Recherche fondamentale

Opérées au cerveau sous anesthésie, avec une intervention pouvant atteindre deux heures, 532 souris subissent ensuite jusqu'à sept tests comportementaux, et une partie d'entre elles un stress chronique provoqué par de la corticostérone ajoutée à l'eau de boisson. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance modéré et seront tuées à l'issue, le cerveau prélevé. L'objectif déclaré est de préciser le rôle des neurones excitateurs et inhibiteurs du cortex insulaire dans l'anxiété. Le protocole installe donc un état anxieux chez des animaux dont le RNT détaille par ailleurs longuement les conditions d'hébergement.

Objectifs

L’anxiété est une réponse psychologique et physiologique anticipatrice face à une menace potentielle. À un niveau modéré, elle est adaptative : elle augmente la vigilance et facilite l’évitement du danger. Les troubles anxieux apparaissent lorsque cette réponse devient durablement excessive et se maintient en l’absence de menace identifiable. Malgré l’existence de traitements (antidépresseurs, benzodiazépines), une proportion importante de patients présente une efficacité limitée et/ou des effets indésirables qui altèrent le fonctionnement quotidien (somnolence, troubles de l’attention, baisse de la vigilance, confusion…). Cette situation représente un enjeu majeur de santé publique et un fardeau socio-économique considérable. Progresser vers de nouvelles stratégies thérapeutiques nécessite donc de mieux comprendre les mécanismes cérébraux qui sous-tendent l’anxiété. Parmi les régions impliquées, le cortex insulaire (insula) occupe une place centrale. Des méta-analyses d’études d’imagerie fonctionnelle chez des patients souffrant de troubles anxieux rapportent des altérations de l’activité de l’insula par rapport à des témoins sains, suggérant que cette région constitue un nœud important des circuits de l’anxiété. Des travaux précliniques montrent également que les neurones excitateurs de l’insula antérieure augmentent leur activité dans des contextes anxiogènes, et que réduire l’activité de cette région diminue les comportements de type anxieux. En revanche, la contribution des neurones inhibiteurs de l'insula reste beaucoup moins caractérisée, il est donc essentiel de déterminer comment l’équilibre entre transmission excitatrice et inhibitrice, au niveau des neurones et des synapses, façonne les circuits qui soutiennent l’anxiété physiologique et pathologique. Ce projet vise à préciser le rôle relatif des composantes excitatrice et inhibitrice de l’insula antérieure dans les comportements liés à l’anxiété, en répondant à deux questions principales : (1) quel est le profil d’activité des neurones inhibiteurs de l’aIC dans des situations anxiogènes ? (2) une modulation sélective de la transmission excitatrice ou inhibitrice peut-elle réduire les comportements anxieux ?

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont multiples : (i) approfondir la compréhension des mécanismes de transmission neuronale impliqués dans l’anxiété ; (ii) ouvrir la voie à l’identification de stratégies visant à restaurer les altérations observées chez les patients atteints de troubles anxieux ; et (iii) favoriser des avancées méthodologiques et techniques en recherche neurobiologique.

Procédures

A l’âge adulte (semaine 9), tous les animaux subiront une chirurgie cérébrale d’un maximum de 2h suivie d’une période de 4 semaines de récupération. La totalité des animaux seront ensuite soumis à une batterie de tests comportementaux (7 au maximum d’une durée comprise entre 10 et 30 minutes) étalés sur 2 semaines à raison d’un test par jour.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues sont les suivantes : peur ou stress liés aux manipulations et aux tests comportementaux. Les contacts avec l’expérimentateur, les changements d’environnement et l’exposition à des tests standards peuvent provoquer une anxiété passagère. Les protocoles de stress chronique (corticostérone dans l’eau de boisson) peuvent altérer temporairement l’état général, avec notamment une perte de poids, une baisse d’activité, une diminution de la prise alimentaire ou un aspect du pelage moins soigné. Les interventions chirurgicales cérébrales, réalisées sous anesthésie générale, peuvent entraîner un ralentissement transitoire au réveil, ainsi qu’une douleur postopératoire, une inflammation locale, un risque d’infection, une perte de l’implant, des lésions liées au grattage au niveau de la tête et une gêne due au relief de l’implant. Enfin, les outils utilisés pour moduler l’activité des neurones peuvent induire des changements transitoires du comportement, en lien avec les effets attendus de la manipulation expérimentale.

Devenir

A l’issu du projet, les souris seront euthanasiées pour prélèvement du cerveau.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connectivité des neurones et de leurs propriétés de codage d’informations au cours de comportements complexes. Par conséquent, cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. Des méthodes telles que la culture cellulaire ne permettent pas la quantification des connexions neuronales ou de la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle in vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous adopterons une approche statistique rigoureuse permettant d'obtenir des résultats fiables avec un minimum d'animaux. Le nombre d'animaux nécessaires a été soigneusement calculé pour garantir la robustesse des résultats tout en limitant leur utilisation. Nous utiliserons également des techniques avancées de neurosciences computationnelles pour maximiser les données comportementales extraites de nos souris. Des logiciels utilisant l’intelligence artificielle seront employés pour analyser ces comportements et constituer une base de données détaillée. Ces méthodes permettent de tirer le maximum d'informations de chaque animal tout en minimisant leur nombre.

Raffinement

Pour réduire la souffrance imposée par le protocole et améliorer le bien-être des animaux, les mesures suivantes seront appliquées : Les animaux seront hébergés en cages collectives, regroupés par fratrie pour éviter l’isolement social. Les cages seront enrichies avec du matériel de nidification pour améliorer leur confort. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée par le personnel animalier, y compris les week-ends et jours fériés. Avant le début de l’expérience, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par l’expérimentateur, qui passera ensuite à une surveillance quotidienne pendant toute la durée de l’expérience. Les observations incluront la vérification de la prise alimentaire, le poids, le comportement, la vivacité et l’état du pelage. Pour prévenir la douleur après chirurgie, un médicament antidouleur sera administré. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. La température corporelle de l’animal sera contrôlée et maintenue, et un gel sera appliqué sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Après la chirurgie, une petite quantité de solution stérile sera administrée pour éviter la déshydratation, et de la nourriture humidifiée sera mise à disposition au sol de la cage. L’état de l’animal et la bonne cicatrisation de l’incision au niveau de la tête seront contrôlés quotidiennement pendant la semaine suivant la chirurgie. En cas de signes d’infection (rougeur, gonflement, écoulements, saignement), la plaie sera nettoyée et désinfectée avec un antiseptique. Le vétérinaire sera informé et décidera si un traitement supplémentaire est nécessaire. Si l’animal présente 3 des signes ci-dessous sur 3 jours consécutifs sans amélioration, il sera euthanasié : infection de la plaie, perte de poids de 15 % ou plus sans reprise, déshydratation, prostration, perte d’interaction avec l’environnement, agressivité accrue, réduction de mobilité. Dans tous les cas, si l’état général de la souris ne s’améliore pas sous 24 h, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de référence pour l’étude des circuits de la peur et des troubles anxieux. Par ailleurs, la région cérébrale étudiée, le cortex insulaire présente chez la souris une organisation et une cyto-architecture comparables à celles observées chez l’humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte (9 semaines), afin de travailler sur des neurones et circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées matures.

Opérés pour la pose d'un cathéter permanent d'auto-administration d'alcool, 256 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. La chirurgie de trente à quarante-cinq minutes se fait sous anesthésie, suivie d'un entraînement à consommer de l'alcool et de tests avec divers composés pharmacologiques. Le porteur signale des risques d'infection, de plaies liées au léchage de la zone opérée et de perte des sutures. À la fin, les rats sont tués et leur cerveau prélevé pour mesurer l'activité cérébrale.

Objectifs

La consommation excessive d’alcool est un enjeu majeur de santé publique et une des principales causes évitables de morbidité et de mortalité chez l’humain. Cette consommation est motivée principalement par la recherche d’un état d’intoxication soit dans un but de recherche de plaisir et d’émotions positives, soit dans un but de réduction d’émotions négatives, telles que l’anxiété. Afin d’en comprendre les mécanismes biologiques, la consommation d’alcool a été largement étudiée chez le rat. Toutefois, à ce jour, les effets motivant la consommation d’alcool chez le rat restent encore incertains. Est-elle principalement motivée par le plaisir du goût de l’alcool ou par les effets ressentis après ingestion et absorption de l’alcool dans le sang ? Une bonne connaissance de ces effets est essentielle afin de développer des modèles animaux de consommation d’alcool plus pertinents pour la recherche de traitements efficaces. Ce projet vise donc à étudier et comparer la consommation d’alcool par différentes voies d’administration : orale, intragastrique et intraveineuse. Cette étude permettra de décomposer et mesurer les contributions du goût de l’alcool et des effets ressentis après ingestion et absorption de l’alcool sur sa consommation. Le projet prévoit également de mesurer les modifications de l'activité du cerveau liées à ces différentes contributions.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera d’identifier les différents effets motivant la consommation d’alcool chez le rat et leur influence relative. Le second bénéfice sera d’évaluer la sensibilité de ces effets à différents traitements pharmacologiques. Enfin, un autre bénéfice sera d’identifier les changements de l’activité du cerveau liés aux différents effets de l'alcool motivant sa consommation.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de courte durée pour la mise en place d'un cathéter à demeure pour l’auto-administration d’alcool. Ces chirurgies, d’une durée moyenne comprise entre 30 minutes et 45 minutes, seront réalisées sur couverture chauffante, en conditions aseptiques, sous anesthésie chimique et sous analgésie appropriée. Au cours des phases expérimentales, les animaux seront entraînés et testés dans des différentes tâches comportementales. Au cours de la dernière phase de test, ils seront testés avec différents composés pharmacologiques afin d’étudier les mécanismes neuropharmacologiques de leur consommation d’alcool. Enfin, des prélèvements sanguins ponctuels de faible volume seront réalisés afin de mesurer l’alcoolémie. Le nombre de prélèvements par animal sera limité à trois au total : une fois pendant la phase d’apprentissage, une fois pendant la phase des tests comportementaux et une fois pendant la phase de tests pharmacologiques. Dans chaque cas, le prélèvement sera effectué environ 10 minutes après la fin d’une séance d’auto-administration.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des procédures dont le degré de gravité principal est léger et qui ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (habituation, anesthésie, analgésie, conditions aseptiques, suivi post-opératoire), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir au cours du projet. Les nuisances attendues sont principalement liées aux procédures chirurgicales. Celles-ci incluent un risque d’inflammation ou d’infection, l’apparition éventuelle de plaies liées à un toilettage excessif de la zone opérée, ou une perte prématurée des sutures avant cicatrisation complète. Les prélèvements sanguins ponctuels pourront entraîner un inconfort transitoire. Aucune nuisance particulière n’est anticipée lors des test comportementaux de mesure de la consommation d’alcool. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter et de prévenir rapidement tout signe d’inconfort, de stress ou de douleur.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux seront prélevés post-mortem pour effectuer une mesure de l'activité globale du cerveau.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (jeunes adultes, mâles et femelles), élevé en groupe dans un environnement enrichi contenant un tunnel en carton et un os à ronger. Ce recours à l’animal se justifie par l’impossibilité d’étudier, chez l’être humain, de manière contrôlée et éthiquement acceptable, les déterminants comportementaux et neurobiologiques de la consommation d’alcool, en particulier lorsqu’elle implique des manipulations invasives ou répétées. Par ailleurs, il n’existe actuellement pas de modèles in vitro, ex vivo ou in silico permettant de reproduire de façon réaliste les interactions complexes entre comportements de consommation, conséquences pharmacologiques de l’éthanol et organisation cérébrale. Les lignées cellulaires ou autres modèles alternatifs ne permettent pas de rendre compte de ces dimensions intégrées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été calculé au minimum nécessaire à la réalisation des objectifs scientifiques, en tenant compte des contraintes expérimentales propres au projet et de l’effectif par groupe, par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ont été conçues afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance, et le stress des animaux tout au long du projet. Les interventions chirurgicales nécessaires à la mise en place des cathéters seront réalisées sous anesthésie chimique et sous analgésie appropriée, en conditions aseptiques et sur couverture chauffante. La durée des chirurgies sera limitée au strict nécessaire et une surveillance attentive sera assurée tout au long de l’intervention. En fin de chirurgie, les animaux recevront une prise en charge adaptée visant à favoriser la récupération, incluant une réhydratation. Les animaux seront ensuite placés en cage de réveil sous surveillance jusqu’au retour à un état de vigilance normal, avant d’être relogés dans leur cage avec leur congénère. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne tout au long du projet afin de détecter précocement tout signe d’inconfort, de douleur ou d’altération de l’état général (perte de poids, modification du comportement, altération de l’aspect physique). Les interventions visant à réduire ou supprimer l’inconfort seront gradées. En cas d’apparition de signes légers, des mesures de nursing seront mises en place, incluant un accès facilité à la nourriture et à l’eau. Si nécessaire, des traitements analgésiques supplémentaires seront administrés et une réhydratation sous-cutanée pourra être réalisée. Les prélèvements sanguins ponctuels seront effectués par du personnel formé, selon des procédures minimisant l’inconfort et la durée de contention.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue un compromis. Cette espèce est suffisamment proche des êtres humains pour servir de modèle animal pertinent des phénomènes d’addiction, par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple les invertébrés, à l’exception possible des céphalopodes). Les animaux utilisés seront des rats jeunes adultes au début des procédures expérimentales (âge moyen d’environ 2 mois). Cette période du développement correspond à une phase de vulnérabilité particulière vis-à-vis des comportements de consommation d’alcool et est donc pertinente au regard des objectifs du projet.

92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour mettre au point un modèle de pneumonie due à la bactérie Tropheryma whipplei. L'infection se fait par aspiration dans la gorge, précédée d'un prélèvement de sang à la lancette sur animal éveillé. Le porteur évoque une atteinte des voies respiratoires et une douleur transitoire après la procédure. Le texte annonce un suivi des animaux infectés sans préciser les critères d'observation ni les signes qui déclencheraient une mise à mort anticipée.

Objectifs

Tropheryma whipplei est une bactérie associée à un large spectre d’affections chez l’Homme, s’étalant d’un portage asymptomatique à des infections chroniques systémiques. Les avancées des techniques de détection et de séquençage à haut débit ont profondément modifié l’épidémiologie de ces infections. Ainsi, un nombre croissant d’études suggère que T. whipplei est un agent de pneumonies aigues. Dans ce contexte, nous souhaiterions explorer de manière exhaustive la pneumonie induite par T. whipplei afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’infection. Compte tenu des données épidémiologiques, nous devons modéliser la pneumonie d’aspiration et la pneumonie communautaire. Ce projet s’articulera donc autour de l’établissement et de la comparaison de 2 modèles de pneumonie : un modèle de pneumonie d’aspiration par aspiration oro-pharyngée de T. whipplei et un modèle de pneumonie communautaire par inhalation.

Bénéfices attendus

T. whipplei peut provoquer diverses infections qui sont relativement rares dans le monde. Avec le développement de la biologie moléculaire et si la capacité de détecter cette bactérie a augmenté ces dernières années, son importance dans les échantillons des voies respiratoires inférieures reste incertaine. Ainsi, ce projet permettra de mieux comprendre la mise en place des pneumonies à T. whipplei, notamment le contexte de leur apparition (pneumonie aigue communautaire ou pneumonie d’aspiration). Il mettra également en évidence des éléments critiques dans l’établissement et la physiopathologie de l’infection pulmonaire à T. whipplei. Enfin, il permettra de définir également de développer des outils diagnostiques et éventuellement pronostiques de telles infections.

Procédures

Un prélèvement sub mandibulaire sera effectué sur souris vigile avant l'infection à l'aide d'une lancette (Golden Rod 4MM). Quelques gouttes (100 microlitres environ) de sang sera prélevé sans dépasser le rapport volume/ poids réglementaire. D'autres prélèvements seront réalisés sur animaux morts.

Impact sur les animaux

Des altérations de l'épithélium des voies aériennes peuvent être observées, bien que généralement modérées et transitoires suite à l’aspiration oro-pharyngée. Il est possible que les souris présentent une douleur transitoire post-procédure. L’infection par T. whipplei pourrait causer une pneumopathie et éventuellement conduire à une diminution de la compliance pulmonaire.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux pour prélèvements de fluides et organes.

Remplacement

Bien que nous menons parallèlement des études in vitro visant à évaluer la capacité de T. whipplei à infecter les cellules épithéliales, Il est nécessaire de tester nos observations dans un modèle de souris afin de se rapprocher des conditions physiopathologiques de la pneumonie induite par T. whipplei et d’en comprendre les mécanismes sous-jacents.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit grâce à la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal. De plus, du fait de notre expérience (effets modérés de l’infection à T. whipplei), nous avons déterminé que 10 animaux/groupe sont nécessaires à notre étude pour observer une différence statistique significative entre les groupes. D’autre part, pour la procédure 1, nous avons proposé une étude pilote sur 12 souris qui permettra de tester les paramètres utilisés et de les ajuster si besoin.

Raffinement

La mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel ainsi que le suivi quotidien de l’état de santé des animaux permettront le raffinement de ce projet. Ainsi, les animaux seront hébergés en respectant le nombre maximum d’individus par cage (5 souris par petite cage ou 10 par grande), dans des cages équipées d'igloo et matériel à ronger afin d’offrir un environnement enrichi et approprié. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en envisageant l’utilisation d’antalgiques. Dès lors qu’un animal aura atteint le score entre 9 et 12 la souris sera euthanasiée dans le but de réduire toute douleur, souffrance et angoisse. Suivant notre grille de score, pour un score entre 5 et 8, un suivi et un analgésique pourra être administré. Au besoin, les souris recevront des croquettes à leur portée ou de la nourriture et de l’eau gélifiée ad libitum.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire, et les infections respiratoires chez la souris peuvent reproduire de façon fiable l’inflammation pulmonaire, la réponse immunitaire, la production de cytokines et l’évolution clinique observées chez l’homme. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 8 semaines seront utilisées.

Pour une étude pilote sur la fibrose pulmonaire, 32 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un inducteur de fibrose par aspiration dans la gorge, sous anesthésie brève, puis peuvent perdre du poids dans la semaine qui suit. Leur mise à mort permet de quantifier la fibrose sur les poumons prélevés. Le porteur présente ce travail comme préliminaire, destiné à décider s'il est utile de poursuivre sur davantage d'animaux.

Objectifs

La fibrose pulmonaire est une maladie grave des poumons. Dans ce contexte, certaines cellules du système immunitaire jouent un rôle important avec un déséquilibre entre les cellules. Parmi ces cellules, les lymphocytes T CD4 peuvent avoir des effets opposés. Nos travaux récents, ont montré NLRP3 pourrait être impliqué dans le contrôle de cet équilibre. Pour mieux comprendre si NLRP3 peut modifier cet équilibre, nous proposons de réaliser une première étude pilote dans des souris transgéniques en provoquant une fibrose pulmonaire expérimentale. Nous étudierons si cette absence de NLRP3 aggrave ou modifie les lésions pulmonaires. Cette étude préliminaire permettra de savoir s’il est utile de poursuivre ce travail dans un projet de recherche plus large.

Bénéfices attendus

Cette étude est une première étape pour mieux comprendre une maladie appelée fibrose pulmonaire, qui abîme les poumons et rend la respiration difficile. Le but de cette étude est de voir si une protéine joue un rôle important dans la maladie. C’est une étude exploratoire, c’est-à-dire une étude de départ, qui sert à savoir si cela vaut la peine d’aller plus loin. Cette recherche aidera à mieux comprendre comment fonctionne le système immunitaire dans la fibrose pulmonaire. Ces informations sont importantes pour décider si ce travail doit être poursuivi avec des études plus grandes, ou arrêté s’il n’apporte pas de résultats utiles. À plus long terme, mieux comprendre ces mécanismes pourrait aider les chercheurs à développer de nouveaux traitements pour les personnes atteintes de fibrose pulmonaire.

Procédures

Les souris recevront une administration d’un inducteur de fibrose par aspiration oropharyngée. Cette intervention sous anesthésie générale dure 30 secondes maximum.

Impact sur les animaux

Le modèle expérimental décrit dans ce projet est couramment utilisé en recherche dans le domaine de la fibrose pulmonaire. Entre 2 et 7 jours après l’induction du modèle, les souris peuvent perdre du poids. Lors des réveils de l’anesthésie, les animaux connaissent quelques minutes de désorientation, rapidement résolues par la reconnaissance de leur environnement.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéines) et analyses des populations immunitaires par cytométrie en flux

Remplacement

Les poumons sont des organes très complexes, composés de plus de 40 types de cellules différentes. La fibrose pulmonaire est une maladie qui fait intervenir plusieurs mécanismes dans les poumons, comme l’inflammation et la transformation des tissus. Ainsi, pour bien comprendre cette maladie, il est nécessaire d’étudier l’organe entier, car aucun test en laboratoire sur des cellules seules ne peut remplacer l’étude chez un animal.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, cette étude est d’abord une étude pilote, c’est-à-dire une petite étude exploratoire. Elle permettra de vérifier si la protéine qui nous intéresse a un effet sur l’évolution de la fibrose et sur l’équilibre entre les cellules. En menant d’abord cette étude préliminaire, nous pourrons décider s’il est utile de faire une étude plus grande, ce qui évite d’utiliser un grand nombre d’animaux sans raison scientifique. De plus, notre équipe possède déjà beaucoup de données obtenues sur des cellules in vitro en laboratoire. En combinant ces informations avec l’étude pilote, nous utilisons le minimum d’animaux nécessaire tout en obtenant des résultats fiables.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un environnement confortable, avec lumière, température et bruit contrôlés, dans des cages adaptées pouvant accueillir jusqu’à 10 animaux. Elles disposeront d’éléments pour jouer et se cacher, comme des tunnels en plastique et des papiers, afin de réduire le stress et l’ennui. Elles auront aussi de la nourriture spéciale à volonté, comme des aliments gélifiés ou des morceaux de pommes, pour éviter la perte de poids. Le suivi sera quotidien, assuré par du personnel qualifié, afin de détecter rapidement tout signe de malaise. Une attention particulière sera portée pour s’assurer qu’elles reprennent une activité normale après l’anesthésie.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris pour cette étude car elles sont le meilleur modèle connu pour étudier la fibrose pulmonaire. Beaucoup de recherches ont déjà utilisé des souris pour cette maladie, ce qui permet de comparer facilement nos résultats avec ceux d’autres équipes dans le monde. Les souris ont aussi l’avantage d’être les seules espèces où il est possible de créer des animaux transgéniques. Les souris permettent également de réaliser plusieurs types d’injections et de prélèvements, un peu comme ce qui se fait chez l’homme en recherche clinique. Pour cette étude, nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et pesant au moins 21 grammes. À cet âge, elles sont considérées comme adultes, avec des poumons et un système immunitaire bien développés. D’après notre expérience, la fibrose, est plus toxique chez les souris petites. Pour limiter ce risque, nous choisissons des souris suffisamment grandes et robustes : des mâles pesant plus de 21 grammes, afin de réduire les signes de malaise.

2481 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant recevoir une injection d'agent mutagène, une greffe de cellules cancéreuses dans la rate ou la paroi digestive, jusqu'à cinq prélèvements de sang sur quarante-deux jours et un produit qui provoque une inflammation du côlon. Les procédures sont classées au niveau de souffrance modéré. Le porteur signale des diarrhées, une perte de poids d'environ 10 % et des tumeurs pouvant devenir irritantes. L'ensemble vise à décrire le rôle d'une protéine nucléaire dans plusieurs cancers, sans qu'aucun bénéfice thérapeutique ne soit à ce stade autre chose qu'une preuve de concept.

Objectifs

Malgré des avancées dans la prise en charge des patients, les cancers restent la première cause de mortalité prématurée. Ce projet a pour but de décrypter les rôles dans les cancers d’une protéine et à apporter une preuve de concept pour son ciblage thérapeutique. Les cellules cancéreuses doivent s’adapter pour survivre dans un environnement en dehors de leur tissu d’origine. Interférer avec leur capacité d’adaptation, présente une opportunité thérapeutique potentielle. Ceci repose sur la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents. Nos travaux récents suggèrent que notre protéine d’intérêt en est un élément clé. Nos études précédentes ont démontré qu’elle facilite plusieurs étapes de la carcinogénèse, et pourrait représenter une nouvelle classe de cible thérapeutique. Il est nécessaire de mieux comprendre ses fonctions normales et son rôle dans des cancers différents, et tester les effets de son élimination. Notre projet, qui sera réalisé chez la souris, comporte 4 volets. Nous allons : 1) Déterminer si l’élimination du gène chez la souris interfère avec (a) l’équilibre du système immunitaire, comme suggéré dans la littérature scientifique; (b) le vieillissement (un facteur de risque dans les cancers); (c) la tumorigénèse intestinale, induite de différentes façons. 2) Déterminer si l’ablation du gène directement dans les cellules cancéreuses affecte la tumorigénèse et les réponses aux traitements (chimiothérapie ou immunothérapie) dans trois modèles de cancers différents: mélanome, cancers du sein et colorectal. 3) Identifier des protéines partenaires qui affectent aussi la tumorigénèse. 4) Apporter une preuve de concept thérapeutique via une molécule qui permet d’induire la destruction d’une protéine génétiquement modifiée. A terme, ce projet pourrait permettre de développer des nouvelles stratégies thérapeutiques contre les cancers.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses s’adaptent à leur environnement, aux réponses immunitaires anti-tumorales et aux traitements, et pourrait à terme permettre le développement de nouvelles thérapies.

Procédures

Les interventions sur animaux vigiles prévues sont : 1) des injections . Celles-ci seront uniques, pour injecter un agent mutagène afin d’initier la tumorigénèse, un médicament qui agit sur des cellules cancéreuses, ou un agent qui induit la perte transitoire des cellules immunitaires. Elles durent environ 5 secondes. 2) des piqûres pour prélèvement sanguins. Celles-ci seront effectuées un total de 5 fois sur 42 jours, espacés d’au moins une semaine. Elles durent environ 1 seconde. Les procédures chirurgicales prévues sont uniques, et se font sous anesthésie général. Elles consistent en la greffe des cellules soit dans la rate, soit dans la paroi du tube digestif. La procédure dure environ un quart d’heure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont: 1) L’inflammation intestinale provoquée par la prise dans l’eau de boisson d’un produit qui induit une inflammation transitoire dans le colon. Ceci peut provoquer des diarrhées et induit également une perte de poids d’environ 10% entre les jours 6 et 9 de la procédure. Ensuite les souris reprennent très vite du poids pour revenir à leur poids initial en 3-4 jours. 2) La greffe de cellules sous la peau. Il est possible que les tumeurs, qui généralement ne gênent pas les animaux, deviennent irritantes. Si c’est le cas nous appliquerons des crèmes cicatrisantes et anti-douleur aux animaux concernés. 3) Pour les animaux greffés dans la rate ou dans la paroi du tube digestif, la chirurgie peut entraîner de la douleur ou de l’inconfort liés à l’incision et à la manipulation des organes internes, ainsi que des complications possibles telles qu’une infection, un saignement ou une inflammation locale. Les injections dans la rate peuvent parfois provoquer des lésions ou hémorragies internes, tandis que les injections dans le tube digestif peuvent fragiliser l’intestin et entraîner une infection abdominale ou des troubles digestifs. Enfin, si la suture est arrachée avant cicatrisation, il pourrait y avoir une plaie non-fermée et/ou infectée. Ces souris seront surveillées quotidiennement pour détecter des signes précoces de mal être (pelage non nettoyé, manque de vivacité, perte de poids supérieure à 10%, sur-vascularisation des tumeurs, mauvaise cicatrisation des sutures). Les animaux montrant l’un de ces signes seront suivis quotidiennement et évalués selon une échelle standard de la nuisance afin de prévoir des adaptations, et la mise à mort de l’animal sera effectuée si la nuisance est excessive.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort pour prélèvement d’échantillons.

Remplacement

Un large travail en amont pour étudier les rôles cellulaires de la protéine d’intérêt a préalablement été réalisé dans les cellules en culture. Il n’existe aucune méthode alternative au recours aux animaux pour suivre son éventuel rôle dans la production cellules sanguines, le vieillissement et la tumorigénèse.

Réduction

Nos études précédentes permettent d’estimer avec précision le nombre de souris nécessaires pour générer des données statistiquement robustes. Pour chaque procédure, une étude statistique préalable a été réalisée afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Notre pratique régulière nous permet de réduire au maximum le temps de contention et d’injection. Pour minimiser la douleur de la piqûre, l’aiguille utilisée sera très fine. Pour les prélèvements sanguins, nous utiliserons des lancettes qui possèdent une pointe fine pour une pénétration sans douleur et permettent une collecte de sang facilitée et une cicatrisation rapide. Les cages restent sous surveillance 20 minutes après toute injection pour détecter les éventuels signes de douleurs. Les animaux seront pesés une fois par semaine. Un anesthésique et un analgésique seront utilisées lors des chirurgies pour réduire la douleur. En post-chirurgie de la nourriture et de l'eau gélifiée seront posé à même le sol afin de leur permettre de se nourrir facilement. Enfin, la comparaison des observations quotidiennes des animaux avec une échelle de nuisance pré-établie permettra de prendre des décisions objectives pour soigner les animaux ou, le cas échéant, leur euthanasie si la souffrance est excessive.

Choix des espèces

Les lignées cellulaires de cancer de souris que nous avons choisi reproduisent au mieux les cancers humains. Les animaux génétiquement modifiés pour le gène de Ki-existent uniquement chez la souris, et permettent d’analyser les rôles physio-pathologiques de Ki-67. Les animaux seront utilisés à partir de 2 mois d'âge selon les protocoles établis dans la littérature, lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g. Cet âge tient compte de la maturité sexuelle nettement dépassée pour les animaux, compatible avec la description des âges des patients atteints de cancer du sein, colorectal ou mélanome.