Recherche fondamentale

Équipées par chirurgie d'un capteur implanté de pression artérielle, 212 souris sont enregistrées à plusieurs âges, et 106 d'entre elles doivent aussi marcher sur un tapis roulant "à vitesse soutenue". 274 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tuées pour des prélèvements de tissus, la moitié portant une mutation semblable à celle de la sclérose latérale amyotrophique humaine, qui provoque des atteintes motrices. Le projet cherche si la régulation de la pression artérielle se dérègle avant les premiers symptômes moteurs. Le RNT ne dit pas jusqu'à quel stade de la maladie les souris sont gardées, et ses effectifs ne concordent pas : 212 souris opérées et 168 autres gardées jusqu'au vieillissement font 380, pour 274 déclarées.

Objectifs

La moelle épinière thoracique contient l'essentiel des neurones à l'origine de la commande nerveuse autonome sympathique, un acteur majeur du maintien de l'homéostasie corporelle, responsable du contrôle d'un grand nombre d'activités automatiques de l'organisme. Les neurones préganglionnaires sympathiques (SPNs), étage de sortie de la commande sympathique, connectent au sein des ganglions sympathiques les neurones postganglionnaires sympathiques qui à leur tour connectent les organes cibles. Les SPNs sont des neurones qui sont moléculairement extrêmement proches des neurones qui commandent les muscles striés : les motoneurones (MNs). La sclérose latérale amyotrophique (SLA), troisième maladie neurodegerative après Alzeihmer et Parkinson est caractérisée par la perte des neurones moteurs corticaux et des MNs spinaux conduisant à une atrophie musculaire, à la paralysie progressive des malades et à leur décès par insuffisance respiratoire. Les causes précises de la dégénérescence des MNs sont à ce jour encore inconnues et nous ignorons encore si cette dégénérescence est initiée directement au niveau des MNs ou au niveau du muscle. Notre hypothèse est que les SPNs sont aussi atteints dans la SLA et participent via un dysfonctionnement du contrôle vasculaire musculaire à la dégénérescence du muscle et des MNs. L’objectif de ce projet est donc de mettre en évidence des altérations précoces (avant l'apparition des symptômes moteurs) de la régulation de la pression artérielle sur un modèle murin de la SLA.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) dont l'issu est aujourd'hui toujours fatale chez l'homme (dans les 3 à 5 ans suivant les premiers symptômes).

Procédures

Certains animaux subiront une chirurgie (n=212) et certains d'entre eux marcheront aussi sur un tapis roulant à vitesse soutenue (n=106). Les 168 autres animaux seront maintenus en vieillissement pour des prélèvements post-motem uniquement.

Impact sur les animaux

La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices qui seront surveillées de très près par une équipe compétente (50% des animaux de l'étude)

Devenir

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des prélèvements de tissus seront faits. Cela permettra de faire des études histologiques et immuno-histologiques

Remplacement

Des études préliminaires sur tissus ont été faites afin d'orienter le projet. De plus, une grosse partie du projet se fera ex-vivo grâce à des techniques d'histologie et d'immuno-histologie. Il n'existe pas de modèle mathématique simulant les modifications induites par SLA sur les paramètres cardiovasculaires car les connaissances de cette maladie sont aujourd'hui limitées. De plus, le suivi de paramètres physiologiques au cours de la vie d'un animal n'est pas possible en dehors d'un système intégré comme un organisme entier. Il n'est donc pas possible de faire cela sur des tissus ex-vivo. C'est à cause du manque de connaissance de notre modèle (la SLA) que nous avons recours à l'utilisation d'animaux présentant cette maladie.

Réduction

Afin de déterminer au mieux le nombre d'animaux, nous avons calculé le n à l'aide de tests statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser un système de mesure de la pression artérielle qui sera implanté. Ainsi, chacun des animaux sera enregistré à chaque temps permettant de ne pas multiplier le nombre d'animaux par le nombre de temps d'enregistrement. Une étude pilote sur très peu d'animaux (16) sera faite et conditionnera l'utilisation des autres animaux.

Raffinement

Les individus porteurs de la mutation seront suivi régulierement et l'évaluation des signes moteurs sera faite toutes les semaines, puis 2 fois par semaine, puis tous les 2 jours puis quotidiennement afin de ne jamais laisser un animal en souffrance. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé afin de préserver le caractère grégaire de la souris. Lors de la chirurgie d'implantation, des soins post-opératoires seront faits (analgésie, antibiothérapie si nécéssaire sur avis vétérinaire, tapis chauffant pour le réveil), les conditions d'asepsies seront respectées (autoclavage, stérilisation à froids, matériels à usage unique stérile) et le personnel dédié à la chirurgie sera parfaitement formé (formation réglementaire et spécifique auprès d'un centre de formation dédié).

Choix des espèces

La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. De plus, un modele murin de la sclérose latérale amyotrophique existe. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Enfin le choix de l'espèce est aussi conforme au R de réduire puisque nous avons choisi un modèle mammifère relativement petit. Les animaux de l'étude pilote seront implantés à P50 pour être enregistrés à partir de P60 Les animaux de l'étude complémentaire seront implantés à P21 (minimum 22gr) pour être enregistrés à partir de P29

Ce projet utilise des souris pour confirmer des résultats déjà obtenus sur des larves de poisson zèbre, et valider ainsi un protocole que l'équipe présente comme un futur substitut à la souris. 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Nourries d'un régime riche en graisses, elles reçoivent par gavage, neuf fois en neuf semaines, un mélange de quatre perturbateurs endocriniens, la dioxine TCDD, le bisphénol A, le DEHP et le carbendazime, puis subissent une prise de sang derrière l'œil, en contention ferme, juste avant leur mise à mort. Le porteur écrit qu'il est "indispensable d'utiliser des souris" pour valider ce protocole censé les remplacer.

Objectifs

Les maladies non-alcooliques du foie (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) sont devenues une priorité de santé publique à cause de leur prévalence grandissante (20% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis), propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux perturbateurs endocriniens (PE) seuls ou mélange, est suspectée. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact des PE sur la santé, en particulier dans les NAFLD. Etant donné la nature complexe de ces pathologies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est indispensable d’avoir une approche intégrative uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Ainsi, nous avons mis en place une stratégie en deux temps : d’abord un criblage de l’impact sur le foie de l’exposition chronique à des mélanges de PE dans notre modèle de larve de poisson-zèbre obèse suivi de la confirmation de ces effets dans un modèle murin pertinent. L’objectif de ce projet est donc la réalisation de la 2éme phase de confirmation des effets observés chez la larve de poisson zèbre d’un mélange de PE sur le developpement de la pathologie NAFLD chez la souris

Bénéfices attendus

Le caractère novateur de ce projet repose sur le choix du modèle pour répondre aux enjeux de la recherche sur les PE notamment dans des populations dites à risque. En effet, la larve de poisson-zèbre a de nombreux avantages : faible coût financier, mise en place rapide des processus physiopathologiques sur organisme entier, sensibilité aux agents chimiques (meilleure prédiction de l’hépatotoxicité que des modèles in vitro humain), criblage moyen/haut débit. De plus, la taille et la transparence des larves seront mises à profit pour identifier des perturbations précoces mitochondriales ou membranaires. Enfin, l’emploi de ce modèle, en accord avec la règle des 3R, peut être une alternative ou un prérequis à l’emploi des modèles in vivo de mammifères classiquement utilisés. Cette étude de faisabilité a pour but de proposer un nouveau modèle in vivo visant à mieux caractériser les effets des PE en mélange sur la progression des NAFLD et ainsi de répondre aux préoccupations concernant leurs potentiels effets cocktails. Pour cela, 4 PE ont été choisis car la population y est couramment exposée et pour garantir les chances de démontrer un effet cocktail. En effet, chacune des molécules (TCDD, BPA, DEHP et carbendazime) est reconnue pour son implication dans les NAFLD. En outre, ces molécules sont issues de familles différentes (polluants organiques persistants, plastifiants et pesticides) impliquant l’activation de mécanismes variés (activation de différents récepteurs nucléaires, stress oxydant…), ce qui pourrait ainsi potentialiser leurs effets lors de mélange. Enfin, le choix du modèle s’est porté sur la larve de poisson-zèbre, dont la sensibilité aux PE a été démontrée et pour lequel nous avons déjà mis en place un modèle développant une stéatose rapidement, et qui nous a permis de mettre en évidence qu’un mélange d’agents hépatotoxiques à faibles doses favorise la transition vers la NASH. Le premier volet de ce projet sur le modèle de larve de poisson-zèbre a été réalisé et a fait l’objet d’une saisine spécifique. Les résultats ont permis de déterminer la composition d’un mélange de ces 4 PE (TCDD, CBZ, BPA et DEHP) pour lequel on a observé une avancée de la stéatose vers la stéatohépatite pour des concentrations où chaque PE en exposition unique n’avait que peu ou pas d’effet, ce qui indique un effet cocktail de ces molécules.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage pour maitriser l'exposition aux perturbateurs endocrniens à raison d'un traitement par semaine 9 fois (entre la 3eme semaine de régime riche en graisse et la 12eme semaine). Ils seront aussi soumis à un prelevement de sanguin par voie retro-orbitale juste avant le sacrifice.

Impact sur les animaux

Le gavage induit un inconfort des animaux, reste que la NAFLD est une pathologie indolore. Le prelevement en retroorbital necessite l'inconfort d'une contention ferme, la legère douleur qui pourrait etre associée à l'introduction de la pipette est soulagée par l'anesthesis locale.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort afin de recolter les organes pour permettre l'etude scientifique.

Remplacement

Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissu adipeux et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constitue le foie. De plus, l’altération des systèmes de communications hormonaux est le mécanisme d’action définissant l’action des perturbateurs endocriniens. Seuls les modèles in vivo présentent toutes ces interactions. Le développement d’un nouveau modèle animal pour étudier la stéatohépatite qui peut être mis en œuvre sur des temps plus court et plus éthique a été proposé par l’équipe. Il utilise les larves de poisson zèbre et a montré des premiers résultats très encourageants qui doivent être confirmés sur le modèle murin de référence pour les études de toxicologie pour valider la pertinence de ce modèle de poisson zèbre et permettre la substitution de l’utilisation des souris par ces larves de poissons.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Enfin le projet vise à confirmer chez la souris la validite de résultats obtenus dans un autre modele

Raffinement

Les études seront conduites dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux, une attention journalière à l’état des animaux sera mise en œuvre, et un grand nombre de mesures sur les échantillons prélevés sont envisagées pour récolter un maximum d’informations. Les souris seront traitées dans une pièce isolée de leurs congénères sur un temps court ne permettant pas le développement de douleur. Enfin, l’utilisation de points limites adaptés et de critères d’arrêt des souffrances ont ete déterminés et seront mis en oeuvre .

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’utilisation du modèle de poisson-zèbre pour étudier l’impact de cocktail de perturbateurs endocriniens sur la transition de la stéatose en un état pathologique, la stéatohépatite et à valider le caractère prédictif du modèle de poisson-zèbre en le comparant à un modèle murin classiquement utilisé pour l’étude des NAFLD. Il est donc indispensable d’utiliser des souris pour remplir les objectifs du projet. Adulte, pour étudier une pathologie qui affecte surtout des adultes. Animaux âgées de 8 à 12 semaines, d’environ 20g

Une souris qui montre une difficulté respiratoire dans les cinq à dix minutes suivant l'injection hydrodynamique est mise à mort. 3 260 souris profondément immunodéficientes vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une irradiation, une injection de cellules souches sanguines humaines avant l'âge de neuf jours, l'injection hydrodynamique et jusqu'à huit prises de sang pour mesurer la part de cellules humaines dans leur sang. Le porteur cite parmi les effets une grande sensibilité aux infections, des dermatites et des tumeurs après l'irradiation. Les souris produites sont fournies aux laboratoires utilisateurs de la plateforme, 75 en moyenne par utilisateur et par an, pour être réutilisées dans d'autres projets.

Objectifs

L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite utilisées par ou en collaboration avec des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements.

Bénéfices attendus

Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).

Procédures

- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes)

Impact sur les animaux

Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.

Devenir

Les animaux issus de la procédure 1 pourront être inclus dans la procédure 2. Certaines souris issues de la procédure 1 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris issues de la procédure 2 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.

Réduction

Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).

Raffinement

La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+isolées dans des souriceaux nouveau-nés (

Sept prélèvements vaginaux au coton-tige par femelle, l'auto-administration de cocaïne, puis des rechutes provoquées par des signaux associés à la drogue, par une nouvelle injection ou par un stress : 5 184 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse de leur cerveau. Le projet teste si la progestérone protège de la rechute et quel rôle y jouent certains neurones de l'insula. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour que ces neurones puissent être ciblés. Le RNT décrit le frottis vaginal jusqu'à sa durée, dix secondes au plus, et ne précise ni la nature des chirurgies pratiquées sous anesthésie générale, ni le matériel implanté qui oblige à isoler certaines souris.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont triples : - Premièrement, tester l’effet d’un traitement à la progestérone sur les tests comportementaux de rechute induite par l’exposition aux signaux associés à la cocaïne, par l’injection de la cocaïne ou par un stress - Deuxièmement, l’identification le rôle causal des neurones de l’insula exprimant les PR sur la rechute à la cocaïne - Troisièmement, déterminer comment l’activité des neurones PR de l’insula est modifiée par le traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne

Bénéfices attendus

Ce projet sera une caractérisation unique de l'effet de la progestérone sur l'activité des neurones exprimant les récepteurs à la progestérone (PR) du cortex insulaire pendant la rechute de cocaïne. Nous pourrons ainsi élucider le rôle causal de cette population neuronale dans la rechute à la cocaïne, et démontrer l’effet protecteur de la progestérone dans la rechute chez les animaux mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement à la progestérone.

Procédures

Chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi par un prélèvement vaginal quotidien commençant une semaine avant le test de rechute et cela pendant 5 jours, ainsi qu’un prélèvement avant chaque test de rechute amenant à un total de 7 prélèvements par souris. Les échantillons seront collectés à l'aide de pointes de coton stériles humidifiées avec du sérum physiologique stérile. Un coton-tige par souris sera inséré dans l'orifice vaginal avec une pénétration peu profonde, tourné à 360 degrés et retiré. Un prélèvement ne dure au maximum 10 secondes par animal. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale, avec injection d’anti-inflammatoires et ajout d’anesthésiants locaux sur la zone d’incision. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur post-opératoire.

Impact sur les animaux

La prise de cocaïne peut engendrer une perte de poids lors dès les premières prises, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent leur poids initial. La cocaïne peut également engendrer une hyperactivitée des animaux qui disparaît au bout d’1 heure après la fin de la prise de drogue. Les effets toxiques de la yohimbine sont similaires à ceux observés chez l'homme. L'hypertension, la tachycardie, la stimulation du système nerveux central et l'antidiurèse peuvent se produire (A. Garrard, dans Encyclopedia of Toxicology (Third Edition), 2014). Néanmoins en injection aigu à la concentration utilisée les effets indésirables restent minimes mais nous contrôlerons l’était général des animaux pendant 24 heures après l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 5184 animaux sur cinq ans.

Raffinement

La majorité des animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Nous avons réduit au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour des raisons expérimentales (endommagement du matériel implanté pouvant mettre en péril la santé de l’animal si arraché par un congénère). Les cages seront également enrichies en nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. En cas d’infection, le vétérinaire référent sera sollicité pour mettre en place un traitement antibiotique approprié.

Choix des espèces

Des souris génétiquement standards (C57Bl6/J) seront utilisées afin de caractériser leur comportement lors des procédures d’auto-administration de cocaïne, de rechute et d’enregistrement de l’activité neuronale. Des souris génétiquement modifiées (PR-IRES-Cre) seront également utilisées lorsque nous étudierons une population neuronale spécifique (exprimant les récepteurs à la progesterone) afin de cibler, lors de l’étude du role causal, uniquement ces neurones d’intérêt. De plus, il a été démontré que le comportement des animaux peut varier entre les souches génétiquement modifiées ou standards. Ainsi, nous utiliserons également des souris PR-IRES-Cre pour des études comportementales afin de comparer leur comportement avec les souris génétiquement standard. Tous les animaux utilisés seront adultes (10 semaines) afin d’étudier des populations et des circuits neuronaux matures.

35 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de tumeur cérébrale humaine leur sont implantées dans le cerveau, puis des nanoparticules sont injectées avant irradiation, certaines souris dites satellites étant tuées de façon précoce pour l'analyse des tissus. Le porteur classe l'étude en gravité modérée du fait des anesthésies et des transports répétés vers le site d'imagerie. Il affirme que le remplacement par des méthodes alternatives n'est "clairement pas possible", le développement d'une tumeur cérébrale relevant selon lui de phénomènes trop complexes.

Objectifs

ll s'agit de valider le bénéfice d'une thérapie photodynamique activée par des rayons X sur un modèle de tumeurs cérébrales orthotopiques implantées chez la souris. L'utilisation de souris satellites (souris mises à mort précocémment pour l'observation des tissus au microscope pour observer l'effet précoce du traitement) permettra de caractériser par histologie les effets du traitement X-PDT régulièrement après l'adminitration du traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet mené en recherche préclinique permettra d'estimer si cette approche expérimentale est applicable par la suite chez l'Homme. Il permettra à long terme de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ce type de tumeurs cérébrales très aggressives (glioblastome) en médecine humaine.

Procédures

Procédure 1 : Xénogreffe intracérébrale : implantation de cellules tumorales dans le tissu cérébral (35 souris au total pour une durée d'1h environ par animal, répété une seule fois en début d'étude) Procédure 2 : Administration intra-veineuse des nanoparticules sur souris vigiles 1h avant les irradiations : cette procédure ne nécessite pas d'anesthésie, la technique étant parfaitement maitrisée par les membres du laboratoire (durée 1min, 19 souris concernées avec 2 réitérations)

Impact sur les animaux

Anesthésie chimique ainsi que transport sur site d'imagerie répétés d'où passage de la saisine en classe modérée.

Devenir

Procédure 1 "xénogreffe intracérébrale" (implantation de cellules tumorales dans le tissu cérébral) : tous les animaux sont gardés en vie (implantation tumorale étant l'étape clé indispensable du projet) Procédure 2 "administration des traitements" : tous les animaux sont gardés en vie (pour permettre par la suite d'évaluer l'efficacité des traitements) Procédure 3 "suivi par imagerie" : tous les animaux sont gardés en vie sauf si un animal a atteint un des points limites décrit précédemment, il sera dans ce cas mis à mort à l'issue de la procédure. En outre, les animaux satellites (souris mises à mort précocémment pour l'observation des tissus au microscope pour observer l'effet précoce du traitement) pour lesquels le temps cinétique prévu est atteint (Jn+4, Jn+11, Jn+18) seront mis à mort à l'issue de la procédure en vue d'analyses histologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse au traitement in vivo de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (intravasation, extravasation, envahissement du parenchyme cérébral, angiogénèse...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules endothéliales, stroma...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. L’évolution de l’intensité de bioluminescence sera un indicateur d’efficacité des traitements. De plus, chaque groupe sera caractérisé par une courbe de survie. Les survies moyennes seront comparées par test de Kruskal-Wallis suivi d’un test post-hoc si la différence entre tous les groupes est significative.

Réduction

Nos données nous ont permis de réaliser un premier suivi en imagerie de la croissance des cellules U251 -Luc implantées en stéréotaxie (procédure chirurgicale permettant d'implanter les cellules tumorales directement dans une région bien précise du cerveau), en traitant par la voie X-PDT. Néanmoins, il est cependant nécessaire de compléter les effectifs pour avoir une meilleure fiabilité statistique mais les premiers données seront également exploitées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette étude. L'estimation de l'efficacité de la thérapie par imagerie par Bioluminescence nécessite un suivi longitudinal des souris. Chaque animal sera son propre témoin ce qui constitue une stratégie permettant une utilisation judicieuse des animaux et assure une rigueur scientifique

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger. De plus, une analgésie sera administrée lors des procédures invasives (chirurgie d'induction tumorale)

Choix des espèces

Souris : pour nos expérimentations, nous travaillerons sur des modèles de tumeurs humaines implantées chez des rongeurs immunodéprimés. Ces modèles sont très pertinents dès lors qu'il s'agit d'évaluer de nouveaux agent diagnostiques ou thérapeutiques Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie de Paxinos et Franklin.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quarante femelles gestantes reçoivent des injections sous-cutanées d'une molécule pendant la gestation et après la naissance, et leurs 420 souriceaux subissent des tests respiratoires, un enregistrement de vocalisations après séparation maternelle et un test de préférence pour l'odeur maternelle, avant que tous soient tués pour prélever les cerveaux. Le porteur décrit ces tests sur les nouveau-nés comme non invasifs et peu stressants. Il affirme qu'un "organisme entier et vivant" est nécessaire, la complexité d'un organisme ne pouvant être créée artificiellement.

Objectifs

La trisomie 21 est le syndrome génétique le plus fréquent dans la population générale. En raison des différentes politiques de dépistage et d’interruption médicale de grossesse, cette maladie concerne 1 naissance sur 700 à 1 naissance sur 2000 dans les pays industrialisés. Le projet s’inscrit dans une étude visant à développer une nouvelle approche thérapeutique visant à corriger les désordres neurologiques impliqués dans la trisomie 21. Agir sur le nombre de neurones pourrait permettre de diminuer le risque de déficience intellectuelle dans cette pathologie et de changer son pronostic. Pour cela, le but est de trouver un traitement pour protéger le cerveau lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse. Notre étude s’intéresse à une molécule d’origine embryonnaire qui possède des propriétés neuroprotectrices et qui diminue la mort des neurones. Il pourrait donc protéger contre de tels désordres neuro-développementaux. Nous proposons de tester cette molécule par injection sous-cutanée à la mère durant la gestation et après la naissance (période prénatale et périnatale) et d’étudier ses effets sur le cerveau des souris. L’objectif de ce travail est donc de tester l’effet de cette molécule sur le nombre de neurones et les capacités comportementales des souris présentant des caractéristiques de la trisomie 21. Des tests comportementaux seront réalisés dans les 8 premiers jours de vie des souriceaux et des analyses seront réalisées sur les cerveaux afin de déterminer si le traitement est protecteur vis-à-vis des désordres neurodéveloppementaux de la trisomie 21. De plus, dans un but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous souhaitons utiliser les souriceaux de ce projet pour réaliser des tests respiratoires car une forte comorbidité avec le syndrome d’apnée obstructive du sommeil est observée dans la pathologie. 40 femelles seront nécessaires pour le traitement qui sera administré durant la gestation et jusqu’à 11 jours après la naissance. Quatre groupes de souriceaux seront constitués : des témoins traités et non traités et des trisomiques traités et non traités, pour un total de 420 souriceaux. Les différentes expérimentations pourront être effectuées sur les mêmes groupes de souriceaux dans la mesure où celles-ci se révèlent non invasives, non douloureuses et avec un stress minimal pour l’animal.

Bénéfices attendus

Cette pathologie, associée à une déficience intellectuelle, à des troubles de comportement et du langage, impacte l’autonomie des personnes porteuses de ce syndrome. Ce projet permettrait de continuer à explorer les mécanismes conduisant à des anomalies cérébrales dans la trisomie 21 et d’ainsi pouvoir proposer des traitements plus spécifiques. Il permettrait également d’identifier si la molécule a un effet protecteur sur le développement du cerveau dans le but de diminuer la déficience intellectuelle lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse suite à un diagnostic prénatal de trisomie 21. Les tests respiratoires permettront d’investiguer sur les capacités respiratoires des souriceaux et de déterminer s’ils présentent un risque précoce d’obstruction comme cela a déjà été montré dans ce modèle chez des souris adultes.

Procédures

40 femelles recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ou de la molécule. Ce geste sera réalisé sur l’animal vigile, à partir du 14ème jour de gestation, jusqu’à 11 jours après la naissance des souriceaux. Les 420 souriceaux issus des femelles gestantes seront utilisés pour : - Un test respiratoire dans les 12 heures suivant la naissance. Les souriceaux sont placés dans une boite étanche thermostatée pendant 15 minutes afin de mesurer des paramètres respiratoires. - L’enregistrement des vocalisations ultrasoniques le 7ème jour après la naissance pour étudier la communication vocale et les interactions sociales. Les souriceaux sont placés seuls dans une enceinte thermostatée et les ultrasons émis en réponse à la séparation maternelle sont enregistrés pendant 3 minutes. - Un test de préférence maternelle le 8ème jour pour étudier les capacités des souriceaux à identifier l’odeur maternelle, la mémoire et la préférence de cette odeur. Les souriceaux sont placés seuls dans une arène proposant 3 zones avec des odeurs différentes dont l’odeur maternelle. Le temps passé dans ces 3 zones est mesuré pendant 3 minutes.

Impact sur les animaux

Les administrations aux femelles gestantes de la molécule seront effectuées sur l'animal vigile et effectuée selon les bonnes pratiques vétérinaires et n'induisent pas de douleur à l'animal autre que la piqûre de l'aiguille. Les tests qui seront réalisés chez les souriceaux sont faits de façon non-invasive. Ils durent au maximum 15 minutes et induisent peu de stress et aucune douleur à l’animal.

Devenir

Tous les animaux utilisés seront euthanasiés afin de prélever les cerveaux pour effectuer des analyses sur le nombre de neurones et la mort neuronale. Parallèlement à cette étude au niveau neurologique qui nous permettra de montrer l’efficacité du traitement, nous analyserons des marqueurs de la fonction hépatique et de la fonction rénale sur de biopsies de tous les animaux, y compris les femelles traitées, afin de confirmer la sécurité du traitement.

Remplacement

Pour atteindre les objectifs du projet basé sur un traitement, un organisme entier et vivant est nécessaire, n’ayant pas la possibilité de créer artificiellement la complexité d’un organisme avec tous les différents types cellulaires. De plus, la réalisation de tests comportementaux et l’étude des fonctions respiratoires n’est possible que sur un animal vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé après avoir établi l’ensemble des procédures expérimentales à l’aide d’un test de puissance statistique en se basant sur la variabilité entre animaux et le résultat des valeurs. De plus, l’exploration des fonctions respiratoires réalisée en même temps que ce projet permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin de garantir le bien-être des animaux, le milieu sera amélioré par l’ajout d’un nid végétal et d’un rouleau en carton. Pour les femelles gestantes et avec leurs petits, de l’enrichissement supplémentaire sera apporté : une cabane ainsi que du gel enrichi en nutriments. Les approches expérimentales seront accompagnées d’une surveillance journalière afin de vérifier tout comportement anormal traduisant une souffrance, comme des signes de prostration, d’agressivité, d’apparence physique. Le poids des femelles gestantes sera relevé tous les jours lors de l’administration du traitement. Une absence de prise de poids sera particulièrement surveillée afin de déterminer s’il s’agit d’une dégradation de l’état de santé de l’animal et/ou d’une interruption de la gestation afin de retirer l’animal de l’étude. Les injections seront stoppées en cas d'interruption de la gestation ou l'animal sera euthanasié si son état de santé est dégradé. Les injections journalières seront réalisées par administration sous-cutanée selon les bonnes pratiques vétérinaires. Lors de la manipulation des souriceaux, les mains de l’expérimentateur seront systématiquement frottées avec de la litière de la cage afin de favoriser des odeurs familières moins stressantes pour les petits et la mère. Un changement de gants aura lieu entre chaque cage de femelles gestantes. La technologie utilisée pour réaliser les tests des fonctions respiratoires et comportementaux chez les souriceaux est conçue de façon non invasive, dans des enceintes thermostatées, d’une durée n’excédant pas 15 minutes afin de réduire au maximum le stress des animaux tout en permettant les mesures.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris dans ce projet nous permet de pouvoir réaliser des tests comportementaux et respiratoires sur un modèle de souris établi comme modèle de la trisomie 21. Les injections du traitement seront réalisées sur des femelles adultes à partir du 14ème jour de gestation jusqu’à 11 jours après la naissance des souriceaux afin de réaliser le traitement durant la gestation et après la naissance. Les tests comportementaux et des fonctions respiratoires seront réalisés sur des souriceaux jusqu’à 11 jours après la naissance afin d’étudier précocement l’effet du traitement sur les désordres neurodéveloppementaux. Ceci permettrait également à l’étude d’évaluer le potentiel thérapeutique transposable à l’Homme dans le cas d’une administration chez la femme pendant la grossesse pour corriger très précocement la déficience intellectuelle associée à la trisomie 21.