Oncologie

1 772 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité tuée à l'issue et douze réutilisées. Des cellules de leucémie aiguë myéloïde, de lignées ou issues de patients, leur sont injectées, parfois directement dans le tibia sous anesthésie, pour évaluer de nouveaux traitements. Le porteur cite des effets attendus tels que douleur au point d'injection, douleurs chroniques, perte de poids et développement tumoral, et affirme qu'il n'existe "aucune autre méthode probante" pour remplacer l'animal en préclinique. Les souris sont tuées en fin de procédure pour analyse de l'implantation de la leucémie.

Objectifs

La Leucémie Aigüe Myéloïde (LAM) est une hémopathie maligne traitée principalement par chimiothérapie conventionnelle associé à une forte toxicité et un taux de rechute important. Le projet porte sur l’évaluation de nouveaux traitements et de nouvelles cibles dans les LAM préalablement identifiés et validés in vitro sur modèles cellulaires. Il n’existe actuellement aucune autre méthode probante se substituant à l’expérimentation animale pour les évaluations précliniques. Ce projet est développé par un laboratoire académique et financé dans les tutelles et des associations de lutte contre le cancer et les leucémies. L’étude in-vivo validera les cibles et les candidats médicaments dans des modèles murins C57BL/6 ou NOD-SCIG -gamma (NSG).

Bénéfices attendus

Les retombées du projet sont de valider les effets anti-leucémiques / différenciateurs de nouveaux composés à visée anti-tumorale et de valider de ouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans la leucémie aigue myéloïde.

Procédures

Certains animaux auront une injection en intra-tibial des cellules leucémiques sous anesthésique (isoflurane) et analgésique (buprenorphine). La durée de l'intervention est de 3 à 5 minutes et est effectuée en transcutané sans ouverture. Le nombre de souris minimum (mise au point et xénogreffes de cellules de patients PDX) sera au maximum de 572 animaux. Si les résultats des étapes de mise au point des modes d'injection (intra-péritonéal, intra-veineux ou intra-tibial) pour les lignées leucémiques humaines montrent la nécessité d'effectuer les procédures expérimentales en injection intra-tibiale, ce nombre passera au maximum à 1436 animaux.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont une possible une douleur transitoire au point d’injection, des douleurs chroniques, une perte de poids >15%, le développement excessif d'une tumeur ou grosseur au point d’injection sans que la charge tumorale n’excéde 10 % du poids normal de l'animal sujet aux expériences thérapeutiques, ou qui gêne les mouvements normaux de l’animal ou qui est ulcérée, la perte d’alimentation brutale ou encore une tension abdominale signe de splénomégalie ou d’ascite induisant une forte prise de poids et liée au développement de certains modèles de leucémies aigues myéoïdes, des tremblements, secousses, convulsions, boiteries ou décubitus permanent.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures pour analyse de l'implantation de la leucémie des modèles leucémiques ou des effets des traitements. Les souris controles seront trop agées à l'issues des procédures pour éventuellement être réutilisées dans les procédures d'implanation des cellules leucémiques.

Remplacement

L'objectif est d'évaluer les effets anti-cancéreux et/ou différentiateurs de nouveaux composés anti-cancéreux. La souris est le modèle animal le plus largement utilisé par la communauté scientifique en oncologie et étude de effets antitumoraux in vivo. Le modèle murin immunodéficient est le seul disponible pour la mise en place de modèles de leucémies induites à partir de lignées ou cellules humaines. Certaines lignées utilisées sont des lignées murines : le modèle murin syngénique sera alors utilisé.

Réduction

Le nombre d’animaux sera de 3 par groupe pour les étapes de mise au point des modèles et à 8 par groupe pour les expérimentations proprement dites, nombre modulé selon une évaluation statistique par tests non paramétriques pour atteindre une valeur statistique de p-value

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe afin d’éviter le stress de l’isolement et avec des enrichissements du milieu. Le personnel est compétent pour déterminer si l’animal n’est plus dans sa zone de confort et la Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) de notre plateforme garantit l’amélioration des soins et des conditions de vie des souris. Si l'un des points limites est atteint (perte de poids, détérioration irréversible de l’état de l’animal impactant sa survie, perte d’alimentation brutale, forte prise de poids, tremblements, secousses, convulsions, boiteries, décubitus permanent), l'animal sera euthanasié pour arrêter ou empêcher des souffrances.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus largement utilisé par la communauté scientifique en oncologie et étude des effets anti-tumoraux in vivo. Le modèle murin immunodéficient est le seul disponible pour la mise en place de modèles de leucémies induites à partir de lignées ou cellules humaines. Certaines lignées utilisées sont des lignées murines : le modèle murin syngénique doit alors être utilisé. Animaux injectés à 4-8 semaines (optimum de prise de leucémie décrit dans la littérature et validé antérieurement au laboratoire).

690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent gavages, injections intrapéritonéales, une inhalation et une irradiation reproduisant l'exposition à des substances génotoxiques comme l'acétaldéhyde, le formaldéhyde ou les UV, pour étudier la réparation de l'ADN et le risque de cancer. Le porteur indique que les irradiations peuvent provoquer une inflammation aiguë de la peau et affirme que l'exposition aux produits mutagènes sera trop courte pour causer des lésions visibles. Les souris sont ensuite tuées pour analyse des tissus et organes.

Objectifs

Les ultraviolets et les psychotropes comme le tabac ou l’alcool contribuent au développement de tumeurs. L’exposition à la lumière UV ainsi qu’aux drogues récréatives endommagent l’ADN des cellules humaines et augmentent le risque de cancers dans la population en induisant des mutations sur l’ADN. Les altérations produites par ces substances nuisibles à l’ADN sont pris en charge par des systèmes de protection de l’ADN tels que la réparation par excision de nucléotides (NER) et, à défaut, par les polymérases translésionnelles (TLS). Des lésions non réparées entraînent des mutations qui augmentent le risque de cancers. Ces produits communément présents dans de nombreuses drogues récréatives, tels que l’acétaldéhyde, le formaldéhyde et le benzo(a)pyrène, ainsi que l’exposition prolongée et chronique aux UVs, produisent une large gamme de lésions à l’ADN qui sont réparées par le NER. Xeroderma Pigmentosum (XP) est une maladie génétique rare causée par une déficience constitutive du NER. Les patients XPs ont un risque de cancer de la peau 10 000 fois plus élevé, dû à leur inaptitude à réparer les dommages induits par les UV. Il a été montré que les patients XP ont un risque de cancer interne plus de 100 fois plus élevé. Les processus mutationnels impliqués ne sont pas bien compris. Il est possible qu’ils soient dus à l’action de sources mutationnelles interne ou externe au corps, telles que l’acétaldéhyde ou le formaldéhyde. De plus, une augmentation du risque de cancers corrélé à des mutations délétère sur un allèle (mutation inactivant une copie d’un gène, c’est-à-dire une mutation hétérozygote) de gènes du NER a été montrée dans des modèles murins et humains. La consommation excessive des psychotropes cités pourrait impacter le risque de cancer chez des porteurs de ces mutations NER dans la population générale. Certaines populations présentent ces mutations hétérozygotes de manière particulièrement fréquente, allant de 0,5 à 2% de la population. L’évaluation de la susceptibilité aux cancers associés à l’abus de ces substances, ainsi qu’à l’exposition excessive aux UV est donc de haute pertinence clinique. Notre projet vise à identifier les conséquences au niveau de l’ADN et des mutations engendrées par l’exposition chronique d’animaux adultes et pendant la grossesse à ces substances cancérigènes et au rôle joué par le NER et la voie des TLS.

Bénéfices attendus

Identifier la quantité et le type de mutations engendrés par ces sources cancérigènes chez nos souris nous permettra de préciser les diagnostiques fait pour les cancers humains, ainsi que la mise en évidence d’une potentielle population particulièrement à risque pour l’exposition à ces substances.

Procédures

Gavages: nombre= 3, durée = 2 minutes . 4 injections intrapéritonéales :30 secondes:. Inhalation (1), durée: 10 minutes. Irradiation (1) : durée: 14 minutes.

Impact sur les animaux

Les irradiations sont susceptibles de provoquer des inflammations de la peau de manière aigue et contenue à la zone d’irradiation. L'exposition aux produits mutagènes ne sera pas d'une durée suffisante pour provoquer des lésions macroscopiques qui entraîneraient des nuisances.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les tissus et organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux se révèle essentielle pour l’étude de la mutagenèse dans un contexte prénatal. En effet il est impossible de répliquer ce processus complexe de développement ex vivo. Pour ce qui est de la tumorigenèse induite par les UV, les études In vitro, bien que points de départ nécessaires et importants, ne nous permettent pas de modéliser ni de prendre en compte le processus complexe qu’est la tumorigenèse chez un être vivant complet, avec toutes les interactions entre organes.

Réduction

Notre projet n’étudie pas de caractéristiques quantifiables sur les animaux mêmes, mais sur des séquençages fais à partir de tissus récupérés sur ces animaux. De ce fait, les statistiques elles-mêmes sont fait sur les résultats de séquençage, et ne prennent pas en compte le nombre d’animaux. Nous avons besoin de 10 individus différents par génotypes et traitements pour rendre nos statistiques robustes sur l’analyse haut débit.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les animaux, ceux-ci sont suivis quotidiennement par le même manipulateur et les mêmes animaliers. Pour les interventions et procédures des anesthésies seront effectuées. Un traitement d’appoint sous forme de crème analgésique est prévu en cas d’inflammation cutanée suite aux expositions aux ultraviolets. Des points limite et des critères d'arrêt de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les 9 modèles nécessaires sont tous d’ores et déjà existants chez la souris sur un fond génétique C57BL/6 et/ou BALB/c. L’organisation du système vasculaire de la souris et les relations avec le microenvironnement tumoral sont très proches de celles observées chez l’Homme. L’utilisation de la souris permet d’obtenir des effectifs suffisants et des lots homogènes permettant une reproductibilité des résultats. Les stades choisis sont justifiés par les maladies qui peuvent apparaître, suivant les carcinogènes, à différents stades de la vie dans l'espèce humaine. Des femelles et mâles à maturité sexuelle (à partir de 8 semaines) pour les expériences sur les animaux adultes et pour permettre un maintien de la lignée. Des femelles pour les traitements au cours de la gestation. Pour analyser la mutagenèse prénatale après exposition aux différentes génotoxines, nous aurons besoin d'individus âgés de 2 à 3 semaines.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de lymphome leur est implantée sous la peau par chirurgie sous anesthésie, puis suivie par des séances d'imagerie IRM sous anesthésie, jusqu'à quatre par animal, pour démontrer l'intérêt de cette imagerie en oncologie. Le porteur indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % entraîne la mise à mort de l'animal. Les souris sont tuées en fin de procédure pour congélation ou fixation des tumeurs.

Objectifs

Le projet présenté vise à démontrer l'intérêt et la valeur ajoutée de l'utilisation de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) en oncologie . L'IRM est une technique d'analyse de tumeurs implantées chez l'animal qui est non invasive, précise et utilisée en clinique. Nous attendons de l'IRM qu'elle permette de raffiner les études précliniques et ainsi à terme d'optimiser la règle des 3R, mais également qu'elle permette de travailler avec des modèles tumoraux inaccessibles aux méthodes classiques. Le projet présenté rentre dans ce dernier cas de figure. Il porte sur le suivi par IRM d'un modèle de lymphome implanté en sous-cutané chez la souris immunocompétente. Ce modèle présente un intérêt fort pour comprendre les mécanismes d'apparition de résistances aux anticorps thérapeutiques, mais ne peut pas être étudié avec des méthodes conventionelles. En effet, après l'implantation sous cutanée du modèle tumoral, se développe à l'emplacement soit une masse tumorale, soit une masse inflammatoire, qui ne peuvent pas être discriminées par les méthodes d'observation et de mesure. L'IRM permettra de faire cette discrimination. Le projet prévoit d'utiliser 30 souris, 10 pour amplifier la modèle tumoral in vivo, 20 pour l'analyse IRM.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra de caractériser un modèle de cancer du sang, le lymphome B, afin de développer un variant permettant de comprendre les mécanismes d’apparition de résistances à un anticorps thérapeutique. Il permettra aussi d'obtenir des données scientifiques afin de promouvoir l'utilisation d'une technique non invasive en oncologie préclinique, technique dont la précision permettra à terme d'optimiser les 3R dans ce contexte.

Procédures

-implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute, administration d’antalgiques au préalable ; traitement si douleur post opératoire 20 minutes maximum -anesthésie fixe durant l’IRM durée maximale 30 minutes de kétamine/Xylazine sur un total de 2/semaine durant 2 semaines soit 4 injectionx maximum.

Impact sur les animaux

- Perte de poids constatée : plus de 10% non améliorée par ajout de nourriture humide en maximum 24h ; une perte de plus de 20% qui serait liée à l'évolution de la croissance entrainera une mise à mort de l’animal - implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute administration d’antalgiques au préalable ; - croissance de tumeurs sous-cutanée au niveau du flanc - anesthésie fixe durant l'IRM pour une durée maximale de de 30 minutes,4 séances maximum espacées de 3 jours au minimum

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de chaque procédure (soit pour congelation des tumeurs pour le stock soit pour fixation en formol).

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude par IRM du développement d’une tumeur ne peut se faire que sur l’organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de conclure de façon fiable statistiquement au taux d’anomalies de croissance tumoral. Nous utiliserons 10 souris + 20 souris soit 30 souris totales, et ferons une étude statistique d’analyse de contingence et un test de Fischer pour comparer avec une situation normale.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Des prélèvements en point final des tumeurs seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Pour les modèles implantés sous la peau par chirurgie, les animaux seront traités avec un antalgique avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie. La procédure d’imagerie IRM se fera sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 5 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser.

45 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau, puis des injections de nanoparticules et des séances d'imagerie IRM et scanner sous anesthésie, pour optimiser la dose à injecter. Le porteur qualifie la douleur chirurgicale de modérée, avançant que le cerveau n'est pas innervé et que seule l'incision du cuir chevelu fait mal. Il justifie le recours à l'animal par la complexité du développement tumoral, impossible selon lui à reproduire in vitro.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie guidée par l'image grâce à l’utilisation de nanoparticules. Une nanoparticule radiosensibilisante (en cours de développement clinique) a été développée pour permettre une imagerie bimodale par résonance magnétique (IRM) et tomodensitométrie (TDM). L’objectif principal de ce projet consiste à optimiser la dose de nanoparticule à injecter chez le rat pour visualiser la tumeur en IRM et en TDM. Nous avons préalablement évalué in vitro (sur cellules tumorales humaines) l’intérêt s de ces nanoparticules pour les 2 modalités d’imagerie, la toxicité des nanoparticules ainsi que l’efficacité thérapeutique en association avec la radiothérapie et avons ainsi pu démontrer leur pouvoir « radiosensibilisant » et leur intérêt pour de l’imagerie bimodalité. Nous souhaitons confirmer ces résultats très prometteurs sur un modèle de tumeur cérébrales chez le rat et optimiser les conditions d’imagerie.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

Chirurgie 1h sous anesthésie gazeuse. 1 fois Imagerie par bioluminescence : injection intra-péritonéale sur animal vigil (quelques secondes) puis15 min d'imagerie sous anesthésie gazeuse. 1 fois Injection de nanoparticule par voie intraveineuse dans la veine de la queue ( quelques secondes) : 2 fois à 3 jours d'intervalle. Imagerie par tomodensitométrie sous anesthésie gazeuse : 30 min; 2 fois Imagerie IRM sous anesthésie gazeuse : 20 min; 2fois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire . Malgré une opération invasive due à l’incision de la peau du crâne et à l’injection de cellules intracérébrale, la douleur engendrée par l’acte chirurgical est estimée modérée, car dès le lendemain le rat se laisse manipuler aisément, ne montre aucun signe de peur (cris, prostration, agressivité) lors du nettoyage de la plaie. Le cerveau n’étant pas innervé, la douleur principale engendrée par l’opération provient de l’incision de la peau du crâne que nous estimons légère. Utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Imageries non invasives réalisées sous anesthésie volatile.

Devenir

Animaux mis a mort à la fin de la procédure ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau ainsi que les organes seront prélevés pour analyse macroscopique et histologique.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus la distribution des nanoparticules in vivo est indispensable pour évaluer leur intérêt en imagerie. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance tumorale ainsi que la prise de contraste par les nanoparticules. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif de la procédure conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux depuis le site d’hébergement et de chirurgie vers les sites d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par les limitations de résolution offertes par l’imagerie. Les rats nude (dépourvus d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des rats mâles, sexe utilisé jusqu’à présent dans nos études antérieurs afin de pouvoir confronter nos résultats. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas sur lequel nous nous basons pour injecter les cellules tumorales dans un endroit précis du cerveau.

120 souris gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes d'un médicament entre le 12e et le 18e jour de gestation, avec des prises de sang sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser placentas et fœtus. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable grave et signale qu'un tiers des animaux livrés peuvent ne pas être gestants. Il justifie le recours à l'animal par l'absence de modèle in vitro reproduisant l'interaction entre la mère, le placenta et le fœtus.

Objectifs

Décrire l'effet d'une classe médicamenteuse sur les marqueurs sanguins de la maladie (molécules circulantes dans le sang maternel) en cours de gestation animale. Décrire d'éventuels effets toxiques de cette classe méicamenteuse sur l’évolution des fœtus en cours de gestation animale.

Bénéfices attendus

Le développement de thérapeutiques est une priorité de la recherche en médecine périnatale. Le bénéfice attendu de nos recherches est d'apporter la preuve de concept sur un model d'animal gestant qu’une classe médicamenteuse permet potentiellement de ralentir l’évolution de la maladie sans effets secondaires indésirables sur le developpement foetal. Cette preuve de concept permettra de decliner des propositions d'études médicamenteuses avec des molécules déja commercialisées utilisables chez l'espèce humaine.

Procédures

L’injection quotidienne des médicaments est un acte peu douloureux et peu stressant quand il est réalisé par un opérateur entrainé. Cette procédure est réalisée quotidiennement par un très grand nombre d’équipes de recherche. L’injection de médicament sera effectuée entre le 12e et le 18e jour de la gestation. Les prises de sang (réalisées 3 fois dans notre protocole de recherche, 12e, 15e et 18e jour de la gestation) seront systématiquement réalisées sous anesthésie générale pour limiter au maximum à la fois le stress et la douleur des animaux.

Impact sur les animaux

Aucun effet secondaire, ni indésirable grave n’est attendu des gestes réalisés en cours de gestation (injection de médicament, prise de sang) au cours de notre protocole. Aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée sur les animaux jusqu’au jour de l'euthanasie.

Devenir

Chaque animal sera euthanasié en fin de procédure au 7ème jour du protocole expérimental c’est-à-dire au 18e jour de gestation. L'euthanasie se justifie par la nécessité d’une prise de sang maternel de plus gros volume et l’analyse systématique des placentas et des fœtus. Nos procédures d’analyses ne sont pas possibles après la parturition et la mise bas des portées.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de remplacer l’interaction entre la mère, le placenta et le fœtus au cours de la gestation. C’est pourquoi en recherche en reproduction le modèle d’animal gestant reste indispensable à ce jour. De plus cette étape experimentale est incontournable pour repérer les éventuels effets malformatifs ou délétères pour la gestation de classes médicamenteuses.

Réduction

Compte tenu de la variabilité du nombre de fœtus par portée et de la variabilité des dosages in vivo, le nombre nécessaire pour montrer une différence significative entre deux groupes est de 8 animaux par groupe. De plus, l’établissement éleveur qui nous procure les animaux gestants, ne peut nous assurer la gestation des animaux à la livraison. Les animaux non gestants peuvent représenter jusqu’à 1/3 de l’effectif total d’animaux prévus initialement. Nous profitons de cette procédure experimentale pour tester un appareil de monitorage du pH tissulaire in vivo le jour de l'euthanasie. Le fait d'effectuer ce test au cours de notre protocole sur souris gestante, ne biaise pas nos données experimentales, n'allonge pas la procédure de manière à perturber nos analyses et surtout permet de diminuer le nombre total d'animaux utilisés pour nos recherches.

Raffinement

Les critères objectifs de souffrance et/ou la détresse d’un animal seront quotidiennement évalués. L’expérimentation sera systématiquement interrompue pour chaque animal en cas d’atteinte des points limites préalablement définis par une grille de suivi. Nous prévoyons de tester systématiquement la dose la plus faible de médicament et d’arreêer en cas d’effet mesuré significatif.

Choix des espèces

Le modèle murin est choisi pour plusieurs raisons : - Son type de placenta est proche de celui de l’expèce humaine - Les molécules responsables de la maladie humaine sont également retrouvées dans le sang maternel au cours de la gestation chez la souris. Les dosages de ces molécules chez la souris sont commercialisés. - Le modèle de gestation chez la souris est systématiquement utilisé de par le monde pour étudier de potentiels effets deletères de classes médicamenteuses en cours de gestation.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Francisella novicida par voie intradermale, certaines après une injection dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine IRF2 dans la réponse immunitaire. Le porteur décrit des points limites, léthargie, prostration, détresse respiratoire, déclenchant la mise à mort, et affirme que la phase précoce de l'infection reste peu agressive. Il qualifie ces expériences d'"absolument indispensables" et justifie le recours à la souris par l'accès aux animaux génétiquement modifiés.

Objectifs

La tularémie est une maladie causée par la bactérie Francisella novicida. Elle touche les mammifères, particulièrement les lièvres et les rongeurs. Ceci permettra d’utiliser la souris comme modèle d’étude, afin d’avoir accès aux KO. La tularémie est une zoonose et peut être transmise à l’homme et causer des problèmes cutanés, digestifs ou respiratoires. C’est une maladie à déclaration obligatoire. Environ 50 cas de tularémie sont déclarés chaque année en France. La tularémie représente également une arme bactériologique. L’objectif de l’équipe est de mieux caractériser les réponses immunes induites lors d’une infection par Francisella, et notamment le rôle des Interferon Regulatory Factors (IRFs), facteurs de transcription impliqués dans la régulation de l’expression ainsi que la réponse aux interférons de type 1, cytokines essentielles pour la régulation de l’inflammasome mais dont le rôle n'est pas bien connu lors des infections bactériennes. Grâce à des travaux préliminaires dans l’équipe, un rôle d’IRF2 dans la régulation de l’inflammasome in vitro a été identifié. L'objectif serait donc de tester si IRF2 joue également un rôle in vivo dans la régulation de l’inflammasome. Pour ce faire, un modèle d’infection murin intradermal par la bactérie Francisella novicida sera utilisé. De plus, étant donné le rôle majeur des cellules Natural Killer (NKs) durant la réponse anti-bactérienne innée contre Francisella, les rôles des NKs et leur état d’activation lors de l’infection par Francisella novicida dans des souris WT ou déficientes pour IRF2 seront étudiés. Le ciblage d'IRF2 pourrait fournir de nouvelles modalités thérapeutiques pour le traitement de pathologies médiées par l'inflammasome. Les résultats attendus in vivo sont une susceptibilité à Francisella novicida conduisant à une mort prématurée des animaux IRF2 -/- infectés comparés aux WT. Le nombre d’UFC dans les organes des souris WT et IRF2 -/- sera quantifié. Les concentrations des cytokines IL-1b, IL-18 et IFN-g seront également dosées dans le sérum de ces animaux. Les résultats obtenus lors d’une infection par Francisella pourraient être extrapolés pour d’autres pathogènes intracellulaires. Des études préliminaires au laboratoire ont montré que l'expression de la Gasdermine D est régulée par IRF2. Des souris déficientes pour la Gasdermine D, protéine cytosolique qui médie la pyroptose, mort cellulaire programmée activée par l'activation de l'inflammasome, seront donc également utilisées.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux caractériser comment le facteur de transcription IRF2 affecte la réponse immunitaire de l’hôte. Une meilleure compréhension de ce système devrait aider au développement de nouveaux médicaments impliqués dans la réponse immunitaire chez l’hôte, notamment en ciblant la voie des IFN de type 1.

Procédures

Les animaux subiront une injection IV à J0 dans le sinus rétro-orbital une fois (2 minutes par injection), puis 3h après, à J0, ces mêmes animaux subiront une injection intradermale de Francisella novicida (2 minutes par injection) (Procédure #2). Les animaux seront sacrifiés 48h pi 51 minute par injection) avant la collecte des organes et du sang. Pour les Procédures #1 et 3, les animaux subiront une injection intradermale de Francisella novicida à J0 (2 minutes par injection) et seront mis à mort 48h post infection (1 minute par injection) avant la collecte du sang et des organes pour la procédure #1, et au plus tard une semaine après à J7 pour la procédure #3 (développement des symptômes).

Impact sur les animaux

Le transfert de NKs ne devrait créer aucun stress. Cependant, les injections en rétro-orbitale seront réalisées sous brève anesthésie à l'isoflurane après application d'un collyre anesthésique sur l'oeil. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroide et un antibiotique à large spectre (framycétine). Concernant l’infection, les animaux seront surveillés tous les jours avec des points limites parfaitement définis. La souche bactérienne utilisée est très bien caractérisée et les souris ne resteront pas plus de 48h en sa présence (Procédures #1 et 2), ce qui correspond à la phase précoce de l’infection, connue pour être moins agressive. Les animaux ne perdent pas de poids dans les 48 premières heures de l'infection. Pour la procédure #3, expérience de développemnt des symptômes, le nombre de CFU utilisé est moindre (1000 CFU) par rapport aux procédures #1 et 2 (5000 CFU) et les animaux seront surveillés une fois par jour dès 24h puis deux fois par jour à partir de 72h d’infection pour détecter toute forme de souffrance. Les animaux seront mis à mort en cas d'atteinte des points limites suivants: pas de mouvement de fuite lors de la saisie, prostration, dos vouté, poils ébourrifés, détresse respiratoire.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux

Remplacement

Les questions posées ici nécessitent un système complexe, et ne peuvent pas être investiguées dans des modèles in vitro ou dans des modèles in vivo utilisant des animaux invertébrés. Toutes les expérimentations préliminaires ont été réalisées in vitro, afin de valider notre hypothèse.

Réduction

De nombreux paramètres de l’hôte et de la bactérie seront étudiés sur chaque animal pour réduire au maximum le nombre de répétitions expérimentales. Une étude bibliographique a été réalisée pour utiliser les doses les plus adéquates de pathogènes au cours des expériences. Les expériences réalisées ici sont considérées comme absolument indispensables pour connaitre le rôle d'IRF2 et des NKs, in vivo. L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique, et a été réduit au maximum sans mettre en péril l'interprétation statistique de nos résultats. Ainsi, un minimum de 7 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Pour les conditions naives, 3 animaux par groupe seront utilisés. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximal d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra être diminué en fonction des résultats obtenus, notamment si le projet in vivo n’est pas concluant. Ainsi, si la procédure #1 ne montre aucun phénotype notable, les procédures #2 et #3 ne seront pas réalisées.

Raffinement

Avant les procédures, les animaux seront entrainés à être contentionnés pour éviter tout stress pendant la procédure. Lors des procédures, les points limites sont suffisamment prédictifs pour éviter l’utilisation des antalgiques et il sera toujours possible d'arrêter la procédure de manière anticipée pour qu’à aucun moment, un animal ne souffre. En effet, en cas de souffrance, l’animal sera mis à mort. Une surveillance journalière (à partir de 24h d’infection) sera réalisée pour détecter toute forme de souffrance pour les procédures #1, #2 et #3, et bijournalière à partir de 72h pour la procédure #3. Plus concrètement pour l'infection: les souris seront suivies une fois par jour pour les procédures #1 et #2 pour détecter l’apparition du moindre point limite défini plus bas. Les souris seront mises à mort par injection d’exagon en cas d’atteinte de l’un des points limites suivants : animal léthargique : pas de mouvement de fuite lors de la saisie, prostration, dos vouté, poils ébouriffés, détresse respiratoire. Pour l'injection de NKs, dans le cas où l'oeil montrerait des signes d'inflammation après l'injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticosteroide et un antibiotique (framycétine).

Choix des espèces

La pertinence physiologique d’IRF2 et de Gasdermine D dans la réponse immune à Francisella ne peut être investiguée dans des modèles in vitro ou dans des modèles utilisant des animaux invertébrés du fait de la nécessité i) de travailler dans un système intégré, et ii) d'utiliser les souris pour avoir accès aux souris KO. Par ailleurs, les invertébrés ne présentent pas d’inflammasome. De plus, la souris est un très bon modèle d’étude de la réponse immune contre des bactéries intracellulaires. Nous utiliserons des souris transgéniques IRF2 KO ainsi que des souris non transgéniques IRF2 WT issues de mêmes portées. Il ne s'agit pas d'un phénotype dommageable. Des études préliminaires au laboratoire ont montré que l'expression de la Gasdermine D est régulée par IRF2. Nous réaliserons donc les procédures #1 et #3 également sur des souris déficientes pour Gasdermine D. La Gasdermine D est une protéine cytosolique qui médie la pyroptose, mort cellulaire programmée activée par l'activation de l'inflammasome. Souris de 6 à 8 semaines. Système immunitaire mature à l’âge adulte.