Oncologie

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux plaies cutanées sur le dos sous anesthésie, une infection par le staphylocoque doré pour une partie d'entre elles, puis des applications d'amibes répétées, avec des anesthésies cinq jours sur sept pendant quinze jours, avant d'être tué pour des biopsies. Le porteur décrit une possible démangeaison à la cicatrisation et un léger stress lié aux anesthésies répétées. Il affirme qu'un modèle in vitro a déjà montré l'activité antibactérienne mais ne rend pas compte de l'effet thérapeutique réel sur l'infection.

Objectifs

En réponse à la propagation préocupante du phénomène d’antibiorésistance, l’OMS a érigé une liste d’espèces bactériennes multirésistantes aux antibiotiques pour lesquelles il est primordial de développer de nouveaux composés antibactériens ou thérapies alternatives à l’usage de ces derniers. Les bactéries antibiorésistantes, et notamment Staphyloccus aureus pour la plus importante, sont à l’origine d’un nombre croissant d’infections nosocomiales et de divers types (respiratoires, urinaires, cutanées, etc). En 2019, 200 000 décès liés à des infections cutanées causées par des souches bactériennes antibiorésistantes ont été recensés de par le monde. De telles souches sont également responsables d’infections chez l’animal et représentent une véritable menace pour le traitement des infections en médecine vétérinaire. Une des alternatives aux antibiotiques actuellement à l’étude est la phagothérapie, utilisant des virus, les phages, capables de lyser spécifiquement certaines bactéries cibles. Bien que cette approche soit prometteuse, notamment pour le traitement de plaies infectées, il n’est pas à exclure que les bactéries puissent échapper à l’action des phages (systèmes de défense anti-phages, mutations). De plus, le spectre d’activité des phages est très réduit, souvent spécifique d’une seule souche bactérienne, limitant ainsi leur usage en première intention. Récemment, il a été démontré que des cellules environnementales naturellement prédatrices de bactéries, les amibes libres, sont capables d’éliminer efficacement des souches bactériennes antibiorésistantes et responsables d’infections nosocomiales. Ces résultats ont suggéré le fait que les amibes possèdent un spectre de prédation large et qu’elles pourraient être utilisées afin de contrôler les populations de bactéries antibiorésistantes se développant au niveau de sites infectieux, comme certaines plaies cutanées ou brûlures. Lors de précédents tests réalisés sur modèle murin, il a été démontré que l’application répétée d’amibes sur peau saine ou sur plaie cutanée ne génère pas de réaction inflammatoire et ne perturbe pas le processus normal de cicatrisation. Dès lors, l’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle murin d’inflammation de plaie cutanée générée par l’application topique d’une souche clinique de S. aureus et d’évaluer ainsi la capacité de souches amibiennes à contrôler la survenue d’une réaction inflammatoire par leur activité antibactérienne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra dans un premier temps d’obtenir un modèle murin reproductible d’inflammation de plaies cutanées qui sera utilisé pour des expérimentations ultérieures. Ce projet permettra ensuite d’évaluer les propriétés antibactériennes et anti-inflammatoires de souches amibiennes lors de leur application sur plaies cutanées et plus largement d’avoir une idée de leur potentiel d’application dans un cadre thérapeutique, afin notamment de traiter des réactions inflammatoires et/ou infections cutanées chez l’Homme ou l’animal.

Procédures

Le premier jour des expérimentations, deux petites plaies cutanées circulaires seront réalisées sur la peau du dos de chaque animal. L’intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale (durant 20 minutes), après avoir administré un antalgique en sous-cutané 30 minutes avant. Les souris recevront 2 doses d'antalgique/ jour les 2 jours suivant la chirurgie (30 secondes). Toutes les applications de suspension de bactéries et/ou d’amibes seront réalisées sous anesthésie générale (durée = 30 secondes). Un seul dépôt de bactéries sera effectué sur les plaies (1 goutte) au cours des expérimentations, le premier jour (durée 30 secondes) et pendant les 3 jours suivants 1 goutte de suspensions amibiennes sera déposée chez les animaux traités avec ces cellules (durée 30 secondes). Les mesures (photographies) seront réalisées sous anesthésie générale (2 minutes par animal). Les expérimentations dureront 15 jours.

Impact sur les animaux

Sur le dos des animaux sera réalisée des plaies cutanées qui répresenteront environ 5% de la surface totale du dos de la souris. Ces plaies seront suivi pour certains animaux, de l'application d'une bactérie, le saphyloccoque dorée ce qui engendrera une infection de la plaie. Les animaux recevront un antalgique et cela ne generera donc pas de douleur. La cicatrisation de la plaie pourrait engendrer une légère démengeaison. L'application de bandage ne genant pas les animaux dans leur mouvements, sera disposé sur les plaies afin d'eviter des grattage qui pourrait conduire à une augmentation de la taille des plaies. D’après notre expérience, il n’est donc pas attendu de troubles importants des fonctions corporelles. Les anesthesies répétées 5x/semaine pendant 15 jours pourront entrainer un leger stress chez les animaux

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements post-mortem. Des biopsies de peau seront prélevées afin de réaliser des analyses histologiques. Des ganglions lympathiques seront également prélevés afin d’analyser la réponse inflammatoire et l’effet anti-inflammatoire des souches amibiennes testées.

Remplacement

L'objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité antibactérienne et anti-inflammatoire d’amibes libres, et ce dans l'objectif de leur utilisation thérapeutique pour traiter des infections cutanées d’origine bactérienne et résistantes aux antibiotiques. Un remplacement in vitro (application d'amibes sur matrice solide à l'interface liquide/air recouvert de bactéries) a déjà été utilisé et a permis de démontrer l'activité antibactérienne des amibes considérées ici. Un remplacement ex vivo (épiderme reconstitué) a été envisagé. Si ce remplacement permettrait de vérifier l'activité antibactérienne, il ne permettra pas de déterminer l'impact réel de cette activitée sur la résolution de l'infection et la cicatrisation (effet thérapeutique recherché). Enfin, nous disposons d'ôres et déjà de données démontrant l'inocuité de l'application d'amibes sur des plaies non-infectées. Aussi, seule la conduite d'étude in vivo sur plaies infectées permettra de déterminer le potentiel des amibes testées à un usage thérapeutique, tel que proposé dans la demande de brevet déposé au European Patent Office.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début des procédures expérimentales. Les animaux seront hébergés par groupes d'individus compatibles et dans des conditions contrôlées. Lors des expérimentations, les animaux seront placés sur un tapis chauffant et anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress pour l’animal. Des mesures seront mises en œuvre afin de limiter la douleur (anesthésie et injection d’un antalgique) et le stress des animaux.Ceux-ci seront endormis par anesthésie générale lors des procédures (formation des plaies, applications de bactéries et/ou d’amibes, mesures) et des points limites bien définis, suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. Un antalgique sera administré en sous-cutané, sur animaux vigiles, 30 minutes avant d’effectuer l’acte chirurgical ainsi que les 2 jours suivants. Afin d'eviter un grattage dû à la cicatrisation et/ou l'application des composés et qui pourrait conduire à une augmentation de la taille de la plaie, les plaies seront bandées aprés la chirurgie ainsi qu'aprés chaque application. Les animaux seront surveillés quotidiennement et notamment au moment des mesures du suivi de cicatrisation 5fois/semaine. Nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux.

Choix des espèces

La souris est un petit animal à cycle de reproduction rapide qui s’adapte bien à ce type d’expérimentations, selon notre expérience et celle de l’équipe collaboratrice. Le suivi clinique de l’inflammation a été éprouvé par l’équipe à travers des expérimentations visant à mieux comprendre l’allergie cutanée. Le protocole que nous projetons de réaliser est très proche de celui ayant déjà été mis en œuvre précédemment sur plaies cutanées et ayant permis de vérifier l’innocuité de l’application de l’amibe Vermamoeba vermiformis M-2 B4 dans ce contexte. Par ailleurs, différentes études disponibles dans la littérature démontrent que la souris est un animal adapté afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement favorisant la cicatrisation cutanée. Les souris provenant du fournisseur arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au sein de notre animalerie avant d’entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 7 semaines, période correspondant à l’âge de maturité du système immunitaire.

10 chèvres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque femelle subit une ovariectomie chirurgicale d'environ une heure, puis est tuée pour prélever les organes olfactifs, l'utérus, les ovaires et le cerveau. Le porteur décrit un risque de douleur, d'hématome et d'infection postopératoires, ainsi qu'une irritation respiratoire possible liée à l'intubation. Il affirme que la question n'est "pas modélisable" autrement et rattache le bénéfice attendu à la gestion de la reproduction dans la filière caprine.

Objectifs

La chèvre est une espèce à reproduction dite "saisonnée", ce qui signifie que son activité de reproduction est naturellement restreinte à une période de l'année. C'est une espèce dite de "jours courts", c'est-à-dire que son activité sexuelle se déclenche en automne lorsque la durée du jour diminue. Cette saison sexuelle est suivie d'une période de repos sexuel (ou "anœstrus saisonnier") pendant laquelle les variations hormonales responsables des chaleurs et de l'ovulation sont stoppées lorsque la durée du jour augmente au printemps. La durée du jour n'est cependant pas le seul facteur environnemental pouvant impacter la reproduction de la chèvre. En effet, plusieurs études décrivent une modification de l'activité sexuelle de la femelle en fonction des contacts sociaux entretenus avec le mâle. Un phénomène nommé "effet mâle" a notamment été caractérisé chez cette espèce ainsi que chez les ovins. Ce phénomène permet, par l'introduction d'un mâle parmi des femelles en période de repos sexuel, une reprise des mécanismes hormonaux menant à l'ovulation. Les indices sensoriels, notamment olfactifs, pourraient jouer un rôle important dans le déclenchement de ce type de phénomène. Chez la souris, l'exposition à un mâle ou à son odeur déclenche une puberté précoce chez les femelles exposées. Chez la chèvre, l'exposition de femelles pendant l'anœstrus saisonnier à des stimuli olfactifs de mâle permet de stimuler les mécanismes hormonaux, pouvant mener à l'ovulation (50% des femelles adultes dans le cadre de l'effet mâle). Pour étudier la sensibilité des chèvres aux composés olfactifs de boucs, notre équipe a développé une approche basée sur une culture cellulaire, produite à partir de la récupération des tissus olfactifs de chèvre après euthanasie. Chez la souris, le statut hormonal influence le seuil de détection des odeurs et leur discrimination. Puisque la chèvre subit des variations hormonales drastiques au cours de l'année, nous aimerions explorer l'hypothèse que le statut physiologique de la femelle va modifier la sensibilité de ses tissus olfactifs aux composés de mâles.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension de l'influence des hormones sexuelles sur la sensibilité olfactive des femelles aux composés odorants de mâles chez un modèle à reproduction saisonnée. A terme, cette étude pourrait apporter des bénéfices à la filière d'élevage caprine via une meilleure gestion de la reproduction par les interactions sociales mâles/femelles et l'utilisation des indices sensoriels olfactifs, tout en limitant l'apport d'hormones exogènes.

Procédures

Les 10 femelles du lot OVX subiront une unique procédure chirurgicale d'ovariectomie (retrait des ovaires). La réalisation de cette procédure nécessite environ une heure.

Impact sur les animaux

Pour les animaux des lots SAISON et ANOESTRUS, les seuls effets indésirables attendus sont du stress lors des manipulations précédant l'enthanasie. Pour les animaux du lot OVX : stress possible lors des manipulations, de la phase pré opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible (hématome au niveau de la plaie), ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthésie, une irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation) peut apparaître, mais ce cas reste rare. De plus, les différentes injections en intraveineuse peuvent engendrer un hématome.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les 10 femelles du lots OVX retourneront en élevage. Dès que possible, ces femelles seront euthanasiées afin de récupérer les organes sensoriels olfactifs (épithélium olfactif principal et organe voméronasal) pour mesurer l’activité cellulaire sur des neurones en culture. L'organe voméronasal est un organe tubulaire du nez présent chez la plupart des mammifères et permettant la détection de molécules odorantes. Les résultats seront comparés à ceux obtenus sur les lots SAISON et ANŒSTRUS (non concernés par la procédure expérimentale faisant l'objet de cette saisine). Ceci nous permettra d'évaluer les effets des variations hormonales saisonnières sur la sensibilité olfactive des chèvres aux stimuli de mâle. Le tractus reproducteur (utérus/ovaires) et le cerveau seront également récupérés pour d'autres types d'expériences.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé dans ce projet étudiant les effets de la saisonnalité sur la réponse des neurones olfactifs aux stimuli de mâle chez la chèvre car ceci n'est pas modélisable par des modèles alternatifs.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés (34 femelles) a été rationalisé dans le but de ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire pour pouvoir mettre en évidence un effet après analyse statistique. La taille de nos effectifs (10 à 13 individus par groupe) a été choisi grâce à un outil statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sur paille et bénéficieront d'enrichissement comme des caisses en bois et des ballons. Afin de prévenir tout stress, les animaux sont gardés en groupes sociaux stables, dans des conditions d’élevage optimales avec fourrages et concentrés de qualité et des locaux calmes. Pour les animaux du groupe OVX, la douleur est traitée préventivement avant l’acte chirurgical dès l’anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu’à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l’état normal est estimé à 3 jours postopératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. Un animal anorexique, prostré, recevra l’administration de morphinique. Sans réponse physiologique satisfaisante, il sera procédé à l’euthanasie suivie du prélèvement du site lésionnel pour analyse. Tout animal qui ne se nourrit pas pendant 4 jours malgré le traitement sera euthanasié. Une fiche de suivi individuel est mise en place, renseignée tous les jours. Les animaux seront surveillés quodtidiennement sur 6 paramètres. Les point limites attendus sont : - Une prostration avec abattement et anorexie en cas de douleur importante : en ce cas ces animaux recevront des injections sous cutanées de morphine - Fièvre, abattement, polypnée en cas d’infection post opératoire : en ce cas, les animaux recevront des antibiotiques et des anti inflammatoires non stéroïdien en fonction de la gravité des symptomes.

Choix des espèces

Chez la chèvre, la présence d'un mâle sexuellement actif impacte la physiologie de la reproduction et les comportements sexuels de la femelle. Les indices olfactifs du mâle pourraient jouer un rôle assez important dans le déclenchement de ces divers phénomènes décrits, notamment dans le cadre de l'"effet mâle". Le statut hormonal d'un individu semble influencer le seuil de détection des odeurs et leur discrimination (données rongeurs). Ainsi, il serait donc intéressant de comprendre si les variations hormonales causées par la saisonnalité de reproduction de la chèvre conduisent également à une modification de la sensibilité de ses organes olfactifs aux stimuli de bouc. Nous utiliserons des femelles sexuellement matures (nées entre janvier et février 2021) pouvant donc afficher les variations hormonales saisonnières attendues pour comparaison.

12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dix-huit injections de thioacétamide sur six semaines, une hépatotoxine qui provoque une fibrose puis une cirrhose du foie, avec une perte de poids et une mortalité pouvant atteindre 15 % des animaux traités. Le porteur indique tuer les souris par ponction cardiaque pour prélever le foie, l'objectif étant de mettre au point une méthode d'imagerie 3D de la fibrose sur foie rendu transparent. Il affirme qu'aucun modèle de fibrose hépatique in vitro n'existe et qu'il est "contraint" de recourir à l'animal.

Objectifs

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), est la première cause de maladie chronique du foie et sa prévalence ne cesse d’augmenter. La NAFLD inclus différents stades allant de la simple stéatose à la stéatohépatite non-alcoolique (NASH) caractérisée par de l’inflammation et une progression rapide de fibrose. Les patients atteints de NASH présentent un risque accru de développer une cirrhose ou un hépato- carcinome. De nombreux facteurs augmentent le risque de progression de la NAFLD à la NASH, mais les mécanismes sont encore peu connus. Il n’existe d’ailleurs actuellement aucun traitement contre la NASH. Les modèles précliniques d’étude de la NASH sont encore peu nombreux et ne récapitulent pas parfaitement les lésions observées chez les patients. Dans l’objectif de mieux caractériser le développement de réseau de fibrose, et avec l’émergence des nouvelles technologies d’imagerie, nous proposons de mettre en place une méthode pour caractériser et quantifier le réseau de fibrose hépatique en 3-dimensions par microscopie bi-photonique sur foie transparisé, c’est-à-dire rendu transparent. Pour rendre le foie transparent, nous utiliserons un protocole décrit nommé CUBIC pour « clear unobstructed brain/body imaging cocktails » ou cocktail pour l’imagerie du cerveau/corps clair et non obstrué. Suite à cela, nous visualiserons le réseau de fibrose en 3-dimensions sur des coupes d’organes de plus de 2 mm d’épaisseurs avec un microscope multi-photonique. Le projet vise ensuite à publier cette méthode dans un journal à comité de lecture afin que celle-ci soit accessible à toute la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Avec les prélèvements de foie fibrosé, nous envisageons de développer une méthode de transparisation de foie murin avec le réactif CUBIC, suivie de visualisation des fibres de collagène en microscopie multi-photonique en 3 dimensions (sur foie jusqu’à 2 mm d’épaisseur). La microscopie bi-photonique est une méthode d’imagerie basée sur la propriété de certaines molécules à générer des signaux seconde harmonie (SHG, pour second harmic generation) lorsqu’elles sont excitées à une longueur d’onde spécifique. Le collagène, la molécule caractéristique de la fibrose est une molécule décrite comme étant propice à la microscopie SHG. Ainsi, la méthode que nous souhaitons développer devrait permettre : 1) Une caractérisation spatiale du réseau de fibrose plus sensible et plus complète que les analyses classiques actuellement utilisées. 2) Une meilleure connaissance de la nature des fibres, avec la possibilité d’orienter l’angle de polarisation du laser pour discriminer différentes fibres. La microscopie bi-photonique avec le SHG est une méthode « label-free », c’est-à-dire qu’elle n’utilise pas de colorants ou d’anticorps. Cela implique donc qu’en plus de réduire les coûts, d’éviter l’exposition à des colorants et produits chimiques nocifs, cette méthode d’imagerie pourrait être couplée à des méthodes d’immunofluorescences classiques sur le même échantillon. On peut donc imaginer d’étudier la colocalisation entre les fibres de collagène hépatique et l’expression de protéines d’intérêt. A la suite de la mise au point de cette méthode, nous envisageons de la publier dans un journal à comité de lecture afin que celle-ci soit accessible à toute la communauté scientifique.

Procédures

Pour mettre au point cette nouvelle méthode d’imagerie en 3 dimensions, nous proposons d’utiliser du foie de souris issues d’un modèle de fibrose hépatique induite par hépatotoxine à savoir la thioacétamide (TAA). Le TAA est un organosulfure (formule chimique C2H5NS), anciennement utilisé comme fongicide, qui est maintenant couramment utilisé comme hépatotoxine pour induire un stade avancé de fibrose et de cirrhose chez le rongeur. Les souris seront soumises à 3 injections intra-péritonéales de TAA par semaine pendant 6 semaines (18 au total). Ces injections visent à induire une fibrose hépatique dans le but de notre étude. A la fin du protocole, un prélèvement de sang sera effectué par ponction cardiaque après anesthésie/analgésie chimique.

Impact sur les animaux

Le thioacétamide (TAA) est un organosulfure (formule chimique C2H5NS), anciennement utilisé comme fongicide, qui est maintenant couramment utilisé comme hépatotoxine pour induire un stade avancé de fibrose et de cirrhose chez le rongeur. L’administration de TAA provoque des lésions hépatiques, celles-ci peuvent atteindre le stade de cirrhose, avec ses complications associées. Cependant, celles-ci sont rarement sources d’inconfort pour les animaux. Une perte de poids modérés peut être observée. La mortalité peut atteindre 15% des souris traitées au TAA.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le foie.

Remplacement

La fibrose hépatique est un processus physiologique complexe, multi-cellulaire et dont la spatialisation du réseau de fibrose dans le foie a un impact physiologique (la fibrose péri-portale et différente de la porto-centrale). Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de fibrose hépatique in vitro, c’est pourquoi nous sommes contraints d’utiliser un modèle animal pour ce projet.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

Les procédures ont été réfléchies pour réduire au maximum le stress et les souffrances des souris soumises aux expérimentations. L’injection de TAA ne nécessite pas d’injection d’analgésique. Les souris sont hébergées par 2 à 5 par cage pour limiter l’isolement, et les cages seront enrichies en frisotis et d’un dôme en carton. Une observation quotidienne des souris et une pesée hebdomadaire seront effectuées. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera euthanasiée sans délai. Si un seul signe clinique spécifique ou 2 signes notables sont détectés alors le responsable du SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera sacrifiée sans délai.

Choix des espèces

Le modèle de fibrose hépatique induite par TAA chez les C57Bl/6J mâles est un modèle de choix et reconnu pour le développement de fibrose. Avec ce modèle, il est très probable que la totalité des animaux traités au TAA soient atteints de fibrose hépatique après 6 semaines de traitement ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les souris seront âgées de 8 semaines au début des injections. Les injections de TAA s’étaleront sur 6 semaines. Ce sont les durées généralement utilisées dans la littérature pour induire de la fibrose hépatique au TAA.

300 diamants mandarins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans être tués à l'issue, les adultes rejoignant l'élevage et les jeunes étant proposés à l'adoption. Les couples reproduisent trois mois en cages plus petites que les volières, une partie des jeunes est séparée du père, et chaque jeune passe six jours isolé lors d'un test de mémorisation spatiale, en contact auditif avec ses congénères. Le porteur décrit l'inconfort du confinement et le stress possible de l'isolement, qu'il dit atténuer par un environnement enrichi. Il affirme que l'étude de l'influence sociale sur le développement cognitif "nécessite" une espèce d'oiseau nidicole et exclut tout remplacement.

Objectifs

Chez les vertébrés et les oiseaux, il est reconnu que la qualité des soins parentaux et l’environnement peuvent avoir une incidence importante sur le développement des jeunes, notamment pour les espèces nidicoles. L’environnement social est ainsi essentiel pour les processus d’apprentissage des jeunes. A l’heure actuelle, la majorité des études se sont focalisées sur des comportements particuliers (ex : chant) ou sur la phase post-natale de développement au nid. Au contraire, l’impact de l’environnement social lors de la phase d’adolescence sur les capacités cognitives a été beaucoup moins étudié. Est-ce que l'instabilité du noyau parental affecte le développement cognitif des jeunes oiseaux ? Est-ce que la proximité sociale avec les autres membres de la famille améliore, ou au contraire, détériore le développement cognitif des jeunes oiseaux ? Est-ce que la proximité sociale permet d’atténuer les effets potentiels d’une perturbation du noyau parental ? Pour répondre à ces questions, nous visons à suivre le développement de 60 nichées de diamants mandarins confrontées à des conditions sociales différentes durant leur adolescence. Nous aurons ainsi 4 groupes d’oiseaux dont l’environnement social diffère durant la phase d’adolescence des jeunes. Lors de l’adolescence (après envol du nid) : (1) 15 nichées seront maintenus avec leurs deux parents dans un environnement social classique (grandes cages) ; (2) 15 nichées seront confrontées au retrait temporaire du père dans un environnement social classique (grandes cages) ; (3) 15 nichées seront maintenus avec leurs deux parents dans un environnement de proximité sociale (cages de taille modérée) ; (4) 15 nichées confrontées au retrait temporaire du père dans un environnement de proximité sociale (cages de taille modérée)). Une fois l'adolescence terminée, des tests cognitifs (mesures de mémorisation spatiale) seront effectués chez les individus devenus adultes pour répondre à nos questions. Cette espèce d'oiseau très social a été selectionnée car le père peut rester près des jeunes durant les deux semaines suivant l'envol, mais il peut également laisser sa descendance juste après l'envol pour entamer un nouvel épisode de reproduction. Ces deux conditions (absence ou présence du père) sont donc fréquemment retrouvées dans la nature et correspondent à uns situation "naturelle".

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer nos connaissances concernant l’apprentissage et la mise en place des comportements cognitifs chez les oiseaux nidicoles. Il permettra notamment de mieux comprendre l’impact de l’environnement social (noyau parental et proximité sociale) lors de l’adolescence sur la capacité de mémorisation spatiale des individus.

Procédures

Les animaux reproducteurs seront capturés pour transfert de leurs volières d'hébergement vers les cages de reproduction (2 captures par adulte en plus des captures hébdomadaires pour le suivi de la masse et de la santé des individus). Ces individus seront recapturés pour le retour en volière d'hébergement 3 mois après la mise en cage de reproduction quand les jeunes auront atteints l'age adulte. Les jeunes seront capturés 1 fois pour le transfert de la cage de naissance vers leurs volières d'hébergement. Il seront ensuite capturés 2 fois pour être transférés dans le dispositif de test de mémorisation et pour retourner dans leur volière d'hébergement. Pendant la phase de test de mémorisation, les individus seront isolés de leurs congénères (pendant 6 jours), mais ils resteront en contact auditif. Les procédures de capture et de transfert prendront 3 minutes au maximum. Les jeunes seront également capturés une fois par semaine pour le suivi de leur masse et de leur état de santé).

Impact sur les animaux

La reproduction des individus dans les cages plus petites que les volières pendant 3 mois peut représenter un léger inconfort. Tous les individus concernés seront placés dans des volières de très grande taille suite au projet. L’effet du retrait du père devrait être limité car c’est un âge où les jeunes ne sont plus dépendants de leurs parents pour l’accès à la nourriture. Dans la nature, c’est également un âge ou le père abandonne fréquemment les jeunes en les laissant sous la garde de la mère uniquement. Les tests de mémorisation spatiale pourraient provoquer un stress (6 jours consécutifs) et sera minimisé par des conditions optimisées durant le test (contact auditif avec congénères, reconstitution de l’environnement de la cage de naissance).

Devenir

Du fait des procédures légères utilisées, tous les animaux seront gardés en vie et seront réintégrés à l'élevage de l'établissement utilisateur (adultes) ou adoptés (jeunes).

Remplacement

L’essence de ce projet est de tester l’influence des conditions sociales lors de l’adolescence sur le développement cognitif des oiseaux nidicoles. De ce fait, le remplacement n’est pas possible et l’utilisation d’une espèce modèle d’oiseau nidicole est nécessaire.

Réduction

La taille des 4 lots permettra de disposer d’une quinzaine de couples par traitement, et de 45 jeunes par traitement. Ceci représente une taille adaptée pour tester l’effet des variables considérés sur la mémorisation spatiale. Le nombre de 45 jeunes par condition a été établi à l'aide d'un test dit de puissance et garantit l'obtention de résultats exploitables. Les résultats seront analysés par des tests statistiques dédiés.

Raffinement

La souffrance et l'angoisse des mandarins seront réduites au minimum en (1) fournissant un environnement enrichi aux individus reproducteurs et aux jeunes mandarins (cages enrichies avec jouets, bains, et abris, photopériode adéquate, température optimale); (2) réduisant la durée des interventions pour chaque cage (passage journalier de 10 minutes par cage avec observation des comportements et « scoring » des individus) ; (3) en faisant réaliser les tests cognitifs par du personnel expérimenté et en réalisant ces tests derrière un miroir sans tain.

Choix des espèces

Le diamant mandarin est une espèce classiquement utilisée pour étudier les oiseaux nidicoles en laboratoire. Leur élevage est facile et très bien maitrisé. De plus, c’est une espèce modèle pour étudier la cognition chez les oiseaux et les protocoles de tests cognitifs ont été validés dans de multiples études. C'est par ailleurs une espèce très sociale qui vit avec une proximité des individus très importante. Les individus seront étudiés durant la reproduction (60 couples) et le développement des jeunes issus de cette reproduction (180 individus).

708 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales en sous-cutané puis des injections d'un virus candidat médicament dans la tumeur, avec deux prélèvements sanguins, pour en suivre l'effet sur la croissance tumorale. Le porteur anticipe l'apparition de tumeurs pouvant entraîner perte de poids, mobilité réduite et défaut de toilettage sur une durée maximale de soixante jours. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne reproduit la mise en place des tumeurs, les souris étant tuées au terme et non réutilisables du fait des virus présents dans leur organisme.

Objectifs

Dans le domaine de la recherche en oncologie, l'utilisation de virus thérapeutiques est devenue l'une des principaux axes de recherche. En effet, cette stratégie permet une approche ciblée sur des marqueurs spécifiques des tumeurs et ainsi une attaque focalisée des cellules malades. Dans ce cadre, de nombreux candidats viraux sont testés afin de déterminer l'approche la plus efficace. Ce projet vise ainsi à mettre en évidence l'effet d'un candidat virus sur une lignée de tumeur greffées en sous-cutanée dans un modèle de Souris. Les effets seront suivis sur la croissance tumorale mais aussi sur les facteurs circulant au niveau sanguin. Les données générées nous permettront d'améliorer notre compréhension des mécanismes d'action dans un organisme complexe et de poursuivre le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d'action et son efficacité en fonction de la vitesse de croissance tumorale. Cette dernière sera liée à la quantité de cellules tumorales que nous allons greffer.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets de candidats virus sur une lignée tumorale. Nous pourrons ainsi comprendre leurs capacités d'action et l'impact de leur injection sur des lignée tumorales déjà installées. Cette connaissance nous permettra de mettre en place des virus thérapeutiques permettant de soigner certaines tumeurs chez l'Homme.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par injection sous-cutanée. Celle-ci déclenchera une altération de la capacité de mouvement et une potentielle dégradation de l'état général des animaux. Par la suite, des injections tumorales de virus seront pratiquées. Ces différentes injections sont effectuées en quelques minutes. Deux prélèvements sanguins seront aussi effectués, chacun durant quelques minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous anticipons l'apparition de tumeurs sous-cutanées, qui pourra déclencher une éventuelle perte de poids, une mobilité réduite, un mauvais toilettage. Ce protocole aura une durée maximale de 60 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J60 ou à l'atteinte d'un point limite. Ils ne sont pas réutilisables du fait de la présence de cellules tumorales et de virus thérapeutiques dans leur organisme.

Remplacement

L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que l'oncologie ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèle non animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexe à l'oeuvre dans la mise en place de tumeurs ou la réponse immunologique associée.

Réduction

Ce projet a été mise en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Ainsi, nos connaissances des modèles tumoraux sous-cutanés chez la Souris nous permettent de dimensionner une première étude avec des groupes de 12 animaux par condition. Cet effectif nous permettra de disposer de conclusions statistiquement relevantes. Nous mesurerons les tailles de tumeurs et le poids de manière répétées. Grâce à ces données, nous réaliserons ensuite les études successives impliquant les virus thérapeutiques avec un nombre d'animaux optimal. Le maximum sera de 12 animaux mais si l'étude statistique nous permet de réduire ce nombre, nous essaierons autant que possible d'y procéder.

Raffinement

Les animaux seront placés dans les conditions optimales d'hébergement. Nous injecterons les cellules tumorales sur le flanc. Ensuite l'apparition de tumeurs et leurs croissances seront mesurées trois fois par semaine afin de suivre la progression ainsi que l'effet possible du virus candidat sur celle-ci. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique à température. Nous suivrons à chaque pesée l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, les sites d'injection et l'aspect des tumeurs. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance.En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommendations vétérinaires.

Choix des espèces

Le modèle Souris constitue un bon modèle pour l'étude de modèle tumoraux. En effet, il s'agit de mammifère au système immunitaire assez proche de l'Homme pour disposer d'une approche translationnelle valide. Nous analyserons des animaux âgés de 8 semaines au moment de l'injection. A cet âge, le système immunitaire est suffisamment développé.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome en sous-cutané, puis des séances répétées d'imagerie sous anesthésie et, pour dix d'entre elles, une injection d'immunothérapie, afin de comparer une administration intra-tumorale couplée à un hydrogel à une administration systémique. Le porteur reconnaît un développement tumoral rapide, atteignant des "masses importantes" occasionnant une gêne pour l'animal. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'étudier l'effet d'une thérapie sur le développement de tumeurs, les masses étant prélevées après la mise à mort.

Objectifs

L’avènement de l’immunothérapie dans la prise en charge thérapeutique des cancers a permis, en monothérapie ou de manière combinée, l’amélioration de la survie des patients notamment ceux atteints de mélanome. Cependant, cette thérapie lorsqu’administrée en intra veineux est responsable d’effets secondaires systémiques d’ordre immunologique. Pour pallier ces effets secondaires fréquents et parfois sévères, des équipes ont étudié l’injection de l’immunothérapie intra tumorale direct, déjà utilisée dans des études cliniques avec des résultats prometteurs permettant de réduire le nombre d’injection ainsi que les doses utilisées. D’autre part, les propriétés intéressantes des hydrogels thermosensibles telles que la gélification entre 36 et 38°C ainsi que leur dégradation progressive en font un support de choix pour la délivrance ciblée et progressive de drogues intra tumorales permettant de réduire l’élimination sanguine dans ces tumeurs très vascularisées. L’objectif de notre étude est donc de prouver le bénéfice d’une administration intra tumorale de l’hydrogel chargé de l’immunothérapie dans la survie et la réponse tumorale.

Bénéfices attendus

Démontrer l’efficacité d’une administration ciblée et prolongée d’une immunothérapie par couplage avec un hydrogel. Comparer l’efficacité d’une administration intra-tumorale versus systémique. En effet, une thérapie administrée en intra-tumoral permettrait de s’affranchir des effets secondaires consécutifs à une administration systémique.

Procédures

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuses (Isoflurane ou sévoflurane). Les 60 animaux de l'étude auront une implantation sous cutanée de suspension cellulaire tumorale. Les 10 animaux du groupe traité par immunothérapie en IP auront une injection IP de 30µL avec une aiguille de 26G. Les 60 animaux seront imagés (TEP, échographie, scanner) tous les 5 jours post-implantation tumorale ou tous les 3 jours post-traitement. L'échographie nécessite 10 minutes d'acquisition, le scanner 5 min et l'imagerie TEP 30min.

Impact sur les animaux

Développement tumoral rapide, atteignant des masses importantes occasionnant une gêne pour l'animal.

Devenir

L'intégralité des animaux utilisés dans ce projet sera mise à mort. Le prélèvement post-mortem des masses tumorales étant nécessaires pour les analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro ou in silico pour étudier l’impact d’un nouveau médicament / thérapie sur le développement de tumeurs. La souris est un modèle de choix puisqu’elle permet le développement et le suivi de lignées tumorales. L'induction de modèle de mélanome murin chez la souris est une techniques simple et documentée.

Réduction

Sur l’ensemble de ce projet, nous utiliserons au maximum 60 souris âgées d’au moins 7 semaines (jeune adulte). L’imagerie TEP et l’échographie sont des imageries non invasives qui permettent de suivre un même animal de manière longitudinale et contribuant ainsi à hautement réduire le nombre d’animaux. Le choix du nombre d'animaux par groupe tient compte de la possibilité que la croissance tumorale ne soit pas homogène entre les individuts. Le nombre d'animaux par groupe pourra être réévalué à la baisse suite à l'étude préliminaire sur 10 souris. Le nombre de souris nécessaires par groupe a été défini selon notre expérience et non selon une approche statistique. En effet, l'analyse statistique des résultats par comparaison des groupes se fera par tests (ANOVA 2-way, Wilcoxon ou Mann-Whitney) qui nécessitent un minimum de 6 animaux par groupe.

Raffinement

Au cours de l’étude, les souris seront hébergées entre 2 à 5 individus par cages enrichies de dômes, tunnels ou batonnets de bois et copeaux, sur portoir ventilé, dans une pièce avec des cycles de lumière-obscurité de 12h, dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées en permanence et avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe de souffrance pour la prendre en charge. Pour limiter au maximum la souffrance et le stress des animaux, l’induction des modèles tumoraux se fera sous anesthésie générale selon des protocoles internes validés et une surveillance accrue des animaux se fera jusqu’à leur réveil. La surveillance de l'aspect et de la taille de la tumeur sera réalisée tous les 2 jours afin de vérifier que les points limites spécifiques du projet ne sont pas atteints. Des antalgiques seront administrés en cas de signes de douleurs. Toutes les imageries se feront également sous anesthésie ; nous privilégierons dans ce cas une anesthésie gazeuse qui permet un endormissement et un réveil rapide. Afin d’éviter la souffrance, tout signe et comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée ou en retrait, ou une perte de poids supérieure à 20% du poids initial des animaux ; entraineront la fin de l’expérimentation, et leur mise à mort sans délai.

Choix des espèces

Le modèle tumorale de mélanome est validé dans la litterature sur cette espèce Les animaux seront utilisés au stade adulte, à 7 semaines, conformément au modèle décrit dans la littérature. Après réception, les animaux seront hébergéspendant 7 jours avant le début du protocole.