Recherche fondamentale
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- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
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- Système respiratoire
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Développement d’un nouveau modèle murin d’atrophie multisystématisée
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à une injection veineuse ou à une chirurgie du cerveau, 1134 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cerveau. Le modèle induit la dégénérescence d'environ la moitié de certaines populations de neurones et l'apparition de troubles moteurs, pour reproduire une maladie neurodégénérative rare. Le porteur ajoute qu'un intérêt du projet est de fournir ce modèle à d'autres chercheurs qui n'y ont pas accès. Il annonce des tests de comportement répétés jusqu'à six mois après la chirurgie sans préciser lesquels.
Objectifs
L’atrophie multisystématisée est une maladie neurodégénérative rare et mortelle touchant environ 5000 personnes en France. Cette pathologie se caractérise par une perte progressive de neurones dans plusieurs régions du cerveau. Cette perte neuronale s’accompagne de l’accumulation toxique d’une protéine spécifiquement dans certaines cellules. Cependant les mécanismes liant ces deux évènements restent peu connus. Comme pour de nombreuses autres maladies, les modèles animaux représentent un outil essentiel pour répondre aux limites des modèles informatiques et cellulaires. Ils apportent beaucoup de connaissances sur cette pathologie. Ainsi, il est essentiel de poursuivre leur optimisation. Dans le contexte de l’atrophie multisystématisée, les modèles transgéniques présentent une pathologie tissulaire large mais peu de troubles comportementaux. Il faut donc poursuivre le développement de nouveaux modèles mimant le plus possible la pathologie humaine. L’objectif de cette étude est de tirer avantage de nouveaux outils moléculaires (vecteurs viraux) pour développer un nouveau modèle de souris d’atrophie multisystématisée qui rassemble de nombreux avantages des modèles précédents. En particulier, nous souhaitons générer un modèle plus pertinent et plus accessible à la communauté scientifique.
Bénéfices attendus
Comme pour les autres maladies, les modèles animaux d’atrophie multisystématisée sont des outils essentiels pour mieux comprendre les mécanismes pathologiques et développer des thérapies. Par le développement de ce nouveau modèle, nous espérons apporter de nouvelles connaissances concernant les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la pathologie. En effet, notre approche permettra l’apparition de signes pathologiques dans l’ensemble du système nerveux central adulte qui est plus vulnérable à ces processus toxiques. Tous ces signes permettront une modélisation plus fidèle de cette maladie chez l’animal. Enfin, de nombreux chercheurs n’ont actuellement pas accès à des modèles animaux d’atrophie multisystématisée, souvent par défaut d’expertise ou du matériel nécessaire à la chirurgie du cerveau. Notre nouvelle méthode de modélisation, obtenue par une simple injection intra-veineuse, permettra de fournir un modèle accessible à une grande communauté de chercheurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection dans la veine (5 minutes) ou une chirurgie du cerveau (20 minutes). Dans la semaine avant ces interventions ainsi qu’un, trois et 6 mois plus tard, les animaux réaliseront des tests de comportements répartis sur 2 jours. Chacun de ces tests peut durer entre 3 minutes et environ 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sont : 1-L’injection dans la veine ou dans le cerveau qui peut induire un stress attendu. 2-L’induction du modèle qui peut induire une dégénérescence d’environ 50% de certaines populations neuronales et gliales et l’apparition de légers troubles moteurs et non-moteurs. 3-Les tests comportementaux qui peuvent induire des stresses attendus, y compris lors du déplacement des animaux vers les salles expérimentales.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour l’analyse du cerveau.
Remplacement
Ce projet a pour but de mesurer des marqueurs de la maladie, notamment comportementaux, au cours du développement de l’atrophie multisystématisée. De ce fait, il est impossible de reproduire la complexité d’un organisme vivant et de remplacer notre approche chez l’animal par un modèle cellulaire ou une simulation informatique.
Réduction
La détermination du nombre d’animaux est basée a priori sur nos études antérieures et celles d’autres équipes démontrant des résultats statistiquement significatifs avec une taille d’échantillons de 15 animaux par condition. Ce nombre pourra être corrigé après l’obtention des résultats des expériences pilotes qui nous fourniront une estimation de la taille de l’effet de l’induction du modèle. Celle-ci nous permettra de calculer le nombre minimal théorique d’animaux nécessaires pour détecter une différence statistiquement significative après un test de mesures répétées ou une comparaison directe de 2 groupes expérimentaux. Le nombre d’animaux nécessaire sera calculé à l’aide d'un logiciel danalyse statisitique. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Avant leur utilisation en expérimentation, un contrôle qualité des vecteurs viraux sera réalisé.
Raffinement
Suite à leur arrivée dans l’animalerie, les animaux auront une semaine d’acclimatation. L’injection du vecteur viral sera réalisée sous anesthésie et traitement anti-douleur. Les tests comportementaux ont été répartis sur plusieurs jours et les animaux seront acclimatés à la salle avant de réaliser les tests. La mise à mort des animaux sera réalisée selon un protocole d’anesthésie et de double analgésie adaptées. Des points limites basés sur des signes indicatifs seront utilisés afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver leur bien-être.
Choix des espèces
La souris est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des régions affectées dans l’atrophie multisystématisée. Le modèle sera induit chez des animaux jeunes adultes (10 semaines). À ce stade, les systèmes cérébraux sont matures et stables et le resteront tout au long des procédures expérimentales proposées.
Comprendre comment un dysfonctionnement mitochondrial conduit à une atteinte du motoneurone et du cœur chez un modèle murin de sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Jusqu'à sept passages sur un dispositif rotatif et quatre échographies cardiaques par animal sur un suivi de six mois, 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Porteuses d'une mutation liée à la sclérose latérale amyotrophique, elles développent faiblesse musculaire, insuffisance cardiaque et perte de poids rapide, avec une espérance de vie ne dépassant pas quatorze mois. Le porteur indique avoir mené des travaux préalables sur des cellules de patients, mais conclut que seule une souris reproduit une pathologie touchant plusieurs organes. La souris est retenue pour la similarité de son cerveau avec les régions humaines atteintes.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative. Elle se déclare à l'âge adulte (40-80 ans) et évolue, en 3 à 5 ans, vers la paralysie complète et le décès du patient. Elle est causée par la mort de certains neurones (motoneurones), entraînant un affaiblissement progressif et une atrophie des muscles. À ce jour, il n'existe pas de traitement contre la sclérose latérale amyotrophique car les mécanismes physiopathologiques restent partiellement méconnus. La sclérose latérale amyotrophique touche les deux sexes et son incidence augmente avec l'âge à partir de 40 ans. Dans une cohorte humaine de patients souffrant de sclérose latérale amyotrophique, des chercheurs ont identifié la mutation d'une protéine. Parmi tous les facteurs impliqués dans la pathogenèse, un dysfonctionnement de certains orgabite (mitochondries) de la cellule a toujours été envisagé comme un acteur majeur de cette pathologie. Néanmoins, les atteintes des neurones pures étant rarement observées dans les pathologies mitochondriales, l’hypothèse d’un rôle causal des mitochondries dans la pathologie a longtemps été débattue. L’identification de mutations dans le gène étudié fut la première preuve génétique démontrant le rôle primaire de la mitochondrie dans des atteintes du motoneurone. Récemment, il a été démontré qu’il est possible de corriger ou de contourner génétiquement certains défauts de la chaîne respiratoire mitochondriale dans des modèles murins de maladies mitochondriales, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques. Sur la base de ces avancées, nous faisons l’hypothèse qu’une approche similaire pourrait permettre de compenser les défauts mitochondriaux dans le modèle rongeur, et ainsi d’évaluer le potentiel de correction génétique des fonctions mitochondriales dans un contexte de maladie du motoneurone et maladie cardiaque.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément certains mécanismes impliqués dans la maladie de Charcot (Sclérose Latérale Amyotrophique). Ils pourraient permettre le développement de nouveaux médicaments, permettant ainsi de prévenir ou freiner le développement des maladies neurologiques chez les patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à des évaluations fonctionnelles et à des examens non invasifs ou peu invasifs, ainsi qu’à une procédure terminale pour certains d’entre eux, dans le cadre d’un protocole visant à étudier des mécanismes biologiques liés au vieillissement. Procédure 1 (suivi longitudinal) Cette procédure inclut deux types d’évaluations, réalisées sur des animaux éveillés ou sous anesthésie légère, sans douleur ni détresse significative : 1. Évaluation de la motricité : Les animaux seront placés sur un dispositif rotatif (test de coordination motrice) pour mesurer leur endurance et leur équilibre. Chaque séance durera entre 5 et 10 minutes, avec un maximum de 15 minutes par animal (temps cumulé incluant une phase d’habituation). Ce test sera répété jusqu’à 7 fois par animal sur l’ensemble du suivi. 2. Examen cardiaque : Une échographie sera réalisée sous anesthésie légère (gaz anesthésiant) pour visualiser le fonctionnement du cœur. Chaque examen durera environ 10 minutes, avec un maximum de 20 minutes par séance, et sera répété jusqu’à 4 fois par animal. La durée totale de cette procédure est de 6 mois par animal, incluant les différentes évaluations fonctionnelles et les examens cardiaques. Procédure 2 (suivi longitudinal avec collecte terminale de tissus) Cette procédure reprend les mêmes évaluations que la procédure 1 (motricité et échographie cardiaque, avec les mêmes fréquences et durées), et ajoute une étape terminale pour la collecte de tissus. Cette étape, réalisée en fin de protocole, consiste en : • Une anesthésie générale profonde, administrée par injection, pour assurer l’inconscience de l’animal avant toute manipulation. Une analgésie (médicament contre la douleur) sera préalablement administrée pour prévenir toute souffrance. • Une perfusion intracardiaque (injection d’une solution de fixation dans le cœur) pour préserver les tissus (cerveau, moelle épinière, muscles, cœur, etc.) en vue d’analyses ultérieures. Cette étape, d’une durée de 20 à 30 minutes par animal, est réalisée sans réveil de l’animal et est suivie d’une confirmation de la mort par une méthode rapide et indolore. La durée totale de cette procédure est également de 6 mois par animal, incluant les évaluations fonctionnelles et l’étape terminale.
Impact sur les animaux
Notre étude précédente sur une lignée de souris a montré que ces animaux avaient une espérance de vie ne dépassant pas 14 mois. Pour cette raison, nous prévoyons de suivre la fonction cardiaque par échographie et d'utiliser un indicateur qui représente une mesure directe du bon fonctionnement contractile de la partie du cœur responsable pour l’oxygénation corporelle comme point limite. De plus, ces souris ne prennent pas de poids comme leurs congénères témoins à partir de l'âge de 10 semaines environ. Les souris mutantes développent une faiblesse musculaire et les signes cliniques apparaissent au stade final caractérisé par une insuffisance cardiaque et une perte de poids rapide la semaine avant la mort.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour pouvoir réaliser des prélèvements.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des expériences ont été réalisées précédemment sur des cellules en culture par nos collaborateurs. Les expériences réalisées sur des cellules issus de patients porteurs de la mutation d'intérêt nous ont permis d'identifier de potentiels mécanismes impliqués dans ces maladies. Des expériences réalisées sur des cellules de patients reprogrammées vers l'état embryonnaire et ensuite différenciées vers les cellules de l'organe d'intérêt présente un potentiel important pour remplacer et réduire l'utilisation de l'animal. Cependant, la pathologie touchant plusieurs organes, seul un modèle animal permettra de comprendre et d'étudier les conséquences multiples de cette mutation sur les mécanismes moléculaires conduisant aux maladies étudiées.
Réduction
Des calculs statistiques de l'effectif nécessaire pour un test de comparaison de deux échantillons indépendants ont été réalisés avec l’aide de biostatisticiens. Nous prévoyons pour ce projet un total de 720 souris. Les animaux seront ensuite utilisés pour comprendre les mécanismes moléculaires impliqués. Les études pilotes ont déjà été menées, permettant de réduire le nombre d’animaux en ciblant 3 phases distinctes détaillées ci-dessous. 2 types de tests statistiques sont envisagés pour comparer les résultats. Les effets des variables âge, sexe, date de mise à mort, cage et nombre de souris dans la cage seront mesurés à l’aide de modèles statistiques spécifiques.. L'utilisation de l'échocardiographie longitudinale permet de réduire le nombre d'animaux, rendant inutile la réalisation de multiples analyses histologiques de la fonction cardiaque tout au long de la vie de la souris.
Raffinement
Dans un but de raffinement, l’utilisation d’une fiche d'observation détaillée (en lien avec le phénotype attendu) permettant un suivi optimal des animaux sera mise en place tout en respectant les points limites. Les animaux seront observés quotidiennement et évalués hebdomadairement, ce qui permettra d’identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Pour ce qui est la gestion de la douleur, nous effectuons un suivi rigoureux et régulier et l’utilisation d’analgésique le cas échéant. De plus, toutes les procédures potentiellement invasives ou générant un inconfort significatif, telles que les échographies cardiaques, seront réalisées sous anesthésie appropriée afin de minimiser le stress et la douleur des animaux. Puisque les souris porteuses de la mutation d’intérêt manifestent la pathologie étudiée, nous suivrons la fonction cardiaque par échographie durant la durée de vie de l’adulte, ce qui permet d’anticiper l’apparition d’atteintes au bien-être des animaux. La pathologie étant associée à une prise de poids diminuée à partir de 10 semaines d’âges, les animaux seront pesés avant les séances d’échographie. Lorsqu'une perte de poids entre 10% et 20% sera observée par rapport à la dernière mesure, une surveillance quotidienne se fera, de l'eau et de la nourriture gélifiée seront également ajoutés dans la cage. Si, lors de cette surveillance, un stress est observé, un enrichissement de la cage sera réalisé et une surveillance accrue sera effectuée.
Choix des espèces
Certaines questions d'intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux mais nous utiliserons deux procédures alternatives : expériences sur les cellules humaines disponibles et cellules animales (souris) maintenues en culture, et l’exploration de certains mécanismes par simulation informatique. Néanmoins, nous ne pouvons pas étudier la physiopathologie des maladies qui nous intéressent ex vivo car les phénomènes sont multifactoriels. Les modèles d’animaux sont nécessaires pour évaluer in vivo au cours de plusieurs mois le développement des altérations pathologiques propres aux organes en question. Le choix de la souris est lié à ces deux considérations : 1) tous les gènes concernés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations. L'étude de la lignée murine réalisée précédemment par nos collaborateurs a permis d'observer que ces animaux présentaient une espérance de vie ne dépassant pas 14 mois. De plus, une prise de poids diminuée par rapport aux souris contrôles est observée à partir de 10 semaines. À la suite de ces résultats, nous prévoyons d'utiliser les animaux à trois stades de développement : - stade correspondant à l'atteinte finale de la maladie (= environs 8-12 mois, soit perte de poids supérieure à 15% par rapport à la pesée précédent la 1ère diminution de poids, soit un affaiblissement partiel de l'extension des pattes ou tremblements, associé à une incapacité pour la souris de se retourner par elle-même lorsqu'elle est sur le flanc en moins de 15 secondes), soit une fraction d’éjection réduite. - stade d'apparition des premiers signes cliniques = 3 mois de vie - stade intermédiaire = 7 mois de vie (stade nécessaire pour comprendre la cinétique d'apparition des signes d'atteintes tardifs)
Rôle du système nerveux périphérique sur la physiopathologie de la tuberculose pulmonaire dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
Génétiquement modifiées pour visualiser leur système nerveux, 2943 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 1020 classées sévères, toutes tuées à l'issue. Elles sont infectées par la tuberculose, une infection sous anesthésie brève, l'autre plus longue, puis reçoivent des traitements pharmacologiques jusqu'à 42 jours. Les effets attendus vont de la perte de poids à la détresse respiratoire, en passant par des troubles moteurs et l'isolement social. Les retombées annoncées contre une maladie qui reste une cause majeure de mortalité mondiale sont formulées comme un espoir, face à des atteintes immédiates et certaines sur plus d'un millier d'animaux en souffrance sévère.
Objectifs
La tuberculose pulmonaire est une maladie provoquée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis. La personne infectée développe une inflammation chronique qui change, parfois de façon irréversible, l’architecture de ses poumons. Des travaux récents ont révélé que cette infection entraîne aussi des modifications importantes dans l’organisation du système nerveux périphérique. Cependant, on ignore encore la nature exacte de ces changements. Permettent-ils une meilleure interaction avec le système immunitaire local ? Contribuent-ils à la résolution de la pathologie ? Ou à son aggravation ? L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre comment le système nerveux périphérique s’adapte à l’infection par Mycobacterium tuberculosis au niveau des poumons. Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser et de manipuler différents compartiments du système nerveux. Ces modèles permettront d’identifier les cellules nerveuses impliquées, de suivre leur évolution pendant l’infection, et d’évaluer leur rôle fonctionnel dans la progression de la maladie. Plus précisément, nous étudierons : ● Le remodelage des fibres nerveuses autour des bronches, ● Le rôle des cellules qui les accompagnent et les soutiennent dans ce processus, ● Les interactions entre cellules nerveuses et cellules immunitaires dans le tissu pulmonaire infecté. Ces analyses utilisent des approches d’imagerie (microscopie), de biologie cellulaire (tri et culture de cellules), et des techniques avancées de séquençage pour étudier finement les réponses des cellules nerveuses et immunitaires au cours du temps. À terme, ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes de communication entre système nerveux et système immunitaire dans un contexte infectieux. Ces connaissances pourraient ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour mieux contrôler l’inflammation et les dégâts pulmonaires associés à la tuberculose.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter des bénéfices scientifiques et médicaux importants dans la lutte contre la tuberculose, une maladie qui reste aujourd’hui l’une des principales causes de mortalité infectieuse dans le monde. Les résultats attendus permettront d’améliorer notre compréhension d’un aspect encore très peu étudié de la maladie : l’implication du système nerveux dans les infections pulmonaires chroniques. En effet, il est de plus en plus évident que les nerfs présents dans les poumons ne sont pas de simples structures passives, mais qu’ils peuvent influencer l’inflammation, la réparation des tissus, et même la réponse immunitaire face aux bactéries. En étudiant précisément le rôle de différents types de nerfs et de cellules nerveuses pendant l’infection tuberculeuse, ce projet pourra : ● Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour limiter les dégâts causés aux poumons pendant la maladie, ● Mieux comprendre pourquoi certains patients développent des formes sévères de tuberculose avec des atteintes pulmonaires importantes, ● Éclairer le rôle du système nerveux dans d’autres maladies inflammatoires chroniques du poumon. À plus long terme, ces recherches pourraient contribuer au développement de stratégies dites « à visée neuro-immunologique », c’est-à-dire ciblant les interactions entre les nerfs et le système immunitaire pour mieux contrôler l’inflammation. Ce type d’approche est déjà en cours d’exploration dans d’autres pathologies (maladies auto-immunes, cancer), mais n’a jamais été appliqué à la tuberculose. Sur le plan fondamental, ce projet aidera également à mieux comprendre comment les cellules de soutien des nerfs (appelées cellules de Schwann) peuvent changer de fonction en réponse à une infection et participer aux mécanismes de défense ou de réparation. Ces connaissances pourront donc aussi bénéficier à d’autres domaines de recherche, comme la régénération nerveuse ou les maladies neuro-inflammatoires.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet seront soumises à plusieurs types d’interventions : ● Deux types d’infections différentes : l’une sous anesthésie générale d'une durée de 30 seconde , l’autre d’une durée de 40-45min au total. ● Des injections engendrant une contention de 1min. ● Des traitements pharmacologiques ciblés d’une durée de maximale de 42 jours. ● Des manipulations génétiques conditionnelles par administration d’une substance d’une durée maximale de 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables répertoriés précédent pourraient être en fonction des procédures : une perte de poids, une baisse d'activité, des troubles moteurs, une perte d'appétit, une altération du comportement, une détresse respiratoire modérée, une altération temporaire de l'état général, une diminution des interactions sociales.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet feront l’objet d’analyses approfondies. Ils seront donc mis à mort de manière programmée et encadrée à la fin des procédures expérimentales pour répondre au mieux aux problématiques scientifiques.
Remplacement
L’étude proposée cherche à comprendre comment les nerfs pulmonaires et les cellules du système immunitaire interagissent lors de l’infection par Mycobacterium tuberculosis. Aujourd’hui, aucun modèle de culture cellulaire ou système artificiel ne permet de reproduire fidèlement la complexité du tissu pulmonaire, notamment l’organisation des nerfs et des cellules gliales dans un environnement en 3 dimensions, avec toutes les interactions mécaniques, nerveuses, vasculaires et immunitaires qui se produisent dans un animal vivant. La bactérie responsable de la tuberculose (M. tuberculosis) se développe très lentement et son comportement dépend fortement du fonctionnement global du corps. Les alternatives existantes ne permettent pas de suivre l’évolution réelle de l’infection, ni les modifications des nerfs ou des cellules. Pour toutes ces raisons, l’utilisation de la souris reste indispensable pour répondre aux questions scientifiques du projet : identifier les types de nerfs impliqués, comprendre leur rôle pendant l’infection, et explorer la manière dont les cellules s’adaptent à la présence de la bactérie. Aucun autre modèle ne permet actuellement d’atteindre ces objectifs de manière fiable.
Réduction
Les effectifs proposés ont été définis à partir de données préliminaires, d’expériences antérieures réussies et d’outils d’analyse statistique reconnus. Les résultats seront traités avec des méthodes statistiques appropriées, permettant d’évaluer les différences entre groupes de manière rigoureuse sans multiplier inutilement les animaux. Nous avons également mis en place des approches permettant d’extraire plusieurs types d’informations à partir d’un seul animal. Par exemple, à partir d’un même poumon, nous réalisons l’analyse des bactéries présentes, l’étude de l’expression des gènes, et le dosage des molécules inflammatoires. Enfin, le projet suit une logique progressive : si une étape expérimentale ne donne pas de résultats exploitables, elle sera arrêtée immédiatement.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre afin de minimiser les nuisances pour les animaux. Les temps de contention lors des phases d’infection et d’injection seront réduits au strict minimum nécessaire. Une surveillance renforcée sera établie après chaque intervention. Une grille de scoring ainsi que des points limites précoces et adaptés à chaque procédure seront mis en place pour suivre au mieux l’évolution de l’état général des animaux.
Choix des espèces
La souris est l’espèce avec une réponse immunitaire bien caractérisée et comparable à celle de l’humain. Ce modèle permet aussi d’examiner finement les interactions entre nerfs périphériques, cellules gliales, et cellules immunitaires dans le contexte pulmonaire. De nombreuses lignées transgéniques nécessaires à ce projet sont disponibles chez la souris et permettent d’isoler, tracer ou manipuler spécifiquement les populations cellulaires ciblées. Seules des souris adultes (6 à 10 semaines) seront utilisées. Ce stade garantit une immunité pulmonaire mature, indispensable pour étudier les conséquences de la tuberculose.
Exploration de la fonction endocrine de la surrénale dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
498 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une ou deux injections et un prélèvement sanguin de moins d'une minute, pour explorer la fonction hormonale de la glande surrénale en réponse au stress. Le porteur signale que des protocoles identiques antérieurs n'avaient montré aucune souffrance observable, et prévoit néanmoins la mise à mort de tous les animaux pour prélever leurs tissus. Il retient la souris pour sa physiologie endocrine proche de l'humain et son aptitude aux modifications génétiques.
Objectifs
La surrénale est une glande endocrine qui, par ses sécrétions hormonales permet la survie de l’individu. La surrénale est considéré comme l’organe principale de la réponse au stress et dépend de l’intégrité du cortex surrénalien, organisé en zones concentriques spécialisées : la zone glomérulée (zG) pour les minéralocorticoïdes (aldostérone) et la zone fasciculée (zF) pour les glucocorticoïdes (cortisol chez l’homme et corticostérone chez la souris). Les mécanismes responsables du maintien de cette organisation sont encore largement incompris. Des études antérieures ont permis de montrer que des modulations de la SUMOylation (modification des protéines) entraine des perturbations de la fonction endocrine de cette glande. Par ailleurs, d’autres travaux ont permis de montrer que les surrénales males et femelles ont des fonctions surrénaliennes propres à chacun des sexes. L’objectif de ce projet est d’étudier la fonction endocrine de la surrénale en réponse à différents stimulis dans plusieurs modèles murins.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la fonction surrénalienne et en particulier : 1) l’impact des mécanismes de SUMOylation (mécanismes de modification des protéines) ainsi que des acteurs du dimorphisme sexuel mais également 2) l’identification des modifications protéiques lors des différentes stimulations surrénaliennes.
Procédures
Les souris vigiles seront soumises à une injection (234 souris) ou deux injections (264 souris) et un prélèvement de sang (264 souris), Ces interventions durent moins de 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des traitements réalisés sur 4 jours, peuvent être une perturbation du sommeil et de l’excitabilité. Les études antérieures utilisant les mêmes protocoles n’ont montré aucun comportement particulier, ni souffrance observable.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience en vue du prélèvement des tissus requis pour la réalisation de différentes analyses.
Remplacement
Ce projet concerne l’étude de l’exploration fonctionnelle d’un organe de réponse au stress dont l’activité est soumise à un rétrocontrôle hypothalamo-hypophysaire. Il n’existe aucune méthode alternative permettant d’intégrer ces différents niveaux de complexité.
Réduction
L’étude se fera sur 498 animaux au maximum Afin de diminuer le nombre d’animaux, les mêmes groupes témoins seront utilisés lorsque cela est possible ce qui permettra de diminuer le nombre de souris (diminution de 88 souris). De plus, Les animaux des groupes témoins seront issus des mêmes portées que les animaux génétiquement modifiés. Nous utiliserons les mêmes animaux pour réaliser deux stimulations surrénaliennes différentes.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi selon les recomandations en vigueur. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 individus pour permettre le maintien d’un bien-être social. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. La surveillance se fera 2 fois par jour lors des différents traitements. Aucun raffinement supplémentaire n’est requis lors de nos procédures.
Choix des espèces
La souris présente une physiologie endocrine, très proche de l’espèce humaine et est le modèle mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques. Enfin, les méthodes d’exploration de la fonction hypothalamo-hypophysaire-corticotrope sont les mêmes que celles utilisées chez l’homme Pour l’analyse de la réponse endocrine de la surrénale, les animaux seront utilisés à l’âge de 11 semaines qui correspond à un stade adulte.
Évaluation de l’impact de mutations génétiques dans la mise en place de l’insuffisance cardiaque chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Irradiées en corps entier puis greffées de moelle osseuse, 2592 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi l'implantation chirurgicale de mini-pompes et des échocardiographies sous anesthésie, pour étudier l'inflammation menant à une insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée. Le porteur indique avoir d'abord testé ses hypothèses sur des cultures de macrophages, mais affirme que la réponse inflammatoire ne s'appréhende que dans un "organisme entier". Toutes sont tuées par exsanguination en fin de protocole pour le prélèvement de leurs organes.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée est une forme d'insuffisance cardiaque qui se définit par des symptômes cliniques d’insuffisance cardiaque, associés, entre autres, à une fraction d’éjection du ventricule gauche supérieure ou égale à 50 %. Il a été estimé que la proportion de patients souffrant d’insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée augmente de 1% par an et est en passe de devenir la forme d’insuffisance cardiaque majoritaire. Les études récentes indiquent une claire implication du système inflammatoire menant à une fibrose du coeur (rigidification du muscle du coeur) excessive dans cette pathologie, en revanche, les mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent l’implication du système inflammatoire dans le développement de l'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée restent mal compris. Également, des études ont mis en évidence un lien causal entre une pathologie des cellules de la moelle osseuse, qui affecte préférentiellement les individus âgés, et le développement d’une inflammation excessive et d’une insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée. Cette pathologie est caractérisée par l'acquisition, par des cellules de la moelle osseuse, de mutations touchant des gènes impliqués dans les cancers du sang. Au stade de cette pathologie auquel nous nous interessons, une ou des mutation(s) sont observées dans au moins 2% des cellules sanguines circulantes en absence de cancer du sang. Notre projet vise à explorer précisément les liens mécanistiques entre cette pathologie de la moelle osseuse et notamment sa principale mutation décrite sur le développement de l’insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires inflammatoires mis en jeu lors de l'hématopoïèse clonale à potentiel indeterminé et impliqués dans l’insuffisance cardiaque. Ce projet permettra également de mettre en évidence de nouvelles options thérapeutiques prometteuses qui cibleront la réponse inflammatoire.
Procédures
- Irradiation en corps entier. Durée : 30min. - Transplantation de moelle osseuse dans des souris irradiées anesthésiées par injection. Durée: 5 secondes. - Echocardiographie sur souris anesthésiées (une à quatres fois). Durée : 10min. - Implantation de mini-pompes sur souris anesthésiées. Durée : 5min - L'administration de traitements. Durée: 5 secondes. - Mise à mort par exsanguination pour récupération des organes et prélèvement de sang sous anesthésie. Durée : 5min.
Impact sur les animaux
- Transplantation de moelle osseuse dans des souris irradiées anesthésiées par injection. Durée 5: secondes. Nuisance : légère douleur transitoire au point d'injection. - Implantation de mini-pompes osmotiques sur souris anesthésiées. Douleur péri-opératoire modérée. - L'administration d'inhibiteurs peut induire du stress et une légère douleur transitoire au moment de l'administration au traitement. Durée: 5 secondes.
Devenir
Les organes de tous les animaux seront prélevés à la fin des différentes procédures, nécéssitant la mise à mort des animaux.
Remplacement
Pour respecter le principe des 3R, nous avons évalué nos hypothèses avec des cultures de macrophages avant de l’étudier dans un modèle pré-clinique chez la souris. Ces expériences nous ont notamment permis de déterminer les concentrations optimales et d’évaluer la puissance des inhibiteurs dans des tests d’activation cellulaire. Cependant, la réponse inflammatoire et le remodelage cardiaque résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes (moelle osseuse, sang, rate) et diverses populations cellulaires. Cette dynamique ne peut être appréhendée de manière intégrée qu’au sein d’un organisme entier, dans lequel la physiologie systémique et les communications intercellulaires et inter-organes sont préservées. C’est pourquoi notre projet nécessite l’utilisation d’un modèle chez la souris préservant la complexité physiopathologique globale des systèmes cardiovasculaire et inflammatoire.
Réduction
Les effectifs sont déterminées et les résultats sont analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales, notamment l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés pour les procédures et l’établissement de points limites adéquats. - Transplantation de moelle osseuse : injection de cellules de moelle par voie intraveineuse, anesthésie gazeuse. - Implantation de mini-pompes osmotiques en sous-cutané (chirurgie) : injection sous-cutanée d’analgésique. L’intervention se fait sous anesthésie gazeuse. La stratégie d’antalgie préventive au site d’incision par injection sous-cutanée d’analgésique, qui sera répétée dans les jours suivants la chirurgie selon les besoins des animaux. - Mise à mort des animaux par exsanguination (veine cave inférieure) : injection sous-cutanée d’analgésique. Les animaux seront sous anesthésie gazeuse profonde durant toute l’intervention. Les souris seront élevées en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris : - température contrôlée à 22°C - cycle de jour/nuit de 12 heures - nourriture et eau ad-libitum - hébergement dans des cages de 2 à 5 souris maximum - enrichissement des cages avec maisonnettes, batônnets en bois et coton. Après la procédure chirurgicale, les animaux sont placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie antalgique sera systématiquement poursuivie en post-opératoire, avec administration sous-cutanée d’antalgique le lendemain de la chirurgie et les jours suivants si nécéssaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les responsables du projet pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être jusqu’à la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
La souris constitue le modèle expérimental de référence pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’inflammation et le remodelage cardiaque. Ces phénomènes mettent en jeu différents systèmes biologiques extrêmement dynamiques (inflammation, fonction et remodelage cardiaques), ce qui nous oblige d’avoir recours au modèle d’insuffisance cardiaque par surcharge de pression. Ce modèle est largement validé dans la littérature, ce qui permet une comparaison directe et une intégration cohérente des résultats avec les données existantes dans la littérature. Les procédures seront initiées sur des souris jeunes adultes (souris de 6 semaines). Le protocol expérimental s'étend sur 7 semaines, cela nous permet d'obtenir des prélèvements de souris adultes âgées de 13 semaines.
Modèle de vieillissement chez le rongeur : outils d’évaluation préclinique de thérapies ralentissant le vieillissement
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Rats : 800
Pour tester des thérapies censées ralentir le vieillissement, 1600 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes. Chaque animal reçoit des traitements par injection ou par gavage et subit des prélèvements sanguins répétés, tandis que le protocole laisse la santé se dégrader avec l'âge, avec tumeurs, déclin moteur et perte de poids. Les bénéfices avancés pour la médecine gériatrique restent renvoyés au conditionnel et au moyen terme. Sur le remplacement, le porteur affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme entier" et conclut au recours aux rongeurs.
Objectifs
Le vieillissement en bonne santé est devenu un enjeu crucial avec l'augmentation de la population gériatrique dans le monde entier. Le vieillissement est un processus biologique complexe qui entraîne un déclin progressif des fonctions physiologiques de l'organisme. Il résulte d'une combinaison de changements cellulaires et moléculaires qui s'accumulent au fil du temps, tels que les dommages à l'ADN, le dysfonctionnement mitochondrial et l'accumulation de cellules sénescentes. Ce processus est très individuel, ce qui fait que l'âge biologique diffère souvent de l'âge chronologique. Ce projet a pour objectif d’apporter des éléments de réponse à des questions comme Quelle est la fenêtre d'intervention thérapeutique optimale pour inverser ou ralentir le déclin ? ou encore La solution améliore-t-elle les fonctions physiologiques intégrées ou se contente-t-elle de modifier un marqueur moléculaire ?
Bénéfices attendus
À court terme, les modèles rongeurs permettent une validation rapide des hypothèses. En quelques mois, on peut : (i) Établir une preuve de concept : on peut rapidement tester si une molécule ou un régime alimentaire a un effet sur les marqueurs du vieillissement. (ii) Évaluer la sécurité et la toxicité d’un traitement potentiel pour ses effets secondaires indésirables avant d'envisager des études plus longues ou plus complexes. (ii) Obtenir des données préliminaires À moyen terme, ces modèles permettent une compréhension plus profonde des mécanismes du vieillissement et de l'efficacité d'un traitement. (i) Étudier les effets à long terme : La durée de vie relativement courte des rongeurs permet d'étudier l'impact d'une intervention sur la longévité et la santé. On peut observer si un traitement retarde l'apparition de signes caractéristiques du vieillissement. (ii) Élucider les mécanismes d'action : En analysant des échantillons de tissus et de fluides à différents âges, on peut identifier les voies moléculaires et cellulaires par lesquelles une thérapie fonctionne. (iii) Optimiser les traitements : on peut ajuster les doses, la fréquence et la voie d'administration d'un traitement pour trouver le protocole le plus efficace. Les bénéfices à long terme de ces modèles sont d'une importance capitale pour la médecine translationnelle et la santé publique. (i) Développement de thérapies cliniques : Les données solides obtenues sur les rongeurs sont essentielles pour justifier le passage aux essais cliniques chez l'humain. Elles réduisent les risques et augmentent les chances de succès des futurs médicaments. (ii) Identification de nouveaux biomarqueurs : La recherche sur les rongeurs peut révéler de nouveaux marqueurs biologiques du vieillissement, qui pourraient ensuite être utilisés pour évaluer le "vrai" âge biologique ou la réponse aux traitements chez l'humain. (iii) Amélioration de la compréhension du vieillissement humain : Les découvertes faites sur ces modèles contribuent à une meilleure compréhension des maladies liées à l'âge et peuvent mener à de nouvelles stratégies de prévention. En fin de compte, l'objectif est d'améliorer la qualité de vie et de prolonger la période de bonne santé chez les personnes vieillissantes.
Procédures
Dans ce modèle in vivo de vieillissement, les rongeurs sont soumis à très peu d'interventions, principalement pour l'administration des traitements et la collecte d'échantillons. Des efforts sont faits pour limiter l'impact de ces interventions en suivant des protocoles de réduction de la douleur et du stress. L'anesthésie avec l'isoflurane induit un stress de courte durée (15 secondes). Les piqûres d’aiguille pour traiter les animaux entraînent une douleur légère de courte durée (2 secondes). Les traitments seront administrés en intrapéritonéal 10 sec, en sous-cutané 15 sec, ou par gavage 20 sec sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Effets liés au vieillissement : La principale source de nuisance est la détérioration progressive de la santé de l'animal. Cela inclut : déclin cognitif, diminution de la mobilité, pathologies liées à l'âge (apparition de tumeurs), altérations physiologiques. Les animaux peuvent également souffrir d'une perte de poids liée à l'âge. Nuisances liées au protocole expérimental: L'administration de substances par voie orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée peut causer de la douleur ou du stress à l'animal. Les injections répétées, en particulier, peuvent induire un inconfort. Les prélèvements sanguins peuvent causer un inconfort physique. Des efforts sont faits pour limiter ces impacts en suivant des protocoles de réduction de la douleur et du stress. L’ensemble de ces effets sera suivi attentivement par un monitoring clinique rigoureux, afin de détecter rapidement toute altération significative de l’état des animaux et de mettre en place, le cas échéant, des mesures correctives ou un arrêt anticipé de l’expérimentation.
Devenir
A la fin de la procédure tous les animaux sont mis à mort, afin d’en prélever les organes et fluides biologiques afin de quantifier des biomarqueurs divers et valider l'efficacité de la thérapie analysée.
Remplacement
Le protocole prévu dans ce projet ne peut pas être transposé efficacement dans un système in vitro. Il existe plusieurs alternatives non animale pour investiguer le processus de vieillissement, mais elles ne peuvent pas remplacer totalement les tests sur les animaux utilisés dans ce projet. 1. Modèles in vitro : Les cultures cellulaires humaines ou animales permettent d’étudier des interactions cellulaires et les réponses inflammatoires. Cependant, elles ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment les interactions multicellulaires complexes et la réponse immunitaire systémique. 2. Modèles ex vivo : Les tissus humains ou animaux (biopsies, explants) permettent d’étudier des processus biologiques en conditions plus réalistes, mais il manque des interactions entre plusieurs systèmes organiques. 3. Modèles organoïdes et organes sur puce : Ces systèmes imitent des organes pour étudier les réponses biologiques. Cependant, ils ne peuvent pas reproduire la réponse systémique d'un organisme complet. 4. Modélisation informatique : Les simulations informatiques ne peuvent pas simuler toutes les réactions biologiques complexes d'un organisme vivant. Ces alternatives ne peuvent pas complètement remplacer les animaux, car les modèles non animaux ne peuvent pas reproduire la complexité d’un organisme vivant complet, limitant leur capacité à simuler des réponses biologiques globales et interconnectées.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux sera mise en oeuvre par l’estimation du nombre minimal d’animaux permettant de garantir l’interprétabilité des résultats. De façon systématique des analyses statistiques sont effectuées afin de déterminer le nombre d’animaux optimal afin de produire des résultats robustes pour chaque point de mesure.
Raffinement
La fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, tels que la perte de poids, fièvre, modifications de la mobilité, ou respiration laborieuse, sont particulièrement surveillés par l'observation de points limites en raison des effets du vieillissement. Si des signes de stress apparaissent, nous actionnerons des actions correctives. Des critères d'arrêt sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux.
Choix des espèces
Les rongeurs partagent une grande similarité génétique et physiologique avec les humains. Leurs organes et systèmes fonctionnent de manière similaire, ce qui facilite l'extrapolation des résultats à l'homme. Les rongeurs développent de nombreuses pathologies liées à l'âge qui ressemblent à celles observées chez l'humain. Leur courte durée de vie est un atout majeur. La souris est privilégiée pour les phases précoces et de large criblage : Son faible poids corporel réduit la quantité de principes actifs nécessaires. C'est un avantage majeur lorsque les molécules testées sont coûteuses à synthétiser ; Sa petite taille permet la manipulation de grands effectifs, garantissant des résultats statistiquement robustes. Le rat est souvent choisi pour les phases de validation avancées et les études pharmacologiques. La taille du rat permet d'effectuer des prélèvements biologiques répétés d’un plus grand volume que chez la souris, sur le même individu tout au long de sa vie. Les animaux utilisés seront des animaux adultes.
MODIFICATION 2 : Evaluation de l’effet de deux suppléments alimentaires (utilisés seuls ou en combinaisons) sur les émissions de méthane entérique, la production laitière et l’ingestion chez des vaches laitières.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Maintenues en vie et rendues à leur troupeau à l'issue, 48 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Pendant sept mois, elles subissent cinq séries de prélèvements de sang, de fèces et de jus de rumen, ce dernier par une sonde passée dans l'œsophage, sous contention. L'objectif déclaré est de mesurer l'effet de compléments alimentaires sur le méthane émis par les vaches, la production de lait et le microbiote du rumen. Jusqu'à 57 millilitres de sang sont prélevés en une fois, l'essai s'inscrivant dans les objectifs de décarbonation de l'élevage bovin.
Objectifs
L'objectif de cette expérimentation, menée chez la vache laitière avec des régimes à base d’ensilage d’herbe, est de mesurer les changements induits par la supplémentation de la ration avec des suppléments alimentaires anti-méthanogènes utilisés seuls ou en combinaison sur les émissions de méthane entérique, l'ingestion, la production laitière, la structure du microbiote ruminal. Un objectif secondaire consistera à confirmer ou identifier des prédicteurs biologiques plasmatiques, fécaux et ruminaux permettant de prédire les émissions de méthane.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de confirmer l'effet anti-méthanogène des 2 ingrédients utilisés seuls et tester l'additivité de leurs effets lorsqu'ils sont utilisés en combinaison sur les émissions de méthane entérique et les performances zootechniques de la vache laitière. Les mécanismes d'action des ingrédients utilisés seuls ou en combinaison sur le microbiote ruminal seront identifiés. Enfin, cet essai permettra d'implémenter des bases de données incluant - des phénotypes (tels que les émissions de méthane entérique) de bovins laitiers difficiles à mesurer sur le terrain avec des méthodes de référence et leurs prédicteurs (microbiens, fécaux, sanguins) issus de différentes matrices biologiques faciles d'accès sur le terrain et prélevées en simultané sur le même animal. Cet essai permettra la mesure simultanée de prédicteurs du méthane entérique sur 3 matrices biologiques disponibles en exploitation.
Procédures
Durant les 7 mois de l'expérimentation, 5 prélèvements de fécès, sang et de jus de rumen auront lieu en semaine 8, 12, 16, 21 et 25. Le volume de sang prélevé sera de 39 mL (semaines 8, 12 et 24) et de 57mL (semaine 16) , celui de fécès de 200 g et celui de jus de rumen de 400 mL.
Impact sur les animaux
Différents prélèvements relevant de procédures légéres (fécès, sang et jus de rumen) sont prévus tout au long de l'essai pour caractériser la réponse physiologique, métabolique et digestive des vaches laitières. Le prélèvement de jus de rumen sera réalisé par prélèvement gastro-oesophagien (PGO) et pourrait engendrer une légère iritation de l'oesophage. La prise de sang sera effectuée à la veine caudale et les prélèvements de fèces par défécation naturelle ou fouille rectale si besoin. Ces prélèvements seront réalisés en cage de contention et sont susceptibles d'induire de l'inconfort léger pendant la manipulation. La fréquence des prélèvements des 3 matrices (fécès, sang et jus de rumen) sera limitée au minimum nécessaire pour mesurer une cinétique d'action des ingrédients testés ainsi que leur effet de rémanence après arrêt de la distribution. Au total, les animaux seront prélevés 4 fois pendant l'essai qui durera 6 mois. La contention de l'animal pour les 4 prélèvements des 3 matrices durera 10 minutes maximum. "AJOUT : la version "MODIFICATION 2" la prolongation de l'expérimentation de 7 semaines implique une journée de prélèvement supplémentaire pour l'ensemble des animaux soit 2 contentions supplémentaires. Les animaux seront ainsi prélevés 5 fois au lieu de 4 durant l'essai."
Devenir
A l'issue de cette expérimentation, les 48 vaches laitières seront maintenues en vie et regagneront le troupeau de production, en vue d'être réutilisés dans d'autres projets si besoin.
Remplacement
La réponse concomittante de l'hôte et du microbiote ruminal aux ingrédients ne peut à ce jour être remplacée par aucune stratégie in vitro ou in sillico. L'un des objectifs du projet est d'identifier et de valider des indicateurs capables de prédire les émissions de méthane entérique. En conséquence, nous avons besoin d'une méthode de référence in-vivo (GreenFeed) pour construire des modèles de prédiction des émissions de méthane à partir de ces prédicteurs. À terme, ces prédicteurs pourront être proposés comme alternative aux méthodes de référence nécessaires en recherche et difficiles à utiliser sur le terrain. L'utilisation des techniques in-vitro pour étudier l'effet de l'additif sur la fermentation ruminale a été déjà réalisé et par conséquent nous avons besoin d'animaux expérimentaux pour confirmer les effets in-vivo.
Réduction
Pour cette expérimentation, 48 vaches laitières seront mobilisées et réparties en 4 lots soit 12 animaux par modalité. Ce chiffre est basé sur les résultats obtenus au préalable par notre équipe chez la vache laitière avec des régimes comparables . En effet, en considérant la variabilité entre animaux des émissions de méthane mesurées au GreenFeed, il faut entre 8 et 14 animaux dans chaque lot.
Raffinement
Les conditions de logement des animaux en stabulation répondent aux exigences réglementaires et les bâtiments sont dotés d'équipements pemettant un enrichissement du confort des bovins (brosses) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (suivi de la température et de l'hygrométrie). Les procédures sont mises en oeuvre par du personnel formé et habilité à effectuer ces prélèvements ce qui assure que ceux-ci se feront dans les conditions mises en places pour le bien-être de l'animal. De plus, les fouilles rectales pour les prélèvements de fecès ne sont réalisées que si les animaux ne défèquent pas naturellement au moment de la collecte des fécès.
Choix des espèces
En France, l’agriculture représente 19% des émissions de gaz à effets de serre, dont près de la moitié provient des élevages bovins lait et viande. Les émissions de méthane entérique, coproduit de la digestion des polysaccharides par les ruminants, représentent environ 50% des émissions de gaz à effets de serre d’une exploitation bovine. Les élevages bovins lait et viande sont ainsi confrontés aux objectifs de décarbonation des activités. Le recours aux bovins laitiers dans cette expérimentation est directement justifié par les objectifs scientifiques du projet : l’étude des effets des inhibiteurs de méthane sur les performances laitières, les émissions entériques de méthane, ainsi que les caractéristiques du microbiote ruminal. Par conséquent, l’utilisation d’une autre espèce animale de ruminant introduirait des biais majeurs et réduirait considérablement la transposabilité et la pertinence des résultats. Les vaches laitières entreront en expérimentation après le pic de lactation (par lot de 8 vaches dès que la dernière d'entre elles aura atteint sa 8ème semaine après vêlage), c'est à dire au moment où les vaches retrouvent une stabilité métabolique après les fortes contraintes du début de lactation. Ceci permet des mesures moins variables des émissions de méthane et du microbiote ruminal, des performances zootechniques et éfficacité alimentaire. Les vaches en post-pic présentent une ingestion plus stable, un bilan énergétique plus équilibré et une production laitière toujours significative, rendant ce stade pertinent pour évaluer les effets de différents ingérdients anti-méthanogènes. De plus, cela permet de limiter les risques pour la santé et le bien-être des animaux, en évitant les périodes de forte mobilisation corporelle. Ce stade est donc scientifiquement pertinent et éthiquement justifié.
Etude par imagerie moléculaire du rôle de l’inflammation intestinale dans l’accident vasculaire cérébral chez la souris Mus musculus – Etude pilote
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
À J1, une colite est déclenchée chez la moitié des 120 souris par un produit dans l'eau de boisson, à J5 vient une IRM sous anesthésie, à J6 un AVC provoqué par injection de thrombine lors d'une chirurgie d'une à deux heures, puis deux IRM à J7 et J13. Ces souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec diarrhées, saignements rectaux et faiblesse d'une patte. L'étude déclare n'être qu'un pilote, destiné à calibrer une expérience plus large sur les liens entre inflammation intestinale et AVC. Toutes sont tuées à J13 par exsanguination pour prélever cerveau et intestin.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un enjeu majeur de santé publique. Le traitement de l’AVC ischémique repose actuellement sur la thrombolyse et/ou la thrombectomie. Cependant, ces interventions ne sont pas toujours réalisables et ne garantissent pas une récupération fonctionnelle complète. Cela justifie le développement de nouveaux outils pronostiques et thérapeutiques. Le rôle de l’inflammation intestinale dans la pathophysiologie de l’AVC suscite un intérêt croissant. Plusieurs travaux récents mettent en évidence des interactions étroites entre inflammation intestinale et neuroinflammation post-AVC. Dans ce contexte, l’objectif principal de ce projet pilote est de réaliser des expérimentations préliminaires visant à évaluer l’impact d’un état inflammatoire intestinal élevé sur la sévérité de l’AVC dans un modèle murin. Les données obtenues permettront d’optimiser les protocoles ultérieurs, en fournissant notamment les éléments statistiques nécessaires à une estimation rigoureuse du nombre d’animaux requis, dans une logique de réduction et de raffinement conformément aux principes des 3R. Ces expérimentations préliminaires aideront également à identifier d’éventuelles contraintes techniques ou biologiques, afin d’ajuster au mieux les procédures et d’améliorer le bien-être animal.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude pilote constitueront une base expérimentale pour une étude de plus grande envergure, destinée à approfondir l’analyse des interactions entre l’inflammation intestinale et la neuroinflammation post-AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une séquence expérimentale unique comprenant l’induction d’une inflammation intestinale, des examens IRM, l’induction d’un AVC thromboembolique et la mise à mort pour analyses histologiques. 1. Induction de l’inflammation intestinale (J1–J5) Chez la moitié des animaux (n = 60), une inflammation intestinale modérée sera induite par administration de DSS 2 % dans l’eau de boisson pendant 5 jours. Cette étape ne nécessite pas d’anesthésie. Un suivi clinique quotidien sera assuré. 2. IRM moléculaire (J5) Tous les animaux (n = 120) seront anesthésiés à l’isoflurane (2 % dans O₂/N₂O 30/70) pour un examen IRM de 30 à 45 minutes. Un cathéter sera inséré dans la veine caudale pour l’injection de MPIO, puis retiré en fin de séance. Une analgésie locale (lidocaïne/xylocaïne) sera appliquée au point d’insertion. 3. Induction du modèle d’AVC (J6) Sous anesthésie générale (isoflurane 2 % dans O₂/N₂O 30/70) et analgésie systémique (buprénorphine 0,1 mg/kg s.c. en prémédication), une chirurgie stéréotaxique sera réalisée pour induire une ischémie focale par injection de thrombine dans l’artère cérébrale moyenne. La procédure dure 60 à 90 minutes. Les animaux recevront ensuite soit du tPA (10 mg/kg i.v.), soit une solution saline. 4. IRM post-AVC (J7 et J13) Deux nouveaux examens IRM seront réalisés sous les mêmes modalités anesthésiques (isoflurane 2 %, durée 30–45 min) afin d’évaluer le volume lésionnel, la neuroinflammation et l’inflammation intestinale. 5. Mise à mort et prélèvements (J13) À l’issue du dernier examen, les animaux encore sous anesthésie générale seront mis à mort par exsanguination induite par perfusion intracardiaque de sérum physiologique (isoflurane 5 % en O₂/N₂O 30/70 ; fentanyl 0,3 mg/kg i.p. en prémédication). Les organes d’intérêt (cerveau, intestin) seront prélevés immédiatement pour analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Le modèle d’induction d’une inflammation intestinale par traitement au DSS peut entraîner une perte de poids, des diarrhées et des saignements rectaux. Ces symptômes seront suivis avec attention grâce à l’utilisation quotidienne d’échelles de scores cliniques déjà établies, permettant un ajustement rapide des soins si nécessaire. Nos travaux antérieurs ont de plus montré que la dose de 2 % utilisée dans cette étude n’entraîne que des signes modérés de colite tout en induisant une inflammation intestinale suffisante pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Concernant le modèle d’AVC, certains animaux peuvent présenter des signes transitoires de douleur dans les heures suivant la chirurgie, ainsi qu’un affaiblissement temporaire de la patte avant gauche, correspondant à la zone cérébrale lésée, qui disparaît généralement au cours de la première semaine. Afin de limiter au maximum toute forme d’inconfort ou de souffrance, des analgésiques locaux seront appliqués au niveau du site chirurgical avant l’intervention, et des analgésiques systémiques seront administrés avant et après l’intervention. La surveillance quotidienne des animaux, associée à ces conditions environnementales contrôlées et à la prise en charge analgésique, permettra de réduire autant que possible les nuisances et la douleur liées aux procédures expérimentales.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux (n = 120) seront mis à mort afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques indispensables à la compréhension des mécanismes étudiés. Ces prélèvements visent notamment à confirmer et compléter les observations issues des analyses d’imagerie in vivo (IRM), en permettant une évaluation fine des lésions cérébrales, de la neuroinflammation et de l’inflammation intestinale. Les échantillons obtenus fourniront également les données quantitatives nécessaires à l’optimisation et à la standardisation des protocoles ultérieurs. La mise à mort interviendra à la fin de la procédure. La mise à mort de tous les animaux se justifie par la nécessité scientifique de disposer de tissus parfaitement préservés pour les analyses post-mortem et par le souci constant de limiter toute utilisation et toute souffrance inutile, conformément aux principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).
Remplacement
Les modèles animaux constituent à ce jour les outils expérimentaux les plus pertinents pour répondre à la question scientifique posée. En effet, aucun modèle de substitution disponible actuellement ne permet de reproduire la dimension multi-organe de la pathophysiologie de l’AVC étudiée ici et, donc d’apporter une réponse adéquate à la problématique susmentionnée.
Réduction
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques ne pouvant être ici exclue, nous veillerons à en limiter le recours au strict nécessaire. La présente demande d’autorisation de projet couvre une étude pilote, dont les résultats permettront de mieux anticiper et d’optimiser l’utilisation d’animaux lors des études ultérieures. Nonobstant le caractère préliminaire de cette étude, nous nous attachons à réduire le nombre d’animaux employés, tout en conservant un effectif suffisant pour assurer la robustesse et la validité des analyses. Par ailleurs, l’utilisation de méthodologies d’imagerie in vivo autorise le suivi longitudinal des mêmes individus et contribue, de fait, à la réduction du nombre total d’animaux nécessaires. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires tient également compte des aspects méthodologiques de la procédure expérimentale, notamment l’habileté et l’expérience de l’expérimentateur, ainsi que des risques de perte inhérents à la conduite de la procédure.
Raffinement
Au cours de la procédure expérimentale, une attention particulière sera portée au bien-être des animaux. La procédure inclut des modèles et des modalités d’imagerie susceptibles d’entraîner certaines nuisances et/ou un stress. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi quotidien assuré par du personnel qualifié. Les symptômes intestinaux induits par le traitement au DSS seront évalués quotidiennement à l’aide d’une échelle de score spécifique, permettant d’anticiper la persistance ou l’aggravation des nuisances. Des protocoles validés d’anesthésie et d’analgésie seront également mis en œuvre, notamment lors de l’induction du modèle d’AVC et des examens IRM, afin de limiter au maximum toute forme de douleur, de détresse ou d’angoisse liées aux interventions. L’ensemble des manipulations sera réalisé par du personnel expérimenté et formé aux procédures chirurgicales et aux soins post-opératoires. Les animaux seront hébergés en petits groupes sociaux (n=5) dans des cages standard, dans des conditions conformes aux normes européennes en vigueur (température stabilisée à 21 °C, hygrométrie de 55 %, intensité lumineuse de 100 lux, et cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h), avec du matériel d’enrichissement et un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie comme espèce expérimentale pour ce projet en raison de sa pertinence scientifique et de sa faisabilité technique. La physiologie murine, notamment en ce qui concerne le système immunitaire intestinal et la réponse neuroinflammatoire post-AVC, présente des similitudes établies avec celle de l’humain, permettant ainsi d’étudier de manière appropriée les interactions entre inflammation intestinale et sévérité de l’AVC. De plus, des modèles murins bien caractérisés existent à la fois pour l’induction d’une colite expérimentale et pour l’ischémie cérébrale thromboembolique focale, avec des protocoles reproductibles et validés à l’échelle internationale. Enfin, aucune alternative in vitro ou modèle in silico ne permet aujourd’hui de reproduire de manière intégrée les interactions multi-organes dans le contexte post-AVC, rendant l’utilisation de la souris indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. L’AVC est une pathologie qui touche principalement l’adulte, le plus souvent au-delà de 65 ans, mais son incidence augmente également chez l’adulte jeune. Pour reproduire au mieux la pathophysiologie humaine, les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), stade où la maturation physiologique et la réponse neurovasculaire sont comparables à celles de l’adulte humain.
Etude des mécanismes physiopathologiques immunologiques associés au syndrome de détresse respiratoire aiguë
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Anesthésiées puis injectées dans la trachée avec des bactéries, des cellules immunitaires ou une chimiothérapie, 356 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Un sepsis pulmonaire leur est provoqué, avec hypothermie, gêne respiratoire et perte de poids attendues. L'objectif déclaré est de comparer les sous-types de sepsis humains à ce modèle murin. Le porteur reconnaît lui-même que la souris pourrait ne représenter qu'une partie des malades, ce que le projet vise justement à vérifier.
Objectifs
Le sepsis est une infection grave qui touche 50 millions de personnes par an dans le monde. Il est responsable de >10 millions de décès par an. Les infections respiratoires sont la première cause de sepsis.Malgré sa gravité, les traitements n’ont guère évolué depuis 30 ans, en partie parce que les patients atteints de sepsis sont très différents les uns des autres. Des chercheurs ont identifié chez certains patients des « sous-types » de sepsis basés sur le niveau de certains marqueurs de l’inflammation dans le sang. Ces sous-types permettent de regrouper les patients plus uniformément et pourraient aider à mieux cibler les traitements. Comprendre comment ces sous-types fonctionnent est donc essentiel pour développer de nouvelles thérapies. Chez la souris, ces sous-types n’ont pas encore été étudiés, il est possible que la souris ne représente qu'une seule partie des malades. D'autre part , Le sepsis modifie profondément le système immunitaire, créant ce qu’on appelle une « mémoire immunitaire », qui peut être bénéfique ou au contraire délétère. Le projet vise à reproduire un modèle de sepsis pulmonaire chez la souris. L’objectif est de décrire l’évolution spatiale et temporelle des principales cellules immunitaires pulmonaires chez l’animal afin de le comparer aux sous types de sepsis observés chez l'homme.Dans un second temps, nous cherchons à connaître le rôle des sous-types cellulaires dans la cicatrice immunitaire laissée par le sepsis en injectant à des souris des macrophages porteurs de cette mémoire immunitaire.
Bénéfices attendus
Jusqu’à présent, les traitements visant à réguler le système immunitaire chez les patients atteints de sepsis ou de syndrome de détresse respiratoire n’ont pas donné de résultats efficaces, et seuls les corticoïdes sont parfois utilisés en pratique. Ce projet vise à mieux comprendre comment le système immunitaire réagit dans ces maladies. À terme, il pourrait permettre de repérer quels patients sont les plus susceptibles de bénéficier des traitements existants et d’aider à développer de nouvelles thérapies.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de bactéries, de cellules immuniatires ou de chimiothérapie dans la trachée sous anesthésie générale. L'administration de la bactérie dure 30 secondes sous anesthésie générale. L'administration des cellules immunitaire dure 30 secondes sous anesthésie générale. L'administration de la chimiothérpaie dure 30 secondes sous anesthésie générale. Cette administration est répétée une fois 5 jours après.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une injection intratrachéale de bactéries, de cellules immunes ou de chimiothérpie sous anesthésie générale. Ce geste n’est pas douloureux. Il en découlera une hypothermie, une gène respiratoire et une perte de poids transitoire qui est récupérée très rapidement
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin de prelever les différents organes à analyser
Remplacement
Le sepsis est une réaction inappropriée d’un hôte à un pathogène qui se traduit par une défaillance d’organe. Il met en jeu une physiopathologie complexe à un niveau moléculaire, cellulaire, d’organe mais aussi de l’organisme entier. L’infection respiratoire nécessite le recrutement de cellules inflammatoires produites par la moelle osseuse, qui sont transportées par le sang jusqu’aux organes et pénètrent les organes via des signaux moléculaires. Il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro (culture cellulaire ou organoïde) qui reproduise la complexité de l’immunité innée humorale, de l’immunité adaptative (qui met plusieurs jours à se mettre en place) ou de la communication entre les organes. L’obtention de données de transcriptomique sur les cellules immunitaires pulmonaires permettra de remplacer un certain nombre d’observations chez l’animal, car ces données permettent d’étudier « in silico » les mécanismes immunitaires à l’œuvre. Ces données pourront être réutilisées pour de futurs projets.
Réduction
La première partie de l’étude consiste à observer et décrire ce qui se passe chez les animaux, sans chercher à tester un traitement particulier. Il n’est donc pas possible de prévoir exactement combien d’animaux seront nécessaires. Pour limiter leur nombre, l’équipe s’est appuyée sur des expériences similaires publiées et sur son expérience passée. Pour la deuxième partie de l’étude, le nombre d’animaux et de groupes a été calculé de manière statistique afin d’être sûr de détecter les différences importantes tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les injections intratrachéales se font sous anesthésie générale, qui apporte du confort pour l’animal et réduit son stress pendant l’intervention. Une dose d'antidouleur sera administrée en cas d’observation de souffrance de l’animal. Des points limites bien établis et suffisamment précoces permettront de minimiser la douleur de l’animal en appliquant les décisions définies.
Choix des espèces
Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle murin de pneumonie est relativement similaire à la pathologie humaine. De plus, le modèle murin pour l’étude de la réponse immunologique au sepsis pulmonaire est le plus couramment utilisé dans la littérature. Souris de 4 à 8 semaines correspondant à de jeunes adultes permettant de mimer les conditions pathologiques humaines. C’est également le stade le plus utilisé dans la littérature permettant une extrapolation et une comparaison de nos résultats avec d’autres travaux.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement modifiés utilisés dans l’étude de l’épilepsie, de la migraine et de l’autisme.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux millimètres de queue prélevés sur l'animal vigile, sous contention : 12 500 souris vont être utilisées dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Le RNT présente ce projet comme un gain pour la réduction et le raffinement, après avoir écarté des méthodes non invasives jugées peu fiables. Pourtant l'élevage prévu pour ce seul génotypage porte sur 12 500 animaux. Les souris au génotype non recherché sont tuées, et pour certaines lignées les femelles le sont aussi, seuls les mâles reproducteurs étant gardés.
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux à fins scientifiques, des modèles animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Il est donc nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les procédures expérimentales de projets autorisés et ceux nécessaires au maintien des lignées. Nous avons testé des prélèvements par 3 méthodes non invasives à partir de follicules pileux, de fécès, ou via un écouvillonnage bucal. Elles ne sont pas adaptées à nos conditions de diagnostics de validation des génotypes, et manquent de fiabilité. Cela peut amener à des erreurs qui compromettraient les résultats obtenus et conduiraient à la nécessité de répéter des prélèvements sur les mêmes animaux ou à en utiliser un plus grand nombre, ce qui est en contradiction avec les principes de raffinement et de réduction. L’objectif de ce projet est une procédure de prélèvement par biopsie utilisée au sein de notre équipe pour la sélection des animaux, qui sera associée à une identification par pose d'une bague auriculaire. Les animaux produits seront utilisés sur des projets concernant la pathophysiologie de l'épilepsie, de la migraine ou de l’autisme.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de sélectionner les animaux pertinents pour les études scientifiques, afin d'optimiser la gestion de l'élevage et de fournir les animaux nécessaires aux projets de l'équipe.
Procédures
Prélèvement de 2 mm de l’extrémité de la queue (durée maximale : 5 secondes), réalisé une seule fois par animal vigile, sous contention.
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement sur la queue. Un saignement peut aussi apparaître et dans de très rares cas un rejet par la mère.
Devenir
Tous les animaux présentant le génotype d’intérêt et le sexe requis seront maintenus en vie à l’issue de cette procédure unique. Ils pourront être utilisés ultérieurement dans une procédure expérimentale relevant d’un projet autorisé, ou bien destinés au maintien de la lignée. Les animaux ne présentant pas le génotype recherché seront mis à mort. Pour certaines lignées, seuls les mâles reproducteurs seront conservés ; les animaux au génotype non recherché ainsi que les femelles seront mis à mort.
Remplacement
A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas données des résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés pour les différents projets de l'équipe.
Réduction
L’objectif est de produire uniquement le nombre d’animaux strictement nécessaire aux projets de recherche et au maintien des lignées, afin d’éviter toute production inutile. Pour cela : - seules les lignées utilisées sont maintenues en élevage, les autres sont conservées congelées ; l- les croisements sont organisés pour obtenir directement les caractéristiques génétiques recherchées et éviter la naissance d’animaux non utiles ; - lorsque c’est possible, des stratégies sont mises en place pour limiter les prélèvements ; - des réunions régulières permettent d’anticiper les besoins et d’adapter la production.
Raffinement
La méthode utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une liste de points limites et d'actions correctives est utilisée
Choix des espèces
La souris est un mammifère très proche de l’être humain sur le plan biologique. Ces similitudes permettent de répondre à de nombreuses questions scientifiques et de mieux comprendre certaines maladies comme l’épilepsie, l’autisme ou la migraine. De nombreux outils génétiques ont été développés chez la souris pour étudier ces mécanismes. Les prélèvements à l’extrémité de la queue sont réalisés entre 13 et 28 jours après la naissance. À cet âge, la zone est encore peu développée, ce qui rend le prélèvement rapide, peu douloureux et associé à un risque de saignement très faible.
Analyse de la sensibilité thermique du lézard vivipare le long d’un gradient climatique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturés dans quinze populations sauvages le long d'un gradient climatique, 225 lézards vivipares mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sur le terrain des mesures, une biopsie de la queue et une prise de sang, puis une semaine d'exposition à des conditions thermiques imposées en captivité, avec deux nouvelles prises de sang. L'objectif déclaré est de comprendre la sensibilité de l'espèce au réchauffement climatique, à des fins de conservation. Tous sont relâchés à leur lieu de capture à l'issue de l'étude, ce que confirment le champ de devenir et la narration.
Objectifs
Comprendre les mécanismes de réponse des organismes aux variations environnementales est un enjeu majeur en écologie et notamment en écologie de la conservation. Les animaux à température variable sont soumis à des contraintes thermiques récurrents pendant la saison d’activité (canicules). Dans ce contexte, il est important de clarifier l’impact de l’exposition à la chaleur et des possibilités d’atténuation des effets. Par exemple, l’accès à la fraicheur nocturne pourrait jouer un rôle clé pour récupérer de l’exposition à la chaleur en journée. De plus les effets des contraintes thermiques peuvent varier selon les populations selon les gradients climatiques avec des effets plus fort des canicules dans les populations en environnement frais. L’objectif principal de ce projet est donc d’évaluer dans quelle mesure, un petit vertébré terrestre, le lézard vivipare répond à des simulations de conditions thermiques imposées en comparant des populations situées sur un gradient climatique naturel. Ces travaux ont des implications importantes en termes de connaissance biologique et de conservation d’espèces qui ont des possibilités limitées de déplacement et sont donc très dépendantes des conditions locales. La prise en compte de ces besoins dans la gestion des habitats/microhabitats naturels pourra par exemple atténuer les effets des épisodes climatiques extrêmes (refuges microclimatiques) et donc favoriser la survie des populations. Cette étude sera menée sur des mâles adultes pour une durée totale de 20 jours. Nous étudierons l’impact de conditions thermiques imposées pendant une période brève (7 jours) avec trois conditions contrastées (frais, chaud le jour, chaud le jour et la nuit). Les conditions choisies reflètent les conditions auxquelles sont exposés les individus dans leur milieu et sont en dessous des seuils dangereux pour la santé. Nous étudierons ainsi les conséquences sur des paramètres physiologiques et comportementaux de cette espèce selon son aire de répartition. Afin de quantifier au mieux les adaptations locales, nous étudierons un maximum de 15 mâles adultes de 15 populations naturelles différentes, un total de 225 mâles soit 75 individus par groupe expérimental. La captivité temporaire est très bien maîtrisée pour l'espèce. Les individus seront replacés sur le terrain à l'issue de l'étude.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de comprendre la réponse au stress thermique dans les populations naturelles de lézards vivipares. Nos précédents travaux dans des populations vivipares du Massif Central suggèrent une accélération du vieillissement, la compréhension écologique et physiologique de ce processus, en explorant l’état de santé des lézards dans des populations ovipares avec des conditions climatiques très contrastées. Par ailleurs, en caractérisant finement les différences de conditions environnementales entre populations nous pourrons mieux comprendre quels facteurs du milieu provoquent ou renforcent ce stress et comment les conditions diurnes et nocturnes interagissent pour moduler ces effets. Ces travaux ont des implications importantes en termes de connaissance biologique et de conservation d’espèces avec des possibilités limitées de déplacement et donc très dépendantes des conditions locales. La prise en compte de ces besoins dans la gestion des habitats/microhabitats naturels pourra par exemple atténuer les effets des épisodes climatiques extrêmes (refuges microclimatiques) et donc favoriser la persistance des populations.
Procédures
Une fois capturés, les individus feront l'objet de mesures morphométriques, d’une biopsie d’un petit morceau de queue et d’une prise de sang. Lors de la phase de captivité, deux prises de sang seront réalisées, avant et après la phase d’exposition thermique.
Impact sur les animaux
La capture sur le terrain est associée à un stress transitoire. Les prélèvements réalisés sur le terrain (prise de sang et biopsie caudale) et en captivité (deux prises de sang) peut générer un stress et douleur transitoire. Enfin une nuisance potentielle est associée aux conditions expérimentales imposées pour simuler les conditions thermiques (7 jours) et notamment le traitement avec chaleur nocturne et diurne. Les conditions thermiques reflètent les conditions auxquelles sont exposés les animaux en situation naturelles et le reflète donc des contraintes écologiquement cohérentes. Les animaux ne sont jamais exposés à leur limite thermique maximum.
Devenir
L'ensemble des animaux sera relâché à l'endroit de leur capture après les mesures réalisées. La remise en nature est cadrée dans l'autorisation de capture de cette espèce de la faune sauvage.
Remplacement
Cette étude vise à comprendre la sensibilité au réchauffement climatique d’une espèce de lézards de milieux frais. Le projet concerne spécifiquement une espèce de la faune sauvage afin de comparer les variations selon les contextes climatique et les populations. Il n’est pas possible de remplacer in vivo ou in silico le modèle biologique utilisé.
Réduction
Pour correctement caractériser l’effet des conditions thermiques et des populations nous avons estimé empiriquement et en tenant compte de nos travaux précédents qu’un effectif de 15 individus par population permettra d’obtenir un échantillonnage suffisant à nos analyses. Ce choix est justifié par un test de puissance statistique pour une taille d'effet équivalente à nos travaux précédents. Nous échantillonnerons 15 populations le long d'un gradient climatique (15 lézards mâle adultes x 15 populations = 225).
Raffinement
Plusieurs raffinements seront mis en place dans le cadre de cette étude. Les mesures sur le terrain seront effectuées en un temps réduits pour limiter les contraintes. Le protocole de terrain a été défini et raffiné par l’équipe depuis plusieurs dizaines d’années. Avant la biopsie caudale l’utilisation d’analgésique local permettra réduire l’inconfort. Le volume sanguin prélevé (sinus orbital) est de 40 µL, soit au maximum (1% masse corporelle). Un collyre ophtalmique analgésique (tétracaïne) sera appliquée sur l’œil une fois l’acte terminé. Les prélèvements seront suivis d’une réhydratation par voie orale) et si besoin d’un apport en fer. Les études sur la sensibilité thermique impliquent souvent la mesures des températures critiques maximum ce qui peut être risqué pour les individus. Nos traitements expérimentaux (7 jours) correspondent à une contrainte thermique modérée avec des températures et éloignées de limites aigues. Les conditions thermiques des conditions d’hébergement standard et lors des traitements thermiques seront suivies en temps réel avec un système de mesure et transmission des alertes (site web, téléphone portable). En captivité au laboratoire, les animaux seront maintenus dans des conditions enrichies validées durant nos précédentes études et respectant la réglementation européenne ainsi que leurs exigences biologiques (gradient de température permettant une thermorégulation active, température des pièces contrôlées, litière et abris, mise à disposition d'eau et de nourriture en illimité. Ces conditions d’hébergements seront raffinées pour mieux correspondre aux besoins spécifiques de l’espèce notamment en terme hydriques sur la base de nos travaux de recherche. En pratique nous réaliserons des aspersions d’eau journalières pour éviter tout risque de déshydratation.
Choix des espèces
Notre étude vise à comprendre comment les conditions climatiques altèrent de façon le niveau de stress et les comportements du lézard vivipare dans le Sud de sa répartition géographique. Il est donc indispensable d’avoir recours à des animaux issus de la faune sauvage pour atteindre nos objectifs. Notre étude se concentre uniquement sur les mâles adultes réduisant les potentiels effets sur les femelles et leurs progénitures. L’ensemble des animaux étant relâchés à la fin de l’expérimentation, cela permet de limiter largement l’impact général de l’étude sur les effectifs naturels.
Etude des réorganisations neuronales après lésion rétinienne par des méthodes tout-optique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour étudier comment le cortex visuel se réorganise après une lésion de la rétine, 845 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie subit une chirurgie d'une à deux heures pour poser une fenêtre crânienne et une barre de tête, une autre une lésion de la rétine, puis des observations au microscope sur animal éveillé, répétées jusqu'à vingt fois. L'étude déclare vouloir éclairer des maladies comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge et développer des outils de restauration visuelle. Le cerveau est prélevé en fin de projet pour compléter les données anatomiques.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre les dynamiques de la réorganisation des neurones du cortex visuel après une lésion partielle de la rétine. Après une lésion, une partie du secteur du cortex visuel ne reçoit plus d’informations visuelle. Les neurones de ces secteurs finissent par retrouver une activité visuelle, en étant recruté par des neurones avoisinants dont le champ récepteur spatial est proche. La dynamique exacte de cette réorganisation est inconnue. En particulier, nous cherchons à comprendre si la sélectivité pour certains aspects des stimuli visuels de ces neurones avant et après lésion influe sur leur réorganisation. La réponse des neurones du cortex visuel avant et après lésion sera quantifiée par des techniques d’imageries. Dans un second temps, nous chercherons à mesurer in vivo la force des connexions entre les neurones avant et après lésion. Ces mesures seront faites par des techniques d’imageries spécialisés. Ce projet permettra de mieux comprendre les réorganisations des neurones qui suivent une perte fonctionnelle localisée de la fonction rétinienne, qui se produit dans certaines pathologies comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge.
Bénéfices attendus
Ce projet constitue un axe de recherche essentiel, dont les bénéfices attendus sont technologiques et biologiques. Au niveau technologique, le développement de mesure de la connectivité in vivo via des méthodes tout-optiques, encore jamais été réalisé, constitue une avancée méthodologique importante. Au niveau biologique, les lésions rétiniennes sont un modèle classique de dégénérescence maculaire liée à l’âge. Ce projet permettra de mieux comprendre les conséquences de cette maladie au niveau du système nerveux central. A un niveau plus fondamental, ce projet permettra de mieux comprendre comment les réseaux corticaux adaptent leurs représentations des stimuli visuels lors de perte sensorielles. Enfin, une perspective de ce projet consiste à développer les outils qui pourront être utilisés dans différentes stratégies de restauration visuelle.
Procédures
Une partie des animaux auront une chirurgie sous anesthésie et sous analgésie consistant à injecter des molécules d'intérêt et à poser une fenêtre et une barre de tête pour étudier l'activité neuronale. Durée de la chirurgie : 1h-2h, une fois par animal. Une partie des animaux observés en microscopie sera éveillée, les animaux seront observés sous un microscope et sur un tapis roulant. Durée : 1-3h, répétée au maximum 20 fois. Une partie des animaux subira une lésion focale de la rétine sous anesthésie et analgésie. Durée de la procédure : 5 minutes, une fois par animal.
Impact sur les animaux
La contention de l'animal pour les injections et pour les expériences sur animaux vigiles peut entrainer un léger stress des animaux. Les injections peuvent induire légère douleur de courte durée au moment de l'introduction de l'aiguille. L’immobilisation des animaux sous le microscope peut occasionner un léger stress. De rares effets pourront se produire pendant les chirurgies : mauvaise réaction à l’anesthésie, saignements pendant la chirurgie. Nous nous attendons à ce que les chirurgies de pose d’implants chroniques puissent causer des douleurs post-opératoires, du stress ou une perte de poids temporaire. Après lésion de la rétine, dans de rares cas des atteintes oculaires inflammatoires peuvent être observées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire à la fin du projet. Les cerveaux seront prélevés afin d'obtenir des données anatomiques supplémentaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Les nouvelles molécules de ce projet seront d’abord testées sur des échantillons in vitro (cultures cellulaires, organotypiques). Nous sélectionnerons les plus prometteurs pour nos expérimentations in vivo). Des simulations par ordinateur, préliminaires aux expériences, sont utilisés pour obtenir les paramètres optimaux d’illumination des tissus (température, modèles pour l’activation des opsines). Les animaux seront utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. À l’heure actuelle, ce modèle ne peut pas être entièrement remplacé par une approche alternative in vitro car les circuits neuronaux impliqués dans la réponse à une stimulation visuelle ne sont pas observables in vitro.
Réduction
L’utilisation d’animaux avec implants chroniques nous permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à chaque expérience et répéter les stimulations et les acquisitions tout en respectant le bien-être des animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (845) est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Le nombre d'animaux nécessaires a été estimé à l'aide d'un test statistique de puissance. L’utilisation de méthodes de protéomique moderne permet de quantifier l’expression de nombreuses protéines (jusqu’à 200) sur les mêmes échantillons, réduisant considérablement le nombre d’animaux nécessaires. Nous utiliserons ensuite des tests statistiques adaptés pour l’analyse de nos résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation. La température des cages, l’hygrométrie et le cycle jour nuit sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Selon les procédures, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale et d’une analgésie. L’efficacité de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée tout au long de la procédure par test des réflexes. En cas de signes de réveil, une adaptation du niveau d’anesthésie sera réalisée. Des traitements analgésies/anesthésies locaux seront également mis en place. Les souris seront constamment surveillées et réchauffées pendant la phase d’anesthésie et de réveil à 37 degrés Celsius (dans une boîte ou sur un tapis chauffant). Pendant les procédures d’anesthésie générale les yeux seront protégés contre le dessèchement avec gel oculaire. A la fin de la chirurgie l’animal reçoit une dose de solution saline de réhydratation pour l’aider à récupérer rapidement ses capacités. Les procédures sont affinées au cours du temps pour garantir le bien-être des animaux (par exemple la mise à disposition dans la cage de gel pour l’alimentation en cas de perte de poids en post-opératoire). Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée pour assurer une surveillance adaptée des animaux. L’utilisation d’une grille d’évaluation et scoring permettra de définir les points limites précoces et prédictifs à chaque acte expérimental pour s'assurer de réduire la souffrance et la détresse des animaux au maximum. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure chargée du bien-être de l'animal. Les animaux étant observés éveillés, ils seront soumis à un entrainement avant les observations au microscope, pour les habituer à leur environnement et réduire le stress.
Choix des espèces
La souris adulte est un modèle très utilisé par les laboratoires de recherche pour étudier le fonctionnement de circuits neuronaux complexes dans des conditions physiologiques. La souris est un modèle établi et très utilisé du système visuel. La taille du cerveau de souris est aussi idéale pour les études en microscopie multi-photonique en profondeur avec une résolution cellulaire. Au début des procédures, les souris seront âgées entre 7 et 24 semaines (système visuel mature), puis nous effectuerons des expériences sur les réorganisations post lésions des circuits neuronaux corticaux jusqu’à 6 mois post-lésion. La souris permet également d'obtenir des modèles transgéniques présentant un phénotype non dommageable et ne pas nécessitant l’injection de vecteurs viraux.