Oncologie

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'un aérosol, puis reçoivent des composés par gavage cinq jours par semaine pendant quatre à huit semaines, avec une perte de poids pouvant conduire à la mort et une mise à mort à 20 % du poids perdu, avant le prélèvement des poumons et de la rate. Le porteur situe le projet dans un consortium européen et revendique un "besoin" de générer un maximum de données. Il affirme que les essais précliniques reposent sur le recours à l'"organisme entier".

Objectifs

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la sélection in vivo de molécules comme traitement ou encore vaccins avant leur passage en essais cliniques. Le projet européen, dans lequel nous sommes partenaires, est engagé dans le développement de nouvelles molécules anti-tuberculeuses. Ce projet, qui ne compte pas moins de 30 partenaires de 13 pays différents, a pour ambition d’accélérer les processus qui conduiront à la sélection de nouveaux composés et nouvelles combinaisons efficaces comme traitement contre la tuberculose avant leur entrée en phase clinique. Les nouvelles molécules sont synthétisées par des groupes pharmaceutiques partenaires, sont testées par une partie du consortium en charge des expériences in vitro et les plus prometteuses (seule ou en combinaison) passent ensuite à l’étape in vivo pour évaluer leur véritable potentiel sur un organisme vivant. Nous intervenons, avec d’autres groupes, d’autres modèles, à ce niveau-là. Notre participation à ce projet permettra de générer in vivo des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques chez le modèle murin pour un nombre limité de molécules savamment sélectionnées ; données qui, analysées et intégrées à l’ensemble de celles générées par le consortium, participeront donc à l’optimisation et au développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux, à valider ou non leur passage en phase clinique.

Bénéfices attendus

Les données générées par nos expériences combinées à celles des divers partenaires rendront compte de l’efficacité de nouveaux composés contre l’agent pathogène de la tuberculose, dont certains, telle est l’ambition de ce projet, pourront passer en phase clinique. A cela, l’apport de nouvelles technologies, l’apport de nombreuses données inédites pour caractériser la tuberculose et son évolution in vivo (imagerie, biomarqueurs…) seront un support essentiel pour le développent de meilleures armes pour lutter contre cette maladie qui demeure un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial.

Procédures

1. L'infection des souris par des souches virulentes de bacilles tuberculeux est effectuée par une exposition à un aérosol. Une seule exposition d’une vingtaine de minutes en début d’expérience. 2. Lors du traitement, les composés sont administrés par gavage 5 jours par semaine pendant 4 à 8 semaines. Il y a 1 gavage par jour par souris. Le nombre de gavages total par souris au cours de l’expérience variera selon qu’une souris soit un contrôle du niveau d’infection ou bien reçoive un traitement de 8 semaines, ou encore permette d’obtenir des données pharmacodynamiques à des stades intermédiaires, par conséquent de 0 à 40 gavages. Le geste technique en lui-même ne prend que quelques secondes. 3. Des prélèvements sanguins de faible volume seront effectués au niveau de la queue pour l'étude de la biodisponibilité́ des composés. Un faible volume de sang (~ 30 µl) sera prélevé au niveau d’une incision faite sur la veine caudale. L’animal, vigile, est pour cela placé dans un dispositif l’immobilisant et ne laissant dépasser que la queue. Une pression est ensuite effectuée au niveau de l’incision avec une compresse imbibée d’alcool pour stopper le saignement. Il y aura au maximum 2 prélèvements – à plusieurs heures d’intervalle – pour chaque souris sélectionnée pour l’étude pharmacologique. Il s’agit d’un acte rapide qui doit prendre 1 à 2 min. 4. Pour l’analyse de biomarqueurs, des prélèvements de sang seront effectués par ponction cardiaque sur animaux anesthésiés avant leur mise à mort prévue pour le prélèvement des organes. Sont concernés l’ensemble des animaux de l’expérience (maximum 120). Une fois les animaux anesthésiés, le geste technique ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Sur la base de nos expériences, l’apparition de signes cliniques (déambulation perturbée due à un début de parésie et piloérection) plusieurs semaines après une infection avec des bacilles tuberculeux est précurseur d’une perte de poids qui a terme peut conduite à la mort des animaux. Habituellement à partir de leur apparition, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué. Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considérée comme point limite et les animaux concernés seront mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Dans le cas présent, et du fait d’un besoin de générer un maximum de données relatives aux expérimentations, les animaux identifiés par un marquage aux oreilles seront pesés une fois par semaine avec pour premier point celui correspondant au jour de l’infection. A noter que la probabilité de voir l’apparition de signes cliniques sera fortement diminuée pour les groupes d’animaux traités avec une molécule anti-tuberculeuse. Une attention particulière sera portée sur le groupe témoin non-traité avec toujours pour point limite la perte de 20 % du poids.

Devenir

Tous les animaux au cours de la procédure doivent être mis à mort pour prélever les organes cibles (poumons et rate) pour déterminer les charges bactériennes.

Remplacement

Cet important projet comprend de nombreuses études in vitro pour évaluer, entre autres, l’efficacité́ bactéricide des composés (exemple : via l’infection de lignée cellulaire). Néanmoins elles permettront de ne répondre qu’à une partie de la problématique. Ces modèles ne permettent pas d’identifier et donc de caractériser, de façon biologiquement pertinente, tout ce qui concourt, par exemple, à la colonisation du poumon et à l’établissement plus ou moins durable des bactéries. En d’autres termes le recours aux souris, chez qui le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons plus ou moins importants selon la virulence de la souche, permet de reproduire les processus rendant compte de ce qui sous-tend les premières phases du parasitisme – colonisation, persistance ...- des différentes populations des bacilles tuberculeux et rend compte de manière plus approfondie des phénotypes complexes d’une interaction hôte-pathogène. Les essais pré-cliniques de nouveaux médicaments antituberculeux reposent entièrement sur la combinaison des méthodologies in vitro avec ces approches in vivo (comprendre la réponse d’un organisme vivant « entier » à un traitement) avant un éventuel passage en phase clinique.

Réduction

Au sein de ce projet, une équipe de statisticiens spécialisés dans les études pré-cliniques a pour rôle de concevoir avec les expérimentateurs les designs expérimentaux en trouvant le meilleur équilibre entre les capacités (techniques et d’hébergement) des différentes équipes et la pertinence des données à générer pour répondre au mieux aux problématiques posées. Et ce, avec toujours en tête, la réduction au minimum du nombre d’animaux nécessaire. Exemples : .pour le groupe témoin traité avec une molécule dont l’efficacité est connue et très bien documentée, seul un nombre limité d’animaux seront mis à mort et uniquement en un seul point de cinétique. La charge bactérienne alors estimée en UFC par rapport à celle avant traitement donneront une tendance sur l’efficacité de la réponse qui sera comparée aux multitudes de données pour ce composé déjà existantes et qui permettront d’établir la cinétique sans avoir eu à utiliser des animaux pour des points de cinétique intermédiaires. .pour une étude avec un nouveau composé et donc avec peu voire pas de donnée de disponible, plus d’animaux seront nécessaires pour décrire la réponse au traitement au cours du temps. Néanmoins, nous ne cesserons d’optimiser au minimum le nombre d’animaux requis. Il peut être envisagé d’avoir 5 animaux pour seulement 1 ou 2 points clefs de la cinétique, comme 4 semaines et 8 semaines – dans le cas d’un traitement de 8 semaines – et ainsi obtenir des données statistiquement robustes sur ces points charnières. Ensuite sur des points intermédiaires comme à 1 semaine, 3 semaines ou 5 semaines après le début de traitement, ne mettre à mort « que » 2 animaux serait suffisant pour estimer la cinétique de la réponse. A nouveau, tout ceci repose sur l’étroite collaboration mise en place avec ces spécialistes de la modélisation informatique d’essais pré-cliniques qui analyseront l’ensemble des résultats du consortium. La procédure expérimentale ne cessera d’être optimisée, notamment en termes de nombre de points d’observation / nombre d’animaux par points au cours du traitement ou encore sur la durée entre l’ingestion des composés et le prélèvement de sang périphérique, avec toujours cette considération à minimiser les contraintes de manipulations et réduire au minimum le nombre d’animaux pour l’obtention de données utiles. A noter qu’il a été délibérément choisi que ce soient les mêmes animaux qui serviront à l’obtention des données pharmacocinétiques et des données pharmacodynamiques.

Raffinement

Des observations régulières des animaux sont effectuées tout au long de l’expérience : d’une part lors de la pesée hebdomadaire depuis l’infection jusqu’au début du traitement puis au cours des administrations quotidiennes des composés. De manière plus précise, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base de nos expériences, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids à une fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal étant mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considéré comme point limite et l’animal concerné sera mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Il est à noter également que les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel.

Choix des espèces

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la recherche in vivo de nouveaux traitements anti-tuberculeux. Le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection tuberculeuse ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons. Pour ce projet nous utiliserons des souris commerciales immunocompétentes C57BL/6 et BALB/c pour lesquelles de nombreuses données bibliographiques d’études pré-cliniques existent. Nous serons également amenés à utiliser un modèle de souris dont l’intérêt est grandissant depuis quelques années : la souris C3HeB/FeJ dite « Kramnik ». Il s’agit d’un modèle plus susceptible à l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis pouvant induire des lésions nécrotiques et reflétant au final plus fidèlement la stratification et la pathogénèse de la tuberculose chez l’homme. Nos travaux sont effectués sur des animaux adultes car nous avons besoin d’organisme mature en particulier sur le plan immunitaire.

1 410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales qui provoque une pousse tumorale, avec baisse des interactions sociales et de la mobilité dans les dernières 24 heures, avant le prélèvement de plusieurs organes pour analyser les cellules Natural Killer. Le porteur relie le projet à un financement de la Ligue contre le Cancer. Il affirme que la complexité du système immunitaire rend impossible son étude in vitro.

Objectifs

Les cellules NK (Natural Killer) sont primordiales dans la défense anti-tumorale. En effet, celles-ci appartiennent à la première ligne de défense du corps contre les agents pathogènes et les cellules cancéreuses en ayant les capacités de les éliminer suite à leur reconnaissance. Cependant, lorsqu'elles sont trop sollicitées, celles-ci s'épuisent et n'arrivent plus à éliminer les cellules tumorales ce qui explique l'échappement tumoral. Ce projet vise à générer et étudier une population de cellules NK dites "épuisées" dans le but d'identifier des cibles thérapeutiques pouvant bloquer ce phénomène impliqué dans l'échappement tumoral. Nous avons identifié de multiples altérations chez ces cellules NK épuisées mais les conditions de génération de cette population ainsi que la chronologie des dysfonctions sont inconnues. Le but de ce projet, intégré à un projet financé par la Ligue contre le Cancer (équipe labelisée) est de mieux comprendre les conditions de génération de cette population afin de pouvoir éventuellement interférer avec elles pour empêcher ou restaurer une fonctionnalité des cellules NK normale dans un modèle tumoral chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les causes de l'épuisement des cellules NK en contexte tumoral. Nous espérons que ces données conduiront à l'élaboration de nouvelles thérapies., que ce soit des thérapies cellulaires (permettant le transfert des cellules NK insensible à l'épuisement) ou médicamenteuse (composés ciblant des voies de signalisation impliquées dans l'établissement de l'épuisement).

Procédures

Des injections intra-veineuses (dans la veine caudale des souris) seront réalisées une seule fois chez les animaux. La durée de ce geste est compris entre 10 et 30 seconde à partir du moment où l'animal est prêt.

Impact sur les animaux

La pousse tumorale s'accompagne d'effets indésirables pour les animaux. Ceci se caractérise par une baisse des intéractions sociales. Dans certains cas, une réduction de la mobilité des animaux est observée. Ceux-ci n'apparaissent qu'au cours des dernières 24h précédent la mise à mort des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort dans le but d'analyser les cellules NK présentes dans les organes (rate, moelle, foie, poumons...).

Remplacement

Le système immunitaire est biologiquement très complexe, faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude par des tests in vitro exclusivement. La principale problématique étant que l'on ne connait pas l'ensemble des paramètres du système.

Réduction

L'utilisation de techniques de pointe (séquençages total ou à l'échelle d'une unique cellule) permet d'analyser un grand nombre de paramètres sur chaque animal et ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. De plus, l'utilisation de méthodes statistiques permettent de réduire au strict minimum le nombre d'animaux nécessaire pour le déroulé de ce projet.

Raffinement

Les animaux serront suivis de manière journalière à partir du septième jour post-injection. De plus, le modèle étant parfaitement maitrisé, nous connaissons les jours auxquel les animaux atteindront les points limites et nous augmentons la fréquence de surveillance des animaux (2 fois par jour) sur les 3 jours précédents les jours connus pour atteindre des points limites. Enfin, des croquettes hydratées ainsi que de l'eau gélifiée seront placées au fond de la cage les jours précédents de mise à mort afin d'améliorer le confort des animaux. Des points limites adaptés à notre modèle ont été définis de façon à éviter toute souffrance inutile des souris.

Choix des espèces

Les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées et des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu, un atout déterminant dans notre projet. Enfin, des souris agées de 8 à 12 semaines seront utilisées pour les expérimentations. A cet âge, les souris ont un système immunitaire mature.

900 ombles chevaliers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs œufs sont placés sous différents régimes de fluctuations thermiques jusqu'à l'éclosion, ce qui peut réduire leur survie, puis les larves sont filmées et anesthésiées pour des photographies morphologiques. Le porteur justifie le nombre par une mortalité anticipée pouvant atteindre 50 %. Il conclut que l'espèce n'est ni remplaçable ni substituable pour évaluer l'adaptation des salmonidés au réchauffement climatique.

Objectifs

Les salmonidés lacustres sont emblématiques de l'Amérique du Nord et de l'Europe. Ce sont des espèces qui ont une forte importance économique (pêche professionelle et amateure), patrimoniale et un fort interêt écologique de part leur position dans le réseau trophique. Néanmoins, les densités de populations ne sont pas stables. Le réchauffement climatique est l’une des principales causes pouvant expliquer ce déclin. L’objectif général de ce projet sera de quantifier les effets d'extrêmes de température apparaissant lors des premiers stades de vie. Spécifiquement, nous testerons si des extrêmes de température de courte durée (24h) et répétés influencent le développement et le phénotype des individus. L’objectif ici est de comprendre comment des fluctuations de température modifie la croissance et la mortalité larvaire, et si des modifications morphologiques et comportementales peuvent être observées. En effet, la température influence directement la physiologie, le développement et le comportement des individus, et certaines études suggèrent que certains organismes peuvent mettre en place des stratégies évolutives et plastiques afin d’y faire face. Ces analyses nous permettront d'évaluer le potentiel d'adaptation des salmonidés face au changement climatique. De façon plus spécifique, nous répondrons à ces objectifs en plaçant des oeufs de salmonidés à différents régimes de fluctuations de température chroniques (3 conditions : 4,5°C stable, augmentation à 8,5°C et 9,5°C) jusqu'à l'éclosion. Un suivi temporel sera réalisé à quatre pas de temps (750, 900, 1200 1500 degrés jour) sur le développement larvaire (croissance et mortalité) et le phénotype (morphologie et comportement).

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances essentielles quant au potentiel d’adaptation des salmonidés face aux fluctuations thermiques. Les résultats de ce projet détermineront la pertinence d’étudier à plus large échelle l’adaptation potentielle d'individus ayant différentes histoires évolutives. Ces connaissances pourront alors avoir des répercutions opérationnelles afin de proposer une aide stratégique pour la gestion des salmonidés.

Procédures

Les animaux seront mis dans un petit aquarium afin d'être filmés (mesure comportementale, 10min). Ensuite, ils seront anésthésiés afin d'être placés sous un objectif photo et d'être pris en photo. Enfin, ils seront replacés dans leur aquarium. En outre, les fluctuations de températures auront lieu une fois par semaine de la fécondation à la naissance, cela peut induire une survie inférieure et un développement différent.

Impact sur les animaux

Les procédures de ce projet (prise de photo pour mesurer la morphologie et vidéo pour le comportement) n'impliquent qu'un leger stress du à la manipulation des animaux. Nous nous attendons à ce que ce stress se dissipe rapidement après avoir remis les individus dans leur aquarium. Enfin, les fluctuations de température mise en place lors du développement embryonnaire peuvent modifer leur développement, notamment morphologique et comportementale.

Devenir

Pour pallier au stress et souffrances potentiels dû à l’expérimentation, les individus sont mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre les diminutions de densité dans les populations de salmonidés. L'objectif est d'évaluer les effets d’une augmentation de la variabilité thermique en milieu sauvage dans un contexte de réchauffement climatique en prenant en compte une espèce sujette à l’augmentation de la température et dont les effets sont problématiques d’un point de vue économique et écologique. En effet, cette étude permettra de comprendre la sensibilité au changement climatique d'une espèce avec une forte importance économique (pêche professionelle et amateur) et également écologique (prédateur). Le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il répond a une problématique spécifique. De plus, chaque espèce répond différemment aux variations environnementales, ainsi il n’est pas remplaçable ni substituable.

Réduction

Cette expérimentation prévoit 3 traitements de température (2 régimes fluctuant et 1 témoin stable). L’effectif de 100 individus par répétition permet d’avoir un effectif de qualité pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses, et les 50 individus suivis dans chaque traitement permettent prendre en compte la répétabilité de la variabilité interindividuelle dans chaque traitement ainsi que la variabilité entre les séries, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort gràce à un suivi temporel des mêmes individus (Règle des 3 R : Réduction). Au total 900 individus seront utilisés et mis à mort à la fin de l’étude : (3 traitements * 100 individus + 3 traitements *50 poissons individualisés) = 450 individus. 450*2 (50% de mortalité maximale anticipée) = 900 individus.

Raffinement

Tout au long de l’expérimentation, les structures et conditions expérimentales évolueront avec la croissance des animaux (litrage, nourriture, lumière). Les aquariums disposeront d’un couvercle afin de limiter le stress dû à la lumière. Les animaux seront visités 3 à 4 fois par jours, y compris le week-end. Avant les mesures morphologiques, les individus seront anesthésiés afin de limiter le stress due à la manipulation. Lors des mesures comportementales, une cachette sera disposée dans l'aquarium de test afin de limiter le stress. Enfin, aucune intervention chirurgicale n’est prévue, ainsi les mesures comportementales et morphologiques ne seront pas invasives pour les animaux.

Choix des espèces

Les salmonidés sont en déclin depuis plusieurs décennies, ayant des conséquences économiques, sans que les raisons de ces pertes d’effectifs ne soient complètement comprises. Bien que le réchauffement climatique soit l’une des causes de ce déclin, l’un des facteurs largement sous considéré est l’apparition de phénomène bref et intense de température. Ce projet apportera des connaissances essentielles quant au potentiel d’adaptation des salmonidés face aux fluctuations thermiques. Les résultats de ce projet détermineront la pertinence d’étudier à plus large échelle l’adaptation potentielle des organismes avec différentes origines. Ces connaissances pourront alors avoir des répercutions opérationnelles afin de proposer une aide stratégique pour la conservation des salmonidés. Nous utiliserons des poissons au stade embryonnaire, larvaire et jusqu’au stade juvénile. Ces premiers stades de vie devraient présenter des phénotypes différents selon les traitements des fluctuations de température subit durant le développement embryonnaire.

1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du pancréas leur sont injectées sous la peau, dans le pancréas ou dans le sang, provoquant tumeurs, ascite ou métastases pulmonaires, puis elles reçoivent des traitements, pour comparer la réponse selon la localisation de la tumeur. Le porteur décrit une possible altération de l'état général liée au cancer induit et aux effets des chimiothérapies. Il conclut que l'évaluation de traitements anticancéreux doit se faire sur un organisme vivant.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association immunothérapie (anti-PD-1) et chimiothérapies utilisées en clinique dans des modèles de cancers du pancréas avec différentes localisations (sites d’injections différents) chez la souris. Nous étudierons également les infiltrats immunitaires dans les tumeurs. Ainsi nous pourront 1) évaluer l’efficacité des traitements selon la localisation et 2) déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiée en fonction du traitement et de la localisation du cancer. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

En France, en 2018, le cancer du pancréas était le 9e cancer le plus fréquent chez l’homme et le 7e cancer le plus fréquent chez la femme. Le pronostic de ce cancer, souvent diagnostiqué tardivement, reste sombre, expliquant que la mortalité ne baisse pas. A tel point que l’adénocarcinome pancréatique pourrait devenir la seconde cause de mortalité par cancer dans les années 2030-2040. L’un des critères d’agressivité de ce cancer est sa capacité à former des métastases dans d’autres organes, comme le foie ou le poumon. Actuellement, le traitement de ce cancer repose sur l’utilisation de chimiothérapies qui sont malheureusement peu efficaces, car souvent administrées tardivement, notamment lorsque le cancer a métastasé. L’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. Le but du projet est d’évaluer l’efficacité anti-tumorale d’une association immunothérapie et chimiothérapies utilisées en clinique dans différents modèles de cancers du pancréas. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux traitements par chimiothérapie et de rechercher des moyens de potentialiser l’immunothérapie, jusqu’alors inefficace dans le cancer du pancréas.

Procédures

- Injection par voie sous-cutanée de cellules de cancer du pancréas murines : - 288 souris C57BL/6 et 144 souris BalbC/nude. - Injection orthotopique de cellules de cancer du pancréas murines dans le pancréas : - 160 souris C57BL/6 et 144 souris BalbC/nude. - Injection par voie intra-veineuse de cellules de cancer du pancréas murines : - 160 souris C57BL/6 et 144 souris BalbC/nude. - Traitements par voie intrapéritonéale : - 576 souris C57BL/6 et 432 souris BalbC/nude.

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales dans différentes localisations : - Sous-cutanée : masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. - Orthotopique : croissance d’une masse tumorale intra-abdominale monitorée par palpation abdominale. Possible dissémination de la maladie au niveau du péritoine avec apparition d’ascite. - Métastatique : croissance de métastases intra-pulmonaires, pas d’effet masse attendu. - Dans tous les cas : possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. -Éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux : les chimiothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherche clinique sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. -Concernant le modèle orthotopique, possible complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice : infection, lâchage de suture, douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Certains seront autopsiés (modèles orthotopique et intra-veineux).

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

- Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus une étape de faisabilité pour évaluer la pertinence des modèles sera réalisée en début de projet. Si l’un des modèles ne donne pas les résultats escomptés sur la localisation des tumeurs ou s’il s’avère que les points limites sont atteints prématurément, celui-ci sera abandonné à l’étape de faisabilité (partie I). Si aucun effet bénéfique des composés seuls ou en association sur la réponse anti-tumorale (croissance et infiltrats immunitaires) n’est observé, l’étude sera arrêtée à l’étape II. En choisissant de transposer uniquement le ou les modèles ayant le mieux répondu aux combinaisons de traitements en partie II, dans les souris Balb/nude, nous réduirons également le nombre de souris utilisées pour cette lignée. Enfin pour les modèles orthotopiques et intra-veineux les expériences visant à étudier la taille des tumeurs et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe. Elle sera entretenue pour la greffe orthotopique, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte et surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires (Ketoprofen 4mg/kg) seront administrés en sous-cutanée en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongé pendant 48h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux (lidocaïne 4mg/kg + bupivacaine 2mg/kg) au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidienne pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. Points limites : - perte de poids dépassant 20% par rapport au poids maximum enregistré à arrêt des traitements à si persistance au-delà de 24h, sacrifice de l’animal ; - posture ou autre expression de la douleur à arrêt des traitements à si persistance au-delà de 24h, sacrifice de l’animal ; - absence de toilettage à arrêt des traitements et surveillance de l’apparition d’autres points limites ; - léthargie, immobilité à si persistance au-delà de 24h, sacrifice de l’animal ; - une mauvaise cicatrisation ou une ouverture des sutures à sacrifice de l’animal. - Points limites spécifiques à la présence de tumeurs et dont l’atteinte entrainera l’euthanasie des animaux : - volume tumoral supérieur à 2000 mm3 ; - tumeurs gênant les fonctions vitales et motrices ; - ulcération ou nécroses de la tumeur sous-cutanée supérieure à 20% de la surface totale de la tumeur ; - palpation d’une masse abdominale localisée dans la zone du pancréas et entrainant une gêne ou une douleur ; - envahissement du péritoine de la souris conduisant à un une carcinose péritonéale ou la formation d’ascite et ainsi un gonflement de l’abdomen ; - difficultés respiratoires. Le projet se déroule en 3 parties. L’absence de faisabilité ou de résultats, conduira à l’arrêt de certains modèles.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Des souris génétiquement modifiées seront également utilisées afin de montrer l’importance du système immunitaire. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau puis six à neuf injections d'une molécule développée au laboratoire, avant mise à mort pour analyses. Le porteur qualifie la greffe de "geste rapide et peu douloureux" et n'attend "pas d'effets indésirables particuliers", tout en notant que la tumeur peut gêner le déplacement de l'animal. Il présente la molécule comme une "découverte majeure" et affirme que l'évaluation doit se faire "sur les organismes vivants".

Objectifs

Les objectif de ce projet sont d'évaluer l'efficacité de la molécule thérapeutique développée au laboratoire et de démontrer son inocuité.

Bénéfices attendus

La démonstration de l'efficacité d'une nouvelle molécule anticancéreuse à très faible dose et sans toxicité sur les cellules saine représente une découverte majeure dans le domaine de la cancérologie. Elle serait une avancée notable et un espoir pour les patients intolérants aux thérapies actuelles et souffrant de leurs nombreux effets secondaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée lors de la greffe des tumeurs (1 fois, 20 secondes) et à des injections intrapéritonéales ou sous-cutanées pour l'admisnitration des traitements (6 à 9 sur toute la durée du protocole ; 15 sec par injection) et la mesure de la tumeur.

Impact sur les animaux

La greffe de tumeurs sous-cutanée est un geste rapide et peu douloureux pour les animaux. De plus, au vu des premiers résulats ìn vitro, nous ne nous attendons pas à des effets indésirables particuliers. La croissance tumorale sur le flanc peut parfois géner le déplacement de l'animal.

Devenir

A l'issue de la procédure le sacrifice des animaux sera effectué afin de procéder aux analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictif, les évaluations de nouveaux agents thérapeutiques en oncologie doivent être réalisées sur les organismes vivants. La molécule candidate a été préalablement étudiée ìn vitro. De nouvelles études complémentaires in vitro sont en cours actuellement.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de 10 individus pour le suivi de croissance tumorale afin de disposer d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des effets de nos traitements. La molécule candidate a été préalablement étudiée ìn vitro. De nouvelles études (tissus-cibles et stabilité de la molécule) sont en cours actuellement. Ces résultats nous permettent d'ajuster plus précisément le nombre d'animaux.

Raffinement

Trois fois par semaine, chaque animal sera examiné, pesé, la taille tumorale sera déterminée à l’aide d’un pied à coulisse. Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi rapproché de la taille des tumeurs. Ce suivi individuel permettra la surveillance du bien-être des animaux qui seront hébergés par groupe de dix dans un établissement agréé. La molécule candidate a été préalablement étudiée ìn vitro. De nouvelles études (toxicité) sont en cours actuellement. Ces résultats nous permettent de limiter au maximum les effets potentiellement indésirables sur les animaux.

Choix des espèces

La souris, outre l’avantage lié à ses caractéristiques physiologiques, est un modèle génétiquement homogène et largement commercialisés donc qui permet de standardiser au maximum nos expériences. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles : pas de biais expérimentaux lié à la croissance ou à la puberté. L'utilisation d'un modèle murin offre une large variété d'outils d'analyses biologiques du modèle. Les souris autorisent également une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique chez l’humain. Enfin, le modèle de cellules cancéreuses décrit comme très sensible à notre drogue est d'origine murine.