absence de réaction aux stimuli, et indique que les rats trop douloureux sont sacrifiés en cours de protocole. Il conclut que ces réactions systémiques complexes rendent l'animal indispensable faute de méthode alternative.
Objectifs
Les buts du projet sont de 1) valider l’innocuité des molécules 2) valider une cinétique d’administration de molécules plus spécifiques et stables, 3) valider une dose d’administration de molécules plus spécifiques et stables, 4) valider une voie d’administration et enfin, de manière plus transversale, mieux comprendre les mécanismes dans lesquels est impliquée l’O-GlcNAcylation via l’identification de protéines cibles. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l’O-GlcNAcylation dans l’état de choc hémorragique et potentiellement de développer une nouvelle stratégie thérapeutique.
Bénéfices attendus
Avec les différents résultats précédemment obtenus par l’équipe et celle de John C. Chatham, les résultats attendus sont une amélioration de la réponse inflammatoire, une amélioration de la fonction cardiovasculaire et des différents marqueurs de stress et ceux à différents temps d’administration, à différentes doses et selon les différentes voies d’injection. Ces résultats seront objectivés par l’étude in vivo de la fonction et du stress cardiovasculaire (pression artérielle, fréquence cardiaque), rénaux et hépatiques mais également par des tests biochimiques (RT-qPCR, Western blot) validant l’effet des molécules testées. Un bénéfice à très long terme peut être le développement d’une nouvelle approche thérapeutique dans la prise en charge du choc hémorragique.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 interventions. La première intervention consiste à la chirurgie permettant de développer le choc hémorragique (juste la chirurgie pour le groupe contrôle). Cette chirurgie durera environ 2h30 (sur la base des études précédemment menées). La seconde intervention consiste en un prélèvement d’une goutte de sang au bout de la queue sur un animal vigile. Cette intervention ne durera que quelques secondes. La troisième et dernière intervention consiste à la chirurgie permettant d’avoir accès aux valeurs hémodynamiques de l’animal 24h après l’induction du choc. Cette chirurgie durera environ 10 minutes et sera suivi du sacrifice de l’animal pour prélèvement du sang et des organes de l’animal.
Impact sur les animaux
Le modèle de choc hémorragique est un modèle sévère. Au cours de ce protocole, l’état de santé des animaux va s’aggraver du fait du développement du choc hémorragique avec une mobilité fortement réduite, une absence de réaction aux stimuli sonores et toucher mais également une diminution de la prise alimentaire, sans toutefois de réel impact sur le poids, le protocole n’ayant une durée que de 24h. Enfin, une douleur peut être associée à la chirurgie réalisée sur l’animal. L’apparition de ces effets indésirables est environ 2 à 3h après l’induction du choc et jusqu’au sacrifice.
Devenir
En fin de procédure 1 (développement du choc hémorragique), les animaux présentant des signes de douleur trop importants seront sacrifiés. Seuls les animaux ne présentant pas des signes de douleur trop importants seront conservés pour la procédure 2. En fin de procédure 2, l’ensemble des animaux seront mis à mort pour prélever le sang et les organes pour effectuer des analyses.
Remplacement
Le choc hémorragique est une pathologie sans traitement et faisant intervenir des mécanismes complexes et intégrés, nécessitant impérativement l'utilisation de modèles animaux, en effet, les réactions systémiques complexes de l'organisme ne peuvent pas être reproduites in vitro sur des modèles cellulaires, rendant l'utilisation d'animaux indispensables pour mieux comprendre les mécanismes associés et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire notre modèle et évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude) qui ne nécessiteront pas l’utilisation de nouveaux animaux. Les rats utilisés sont des Wistar mâles âgés de 10 à 13 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les différentes procédures expérimentales de la première étape (mise au point) seront réalisées sur des effectifs réduits afin de déterminer les conditions d’utilisation optimales. Dans un second temps, lorsque les conditions d'utilisation optimales auront été déterminées, les procédures seront réalisées sur un plus grand nombre d’animaux avec seulement les conditions sélectionnées dans la première étape. Afin de raffiner le modèle, des mesures seront mises en place afin de maximiser le confort des animaux par exemple avec la mise en place de scores et de points limites comprenant des critères morphologiques (aspect, comportement) et physiologiques (température, fréquence respiratoire, lactates), l’administration d‘un antidouleur en début de procédure (lidocaïne 2%, gouttes sur les zones d’incision (maximum de 0,49mL pour un rat de 350g), en fin de procédure (buprénorphine à 0,05 mg/kg) et à 8 heures post-chirurgie (buprénorphine à 0,05 mg/kg) est prévue et la réinjection d’une dose supplémentaire peut être considérée en cas de signe de douleur. Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés par 2, dans des cages avec enrichissement, sur portoirs ventilés et avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Après chirurgie, afin d’éviter au maximum le stress, les animaux seront placés dans la même cage. Un respect strict des cycles jour/nuit sera observé.
Choix des espèces
Ce modèle est, historiquement et actuellement, le plus utilisé et le mieux décrit. Sa proximité avec la symptomatologie du choc hémorragique chez l’Homme et sa très bonne reproductibilité font un modèle efficace pour cribler et valider l’efficacité des traitements. De plus l’ensemble des travaux et des résultats précédemment obtenus par l’équipe de JC Chatham sur l’étude du choc hémorragique ont été réalisé sur ce modèle, preuve de son utilisation et donc de la connaissance de ce modèle. Les rats utilisés sont des Wistar mâles âgés de 10 à 13 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les effectifs sont choisis pour avoir une puissance statistique suffisante pour conclure sur nos résultats. Ils sont choisis sur la base des tests statistiques utilisés et de l'expérience de ce modèle, permettant de réduire le nombre d'animaux. 10-13 semaines – c’est un âge standard pour ce genre de manipulations.
Etude de l’effet anti-tumoral d’un inhibiteur de kinases dans un modèle de tumeurs coliques spontanées chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
46 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées pour développer des tumeurs coliques spontanées, elles reçoivent du tamoxifène puis un inhibiteur de kinases par gavage deux fois par semaine pendant un mois, avant mise à mort et prélèvement des intestins. Le porteur indique que les adénomes peuvent provoquer perte de poids, diarrhées, prolapsus et saignements rectaux, et vise à tester cet inhibiteur en prévention chez des familles à risque. Il affirme que la carcinogenèse spontanée reste le modèle le plus adapté et ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
La survenue d'un cancer est, en partie, le résultat d’un défaut du système immunitaire, due en particulier au potentiel des cellules cancéreuses à inhiber ces cellules. La caractérisation de ces mécanismes a permis le développement de différentes stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses telle l’immunothérapie. Le blocage des points de contrôle immunitaire est, de nos jours, l'immunothérapie la plus développée et la plus utilisée. Cependant, malgré des résultats concluants, cette immunothérapie n’est pas efficace chez tous les patients et ne peut être utilisée en prévention de l’apparition de la tumeur. Ainsi, la mise au point de nouvelles stratégies d'immunothérapies utilisant de petites molécules au moins aussi efficaces et utilisables de manière préventive, reste une nécessité. Il est maintenant bien documenté que les protéines kinases jouent un rôle dans le développement de la tumeur, d’où leur ciblage comme stratégie dans les traitements des cancers. Parmi ces inhibiteurs de kinase, le H89 induit une régression tumorale dans un modèle de cancer colique chez la souris. Cet effet antitumoral nécessite la présence d’un système immunitaire efficace. De manière très intéressante, nous avons pu montrer que l’injection préalable de H89 à la greffe des cellules tumorales chez la souris, inhibait la prise tumorale. Ce projet a pour but de mettre en évidence la capacité du H89 à prévenir le développement de tumeurs en utilisant cette fois-ci un modèle de souris génétiquement modifiées dans lesquelles se développe des tumeurs coliques spontanées.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus dans ce projet sont un retard dans le développement des tumeurs coliques, voir une inhibition totale de l’apparition de ces tumeurs. Ce projet a pour but de montrer l’intérêt d’utiliser en prévention cet inhibiteur de kinases dans les familles porteuses de mutations les rendant susceptibles au développement de tumeurs coliques.
Procédures
Les animaux recevront des injections intrapéritonéales ou des gavages de tamoxifène pendant 5 jours puis recevront ou non le H89 par gavage 2 fois par semaine, pendant 1 mois.
Impact sur les animaux
Dans la première procédure permettant de déterminer la dose et voie d’administration du tamoxifène, nous ne nous attendons pas à avoir d’effets indésirables. La voie ip à 1 mg est décrite dans la littérature comme n’induisant pas d’effets indésirables. L’administration par gavage est également largement décrite dans la littérature et connue elle aussi pour n’induire aucune toxicité sur cette courte durée. Dans la deuxième procédure, les souris vont développer une carcinogenèse colique sous 135 jours selon le modèle décrit dans la littérature. Pendant cette période, la formation des adénomes au niveau intestinal peut générer dans de rares cas de la perte de poids, des diarrhées, des prolapsus et saignements rectaux.
Devenir
A l’issu de ces procédures, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicales sous anesthésie à l’isoflurane et les intestins seront alors collectés pour vérifier l’apparition de la mutation (Procédure 1) et des adénomes coliques (Procédure 2).
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire pour évaluer l’efficacité d’une molécule à inhiber le développement spontané d’une tumeur. La carcinogenèse est un processus lent et complexe nécessitant un dialogue entre la cellule cancéreuse porteuse de la mutation et le microenvironnement tumoral. Les modèles de tumeurs greffées chez la souris ne permettent pas d’avoir à faire à une carcinogenèse similaire à celle retrouvée chez l’Homme. Le modèle de carcinogenèse spontanée chez la souris reste le modèle le plus adapté pour répondre à cette question.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous réalisons une première procédure nous permettant de mettre au point l’utilisation du tamoxifène pour induire la mutation dans les cellules épithéliales coliques. Cette procédure sera réalisée sur 2 groupes de 3 souris. Après avoir validé l’un ou l’autre des modes d’administration du tamoxifène, nous pourront réduire les groupes d’animaux (traités ou non-traités) à 20 animaux et utiliser le test statistique de Kruskal-Wallis pour déterminer la significativité des résultats.
Raffinement
L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Le développement des adénomes au niveau intestinal peut générer dans de rares cas la perte de poids, des diarrhées, des prolapsus et saignements rectaux. Nous calculerons deux fois par semaine le score clinique des souris grâce à une échelle de score prenant en compte les critères suivants : perte de poids, saignement rectal, prolapsus rectal, diarrhée, comportement et apparence. L’addition du score de chaque critère donnera une note sur 18. Le suivi des souris passera à 3 fois par semaine lorsque le score atteindre les 2/18, un score de 6 entraînera la mise à mort des souris par dislocation cervicales après anesthésie à l’isoflurane.
Choix des espèces
Ce modèle de souris C57Bl6 mutée (Apclox/+Vil creERT2) représente le modèle idéal permettant de reproduire le développement de tumeurs coliques spontanées. L’injection de tamoxifène doit être réalisée lorsque les souris ont entre 6 et 8 semaines selon les données de la littérature.
Essai de thérapie cellulaire de la sclérose en plaques en utilisant des cellules B régulatrices chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune est induite sous anesthésie puis les souris reçoivent, selon dix-neuf protocoles, des injections de cellules régulatrices et d'autres composés, développant une paralysie ascendante des membres avant une phase de rémission. Le porteur indique que les souris sont mises à mort si elles perdent plus de 20 % de leur poids ou en cas de paralysie complète, et vise à faire de cette approche une thérapie pour guérir la sclérose en plaques. Il conclut que les migrations cellulaires en jeu ne sont pas modélisables in vitro.
Objectifs
L'objectif du projet est de caractériser l'effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B régulatrices dans un modèle de sclérose en plaques (SEP).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est l’optimisation de cette approche pour en faire une thérapie pour guérir la SEP.
Procédures
L'EAE sera induit dans les 1608 souris sous anesthésie générale. Ces souris suivront 19 traitements différents. Le nombre de souris est indiqué pour chaque traitement additionnel: 1) 1 prélèvement de sang par veine mandibulaire, analyse J30: 24 souris 2) 1 injection Bregs, analyse J30: 624 souris 3) 1 injection Bregs, 1 prélèvement de sang par veine mandibulaire, analyse J30: 24 souris 4) Analyse J7: 24 souris 5) 1 injection Bregs, analyse J7: 72 souris 6) Analyse J10: 24 souris 7) 1 injection Bregs, analyse J10: 24 souris 8) Analyse J17: 24 souris. 9) 1 injection Bregs, analyse J17: 24 souris 10) Analyse J19: : 48 souris 11) 1 injection Bregs, analyse J19: 144 souris 12) Analyse J30: 264 souris 13) 1 injection Bregs, 4 injections TACI-Ig, analyse J30: 24 souris 14) 1 injection anti-CD25, 1 injection Bregs, analyse J30: 24 souris 15) 1 injection anti-CD25, analyse J30: 24 souris 16) 3 injections toxine diphtérique, analyse J30: 48 souris 17) 3 injections toxine diphtérique, 1 injection Breg, analyse J30: 24 souris 18) 4 gavages tamoxifène, analyse J30: 48 souris 19) 4 gavages tamoxifène, 1 injection Bregs, analyse J30: 48 souris.
Impact sur les animaux
L'induction de l'EAE est faite sous anesthésie générale. Le protocole d'induction de l'EAE par immunisation a été optimisé pour que la maladie entre en rémission, et pour réduire le nombre de souris requises, en rapport avec les 3Rs. Les souris développent la maladie vers J11 avec une phase de paralysie ascendante atteignant un maximum vers J17 puis une rémission avec récupération des fonctions motrices des quatre membres vers J22. L’évolution de la maladie est suivie de manière quotidienne sur un maximum de 30 jours, exceptionnellement 40 jours en cas de délai de développement. Nous employons une échelle de scores internationalement reconnue comprenant 6 stades. Les souris développent en général un score de 3 qui correspond à une paralysie partielle des membres postérieurs pendant quelques jours au pic de la maladie avant d’entrer en rémission et atteindre un score 2 correspondant à une démarche anormale vers J22. Ces souris restent donc mobiles et peuvent accéder à la nourriture et l'hydrogel placés au fond de la cage avant rémission des signes cliniques. Les souris souris seront systématiquement mises à mort si elles atteignent une perte de poids supérieure à 20%, ou bien une paralysie complète des membres postérieurs et partielle des membres antérieurs durant 24 heures, ou bien une paralysie complète des membres postérieurs et des membres antérieurs. Avant le développement de l'EAE, les souris sont suivies avec une grille de score incorporant poids, apparence et comportement. Les souris sont mises un mort lorsque l'un des critères ou la somme des critères dépasse un seuil limite tel qu'une perte de poids supérieure à 20%, ou bien un comportement très agité ou immobile ou avec automutilation, ou bien une apparence avec un poil très ébouriffé, des yeux plissés ou bridés, ou une posture anormale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que le statut de leur système immunitaire sera alors caractérisé.
Remplacement
Les protocoles expérimentaux nécessaires pour ce projet ont été optimisés par des expériences in vitro en vue de remplacement pour réduire le nombre de souris nécessaires. En outre, le protocole pour produire des Bregs a été sélectionné suite à un long travail d'optimisation in vitro afin de générer des cultures ne contenant que des Bregs. Les propriétés moléculaires de ces Bregs ont déjà été étudiées in vitro afin de réduire le recours à l'expérimentation animale. Ce projet vise à caractériser l’effet de Bregs dans un modèle de SEP. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires, et impliquent des processus d’interactions entre différents types cellulaires et de migrations cellulaires qui ne sont pas modélisables in vitro actuellement. Les maladies auto-immunes du SNC impliquent aussi la migration des cellules du système immunitaire dans le SNC, puis l’interaction de ces cellules avec des cellules résidentes du SNC. Ces processus ne sont également pas étudiables in vitro. Il n’y a donc pas d’alternative au fait de conduire les investigations décrites chez la souris.
Réduction
Le protocole d'induction de l'EAE a été optimisé de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Les mesures de remplacement et de raffinement décrites en 1 et en 3 ont également permis de réduire le nombre de souris nécessaires pour ce projet.Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum pour avoir des résultats statistiquement interprétables. Cest estimations sont basées sur notre expérience, et les estimations obtenues avec le programme d'analyse de puissance statistique G*Power.
Raffinement
Le protocole d'induction de l'EAE a été raffiné de manière à ce que les souris entrent en rémission rapidement après un court épisode clinique afin de réduire la souffrance des animaux. Le protocole a de plus été raffiné de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés par groupe de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés dans leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés tous les jours par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal, et les expérimentateurs. Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement.
Choix des espèces
Le modèle d’EAE chez la souris proposé est bien standardisé. Le savoir disponible sur ce modèle permet de mieux définir les plans d’expérience et donc de réduire le nombre de souris nécessaires. De nombreux outils sont disponibles pour ce modèle, qui permettent d’aborder les problématiques posées de la manière la plus pertinente, et de récupérer le maximum d’information. Ce modèle expérimental a été utilisé pour le développement de thérapies aujourd’hui utilisées chez les patients atteints de SEP. Bien que ce modèle ne soit pas un calque parfait de la SEP, c’est un modèle utile pour le développement de pistes thérapeutiques pour cette pathologie humaine. L’utilisation de souris de fond génétique C57BL/6 de 6 à 14 semaines est appropriée pour ces études.
Ecologie évolutive des mésanges bleues et mésanges charbonnières en populations naturelles
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
930 mésanges bleues et charbonnières sauvages vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, relâchées sur place après manipulation. Elles sont capturées, subissent une prise de sang et un prélèvement de plumes, puis un test de personnalité ou une manipulation anti-malaria, les poussins recevant en plus un déparasitage, pour étudier l'effet des parasites et du microbiote sur leur coloration et leur reproduction. Le porteur indique que chaque manipulation dure moins de dix minutes et que quarante ans de programme ont causé la mort de quinze oiseaux sur près de 24 000 capturés. Il affirme qu'aucun modèle théorique ne peut remplacer l'observation des oiseaux dans la nature.
Objectifs
Cette demande fait partie du programme de recherche « Ecologie évolutive des mésanges bleues et mésanges charbonnières en populations naturelles ». Concernant l’expérimentation animale conduite tous les ans dans le cadre de ce projet, le comité d’éthique a déjà donné un avis APAFIS #8608-2017012011062214 v4 le 5 juin 2018 pour une durée de 5 ans. Notre programme de recherche porte sur l'écologie évolutive des oiseaux sauvages. Nous ne disposons d’aucune méthode alternative qui remplacerait l’observation et la manipulation des animaux vivants pour répondre aux questions posées dans ce programme puisque les études en laboratoire ou les modèles mathématiques font largement abstraction de la grande variabilité environnementale observée dans la nature. Nous avons établi des règles strictes qui limitent au maximum le dérangement des oiseaux et pensons en avance aux statistiques à réaliser pour que nos conclusions soient solides et donc cherchons la balance entre ne pas utiliser trop d’animaux et en utiliser assez pour avoir des statistiques fiables.
Bénéfices attendus
Projet 1. Effet des parasites (malaria) sur les colorations des oiseaux. L'approche expérimentale envisagée ici permettra de tester l'importance des parasites pour l'expression des ornements intervenant dans les processus de sélection sexuelle. Cette question a jusqu'ici été abordée de manière corrélative et l'approche expérimentale sera instrumentale pour déterminer des processus causatifs. --//--Projet 2. Effet du microbiote (bactéries) sur la fitness des oiseaux. L’approche expérimentale de ce projet permettra de dépasser la simple description du microbiote et de tester des prédictions associées à notre hypothèse. Ce projet apportera des réponses fondamentales concernant les déterminants environnementaux et génétiques de la diversité microbienne chez les oiseaux en milieu naturel.
Procédures
Les deux expériences proposent un nombre maximal d'oiseaux utilisés de 930. Ce nombre est dicté par la grande variabilité des individus en populations naturelles, les faibles taux naturels de retour (50%) et de recrutement (10%). Les oiseaux (adultes ou poussins) sont manipulés très rapidement : moins de deux minutes pour chacune des expériences. Le raffinement est effectif par la brièveté des manipulations. Pour l’expérience 1, les adultes sont lâchés sur place et pour l’expérience 2 les poussins sont laissés dans le nid. Les adultes auront quatre actes légers consécutifs, à savoir capture, prise de sang, prélèvement de plumes puis soit un test de personnalité soit l’expérimentation anti-malaria. Les poussins, eux, auront une prise de mesures systématiquement et certain d’entre eux auront l’expérimentation de déparasitage. La durée de ces actes est de moins de 10min ce qui constitue un dérangement minime pour ces oiseaux qui sont relâchés directement sur le lieu de capture.
Impact sur les animaux
L’euthanasie ne sera réalisée qu’en cas d’absolue nécessité, lorsque la manipulation de l’oiseau a entrainé une lésion grave et mortelle. Protocole : l’euthanasie se fera selon les règles établies et reconnues par les comités d’éthique, c’est-à-dire soit par euthanasie gazeuse à l'isoflurane, soit par dislocation cervicale. A titre indicatif, le bilan de notre programme mésanges, après 40 ans d’activité et la capture de 23,879 individus adultes est de 15 oiseaux morts du fait d’une manipulation (dont 4 crises cardiaques et 5 euthanasies suite à des blessures graves). La probabilité que nous ayons à faire une euthanasie est donc faible.
Devenir
Expérience 1. Tous les animaux sauvages sont relâchés dans leurs conditions naturelles après la prise de sang. Les oiseaux captifs retournent en volière et seront relâchés à la fin de toutes les expériences. --/-- Expérience 2. Tous les animaux sont relâchés dans leurs conditions naturelles après l’expérience.
Remplacement
Les mésanges nichent facilement dans des nichoirs et la manipulation de leurs poussins ainsi que la capture des individus n'entrainent aucun abandon de nichées. Nos recherches sur le long terme (40 ans) sur les mésanges nous offrent une opportunité unique de mesurer les traits d’intérêts sur des oiseaux dont toute la généalogie est connue, ce qui permet notamment d’envisager des analyses de génétique quantitative pour estimer l’hérédité des caractères. Par ailleurs, ce modèle d’étude est unique car il permet de travailler à la fois en population naturelle et à l’aide d’expérimentations en conditions contrôlées au laboratoire. Aucun modèle théorique ne peut remplacer l’étude des oiseaux dans la nature pour répondre à ces questions.
Réduction
Pour le nombre d’animaux utilisés, nos connaissances en statistiques (analyses de puissance avec le logiciel R) nous permettent de savoir qu’il faut au moins 20 à 50 individus par traitement pour pouvoir tester l’effet d’une expérience. Pour l’expérience 1, 160 seront manipulés en population naturelles car leur taux de mortalité naturelle en population naturelle est de 50% d’une année à l’autre et donc nous aurons 40 pour chaque groupe. En Captivité 50 sont prévu car nous ne prévoyons pas de mortalité au cours de l’expérience. Pour l’expérience deux 720 poussins sont prévus car en population naturelle leur recrutement est de 90% en population naturelle et donc devrions avoir environ 72 poussins l’année après l’expérience pour les deux groupes.
Raffinement
Le protocole envisagé n’est pas douloureux, pour réduire l’angoisse de l’individu les actes prévus seront court (moins de 10 min par adultes et 5 ??? par poussins).
Choix des espèces
Les mésanges font l'objet d'études dans de nombreux laboratoires européens, et en particulier dans notre laboratoire du CEFE de Montpellier cette espèce est étudiée depuis plus de 40 ans par notre équipe. Les bases de données relatives aux comportements et à l'écologie de cette espèce sont telles que la mésange est devenue un important modèle d'étude pour la compréhension des mécanismes comportementaux d'animaux sauvages. Expérience 1 : stade poussins Nous cherchons à mesurer l’effet de la modification du microbiote sur la personnalité des poussins. Cela demande de venir 4 fois pour nourrir les oiseaux avec l’antibiotique. Les poussins sont facilement accessibles et sont en nombre suffisant pour tester cela. Expérience 2 : stade adulte. La mortalité juvénile (de 90%) nous obligerait à injecter de l’anti paludéen sur un grand nombre de poussin.
Altération de la myéline, activité cérébrale et cognition – étude pilote
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont six dans des procédures classées d'un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent de la cuprizone dans leur nourriture pour détruire la myéline de leur cerveau, subissent des craniotomies avec ou sans réveil pour enregistrer l'activité cérébrale, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour extraire le cerveau. Cette étude pilote cherche à relier renouvellement de la myéline et cognition, dans l'espoir lointain de mieux comprendre la sclérose en plaques et le vieillissement. Le porteur reconnaît l'absence de base statistique pour fixer le nombre d'animaux et conclut qu'aucune méthode ne remplace l'expérimentation animale.
Objectifs
Comprendre le fonctionnement du cerveau et traiter ses troubles nécessitent d’étudier cet organe complexe à plusieurs niveaux d’analyse, ce qui n'est pas encore possible sur des modèles in vitro. En l’absence d’alternatives adéquates, répondre à ces questions nécessite hélas encore à ce jour le recours à l’expérimentation animale. En apportant de nouvelles connaissances sur les réseaux neuronaux impliqués dans la cognition, ce projet permettra à plus long-terme de mieux comprendre la sclérose en plaques ou bien les troubles associés au vieillissement.
Bénéfices attendus
En apportant de nouvelles connaissances sur les réseaux neuronaux impliqués dans la cognition, ce projet permettra à plus long-terme de mieux comprendre la sclérose en plaques ou bien les troubles associés au vieillissement. Ce projet s’inscrit donc dans un cadre de santé publique.
Procédures
Les animaux seront soumis : - Traitement Cuprisone qui induit une démyélinisation transitoire ; ce traitement est donné dans la nourriture - Procédures chirurgicales (craniotomies) sans réveil sous anesthésie générales et analgésie afin d’enregistrer l’activité cérébrales avec des sondes adaptées - Procédures chirurgicales (craniotomies) sous anesthésie générale et analgésie avec réveil et traitement adapté de la douleur éventuelle, afin d’enregistrer l’activité cérébrales avec des sondes adaptées chez l’animal vigile - Perfusion intracardiaque sous anesthésie générale et analgésie profondes dans le but d’extraire les cerveaux
Impact sur les animaux
Le modèle à la Cuprisone et les techniques d'enregistrement utilisés dans ce projet sont maitrisés depuis longtemps par les experimentateurs
Devenir
Procédure #1 : 10 souris traitées à la Cuprisone + 6 contrôles maintenues en vie. Procédure #2 : réutilise toutes les 16 souris issues de la procédure #1 10 souris traitées à la Cuprisone, dont 4 seront gardée en vie pour entrer dans la procédure #3 et 6 sont euthanasiées afin de réaliser des analyses neuroanatomiques sur les cerveaux ; 6 souris contrôles, dont 2 seront gardée en vie pour entrer dans la procédure #3 et 4 sont euthanasiées afin de réaliser des analyses neuroanatomiques sur les cerveaux. Procédure #3 : réutilise 4 souris traitées à la Cuprisone et 2 souris contrôles préalablement enregistrées dans la procédure #2. Elles entreront en fin de procédure dans la #4. Procédure #4 : réutilise les 6 souris issues de la procédure #3 où elles sont euthanasiées afin de réaliser des analyses neuroanatomiques sur les cerveaux.
Remplacement
Le cerveau est un des organes les plus complexes, et l’objectif de ce projet est de décrypter le lien possible entre le renouvellement physiologique et pathologique de la myéline. Le caractère méconnu du fonctionnement cérébral implique que ce projet ne peut pas se passer de l'utilisation d'animaux afin d'en déterminer les mécanismes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour réaliser ce travail.
Réduction
Il s’agit d’une étude pilote et il n’y a pas de bases statistiques pour définir le nombre d’animaux. Compte tenu du caractère individuel des lésions, l’unité expérimentale correspond à l’animal. Seulement deux groupes d’animaux (contrôles et traités) seront utilisés, et le nombre d’animaux par groupe a été optimisé à 6 et 10 respectivement pour réduire au minimum le nombre de souris tout en obtenant des résultats significatifs. Sur la base de notre expérience en neurophysiologie, nous estimons que 6 à 10 animaux par groupe représentent un nombre nécessaire et suffisant.
Raffinement
Ce projet propose des méthodes pertinentes pour limiter la douleur, la souffrance, le stress et l’inconfort. Nous avons mis en place des points limites adaptés et précoces pour chaque procédure (comme les interventions chirurgicales) et une réponse rapide (suivi post-opératoire, analgésie (Buprécare 0,05mg/kg/24h sCut et Metacam 1mg/kg/24h sCut), suivi quotidien des animaux). Tous les actes invasifs seront pratiqués sous anesthésie générale utilisant une association de kétamine-xylazine (100 mg/kg et 10mg/kg) - Buprécare 0,05mg/kg et ropivacaïne (2mg/kg). Le bien-être animal est aussi privilégié au niveau des conditions d'hébergement (animaux à plusieurs dans de grandes cages, eau et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en cartons et divers objets) pour minimiser le stress et être au plus près du comportement naturel de l'espèce animale.
Choix des espèces
La myéline compacte telle qu’on la trouve chez l’homme n’existe pas chez les Invertébrés ; c’est une « astuce » de l’évolution permettant d’accélérer la vitesse de conduction du signal en adéquation avec l’augmentation de la taille des organismes. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle animal vertébré. Parmi ceux-ci, les rongeurs sont particulièrement intéressants de par leur capacité à remyéliniser assez efficacement après lésion. Le modèle utilisant la Cuprisone chez la souris est le modèle de référence. De plus, les dynamiques cérébrales générales analysées dans ce projet sont conservées entre les rongeurs et l’Homme. Les résultats de notre étude permettront de mieux extrapoler les mécanismes cérébraux chez l’Homme. Les expérimentations seront initiées sur des souris adultes soit relativement jeunes (2-3 mois) soit plus âgés (6-8 mois), dont certaines seront conservés pendant 6 mois avant sacrifice (à ce moment les souris seront alors âgées de 8 à14 mois).
Etude des voies de signalisation RAGE dans le syndrome sec oculaire
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur provoque une sécheresse oculaire par des injections de scopolamine quatre fois par jour et une exposition à un courant d'air continu dix heures par jour pendant douze jours, avec suivi de la production de larmes et de l'état de la cornée. Le projet étudie le rôle d'un récepteur, RAGE, dans cette pathologie, sur des souris dont ce gène est inactivé. Le porteur affirme que l'étude "ne peut pas" être menée chez le patient pour des raisons éthiques et que la règle des 3R ne permet pas de remplacer le modèle animal.
Objectifs
L'oeil sec est une pathologie de la surface oculaire, très fréquente, touchant environ 50 à 60 % des personnes de plus de 50 ans. Notre objectif est de caractériser le récepteur RAGE, ses voies cellulaires, et l'expression phénotypique du syndrome sec oculaire dans plusieurs tissus et fluides de l'oeil (cornée, conjonctive, cellules à mucus, larmes) ainsi qu’au niveau physiologique (développement de la maladie) chez des souris KO RAGE -/- et chez des souris "sauvages" soumises à des conditions environnementales connues pour être à risque de syndrome sec oculaire. La conduite de cette étude sur l’oeil sec in-vivo ne peut pas être menée directement chez le patient pour des raisons éthiques évidentes. Ainsi, celle-ci nécessite un organisme vivant, afin d’avoir une vue d’ensemble sur le développement de la maladie et sur les acteurs impliqués dans la survenue et le caractère cyclique de cette pathologie. Considérant la règle des 3R, nous ne pouvons pas recourir au remplacement du modèle animal décrit.
Bénéfices attendus
Le récepteur des produits avancés de glycation (RAGE) est un récepteur ubiquitaire dans l'organisme, connu pour être pro-inflammatoire, pro-thrombogène, ou encore pro-apoptotique au niveau cellulaire. Notre objectif est de caractériser le récepteur RAGE, ses voies cellulaires, et l'expression phénotypique du syndrome sec oculaire dans plusieurs tissus et fluides de l'oeil (cornée, conjonctive, cellules à mucus, larmes) ainsi qu’au niveau physiologique (développement de la maladie) chez des souris KO RAGE -/- et chez des souris "sauvages" soumises à des conditions environnementales connues pour être à risque de syndrome sec oculaire. Ainsi, nous essayons par ce projet de mieux connaitre les voies d'activation cellulaire de RAGE dans la pysiopathologie du syndrome sec oculaire. Un des bénéfice majeur de ce travail pourrait être une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques complexes du syndrome sec oculaire, notamment les voies d'activation de l'inflammation au niveau de la surface oculaire.
Procédures
Des souris KO RAGE -/- et des souris "sauvages" RAGE +/+ de la lignée C57 Black 6 (âgées de 4 à 6 semaines) seront soumises à des stimuli environnementaux connus pour être à risque de survenue de sécheresse oculaire (comme une attention soutenue sur une tâche nécessitant de la concentration, et/ou une condition venteuse avec hygrométrie faible). En parallèle, des souris témoins des 2 fonds génétiques seront utilisés comme contrôle de l’expérimentation. Dans un premier temps, l’ensemble des souris seront placées dans leur cage en condition standard pendant 8 jours: température 23 +/- 2°C, humidité 50 à 75%, alternance 12 heures lumière - obscurité (8h to 20h), et eau/alimentation ad libitum. Pour les groupes « oeil sec », l’induction du syndrome se fera par l’injection sous-cutanée 4 fois par jour (8h00, 12h00, 14h00 et 17h00) de scopolamine (0.5 mg/0.2 ml; Sigma-Aldrich) en alternant le flanc gauche et droit. Les souris seront de plus exposées à un courant d'air continu à partir d'un ventilateur placé à 15 cm devant la cage (courant d’air de 2-4 m/secondes) dans une pièce à environnement contrôlé (30-35 % humidité, 23°C, alternance jour/nuit 12h) et ce pendant 10 heures par jour durant 12 jours consécutifs. Le modèle de maladie de l’oeil sec proposé dans ce projet a déjà largement été utilisé sans effet nocif perceptible lié au traitement à la scopolamine ni à une faible humidité [Luo, L. et al., 2004 ; Yeh, S. et al., 2003]. Pour les groupes témoins, les souris seront placées dans un environnement non stressant contenant 50 à 75% d'humidité à la température de 23 +/- 2°C, sans exposition à l'air forcé et eau/alimentation ad libitum. Lors de l’expérimentation, des tests « non invasifs » seront réalisés afin d’évaluer au jour le jour l’avancée du syndrome . Tout d’abord, la perte de production de larmes sera testée en utilisant des fils de coton imprégnés de rouge de phénol qui seront placés dans le ménisque des larmes du canthus latéral pendant 30 secondes (1 fois par jour pendant la durée de l'expérimentation). Ce test est considéré comme équivalent au test de Schirmer mené chez les patients souffrant d’un syndrome de l’oeil sec (bandelette buvard graduée permettant de quantifier la production lacrymale sur 5 minutes). En parallèle, l’étude de l’intégrité des épithéliums sera réalisée en utilisant l’instillation de fluorescéine (1%) et l’utilisation d’une lampe à fente (1 fois par jour pendant la durée de l'expérimentation).
Impact sur les animaux
La provocation expérimentale d'un oeil sec n'est pas anticipé comme étant une condition risquant de provoquer une douleur majeure ou une angoisse animale. Les symptômes de syndrome sec oculaire sont une sensation de corps étrangers, une brulure oculaire, une rougeur oculaire et une irritation de surface. Cependant, en cas de constation d'un comportement douloureux (intolérance majeure à la lumière, animal prostré, ne s'alimentant plus) ou d'un ulcère cornéen profond (stromal profond de la cornée) et/ou à risque de perforation cornéenne, l'animal sera anesthésié et sacrifié par surdosage en produits anesthésiques (Pentobarbital 150 mg/kg en injection intrapéritonéale), aboutissant à une apnée conduisant au décès. Ce type de symptômes ou constation clinique est exceptionnellement lié à un syndrome sec oculaire chez l'Homme. Ils sont le plus souvent dus à des commorbidités oculaires sous jacentes (pathologies inflammatoires, troubles liés à l'innervation cornéenne, anomalies des cellules souches limbiques, pathologies infectieuses cornéennes).
Devenir
Tous les animaux sont sacrifiés avant prélèvement de leurs globes oculaires.
Remplacement
La conduite de cette étude sur l’oeil sec in-vivo ne peut pas être menée directement chez le patient pour des raisons éthiques évidentes. Ainsi, celle-ci nécessite un organisme vivant, afin d’avoir une vue d’ensemble sur le développement de la maladie et sur les acteurs impliqués dans la survenue et le caractère cyclique de cette pathologie. De nombreux travaux déjà publiés sur l’étude des anomalies de la surface oculaire (cornée, conjonctive, larmes) ont établi que l’utilisation du modèle souris apparaissait comme la meilleure solution. De plus, l’équipe de recherche possédant et utilisant déjà la lignée RAGE -/-, ce choix apparait de fait logique et justifié. Enfin, ce cercle vicieux de l’oeil sec et son processus pathologique dynamique pourront être étudiés sur ce modèle et corrélés avec les agressions subis par l’oeil humain et les capacités de cicatrisation de ce type de tissu vivant. Considérant la règle des 3R, pour le remplacement nous avons réalisé toutes les premières études en utilisant des cellules en culture afin d'éviter l'inclusion d'un trop grand nombre d'animaux.
Réduction
Afin d'inscrire cette expérimentation animale dans le cadre de la Règle des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer), nous réduirons notre étude à 4 groupes distincts (pour tenir compte de la variabilité expérimentale): chaque groupe sera constitué de 10 souris pour un effectif total de 40 souris. Pour rappel: Ce protocole expérimental utilisant la souris nécessitera la constitution de 4 groupes distincts dont les effectifs ont été calculés pour réduire au maximum le nombre de souris afin d'optimiser la puissance statistique. En tenant compte de la variabilité expérimentale concomitante à la conduite de tels projets chaque groupe sera constitué de 10 souris pour un effectif total de 40 : Groupe 1 : Souris Wild-Type *Groupe contrôle (effectif :10); Groupe 2 : Souris RAGE -/- *Groupe contrôle (effectif :10); Groupe 3 : Souris Wild-Type *Groupe OEil-sec (effectif :10); Groupe 4 : Souris RAGE -/- *Groupe OEil-sec (effectif :10). Ces effectifs nous permettront d’obtenu des tests statistiques non paramétriques (Kruskal-Wallis et Mann-Whitney U test).
Raffinement
Dans l'optique de raffiner au mieux notre protocol, nous veillerons au bien-être animal (pas de surpopulation dans les cages, éviter les actes douloureux inutiles, enrichissement des cages avec des roues de course, des tubes en plastique, boîtes en carton et des matériaux de nidification). Points Limites: la provocation expérimentale d'un oeil sec n'est pas anticipé comme étant une condition risquant de provoquer une douleur majeure ou une angoisse animale. Les signes cliniques et fonctionnels du syndrome sec oculaire sont minimes à modérés: une gène oculaire à type de grains de sable, des sensations de brûlures oculaires superficielles, un prurit, une vision trouble fluctuante. L'ensemble de ce protocole ne doit pas normalement entrainer de souffrance animale. Malgrès tout, en cas de constation d'un comportement douloureux (intolérance majeure à la lumière, animal prostré, ne s'alimentant plus) ou d'un ulcère cornéen profond (stromal profond de la cornée) et/ou à risque de perforation cornéenne, l'animal sera anesthésié et sacrifié par surdosage en produits anesthésiques (Pentobarbital 150 mg/kg en injection intrapéritonéale), aboutissant à une apnée conduisant au décès. Ce type de symptômes ou constation clinique est exceptionnellement lié à un syndrome sec oculaire chez l'Homme. Ils sont le plus souvent dus à des commorbidités oculaires sous jacentes (pathologies inflammatoires, troubles liés à l'innervation cornéenne, anomalies des cellules souches limbiques, pathologies infectieuses cornéennes).
Choix des espèces
Comme évoqué dans les paragraphes précédents, le choix de la souris comme modèle d’étude va permettre : - une analyse biomoléculaire proche de la cornée humaine du fait de sa forte homologie anatomique et fonctionnelle avec l’espèce humaine. - l’utilisation du modèle murin dans le syndrome sec expérimental qui est d’ores et déjà largement décrit et reconnu au travers de la littérature. - d’utiliser les nombreux outils moléculaires accessibles, développés et validés dans le modèle murin ; et en particulier l’utilisation de souris dont le gène étudié (RAGE) est inactivé. Nous utiliserons des souris mâles Black 6 (souris « C57BL/6JRj, Janvier Labs ») âgées de 4 à 6 semaines. Ainsi toutes les souris ont le même poids et sont sevrées de l’allaitement maternel. C’est également la période optimum pour la cicatrisation des tissus.