Recherche fondamentale
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Etude des populations immunitaires présentes chez des souris humanisées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, 20 souris dites humanisées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent quatre injections intrapéritonéales d'une molécule censée faire mûrir un système immunitaire humain greffé, puis un prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse. Leur mise à mort tient à l'objet même de l'étude, vérifier après leur mort si ces cellules humaines se comportent comme chez l'humain. Le porteur affirme que ce dispositif remplace des études cliniques sur l'être humain.
Objectifs
Les modèles animaux classiques sont d’une grande utilité dans les études précliniques car ils permettent de tester des hypothèses et des traitements de manière robuste. Malheureusement, le système immunitaire de la souris reste différent de celui de l’Homme et ne peut parfaitement mimer les réponses qui se développeront chez l’Homme. A mi-chemin entre souris et Homme ont été développées des souris humanisées, c’est-à-dire qui possèdent des cellules du système immunitaire humain. L’objectif de ce projet est de tester si les cellules immunitaires présentes chez des souris humanisées possèdent les même caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques que les cellules humaines.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote permettra de mieux caractériser le système immunitaire humain présents dans les souris humanisées. Les bénéfices attendus de ce projet doivent être considérés à l’aune de son caractère exploratoire. Sur le plan scientifique, cette étude permettra d’évaluer la transposabilité des données issues d’expériences réalisées chez les souris humanisées et ainsi de les utiliser au mieux de leur capacité. D’un point de vue translationnel, l’identification d’un modèle murin récapitulant les caractéristiques du système immunitaire humain permettra la mise en place d’études précliniques dont les résultats mimeront avec une grande fidélité ceux attendus chez l’Homme.
Procédures
Les souris vigiles recevront 4 administrations d’une molécule permettant la maturation du système immunitaire en IP (30 secondes par geste). Les souris endormies se verront prélever du sang au niveau de la mandibule une fois pendant une minute.
Impact sur les animaux
Les 4 injections de la molécule permettant la maturation du système immunitaire humain se feront en intra péritonéale. Ces injections sont susceptibles de générer un stress lié à la contention pendant l’injection. L’injection en elle-même n’est pas douloureuse. Le prélèvement de sang se fera sous anesthésie gazeuse par isoflurane et ne devrait pas susciter de douleur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin d’étudier le système immunitaire humain qui s’est développé dans différents organes.
Remplacement
Des expériences in vitro ont été réalisées en amont grâce à l’utilisation de poches de sang. Cependant le système immunitaire humain est complexe et dépendant de son microenvironnement, absent lors des études in vitro. L’utilisation de souris possédant un système immunitaire humanisé permet le remplacement d’étude clinique sur l’homme.
Réduction
Le principe de réduction est au cœur de la conception de cette étude pilote. En menant d’abord une étude préliminaire, nous pourrons déterminer si ces souris humanisées possèdent un système immunitaire humain dont les fonctionnalités sont proches de celle d’un être humain. Cette étape exploratoire permettra d’évaluer la pertinence et la faisabilité d’une étude plus vaste, évitant ainsi l’utilisation d’un nombre plus important d’animaux sans justification scientifique préalable. De plus, notre équipe a déjà généré un volume important de données in vitro en utilisant des poches de sang. En combinant ces deux éléments — étude pilote préalable et exploitation des données expérimentales existantes — nous respectons pleinement le principe de réduction, en utilisant le minimum d’animaux nécessaires pour répondre à la question scientifique tout en assurant la robustesse et la pertinence des conclusions.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit). L’hébergement se fera classiquement en cagepouvant accueillir 10 animaux. Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers, permettant de réduire l‘ennui, diminuer le stress en stimulant l‘activité et procure un sentiment de sécurité à l‘animal dans la cage. Un suivi quotidien par du personnel qualifié et ayant l’habitude du modèle sera réalisé pour repérer au plus vite les éventuels signes de détresse. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale de l’animal (isoflurane) suivi de la mise à mort par dislocation cervicale avant le réveil.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car le processus d’humanisation de leur système immunitaire est maitrisé en routine par la société les mettant en œuvre. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal qui a pu reconstituer un système immunitaire humain complet.
Physiopathologie et thérapie du Syndrome de Wolfram
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
360 souris génétiquement modifiées pour reproduire le syndrome de Wolfram vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Anesthésiées à plusieurs reprises pour des examens du fond d'œil, de la rétine et des électrorétinogrammes, une partie reçoit à la naissance une injection dans la veine temporale. Le porteur décrit des effets possibles du modèle, démarche instable, tremblements, désorientation et comportement anxieux. Il affirme que ce modèle est le "seul moyen" d'explorer les mécanismes de la maladie et le seul à pouvoir tester des traitements sur la rétine, présentant cette irremplaçabilité comme un fait acquis.
Objectifs
Le projet porte sur le Syndrome de Wolfram, une maladie qui entraine une perte de la vision progressive due à une perte de la fonction du nerf optique qui permet de relier l’œil au cerveau. Il n’existe actuellement pas de traitement pour traiter cette maladie. Nous avons donc généré un modèle animal pour reproduire la maladie et tester des traitements. Ce modèle animal reproduit fidèlement les atteintes retrouvées chez les patients. Il est important de noter que ce modèle représente le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie. Ce modèle est également le seul modèle qui puisse être utilisé pour tester des traitements sur la rétine. Nous développerons 2 approches : 1) une étude sur les cellules de la rétine qui sont défectueuses que nous mettrons en culture afin d’étudier leur croissance en réponse à plusieurs traitements. 2) Nous développerons un axe de recherche sur les animaux vivants, auxquels nous injecterons une forme fonctionnelle de la protéine défectueuse afin de protéger leur rétine. Nous mesurerons le bénéfice de cette thérapie sur la fonction visuelle des animaux au cours du temps.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence si notre traitement est capable de protéger la vision des animaux. A long terme, ce projet permettra de proposer un traitement de thérapie génique chez les patients atteints de perte de fonction du nerf optique.
Procédures
90 animaux seront anesthésiés pendant 30 minutes, deux fois, avec une semaine d’intervalle, lorsqu’ils auront 1 mois. Pendant l’anesthésie, ils passeront : • un examen du fond d’œil (10 min), • une analyse des couches de la rétine (10 min), • un électrorétinogramme (10 min). Parmi eux, 60 auront reçu une injection dans la veine temporale à la naissance. 90 autres animaux seront anesthésiés pendant 30 minutes, quatre fois en tout : deux fois à 1 mois (à une semaine d’intervalle) et deux fois à 3 mois (à une semaine d’intervalle). Ils passeront les mêmes examens que ci-dessus. Parmi eux, 60 auront reçu une injection dans la veine temporale à la naissance. 180 animaux seront anesthésiés pendant 30 minutes, six fois en tout : deux fois à 1 mois, deux fois à 3 mois et deux fois à 6 mois (toujours à une semaine d’intervalle à chaque âge). Ils passeront les mêmes examens que ci-dessus. Parmi eux, 120 auront reçu une injection dans la veine temporale à la naissance.
Impact sur les animaux
Les tests fonctionnels pour mesurer la vision sont indolores et pratiqués couramment en ophtalmologie humaine. L’injection des virus peut induire une courte douleur (moins de 2 min). Une partie des tests se fera sous anesthésie générale. Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. Après chaque exploration (test), les souris seront observées quotidiennement. Les effets indésirables liés au modèle de souris peuvent être une démarche instable, des tremblements, une incapacité à grimper, une désorientation, un comportement anxieux.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvement de tissus post-mortem. De plus, la plupart des animaux utilisés étants génétiquement modifiés et/ou infectés par des virus génétiquement modifiés eux aussi, il nous est impossible de replacer ou de faire adopter ces animaux. Ils seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Nous avons généré une souris reproduisant une maladie qui entraine une baisse progressive de l’acuité visuelle due à la perte du nerf optique. Il n’y a pas de traitement. Il est important de noter que ce modèle représente le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie et de tester des traitements. Dans le cadre d'essais cliniques de thérapie génique, le recours à la souris est nécessaire et permet d’apporter une indication de l’efficacité du traitement.
Réduction
Notre projet étudie toutes les souris qu’elles soient porteuses de mutation ou non. Nous avons également constaté une différence d’atteinte chez les mâles et les femelles, de ce fait notre étude prend en compte mâles et femelles. Les mêmes animaux seront étudiés à 1, 3 et 6 mois avant leur euthanasie. Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant d’avoir un effet statistique significatif.
Raffinement
Toutes les mesures biologiques pour étudier la vision et l’audition sont effectuées sur l’animal sous anesthésie. Les animaux sont placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu'au réveil. Après toutes analyses, les souris seront observées quotidiennement. Si des animaux montrent des signes de douleurs ou de souffrances, nous évaluerons cette souffrance et nous prendrons les décisions nécessaires afin de réduire la durée et l’intensité de la souffrance pour y mettre fin.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris, car c’est le modèle mammifère de référence pour étudier l’impact d’une mutation d’un gène sur l’organisme. Les souris modèles que nous utilisons portent des mutations retrouvées chez les patients atteints de Syndrome de Wolfram et reproduisent les caractéristiques cliniques de la maladie chez l’homme. Ces souris sont donc de très bons modèles animaux pour tester des traitements. Les animaux utilisés pour faire des cultures de cellules rétiniennes seront des animaux de 3 jours après la naissance. Ce stade est le stade utilisé pour avoir les meilleurs résultats (rendement en quantité de cellules). Des traitements seront testés sur ces cellules afin d’identifier des molécules protectrices des cellules ganglionnaires de la rétine. Les animaux génétiquement modifiés reproduisant la maladie seront traités par thérapie génique à la naissance et leur vision sera explorée au cours du temps (à 1,3 et 6 mois) afin d’évaluer le bénéfice thérapeutique de l’approche de thérapie génique. Des prélèvements de rétines seront réalisés sur les animaux de 1,3 et 6 mois après euthanasie afin d’évaluer l’effet du traitement sur la morphologie de la rétine.
Etude de la réaction immunitaire cérébrale après induction d’une inflammation générale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour servir de groupe témoin à des travaux sur l'accident vasculaire cérébral, 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection unique dans l'abdomen d'une suspension bactérienne qui déclenche une inflammation de l'"organisme entier", puis une prise de température rectale sur animal éveillé. Le porteur décrit une possible hypothermie, des diarrhées et des modifications de la respiration et de la motricité dans les heures qui suivent. Ces 220 individus ne servent pas à tester un traitement mais à caler un modèle d'inflammation destiné à d'autres expériences du laboratoire.
Objectifs
L’inflammation est une réaction de défense immunitaire du corps à une agression : infection, brûlure, allergie… Dans ce projet, nous portons un intérêt particulier aux cellules sentinelles du système immunitaire au niveau cérébral, en contact avec l’environnement, rapidement mobilisées en cas d’inflammation. Les cellules immunitaires sont présentes dans différentes régions cérébrales où elles sont capables d’interagir avec les vaisseaux sanguins, les neurones ainsi que d’autres types cellulaires présents. Elles ont été décrites dans la littérature comme étant impliquées dans de l’inflammation au niveau cérébral observée dans diverses pathologies du système nerveux central (SNC) telles que les accidents vasculaires cérébraux (AVC). L’objectif de ce projet est d’utiliser l’injection d’une suspension de bactéries (bactéries Escherichia Coli) appelées lipopolysaccharides (LPS) chez la souris pour induire une inflammation générale conduisant à l’activation du système immunitaire au niveau du SNC. Ce modèle d’inflammation constituera un contrôle positif pour l’étude de la réponse inflammatoire dans les AVC étudiés au sein de notre laboratoire et pour lesquels nous disposons d’ores et déjà de saisines dédiées. Ainsi, les animaux constituant ce groupe contrôle recevront le LPS et seront suivis pendant 24 heures (observation de leur comportement général). A l’issue des 24 heures, sous anesthésie générale, les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés pour la réalisation d’analyses diverses. Les données générées par les analyses qui seront effectuées permettront d’évaluer l’efficacité potentielle des molécules testées dans le cadre du développement de thérapies novatrices visant l’inflammation dans le domaine de l’AVC.
Bénéfices attendus
Le groupe d’animaux concerné par cette procédure constitue un groupe contrôle positif permettant de valider la présence au niveau cérébral des cellules immunitaires qui sont impliquées dans la réponse inflammatoire déclenchée en cas d’AVC. Cette réponse inflammatoire étant à l’origine d’une cascade d’évènements délétères dans l’AVC, elle représente une cible de choix dans le développement de stratégies thérapeutiques. Ainsi, grâce à ce groupe d’animaux, le partenaire industriel sera en mesure d’évaluer l’intérêt du développement de cette stratégie et pourrait à terme proposer de nouvelles solutions thérapeutiques pour le traitement des AVC.
Procédures
Les 220 souris de cette procédure seront soumises à l’induction d’une inflammation générale par injection dans le bas de la cavité abdominale d’une suspension d’origine bactérienne. L’injection est effectuée 1 seule fois sans anesthésie, le geste étant très rapide, quelques secondes, et effectué par du personnel qualifié. Les souris seront observées 6 heures après l’injection et une prise de température corporelle au niveau rectal sera effectuée et comparée à la mesure prise en amont de l’injection. Ces prises de température et observations de l’état général des animaux se feront sur animal éveillé et prendront au total moins d’une minute.
Impact sur les animaux
L’induction d’une inflammation générale affectant l’organisme entier pourra entrainer des variations de la température corporelle (hypothermie dans les premières heures), se traduisant par des modifications du comportement des animaux. L’apparence, la respiration et la motricité des animaux pourraient aussi être modifiés. L’apparition de diarrhées pourrait survenir.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.
Réduction
Ces groupes contrôles devrons être composés du même nombre d’animaux que les groupes de nos modèles d’AVC. Ainsi, pour ces modèles d’AVC, les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.
Raffinement
Afin de détecter de potentielle variations de la température corporelle, des mesures de températures rectales seront effectuées à l’aide d’un thermomètre adapté, en amont de l’injection de LPS puis 6 heures après. Du coton sera ajouté à l’enrichissement habituel pour limiter la déperdition de chaleur au sein des cages. Les animaux présentant des modifications de leur température, de leur apparence, de la respiration et de la motricité se verront attribuer un score qui sera établi à partir de la grille de score rédigée et jointe à la présente demande d’autorisation. Ainsi, leur score permettra de déterminer la prise en charge la plus adaptée à leur état. En cas de constatation de dépassement des points limites fixés et détaillés plus bas dans cette DAP, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche médicale, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, ainsi que la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront adultes le jour de l’induction de l’inflammation (entre 8 et 14 semaines). Nous induirons ce modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer ce groupe contrôle aux animaux de l’étude chez qui l’AVC sera induit.
Etude pilote pour tester l’implantation de cellules cancéreuses par chirurgie orthotopique dans un modèle d’allogreffe syngénique de cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées à l'issue pour récupérer leurs tumeurs, 12 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Six reçoivent une injection de cellules de cancer du pancréas dans l'abdomen, six autres une greffe par chirurgie de vingt minutes, puis toutes passent par des imageries sous anesthésie et développent une tumeur pouvant provoquer malnutrition, perte de poids et détresse sévère. Cette étude pilote vise à améliorer le taux de prise de greffe pour, selon le porteur, "réduire" le nombre d'animaux des protocoles suivants. Douze souris sont donc rendues gravement malades au nom d'expériences encore à venir.
Objectifs
Cette étude pilote vise à déterminer si en modifiant notre méthodologie de transplantation des cellules cancéreuses, nous parvenons à améliorer le taux de prise de greffe (et donc à réduire le nombre d’animaux à impliquer dans les prochaines procédures), à contraindre le développement tumoral aux limites de l’organe ciblé (le pancréas), sans que ces actes chirurgicaux supplémentaires ne détériorent le bien-être animal ou ne perturbent le compartiment immunitaire antitumoral des souris.
Bénéfices attendus
A court terme, notre étude pilote devrait permettre de raffiner notre méthodologie d’implantation des cellules pancréatiques dans nos modèles précliniques. De ce fait, cela réduira le nombre d’indivdus nécessaires aux protocoles tout en diminuant les nuisances subies (tumeur limitée au pancréas). A plus long terme, cette étude s’inscrit dans un projet de recherches translationnelles visant à améliorer les stratégies thérapeutiques disponibles pour les patients atteints de cancer du pancréas.
Procédures
Les 12 souris de cette étude seront transplantées avec des cellules tumorales pancréatiques. 6 d’entre elles via une injection péritonéale qui engendrera une brève douleur légère, les 6 autres via une intervention chirurgicale de 20min sous anesthésie. Le développement tumoral sera évalué une fois par semaine (4x au total) par imagerie non invasive mais nécessitant l’anesthésie des animaux (10minutes/souris). Enfin, les 12 animaux subiront également 2 prélèvements sanguins (durée = moins d’une minute) à l’aide de matériel dédié aux rongeurs, un avant transplantation et un second à l’arrêt de l’étude. Ces 2 prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse de même que la mise à mort des animaux.
Impact sur les animaux
Les animaux développeront une pathologie tumorale potentiellement grave pouvant engendrer une détresse sévère repérable par l’apparition de malnutrition, d’une perte de poids et d’une réduction de l’activité. Les manipulations et les anesthésies peuvent être source d’angoisses.
Devenir
Afin de caractériser l’efficacité et la spécificité pancréatique des méthodes de transplantations, nous devons récupérer en fin d’expérience les tumeurs de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Notre projet avant d’impliquer des souris, fait appel à différents modèles expérimentaux développés in vitro à partir de cultures de cellules. Cependant, l’analyse du rôle du métabolisme mitochondrial dans le dialogue entre les cellules tumorales et leur environnement immunitaire dans le contexte ou non d’une thérapie, ne peut être étudiée de manière satisfaisante que sur des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur le taux de prise de greffe et la nature de l’infiltrat immunitaire intra tumoral. Ainsi, il ressort que 6 animaux/groupe seront nécessaires.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et une pesée à minima bihebdomadaire, par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être et de points limites prédictifs et spécifiques au projet. Les greffes, les prélèvements et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie gazeuse et sur tapis chauffant, afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance des animaux. Une analgésie per-opératoires sera appliquée lors de la chirurgie. Enfin, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé non invasif à savoir des acquisitions de bioluminescence par imagerie optique sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
Le recours aux animaux est indispensable pour ce projet préclinique s’inscrivant dans un programme global d’étude physiopathologique du dialogue systémique entre les cellules tumorales pancréatiques et leur environnement immunitaire qui ne peut se faire que dans un organisme vivant. Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’humain pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées cellulaires murines constitue aussi un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules cancéreuses dans des souris receveuses de même fond génétique et l’étude du système immunitaire antitumoral. Les souris receveuses seront implantées avec des cellules cancéreuses pancréatiques murines à l’âge de 6 à 10 semaines, ce qui est un âge classique pour ce type de modèle expérimental de tumeur induite par greffe de cellules cancéreuses.
Caractérisation du fonctionnement des réseaux neuronaux de la mémoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Cinq heures d'implantation d'électrodes dans le cerveau, précédées d'une injection intracérébrale de trois heures, 120 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous mis à mort pour l'analyse de leur cerveau. Les animaux naviguent ensuite dans un grand labyrinthe pendant que des électrodes enregistrent leur activité cérébrale et que l'optogénétique module certains neurones. Le projet cherche à comprendre comment le cerveau encode et stocke la mémoire spatiale. Le porteur revendique plus de vingt ans d'expérience sur ce type d'implantation et présente le rat comme peu coûteux et facile à héberger.
Objectifs
Notre projet de recherche fondamentale vise à comprendre comment le cerveau encode et mémorise les informations. Pour cela, nous utilisons une approche expérimentale basée sur l’étude de rats, soumis à une procédure permettant d’explorer le fonctionnement de leur cerveau au cours de tâches mnésiques. Chez le rongeur, l’environnement est représenté dans des réseaux de neurones répartis dans différentes régions du cerveau, principalement le cortex et l’hippocampe. Les informations encodées circulent à travers ces circuits avant d’y être stockées de façon plus ou moins durable. Cependant, les mécanismes précis de cette circulation et de cette stabilisation de l’information restent encore mal connus. Par ailleurs, plusieurs études, y compris les nôtres, suggèrent que le thalamus jouerait un rôle essentiel dans le transfert d’informations entre l’hippocampe et le cortex, mais les processus impliqués demeurent à élucider. Pour communiquer entre eux, les neurones utilisent une activité électrique, sous forme de potentiels d’action et d’oscillations des potentiels de champ. En implantant des électrodes dans l’hippocampe, le thalamus et le cortex, nous enregistrons ces signaux. Des outils mathématiques, notamment issus du machine learning, nous permettent ensuite de les décoder lorsque les animaux effectuent des tâches de mémoire spatiale. Nous combinons cette approche avec des techniques d’optogénétique, qui permettent de moduler spécifiquement l’activité de certains groupes de neurones, afin de déterminer comment ces trois régions cérébrales coopèrent pour encoder et consolider les informations. Un tel projet est essentiel pour mieux comprendre l’activité cérébrale à la base de la mémoire. Il s’agit d’un enjeu majeur non seulement pour la recherche fondamentale, mais aussi pour la santé publique : les pathologies affectant la mémoire, dont l’impact social et humain est croissant, restent encore mal prises en charge en raison d’une compréhension insuffisante des mécanismes cérébraux sous-jacents.
Bénéfices attendus
En enregistrant et en manipulant les réseaux neuronaux impliqués dans l’apprentissage et la consolidation de la mémoire spatiale, ce projet apportera à court terme des avancées majeures en recherche fondamentale sur les mécanismes cérébraux qui sous-tendent la mémoire. À plus long terme, ces connaissances contribueront à mieux comprendre les pathologies affectant la mémoire, dont l’impact social et humain est croissant, et à ouvrir de nouvelles pistes pour améliorer leur prévention et leur prise en charge. Ce projet représente ainsi un enjeu essentiel, à la croisée de la recherche fondamentale et de la santé publique.
Procédures
Deux chirurgies (injection intracérébrale, 3h environ, et implantation d'électrodes intracérébrales, 5h environ) sont réalisées sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
Les deux interventions invasives prévues seront réalisées sous anesthésie générale, et un traitement complet sera mis en place avant, pendant et après l’opération afin de prévenir toute douleur ou inconfort. Notre équipe dispose de plus de vingt ans d’expérience dans l’implantation de ce type d’électrodes. Nous opérons généralement un à deux rats dans une même série (à quelques jours d’intervalle), ce qui permet un suivi attentif et individualisé de leur état. La cicatrisation après ce type d’intervention est habituellement rapide, et les animaux sont en général prêts à participer aux tâches comportementales environ une semaine après la chirurgie. L’injection de l’outil optogénétique est très ciblée : elle permet d’introduire dans une région précise du cerveau, et dans un type de neurones défini, une protéine (appelée opsine) qui réagit uniquement à une stimulation lumineuse délivrée localement par une microfibre optique. Le vecteur viral utilisé n’est pas pathogène : il s’agit simplement d’une enveloppe inoffensive servant à transporter la séquence génétique nécessaire à l’expression de l’opsine. La tâche de mémoire proposée consiste à naviguer dans un grand labyrinthe pour retrouver le chemin menant à une récompense. Cette tâche a été conçue pour s’inspirer du comportement naturel du rat. Afin de réduire tout stress susceptible d’altérer les performances et le bien-être des animaux, ceux-ci sont longuement habitués à l’expérimentateur et à l’environnement du labyrinthe avant le début des expériences.
Devenir
en fin de procédure, tous les animaux sont euthanasiés afin de collecter les cerveaux pour des analyses anatomiques
Remplacement
L’objectif de ce projet est de comprendre comment le cerveau traite et stocke les informations liées à la mémoire. À ce jour, ces mécanismes restent encore largement méconnus et ne peuvent pas être étudiés sans observer le fonctionnement du cerveau dans un organisme vivant. Il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de reproduire de manière fiable l’ensemble des processus cérébraux impliqués dans la mémoire, notamment les interactions dynamiques entre différentes régions du cerveau au cours du comportement. Les approches non animales, telles que les modèles informatiques, les cultures de cellules ou les organoïdes cérébraux, sont utiles pour répondre à certaines questions spécifiques, mais elles ne permettent pas d’étudier la mémoire telle qu’elle s’exprime dans un cerveau intact, en interaction avec le corps et l’environnement. L’expérimentation animale reste donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. Le rat est utilisé comme modèle expérimental car il s’agit de l’espèce la plus pertinente pour ce type d’étude. De nombreuses recherches ont montré que les structures cérébrales impliquées dans la mémoire, ainsi que leur organisation générale, sont largement conservées entre les rongeurs et l’être humain. Les connaissances acquises chez le rat constituent ainsi une base essentielle pour comprendre les mécanismes de la mémoire humaine et favoriser, à terme, une meilleure prise en charge des troubles de la mémoire.
Réduction
La mémoire étant un processus propre à chaque individu, chaque rat constitue une unité expérimentale à part entière. À l’heure actuelle, les mécanismes précis de la mémoire restent encore mal connus et de nombreux facteurs peuvent influencer les résultats. Il n’est donc pas possible de prévoir à l’avance l’ampleur des effets observés ni de calculer précisément le nombre d’animaux nécessaires par des méthodes statistiques classiques. Afin de limiter le recours aux animaux, nous procédons par étapes. Les expériences débutent avec de très petits groupes de rats (un à trois animaux par condition expérimentale, incluant les groupes contrôles et les groupes soumis à différentes manipulations). Cette approche progressive permet d’évaluer rapidement la variabilité des résultats et d’ajuster les protocoles si nécessaire, sans utiliser un nombre excessif d’animaux. Lorsque les résultats le justifient, les groupes sont complétés progressivement jusqu’à atteindre un effectif minimal permettant des analyses statistiques fiables (au moins huit animaux par groupe). Des méthodes statistiques adaptées sont alors utilisées pour comparer les groupes et identifier uniquement les différences réellement significatives. Cette stratégie permet d’arrêter les expériences dès que des conclusions robustes peuvent être tirées, évitant ainsi l’utilisation d’animaux supplémentaires non nécessaires.
Raffinement
Ce projet met en œuvre de nombreuses mesures visant à réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long de l’expérimentation. Des points limites clairement définis et suffisamment précoces sont intégrés à chaque étape de la procédure afin de garantir une prise en charge rapide et adaptée en cas de difficulté. Toutes les interventions invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée systématiquement à des traitements antalgiques avant, pendant et après la chirurgie. Ces mesures permettent de prévenir efficacement la douleur liée aux interventions. Après chaque opération, les animaux reçoivent une hydratation sous-cutanée et sont maintenus au chaud jusqu’à leur réveil complet, afin de favoriser une récupération rapide et confortable. Une alimentation adaptée, sous forme de nourriture ramollie et appétente, est mise à disposition durant les premiers jours suivant la chirurgie pour limiter la perte de poids et faciliter la convalescence. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement à l’aide d’examens cliniques simples incluant notamment le suivi du poids et de paramètres physiologiques. Cette surveillance permet de détecter précocement tout signe de douleur ou de mal-être. En fonction des observations, des traitements antalgiques complémentaires peuvent être administrés. Si nécessaire, les animaux peuvent être temporairement retirés du protocole expérimental afin de leur laisser le temps de récupérer. En cas d’atteinte d’un point limite majeur, une euthanasie est réalisée après sédation, conformément aux recommandations en vigueur. Le bien-être animal est également pris en compte dans les conditions d’hébergement et de manipulation. Les rats sont logés en groupe dans des cages spacieuses, avec un accès libre à l’eau et à la nourriture, et bénéficient d’un enrichissement de leur environnement (matériaux de nidification, tunnels et objets variés). Un temps important est consacré à l’habituation et à la manipulation douce des animaux par les expérimentateurs, afin de réduire le stress et de respecter au mieux le comportement naturel de l’espèce.
Choix des espèces
Ce projet utilise des rats comme modèle expérimental qui est l'espèce de référence dans le cadre de l’étude des mécanismes de la mémoire. Les régions cérébrales impliquées sont conservées entre les rongeurs et l’humain. De nature très curieuse et de par leur cacapités d'exploration innée pour l'espèce, le rat est l'espèce de choix pour intéroger la mémoire spatiale. De plus, le rat est une espèce peu couteuse et facile d’approvisionnement et d’hébergement.
Etude de l’implication de récepteurs neuronaux dans les mécanismes de développement de douleur chronique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le nerf sciatique lésé par chirurgie pour installer une douleur neuropathique, 3 820 souris vont être utilisées dans des procédures dont la plupart, 3 200, atteignent un niveau de souffrance sévère. Aucun antidouleur ne peut leur être administré, la sensibilité à la douleur étant le paramètre mesuré, et toutes sont mises à mort à la fin pour ne pas prolonger cette douleur. Le projet étudie un récepteur neuronal comme cible contre les douleurs chroniques, sur la base de résultats déjà publiés et brevetés. Le porteur limite chaque expérience à un mois après la lésion, seule borne posée à une souffrance délibérément entretenue.
Objectifs
Une douleur qui dure plus de trois mois est définie comme chronique et en tant que telle représente un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Les douleurs chroniques affectent environ 20% de la population adulte, et sont pour la plupart résistantes aux traitements thérapeutiques actuels. De plus, l'utilisation de la morphine, molécule de référence pour le traitement de la douleur, est limitée en raison de l'apparition d'effets secondaires et de phénomènes de tolérance. Nous avons démontré que l’activation d’un récepteur neuronale est nécessaire et suffisant pour générer expérimentalement une douleur neuropathique (douleur liées aux nerfs) chez les rongeurs. Plus important encore, nous avons montré que, lorsque l’état de douleur neuropathique était installé, l'inhibition de ce récepteur suffisait à annuler les symptômes douloureux. De plus, nos découvertes récentes étendent le champ d’application aux maladies douloureuses habituellement traitées avec des morphiniques, mais également aux douleurs inflammatoires. Ces résultats ont été publiés et fait l’objet de plusieurs brevets. Dans ce projet, l'implication de ce récepteur, nouvelle cible innovante dans les douleurs chroniques, sera étudiée. De façon plus précise, notre projet s’intéresse à mieux comprendre le rôle de ce récepteur dans différents modèles de douleur et notamment de mieux caractériser son rôle dans les mécanismes de chronicisation douloureuse, de maintien et de récupération, tant au niveau sensoriel qu’émotionnel. Le rôle de ce récepteur sera également étudié en lien avec un récepteur aux opioides dont l’implication a déjà été bien caractérisé dans ces processus.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but, dans un premier temps, de compléter nos connaissances sur la mise en place de douleur et son maintien, ainsi que d’amener de nouvelles clés à la compréhension des mécanismes autour de la douleur chronique. Ce travail, mené depuis maintenant plusieurs années, nous a déjà permis de mettre en avant un acteur essentiel dans les douleurs provoquées par un dysfonctionnement nerveux, mais surtout une cible potentielle pour de nouveaux composés thérapeutique. Le manque évident de traitement pour ce type de douleur agit comme motivateur principal à ces travaux de recherche. Au vue de l’avancée de cet étude, il convient maintenant d’approfondir nos connaissances sur la mécanistique de ce récepteur et les mécanismes associés à l’apparition et le maintien de la douleur, pour en parallèle avoir la possibilité d’avancer des candidats pré-cliniques pour le traitement des douleurs chroniques et réaliser ensuite des études cliniques chez l’homme.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à 3 types de procédures chirurgicales différentes, induisant des douleurs neuropathiques ou inflammatoires. Les deux premières induisent des douleurs neuropathiques chez la souris et portent atteinte au nerf sciatique de manières différentes en fonction de la procédure, ces interventions durent entre 5 et 10 minutes et se font sur animaux anesthésiés par inhalation. La quatrième se fait également sur la souris et induit une douleur inflammatoire par une simple incision de la voûte plantaire, cette intervention dure 5 minutes et se fait sur animaux anesthésiés par inhalation.
Impact sur les animaux
La sensibilité étant le paramètre étudié aucun anti-douleur ne peut être utilisé dans ce projet. Cependant, les procédures comprenant une anesthésie par inhalation (voir 5.6.1) seront précédées par l’application d'un spray d’un anesthésique local à 5%, qui sera étalé sur la zone d’injection ou de chirurgie. D’autre part, des tests de toxicologie in vitro sont systématiquement réalisés sur nos composés avant tout test sur l’animal pour garantir la sûreté de nos produits. Aucun des composés déjà testés n’ont montré de problème de toxicologie, ni l’apparition d’effets secondaires sur l’animal. De ce fait, la douleur induite par nos différents modèles sera la seule nuisance pour les animaux. En cas de troubles comportementaux, les animaux seront euthanasiés sans délai afin de prévenir toute souffrance inutile. En cas de lésions dues à des attaques entre les animaux, ceux-ci seront séparés et/ou le milieu enrichi par ajout d’igloo. Si les attaques continuent et/ou les lésions sont trop importantes ou douloureuses pour l’animal, celui-ci sera euthanasié sans délai.
Devenir
La douleur chronique étant étudiée, et donc induite, chez ces animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement la mise à mort afin de ne pas prolonger inutilement la douleur. Aucun placement ou mise en liberté n’est donc prévu pour ce projet.
Remplacement
A ce jour, il n'y a pas de modèles non animaux permettant d'étudier les mécanismes du système nerveux impliqués dans la transition entre douleur aiguë (court terme) et douleur chronique (long terme). Les effets pharmacologiques des molécules utilisées sur la chronicisation douloureuse, l'analgésie et l'état émotionnel, doivent être évalués au travers de systèmes intégrés par différents tests comportementaux, qui viennent appuyer et confirmer les données obtenues par des approches cellulaires. Il est donc indispensable d'avoir recours à des investigations sur l'animal afin de proposer des alternatives thérapeutiques pour une amélioration de la prise en charge de la douleur. La souris étant un mammifère dont la physiopathologie est proche de l'Homme, cette espèce sera utilisée dans le cadre du projet.
Réduction
Le nombre de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations précédentes réalisées. Ce nombre a été confirmé par le calcul de puissance via une analyse a priori à l’aide d’un logiciel.
Raffinement
Précédent chaque expérimentation, une habituation de minimum une semaine est réalisée au cours de laquelle les animaux sont placés dans la pièce expérimentale pendant minimum 1h et exposés aux différents tests sans application du stimulus. Cela permet aux animaux de s’habituer à l’environnement et à l'expérimentateur limitant ainsi l’impact du stress (angoisse) lié à la procédure expérimentale. Ces périodes d’habituation sont fondamentales afin d’assurer une reproductibilité des tests et donc de limiter l’hétérogénéité des animaux, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, afin de limiter la douleur chez les animaux, toute expérience est limitée dans le temps (maximum 1 mois après la lésion). Un animal partage sa cage avec les autres animaux de la même portée ; ils bénéficient également d'un enrichissement du milieu de leur cage (copeaux, igloos en plastique, bâtonnets de cellulose). Un suivi hebdomadaire de l’animal sera mis en place où seront relevés : le poids de l’animal, l’aspect de son pelage, ses comportements ainsi que sa vitesse de respiration. Ces paramètres pourront nous indiquer les potentiels soins à apporter aux animaux.
Choix des espèces
La souris étant un mammifère dont la physiopathologie est proche de l'Homme, cette espèce sera utilisée dans le cadre du projet. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 6 et 12 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement.
Création d’une lignée zebrafish mutante pour un gène impliqué dans la reproduction des femelles
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Créer une lignée de poissons zèbres mutants pour un gène de la reproduction, tel est l'objet de ce projet qui utilise 1 050 poissons zèbres dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le génotypage passe par la section d'un fragment de nageoire sous anesthésie, et les femelles peuvent voir leurs pontes se bloquer, ce qui conduit alors à leur mise à mort. Après deux générations, les animaux sont tués pour l'analyse de leurs ovaires, et 100 poissons hétérozygotes sont réutilisés pour maintenir la lignée. Le projet vise à vérifier si l'effet d'un microARN sur la reproduction, déjà observé chez le médaka, se retrouve chez le poisson zèbre.
Objectifs
Les microARN sont de petits régulateurs qui contrôlent l’expression de certains gènes seulement. Comme ils sont très conservés au cours de l’évolution, on pense que leurs gènes cibles le sont aussi. Dans l’ovaire, un microARN est fortement et spécifiquement exprimé. Quand on l’inactive chez la femelle médaka et la femelle zebrafish, on observe le même type de défaut de reproduction : moins d’œufs produits et moins bien fécondés. Chez le médaka, un des gènes responsables de la baisse du nombre d’œufs a déjà été identifié comme cible de ce microARN. Le projet consiste à supprimer, chez le zebrafish, uniquement le site de fixation de ce microARN sur ce gène, pour empêcher leur interaction. Si les femelles mutantes pondent elles aussi moins d’œufs, cela montrera que la cible du microARN est conservée au cours de l’évolution. En parallèle, des analyses d’histologie et de biologie moléculaire permettront de décrire plus finement les conséquences de cette mutation sur la reproduction.
Bénéfices attendus
Les microARN sont très bien conservés au cours de l'évolution, et on considère généralement que leurs cibles le sont aussi. Pourtant, aucun modèle expérimental n'a encore démontré cette conservation évolutive des cibles de microARN, ni celle des phénotypes associés à leur régulation. Notre microARN d'intérêt ayant un impact similaire sur les phénotypes reproducteurs chez le médaka et le zebrafish, démontrer une conservation évolutive de ces phénotypes et de leurs gènes cibles chez le zebrafish pourrait ouvrir de nouvelles voies pour étudier les défauts de fertilité humaine.
Procédures
Ce projet concerne la création d'une lignées mutante. Pour l'établissement de cette lignée, une procédure de génotypage (section d'un fragment de nageoire caudale) sera réalisée sur les animaux. Cette procédure est très rapide: moins de 2 minutes/animal, temps de l'anesthésie et de la récupération à l'anesthésie du poisson compris. La récolte des oeufs est faite dans l'aquarium, une fois qu'ils sont tombés dans le fond après que le mâle a fécondé les oeufs expulsés par la femelle (il n'y a donc pas manipulation directement sur l'animal pour cette récolte).
Impact sur les animaux
Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système reproducteur, car nos gènes d’intérêts sont principalement exprimés dans les gamètes. Le gène sera modifié pour empêcher la fixation de son inhibiteur dessus et donc empêcher sa régulation. Nous nous attendons principalement à une réduction du nombre d’œufs pondus. Cependant, chez le médaka, il peut arriver un blocage des pontes lorsque les poissons sont mis en couple (arrêt des pontes par la femelle), caractérisé par une absence d’œufs dans le bassin et un gonflement anormal du ventre de la femelle. Si cet événement venait à se produire chez le zébrafish, un autre male serait d’abord ajouté en première instance, afin de stimuler la femelle. Et si cela ne débloque pas la femelle, et que des modifications de la nage ou de comportement alimentaire venant à apparaitre, une euthanasie sera effectuée. Le génotypage est invasif (prélèvement d'un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l'anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction temporaire de l'activité de nage. Les anesthésies pratiquées pour les prélèvements (fragment de nageoire) peuvent entrainer une modification du comportement alimentaire dans la journée.
Devenir
Ce projet vise à étudier le fonctionnement des capacités de reproduction après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes. De cette même génération 100 poissons hétérozygotes (c’est-à-dire présentant une version du gène altéré et une « normale ») seront réutilisés afin de faire un maintien de la lignée (procédure faisant l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet à venir ensuite).
Remplacement
L’objet du projet est d’étudier le rôle précis de l’interaction entre miR‑202 et le gène tead3b sur la fonction ovarienne et les phénotypes de reproduction. À ce jour, aucune méthode ne permet de reproduire fidèlement la complexité de la régulation génique et des interactions cellule–cellule sans recourir à l’animal entier. Le poisson‑zèbre a été choisi car il s’agit d’un modèle vertébré bien établi en biologie du développement et de la reproduction, présentant un système de reproduction fonctionnel, une proximité avec le modèle médaka déjà étudié pour miR‑202, et des outils génétiques disponibles et maîtrisés.
Réduction
In fine, il s’agit de réaliser des prélèvements post-mortem sur 6x4 individus mutants (animaux homozygotes pour la mutation obtenus en F2) et 6x4 individus de génotype sauvage (WT), soit 48 animaux de 2 génotypes différents. Par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus F0 porteurs de mutations intéressantes. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygote en F1 lorsque les F0 sont croisés avec des animaux WT. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes (+/-) de la génération F1 produira une génération F2 homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif de la génération F2). Nous produirons donc le nombre d’individus strictement nécessaires assurant la réalisation de l’analyse de l’ovaire des 48 animaux.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums de 10 litres avec la densité de 30 animaux maximum/aquarium. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à la mutation) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier).
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est particulièrement pertinent pour ce projet car il appartient à la même famille phylogénétique que le médaka, un téléostéen, permettant de tester directement la conservation évolutive de l'interaction entre gène/inhibiteur d’expression et des phénotypes reproducteurs associés. Il présente un système reproducteur bien caractérisé avec des phénotypes de fertilité facilement mesurables (nombre d'œufs pondus, taux de fécondation, dynamique folliculaire). Les outils d'édition génomique y sont parfaitement maîtrisés et efficaces, il présente un fort taux de fécondité (200-300 œufs par ponte) et un développement rapide (maturité sexuelle à 3 mois), permettant une production rapide de lignées mutantes. Son ovaire est accessible à l'analyse histologique et transcriptomique Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (3 mois âge de maturité et 6 mois), l’analyse moléculaire, transcriptomique et histologique des ovaires permettant une étude a deux stades de maturité de développement de l’organe.
Etude du rôle fonctionnel de molécules de signalisation impliquées au cours de la formation et de la maintenance de la jonction neuromusculaire de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Opérées pour une dénervation musculaire, parfois alors qu'elles sont gestantes, 1 048 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour l'analyse de leurs tissus. Les animaux subissent des injections, des chirurgies sous anesthésie, des tests comportementaux d'une heure, un électromyogramme et une mesure de force, la chirurgie pouvant provoquer douleurs, infection et boiterie. Le projet étudie la jonction entre le nerf et le muscle, en vue de comprendre des maladies neuromusculaires rares comme les syndromes myasthéniques congénitaux. Le porteur décrit ces syndromes comme touchant une personne sur 250 000, situant le bénéfice attendu à distance de l'atteinte infligée.
Objectifs
La jonction neuromusculaire (JNM) est la zone de contact entre les neurones moteurs et les muscles striés squelettiques qu'ils innervent. Cette synapse est responsable de l'initiation et du contrôle du mouvement. Le dysfonctionnement de cette synapse entraîne un défaut de la transmission nerf muscle, avec des conséquences dramatiques sur notre capacité à contracter nos muscles, à nous mouvoir ou tout simplement à respirer. Décrypter comment la JNM acquiert sa morphologie complexe et régule sa communication nerf/muscle au cours du développement embryonnaire et tout au long de la vie est essentiel pour comprendre comment le système nerveux fournit le lien entre les pensées et les actions, en relayant des messages qui voyagent si vite que nous ne les remarquons même pas. Compte tenu de la complexité de ces connexions spécifiques, même des défauts subtils dans les événements moléculaires entraînant l'attachement nerf muscle sont à la base d'un large éventail de troubles neurodéveloppementaux affectant en particulier le système neuromusculaire. Par conséquent, l'étude des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la formation et la maintenance de la JNM est essentielle pour comprendre les mécanismes impliqués et restaurer une connectivité synaptique appropriée dans les pathologies de la JNM.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet vont de l’élucidation, in vivo, des mécanismes moléculaires physiopathologiques qui sous-tendent la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM) chez les mammifères, jusqu’à la création d’une base solide pour le développement d’essais cliniques chez des patients atteints de certaines pathologies neuromusculaires comme par exemple les syndromes myasthéniques congénitaux (SMC). Les SMC sont des maladies rares (1 personne sur 250 000) causées par la mutation d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire.
Procédures
Au cours du projet, une partie des animaux recevront des injections non répétées apres anesthésie (générale et locale) et analgésie. Des femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale anesthésie et analgésie (générale et locale) suivie d'une injection non répétée pour une durée de 10 minutes par animal. L'ensemble des animaux du projet effectueront tests comportementaux totalisant une durée d'une heure de tests par animal. De plus, un électromyogramme unique d'une durée de 10 minutes sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés. Enfin l'ensemble des animaux du projet subiront un test de mesure de force (10 minutes) apres anesthésie et analgésie de l'animal et sera ensuite euthanasié. Une autre parti des animaux subira une procédure chirurgicale apres anesthésie et analgésie (générale et locale) d'une durée de 20 minutes maximum par animal. A la fin de le période de maintien, les animaux seront euthanasiés pour des prévelement tissulaires suivis d'analyses cellulaires et moléculaires.
Impact sur les animaux
Les expérimentations réalisées sur les animaux nécessitent leur manipulation (injections, tests comportementaux), ce qui engendre un stress de courte durée pour l’animal. Les injections et éléctromyogrammes peuvent induire une douleur locale également de courte durée. Les différentes anesthésies réalisées peuvent entraîner une baisse de la thermorégulation et, dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire. La chirurgie visant une dénervation musculaire peut engendrer des douleurs, des risques d’infection postopératoire ainsi qu’une boiterie.
Devenir
L'euthanasie est, dans ce projet, strictement nécessaire pour l'analyse phénotypique au niveau cellulaire et moléculaire des animaux impliqués et est réalisée selon des méthodes réglementaires.
Remplacement
L'étude de la formation et de la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM) est un processus complexe incluant pléthore d'acteurs cellulaires et moléculaires ne pouvant pas être modélisés in vitro. La qualité de la mise en place de la jonction neuromusculaire et de sa maintenance a des conséquences physiologiques qui nécessitent l’analyse de paramètres physiques, moteurs, propres aux animaux vivants. Cependant, une partie des études in vivo est complétée par des méthodes de (co-)culture cellulaire cherchant à mimer le développement de la JNM dans le but d'évaluer le rôle d'acteurs moléculaires sur celui-ci.
Réduction
Au total, 1048 animaux sont impliqués. Ce nombre est calculé et strictement limité afin d'avoir une puissance statistique suffisante permettant de montrer la significativité d'une différence lorsque celle-ci existe et d'obtenir des résultats fiables. Le calcul de puissance est réalisé avec un logiciel statistique dédié à cet effet. Par ailleurs, diverses cultures et co-cultures cellulaires sont mises en œuvre afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel étant limité au maximum) en portoirs ventilés, avec un système d’abreuvement automatique et un accès ilimité à la nourriture et à l’eau. Le milieu est enrichi avec au moins deux enrichissements, et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été conçu de manière à permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les études comportementales reposent sur les comportements spontanés propres aux animaux. L’évaluation motrice est réalisée après différentes phases d’habituation (à l’expérimentateur et aux tests), permettant de minimiser le stress associé aux manipulations répétées. La majorité des actes techniques sont réalisés sous anesthésie et analgésie. Pour les chirurgies, une analgésie post opératoire sera également mise en place. Ainsi, la douleur et le stress sont limités grâce à des soins adaptés et une surveillance attentive, accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Le protocole mis en place est optimisé pour respecter le bien-être des animaux et pour réduire la durée de l’expérimentation au minimum.
Choix des espèces
Le développement des techniques d’imagerie et de transgénèse chez la souris rend cet animal le plus adapté à l’identification et à l’étude de nouvelles molécules impliquées dans la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM). Les animaux sont des souris agées de 20 à 180 jours pour les études comportementales et l’analyse des étapes de maintenance de la JNM.
Effet du rôle de certains globules blancs sur la résistance aux immunothérapies dans des modèles murins de cancer du sein.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une greffe de cellules de cancer du sein, une injection destinée à provoquer des métastases pulmonaires pouvant gêner la respiration, et jusqu'à quarante-deux administrations de traitements. Le projet teste l'association de deux médicaments déjà autorisés en clinique, dans l'espoir d'améliorer la réponse aux immunothérapies. Toutes sont mises à mort pour prélever poumons et tumeurs, le porteur qualifiant cette mise à mort de garantie contre "toute souffrance inutile".
Objectifs
Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement du cancer du sein, une maladie qui peut évoluer vers des formes agressives et entraîner la formation de métastases, notamment dans les poumons. Nos travaux préliminaires suggèrent que la combinaison de deux types de traitements déjà utilisés en clinique – l’un stimulant les défenses naturelles de l’organisme et l’autre aidant le système immunitaire à mieux reconnaître et attaquer les cellules cancéreuses – pourrait améliorer la capacité de l’organisme à lutter contre la tumeur. L’objectif de ce projet est de confirmer l’efficacité de cette combinaison de traitements dans des modèles expérimentaux de cancer du sein et d’évaluer son impact sur la progression de la maladie et le développement des métastases pulmonaires. L’un des avantages de cette approche est qu’elle repose sur des médicaments déjà approuvés pour une utilisation clinique. Leur repositionnement pourrait permettre d’accélérer le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et d’ouvrir la voie à des traitements plus efficaces pour les patientes atteintes de cancer du sein, notamment dans les formes associées à un risque élevé de récidive ou de métastases.
Bénéfices attendus
Si ce projet aboutit, il pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement du cancer du sein, en particulier dans les formes résistantes aux immunothérapies actuelles. En ciblant les mécanismes de résistance associés au microenvironnement tumoral et au système immunitaire, cette approche pourrait améliorer l’efficacité des traitements et limiter le développement des métastases pulmonaires. Les résultats de ce projet pourraient conduire au développement de stratégies thérapeutiques innovantes combinant les immunothérapies anti-PD-1 avec le G-CSF, dans le but de renforcer la réponse immunitaire anti-tumorale. Par ailleurs, ce travail contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la résistance aux traitements, ce qui pourrait bénéficier à la recherche sur d’autres types de cancers et à la réduction du risque de récidive.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : • Injection de cellules tumorales pour induire le développement de la tumeur primaire : 1 intervention par animal – durée environ 4 minutes. • Injection de cellules tumorales pour induire le développement de métastases pulmonaires : 1 intervention par animal – durée environ 1 minute. • Administration de traitements expérimentaux : entre 14 et 42 interventions par animal selon les groupes expérimentaux – durée environ 20 secondes par intervention. • Mesure du poids corporel : environ 3 interventions par animal – durée environ 15 secondes par intervention. • Mesure de la taille des tumeurs primaires : environ 3 interventions par animal – durée environ 30 secondes par intervention.
Impact sur les animaux
Les interventions peuvent entraîner les effets indésirables suivants : • Contention de l’animal suivie d’une injection avec une seringue, pouvant provoquer un stress léger et une douleur légère de courte durée. • Injection de cellules tumorales pour induire la formation d’une tumeur, pouvant entraîner une gêne locale légère à modérée pendant la durée de développement de la tumeur. • Développement de tumeurs pulmonaires, pouvant provoquer dans certains cas une difficulté respiratoire modérée et une diminution de l’activité, apparaissant progressivement au cours de l’expérience. • Croissance de la tumeur primaire, pouvant entraîner une gêne locale modérée et une limitation des déplacements pendant la durée de l’expérience. • Manipulation des animaux pour les mesures expérimentales, pouvant provoquer un stress léger et transitoire.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tumeurs et l’analyse post mortem des échantillons. Les poumons, ainsi que le sang, seront prélevés pour des analyses histologiques et biochimiques afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Les critères d’analyse incluront : 1. Le nombre et le volume des tumeurs et métastases pour évaluer l’invasion tumorale. 2. La présence de cellules immunitaires dans les lésions tumorales, afin de confirmer leur implication dans la réponse aux immunothérapies anti-PD-1. 3. La fibrose tumorale, qui correspond à l'épaississement et au durcissement des tissus autour de la tumeur, pour comprendre comment ces transformations du tissu peuvent favoriser la résistance aux immunothérapies anti-PD-1. Ces analyses permettront de valider ou d’infirmer les hypothèses du projet, notamment en ce qui concerne l’efficacité des inhibiteurs et anticorps testés pour améliorer l’efficacité des immunothérapies anti-PD-1. En résumé, la mise à mort des animaux est essentielle pour atteindre les objectifs expérimentaux, tout en garantissant que les animaux ne subissent aucune souffrance inutile à l’issue de la procédure.
Remplacement
Avant d’avoir recours à l’expérimentation animale, nous avons utilisé des modèles expérimentaux en laboratoire ne nécessitant pas d’animaux afin d’étudier les interactions entre cellules tumorales et cellules du système immunitaire. Ces approches ont permis d’identifier certains mécanismes impliqués dans la progression des tumeurs. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions biologiques présentes dans un organisme vivant, notamment les interactions entre les cellules tumorales, les cellules immunitaires et les tissus environnants. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour étudier ces phénomènes dans un contexte physiologique complet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé à l’aide de calculs statistiques permettant d’identifier l’effectif minimal nécessaire pour obtenir des résultats fiables et interprétables. Ces estimations reposent sur des données scientifiques déjà publiées et sur nos travaux préliminaires. Plusieurs stratégies ont été mises en place afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, notamment l’optimisation du plan expérimental et la comparaison de plusieurs conditions expérimentales au sein d’une même étude. Ces approches permettent d’obtenir des résultats robustes tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Plusieurs mesures sont mises en place afin de réduire la douleur, la souffrance et le stress des animaux pendant toute la durée de l’étude. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages enrichies comportant du matériel de nidification et des abris permettant l’expression de comportements naturels. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, dans un environnement calme afin de limiter le stress. Les injections sont réalisées à l’aide d’aiguilles fines et par des techniques d’injection sous-cutanées, reconnues comme moins invasives. Lors des injections intraveineuses, les animaux sont placés sur un tapis chauffant afin de faciliter la vasodilatation et de réduire l’inconfort. Une surveillance clinique régulière est réalisée à l’aide d’une fiche de suivi permettant d’évaluer différents paramètres tels que l’état général, le comportement, le poids et les signes éventuels de douleur ou de détresse. Si des signes de douleur sont observés, un traitement analgésique peut être administré. Lorsque les critères prédéfinis indiquant une altération importante du bien-être sont atteints, l’animal est retiré de l’étude et euthanasié conformément aux méthodes réglementaires, afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle du système immunitaire dans la progression du cancer du sein et dans la réponse aux traitements. Pour cela, le modèle de la souris est particulièrement adapté, car il présente de nombreuses similitudes génétiques et physiologiques avec l’être humain, notamment en ce qui concerne le fonctionnement du système immunitaire. L’utilisation d’un modèle animal permet d’étudier, dans un organisme entier, les interactions complexes entre les cellules cancéreuses, les cellules du système immunitaire et les tissus environnants. Ces interactions ne peuvent pas être reproduites de manière complète dans des modèles expérimentaux réalisés uniquement en laboratoire. Dans ce projet, des souris adultes âgées de 7 à 9 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux ont atteint une maturité physiologique comparable à celle d’un adulte, ce qui permet d’étudier le développement de la tumeur et la réponse du système immunitaire dans des conditions proches de celles observées chez l’adulte. L’utilisation d’animaux adultes permet également d’éviter les variations biologiques importantes observées chez les animaux plus jeunes ou plus âgés, et garantit ainsi une meilleure reproductibilité des résultats expérimentaux. Ce modèle permet donc d’étudier de manière fiable la progression de la maladie et l’efficacité potentielle de nouvelles stratégies thérapeutiques, dans des conditions proches de celles rencontrées chez les patients.
Asthme allergique dans le modèle souris : Etude des mécanismes d’activation et évaluation de molécules à visée thérapeutique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
13 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certains animaux recevant jusqu'à cinquante administrations d'allergène ou de composés. Les produits sont instillés dans le nez ou la trachée pour déclencher un asthme allergique, avec inflammation des voies respiratoires, gêne à respirer et perte de poids. Toutes sont mises à mort pour analyser leurs poumons et leur réponse immunitaire. Le porteur situe l'effectif à dix animaux par groupe et rappelle que le précédent projet a donné lieu à quatre publications, la finalité restant l'accumulation de données sur les mécanismes de la maladie.
Objectifs
Ce projet est la suite d’un précédent projet qui vise à étudier les mécanismes qui participent à la mise en place de la réponse immunitaire pulmonaire en réponse à des allergènes et causant l'asthme allergique sur des modèles murins. L’objectif est d’étudier le rôle des acteurs immunologiques qui participent à la réponse inflammatoire pulmonaire suite à une exposition à un allergène et qui peuvent conduire au développement de pathologies irréversibles comme l'asthme allergique et la difficulté respiratoire et de tester des composés à visée thérapeutique. L'asthme allergique est une maladie complexe caractérisée par une inflammation des voies respiratoires, une obstruction variable du flux d'air et une hyperréactivité bronchique, souvent influencée par des facteurs génétiques, environnementaux et immunologiques. Il se manifeste à travers des crises durant lesquelles il existe une gêne respiratoire (dyspnée) et des sifflements liés à une inflammation chronique associée à des perturbations locales du tissu respiratoire. Selon l’OMS, d’ici 2050, une personne sur deux dans le monde sera allergique, contre trois sur dix aujourd’hui. L’asthme allergique touche environ 300 millions d’individus dans le monde dont 4 millions de personnes en France et est associé à plus de 60 000 hospitalisations et près de 900 décès par an. A ce jour, aucun médicament ne permet d’en guérir d’où la nécessité de continuer à étudier les mécanismes moléculaires impliqués. L’objectif est d’étudier le rôle des cellules, cytokines, récepteurs ou voies de signalisation impliqués dans la réponse immunitaire de l'hôte afin de participer à l’amélioration de nos connaissances et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans un second temps, une fois que des cibles thérapeutiques auront été identifiées, nous testerons ces composés à visée thérapeutique pour voir l’évolution sur la pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans la continuité d’un précédent projet autorisé dont les résultats ont donné lieu à 4 publications scientifiques. Nous avons pu montrer l’implication de certaines voies de signalisation dans la réponse inflammatoire pulmonaire suite à l’exposition aux allergènes. Nous avons également pu montrer le rôle des voies d’activation des récepteurs d’acides nucléiques cGAS-STING suggérant une nouvelle approche pour identifier des cibles thérapeutiques. L’utilisation des souris déficientes en certains gènes a permis de valider la contribution des gènes correspondants et donc des voies de signalisation ou cytokines impliquées dans ces mécanismes pathologiques. Nous poursuivons nos investigations pour tester l’implication de ces voies en utilisant des agonistes et inhibiteurs de ces voies de signalisation et des voies annexes qui ont pu être identifiées grâce à nos travaux. Une fois validées, ces molécules représentent des cibles thérapeutiques potentielles dont la pertinence sera vérifiée par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques. Ces travaux feront l’objet de publications scientifiques.
Procédures
Un prélèvement sanguin unique sous anesthésie gazeuse sur tous les animaux utilisés dans la partie A et B du projet pourra être effectué. Les administrations d’allergène se feront par voie intranasale, intratrachéale, sous anesthésie ou par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale. 3 administrations maximales/semaine espacées de 24 h pour les procédures 4 à 6 auront lieu. Les administrations de « candidat médicament » pourront se faire par voie intranasale/intratrachéale, intrapéritonéale, sous-cutanée, sublinguale ou intragastrique. Le traitement pourra commencer jusqu’à 1 semaine avant l’administration d'allergènes ou au moins 1h après induction et se prolonger pendant toute la durée de l’expérience pour assurer un effet optimal. A noter que certains traitements (notamment ceux administrés par voie intragastrique) pourront être réalisés 2x par jour durant toute la période d’expérimentation, soit au maximum 50 administrations par animal. Les administrations sont de courte durée maximum 2min/souris.
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires chez l'animal liées au développement de la pathologie. La douleur pourra générer une perte de poids. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqûre de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et du stress. Pour les traitements en intragastrique, aucune douleur n'est attendue mis à part un léger stress (quelques secondes) lié à la contention des animaux. Les effets secondaires liés aux molécules à visée thérapeutique ne sont pas attendus. Certaines lignées utilisées sont immunodéficientes, cependant, les phénotypes ne s’expriment pas dans nos conditions d’élevage en portoir ventilé.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques nécessaires à l'évaluation des mécanismes de l'asthme allergique et l’analyse de l’effet des différentes molécules et thérapies testées.
Remplacement
Nous menons des études in vitro sur des cellules épithéliales et immunitaires murines qui nous permettent d’évaluer la toxicité des molécules utilisées. Nous évaluons l’efficacité potentielle de ces molécules en mesurant la sécrétion de molécules de l’inflammation (cytokine pro-inflammatoire par exemple). Bien que nous conduisons en parallèle ces études in vitro, l’inflammation et l’asthme allergique sont des pathologies globales qui ne peuvent être étudiées de façon complète que sur des animaux entiers avec leur physiologie et les différents échanges inter-organes. Le modèle animal reste indispensable afin d’examiner la réponse de l’organisme dans son ensemble. Aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et les inter-relations entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses immunitaires innées et acquises. C’est le seul moyen d’analyser les interactions entre les différents types cellulaires au niveau du poumon et d’examiner la pathologie au niveau histologique, aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, sur les paramètres étudiés. Il ressort ainsi que 10 animaux maximum /groupe seront nécessaires. Ce nombre d'animaux par groupe permet de réduire la répétition des expériences car les résultats sont moins variables. Nous optimisons chaque expérience en termes de prélèvements effectués et de paramètres mesurés.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré et des croquettes humides seront ajoutés dans les cages. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Dans le cas d'une analyse de la capacité pulmonaire, la pléthysmographie sera effectuée sous anesthésie générale avec administration d'un analgésique et anesthésique local. La température corporelle sera maintenue constante entre 37 et 38°C par un tapis chauffant.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie scientifiquement : -La souris est un mammifère qui présente une architecture anatomique et fonctionnelle comparable à l’espèce humaine. -La souris est l’un des seuls modèles de mammifères permettant de telles modifications génétiques de précision cellulaire. -La souris reste l’animal modèle de référence dans la communauté scientifique pour étudier expérimentalement les mécanismes immunitaires pulmonaires. En particulier, des modèles de maladies pulmonaires chez la souris ont été développés dans différents laboratoires dont le nôtre depuis plusieurs années, ce qui nous permet de maitriser ces modèles.
Identification des mécanismes d’action du phosphate sur les calcifications vasculaires dans un modèle de maladie rénale chronique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
116 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour un prélèvement terminal des organes. Placées sous un régime très enrichi en phosphore pendant cinq à dix jours, elles peuvent perdre 10 à 20 % de leur poids, une perte de 20 % déclenchant la mise à mort. Le projet vise à comprendre comment le phosphate provoque des calcifications des artères chez les personnes en insuffisance rénale chronique. Le porteur justifie le recours à l'animal entier par le caractère systémique de la maladie et fonde l'effectif sur son expérience passée plutôt que sur un calcul statistique.
Objectifs
Un taux élevé de phosphate (Pi) sérique est associé au développement de calcifications vasculaires (CV) chez les personnes atteintes de maladie rénale chronique (MRC). En effet, la MRC aboutit à une augmentation de la concentration de Pi qui déclenche la calcification de la paroi artérielle, ce qui entraîne une rigidification du système artériel et contribue au développement des maladies cardiovasculaires. Bien que le rôle des niveaux élevés de Pi dans le développement des CV soit largement reconnu, son mode d'action est encore inconnu et ne peut donc pas être ciblé de manière appropriée. L'objectif de ce projet est de découvrir les mécanismes d'action du Pi qui entraînent le développement des CV dans le contexte de la MRC, et d'identifier des cibles thérapeutiques capables de contrecarrer ses effets délétères. Pour comprendre le rôle du Pi dans les CV, nous travaillons sur une protéine dont le rôle est de transporter le Pi et de ressentir les variations de concentration extracellulaire de Pi. Notre objectif est d’évaluer les effets de la diminution d’expression de cette protéine, dans l’apparition des CV en contexte de maladie rénale. Pour cela, nous utiliserons un modèle de maladie rénale chez la souris. Pour la réalisation de ce projet, 116 souris au maximum seront utilisées.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’action du phosphate dans l’apparition des calcifications vasculaires pourra servir à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
micro-prélèvements sanguins (au maximum 2 fois) - mise sous régime très enrichi en phosphore (pendant 5 ou 10 jours)
Impact sur les animaux
Les micro-prélèvements sanguins peuvent générer un stress et une douleur de classe légère. Le régime très enrichi en phosphore peut ne pas être bien toléré par les animaux, pouvant parfois aboutir à une perte de poids d’environ 10-20%.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour prélèvement terminal pour des analyses sur organes d’intérêt.
Remplacement
S’agissant d’une maladie systémique (insuffisance rénale), l’expérimentation sur animal entier est indispensable pour évaluer le rôle des différents organes impliqués dans cette pathologie
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire pour cette étude (116 souris) a été calculé sur la base de notre expérience antérieure, nos discussions avec d’autres laboratoires utilisant ce modèle et sur la littérature. Nous allons commencer le projet par une expérience pilote en vérifiant l’apparition des calcifications vasculaires et en apportant des améliorations si nécessaire.
Raffinement
Un suivi quotidien du poids des souris sera effectué. Points limites définis : 1) 10% perte de poids, 2) Perte de poids supérieure à 20% du poids initial ; 3) Posture de prostration. Pendant le suivi quotidien du poids de la souris, si une baisse de 10% du poids initial est observé (#1), les animaux seront suivis attentivement pendant 24h supplémentaires puis transférés sur un régime alimentaire standard. Si leur état ne s’améliore pas et en cas d’atteinte des points limites (#2, 3), les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Nous nous intéressons au rôle d'une protéine transporteur de phosphate dans l’apparition des calcifications vasculaires en contexte de maladie rénale. L’utilisation de la souris génétiquement modifiée permet d’identifier le rôle de cette protéine dans un organisme entier. Les animaux seront des adultes âgés de 12-20 semaines.
Rôle des protéines de la polarité planaire dans la plasticité du segment initial de l’axone
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les moustaches coupées d'un seul côté sous anesthésie, 180 souris subissent une privation sensorielle d'au plus dix-huit heures, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Douze heures après la coupe, une partie passe zéro, trois ou six heures dans une cage remplie d'objets, puis toutes sont mises à mort et leur cerveau prélevé. Le projet cherche à décrire le rôle d'une protéine, PK2, dans la plasticité d'un segment du neurone. Chaque animal sert de son propre témoin, la coupe étant unilatérale, ce qui limite le nombre d'individus sans changer leur devenir.
Objectifs
Le projet a pour objectif de mieux comprendre le rôle de la protéine PK2 dans la plasticité du segment initial de l'axone.
Bénéfices attendus
Le projet vise à mieux comprendre le rôle de la protéine PK2 dans la mise en place de la plasticité du segment initial de l’axone (SIA). Le SIA est une structure clé du neurone, cellule la plus représentée dans le cerveau. C'est au niveau du SIA que sont initiés et régulés les signaux électriques, principal moyen de communication du cerveau avec le reste du corps. La protéine PK2 est une des protéines de la PCP (Polarité Cellulaire Planaire). Les protéines de la PCP sont bien connues pour leur rôle dans l’organisation tissulaire, mais leur implication dans l’établissement et la dynamique de la polarité neuronale reste encore peu explorée. Grâce à ce projet nous devrions mieux comprendre comment ces protéines peuvent influencer la polarisation fonctionnelle des neurones. Les défauts de polarité sont un élément commun à différents troubles neurologiques comme l’autisme, l’épilepsie ou l’autisme. Étudier cette plasticité est essentiel pour comprendre comment les neurones s’adaptent à leur environnement, comment les réseaux cérébraux maintiennent leur stabilité, et comment des dérégulations de ces mécanismes peuvent conduire à des troubles neurologiques (épilepsie, autisme, schizophrénie, etc.). Enfin, cela ouvre des perspectives thérapeutiques, en ciblant l’AIS pour moduler l’activité neuronale dans certaines pathologies.
Procédures
Les moustaches de chaque animal seront coupées sur un des côtés à l'aide d'une paire de ciseaux non traumatiques sous anesthésie générale. L'intervention durera environ 5 minutes. 12 heures après cette intervention et suivant le groupe testé l'animal sera transféré dans une cage contenant de nombreux objets (cage sur-enrichie) avec ces congénères. Le temps passé dans la cage sur-enrichie sera de 0h, 3h ou 6heures.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent subir un stress au moment de la coupe des vibrisses qui sera réalisée sous anesthésie générale. Suite à la coupe unilatérale des moustaches, les souris subiront une privation sensorielle limitée pendant au maximum 18h.
Devenir
A l'issue de l'unique procédure prévue dans ce projet, les animaux seront euthanasiés. Les cerveaux des animaux seront prélevés pour des analyses sur la morphologies et la compositions des neurones.
Remplacement
Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires allant de l’étude biochimique ou bio moléculaire au comportement. Beaucoup d’études « in-vitro » sont donc effectuées sur des cellules en culture en amont de l’utilisation de lignées d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. Le laboratoire a ainsi réalisé des études in vitro pour décrire la présence, l'organisation et l'interaction des protéines de la polarité cellulaire planaire au niveau de l'AIS. Il est important de pouvoir étudier le rôle de ces protéines dans un système intégratif utilisant des études comportementales. Pour cela l'animal est indispensable.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux, chaque animal sera son propre contrôle puisque les moustaches des animaux ne seront coupées que d'un seul côté. Nous pourrons ainsi comparer la longueur des SIA chez un même animal en condition stimulée (présence de moustaches) et en condition non stimulée (pas de moustaches). La longueur des SIA pouvant varier d'un animal à l’autre, le fait d'utiliser l'animal comme son propre contrôle permet de limiter la variabilité et donc le nombre d’animaux nécessaires pour les tests.
Raffinement
Le test utilisé pour mesurer la plasticité neuronale est peu stressant pour l'animal. La privation sensorielle par coupe des moustaches sera réalisée de façon unilatérale et sous anesthésie générale pour éviter toute blessure involontaire et limiter la contention. Durant tout le projet les animaux seront laissés avec leur congénère. Durant tout le temps de leur hébergement les animaux seront surveillés quotidiennement. La détection de signes anormaux sera immédiatement reportée aux porteurs de projet pour décider des mesures / action à mettre en place. En l'absence de réponse des porteurs, la vétérinaire désignée sera contactée et prendra les décisions permettant de limiter la souffrance des animaux en concertation avec le personnel de zootechnie.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle particulièrement pertinent pour l’étude de la plasticité du segment initial de l’axone (SIA) dans un contexte de privation sensorielle, notamment à travers la coupe des moustaches. La coupe des moustaches est réalisée sur un seul côté de l'animal. En l'absence de moustaches, une partie du cerveau n'est pas stimulée lors du comportement exploratoire de la souris. Il est ainsi possible d'étudier les différences de morphologies, de structure et de composition entre les neurones ayant été stimulés et ceux qui ne l'ont pas été. Cette différence définie la plasticité structurale et fonctionnelle des neurones. Le cerveau des rongeurs est bien cartographié, facilitant l'analyse régionale fine des effets de la privation. Ce modèle reproduit également certaines formes de plasticité sensorielle observées chez l’humain, ce qui renforce sa transférabilité vers des contextes pathologiques dans lesquels un défaut de plasticité a été identifié. Nous disposons de plus de modèles murins transgéniques chez lesquels l’expression de certains gènes de la polarité planaire a été invalidée ce qui permet de pouvoir étudier le rôle de ces protéines dans la mise en place la plasticité neuronale. La procédure sera réalisée sur des animaux d'environ 28 jours. La littérature indique qu'à cet âge la mise en place de la plasticité entraine des effets les plus marqués sur les neurones.