Oncologie
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- Système respiratoire
- Système urogénital
Evaluation d’inhibiteurs d’une enzyme impliquée dans l’agressivité et la prolifération tumorale (EZH2) sur la croissance tumorale du carcinome à cellules de Merkel dans un modèle de souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
30 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant quatre semaines, pour tester des inhibiteurs d'EZH2 contre le carcinome à cellules de Merkel. Le porteur indique qu'aucune analgésie ne sera administrée afin de ne pas interférer avec les traitements, et qu'une perte de poids, une tumeur de plus d'un centimètre cube ou une ulcération déclenchent la mise à mort par élongation cervicale. Il affirme que le recours au modèle murin est "obligatoire" pour développer ces tumeurs.
Objectifs
Le carcinome a cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif survenant principalement chez le sujet âge de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hémopathies, greffe d’organe, infection par le VIH). Son incidence, estimée à 1/100 000 par an, est en constante augmentation. La survie a 5 ans est estimée à 40%. Dans 80% des cas, le génome du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCPyV) est intégré dans celui des cellules tumorales induisant alors l’expression de deux oncoprotéines virales (antigène grand T ; LT et antigène petit t ; st). Dans ce contexte, une étude récente menée au sein du laboratoire a permis de mettre en évidence l’induction de l’expression d’EZH2 (Enhancer of zest homolog 2), une histone méthyltransférase, par les oncoprotéines virales. Cette enzyme est impliquée dans l’agressivité et la prolifération tumorale d’autres cancers. De plus, une forte expression d’EZH2 a pu être confirmée au sein d’une cohorte de 96 patients présentant un CCM avec un niveau d’expression plus important dans les tumeurs MCPyV positives. L’effet des inhibiteurs d’EZH2 à déjà été démontré sur d’autre tumeurs solides. Dans ce contexte la cytotoxicité de deux de ces drogues a pu être démontrée au sein de notre laboratoire, in vitro sur des lignées cellulaires humaines de CCM. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo, l'effet inhibiteur sur la croissance tumorale du GSK343 et du DZNeP dans un modèle murin de xénogreffe, maîtrisé dans le laboratoire, utilisant la lignée WaGa.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de valider dans un modèle pré-clinique l'utilisation d'inhibiteur d'EZH2 dans l'indication du carcinome à cellules de Merkel. Ces molécules pourraient potentiellement être utilisées chez l'Homme en complément de l'immunothérapie ciblant PDL1.
Procédures
Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules WaGa afin d'établir le modèle tumoral. Suite à leur inclusion, elles recevront quotidiennement par voie intrapéritonéale les deux molécules évaluées ou le véhicule pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
Chez l’Homme, le carcinome à cellules de Merkel est décrit comme non douloureux, néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux limites (aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20% et prostration des animaux, volume tumorale supérieur à 1cm3 ou apparition d’ulcération), conduira à leur mise à mort par élongation cervicale.
Devenir
L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris.
Remplacement
Afin d’étudier l’impact du traitement sur la croissance tumorale, le test sur modèle murin est obligatoire
Réduction
Une seule dose de chaque traitement sera testée sur la base des résultats de cytotoxicité in vitro préalablement obtenus au laboratoire ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. De plus, un test de Wilcoxon a permis de déterminer le nombre d'animaux nécéssaires.
Raffinement
Les souris seront hébergées avec un enrichissement social (5 souris de même sexe / cage) dans des cages enrichies avec des maisonnettes en plexiglas et du papier absorbant. Du fait du statut immunodéficient des souris, l’ensemble du matériel d’enrichissement, ainsi que l’aliment et l’eau de boisson seront stérilisés. Après les injections intra-péritonéales, les souris recevront sous forme de récompense des friandises (cacahuètes en coque, catalogue PLEXX). Aucun traitement d'analgésique ne sera administré afin d'éviter toute interférence avec les traitements testés.
Choix des espèces
Le seul modèle disponible de CCM étant des lignées humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est obligatoire afin de permettre le développement de tumeurs chez la souris. Les NOD/SCID sont un modèle de référence pour les xénogreffes de cellules humaines . 7 semaines incluant la semaine d’acclimatation d'une semaine. Stade physiologique : croissance
Évaluation de la toxicité de l’ADCITMER, un nouveau biomédicament dans le traitement du carcinome à cellules de Merkel chez des rats Wistar males.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
20 rats Wistar mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection dans la veine pénienne sous anesthésie puis deux prélèvements de sang, avant d'être mis à mort pour mesurer la toxicité d'un biomédicament destiné au carcinome à cellules de Merkel. Le porteur indique surveiller le pelage "piqué", une perte de poids de 20 % et une hausse des transaminases comme seuils déclenchant la mise à mort. Il présente l'étude comme une obligation réglementaire préalable à un essai clinique de phase I.
Objectifs
Le carcinome a cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif survenant principalement chez le sujet age de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hemopathie, greffe d’organe, infection par le VIH). Son incidence, estimée a 1/100000 par an, est en constante augmentation. La survie a 5 ans est estimée a 40%. Au stade métastatique inopérable les cliniciens ont peu d’options thérapeutiques induisant une réponse tumorale durable. L’pression du CD56, glycoprotéine de surface impliquée dans l'adhésion cellulaire, a été observée dans 66% des cas de CCM confirmant le choix de cette cible thérapeutique. Un immunoconjugué (anticorps anti- CD56 couplé à la drogue MMAE) a été développé, l’Adcitmer, pour cibler spécifiquement le CD56 et induire la mort des cellules tumorales. L'évaluation in vitro de cette molécule a confirmé son effet cytotoxique sur les lignées de CCM. Pour finir, l'impact sur la croissance tumorale a été montré dans un modèle murin de xénogreffe utilisant une lignée humaine de CCM . L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo, la toxicité de l’Adcitmer chez le rat.
Bénéfices attendus
Le bénéfice premier attendu est d'obtenir la dose maximale tolérée afin de pouvoir proposer une fenêtre thérapeutique optimale pour un essai préclinique réglementaire puis un essai clinique de phase I.
Procédures
Les animaux seront injectés une seule fois dans la veine penienne puis deux prélèvements sanguins seront effectués à 4 et 21 jours post-injection de l'Adcitmer. L’injection dans la veine pénienne durera 5 min par animaux, le prélèvement sanguin durera 3 min également.
Impact sur les animaux
Après 21 jours ou en cas d’atteinte de points limites (aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20%, prostration des animaux ou augmentation des transaminases de 1,5 fois par rapport à la limite supérieur de la norme (normes pour le rat Wistar mâle : ASAT 93 +/- 20 UI/L et ALAT : 32 +/- 5 UI/L), les animaux seront sacrifiés afin d’observer l’impact de l’Adcitmer sur les rats traités versus les rats témoins. Le cœur, la rate, le foie et les poumons seront prélevés pour vérifier que le traitement n’a pas altéré la morphologie des organes. L’analyse histologique sera assurée par les pathologistes de l’équipe. Les critères de jugement de l’étude sont : - Une réduction significative du poids des animaux (une puissance de test supérieure à 80% avec un seuil de risque alpha de 0.05, un test U de Mann Whitney) - Un changement du comportement des animaux Ce protocole suit la règle des 3R : Réduction : Trois doses de traitement seront évaluées sur la base des résultats de réduction de la croissance tumorale préalablement obtenu chez la souris au laboratoire avec trois injections à 10mg/kg in vivo ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de rats utilisés. Raffinement : Les rats seront hébergés dans des cages enrichies avec des abris et du matériel de nidification et une plateforme. L’interaction avec les soigneurs aura lieu tous les jours pour les adapter aux contacts deux semaines avant le début de l’étude afin de réduire le stress lié aux manipulations. Afin de réduire le stress, les rats seront hébergés par paires. Remplacement : La molécule a été évaluée sur des cellules saines n’exprimant pas le CD56 in vitro et n’a pas montré de toxicité in vivo dans un model murin de xénogreffe de CCM. Cependant, une étude de toxicité in vivo est obligatoire afin d’étudier l’impact du traitement sur les organes et le comportement des animaux.
Devenir
La mise à mort de tous les animaux permettra d'évaluer la dose maximale tolérée afin de pouvoir proposer une fenêtre thérapeutique optimale pour un essai préclinique réglementaire puis un essai clinique de phase I.
Remplacement
La molécule a été évaluée sur des cellules saines n’exprimant pas le CD56 in vitro et n’a pas montré de toxicité in vivo dans un model murin de xénogreffe de CCM. Cependant, une étude de toxicité in vivo est obligatoire afin d’étudier l’impact du traitement sur les organes et le comportement des animaux.
Réduction
Trois doses de traitement seront évaluées sur la base des résultats de réduction de la croissance tumorale préalablement obtenu chez la souris au laboratoire avec trois injections à 10mg/kg in vivo ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de rats utilisés.
Raffinement
Les rats seront hébergés dans des cages enrichies avec des abris et du matériel de nidification et une plateforme. L’interaction avec les soigneurs aura lieu tous les jours pour les adapter aux contacts deux semaines avant le début de l’étude afin de réduire le stress lié aux manipulations. Afin de réduire le stress, les rats seront hébergés par paires.
Choix des espèces
Le modèle Wistar est un modèle de référence dans les études de toxicité des immunoconjugués. Les males ont été choisi pour injecter en intraveineuse dans la veine pénienne la molécule après une anesthésie. Ceci permet une meilleure réussite et reproductibilité des injections par rapport à la veine caudale. De plus, l’utilisation de sujets d’un même sexe permet de réduire la variabilité interindividuelle et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet significatif. 8 semaines (incluant la semaine d’acclimatation). Stade physiologique : croissance.
Evaluation chez la poule pondeuse de la contribution des effets génétiques et non génétiques à la persistance de la ponte et de l’efficience alimentaire.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
512 poules pondeuses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent une unique prise de sang, puis sont abattues à 90 semaines par étourdissement électrique et saignée, pour relier des marques génétiques et épigénétiques à la persistance de la ponte et à l'efficience alimentaire. Le porteur précise que cette mise à mort entre dans le cycle de routine d'un sélectionneur privé, dont les animaux servent aussi à l'étude. Il affirme qu'il n'est pas possible de remplacer les animaux par des analyses in vitro pour un objectif portant sur des performances de production en fin de carrière.
Objectifs
Ce travail est financé dans l'appel d'offres SFS-13-2020, en collaboration avec un partenaire du projet. Un accord de consortium a été signé. L'objectif de l’expérimentation est d'évaluer, chez la poule pondeuse en sélection, la contribution des effets génétiques et épigénétiques à la variabilité des caractères liés à la persistance de la ponte, la qualité des œufs et l’efficience alimentaire, en fin de production (90 semaines).
Bénéfices attendus
L'évaluation à l'échelle du génome de la variabilité génétique et épigénétique nous permettra d'identifier les régions génomiques et les marques épigénétiques contribuant à la variation phénotypique des caractères de production, de qualité et d'efficacité à un âge de la poule qui n'a pas été analysé jusqu'à présent (90 semaines de vie). Ces données seront utilisées pour développer de nouveaux modèles de prédiction génomique. Ces données nous permettront également d'estimer la variabilité génétique et épigénétique de cette lignée parentale et de proposer des stratégies de conservation de la diversité génétique et épigénétique dans les lignées parentales.
Procédures
Les 512 poules pondeuses seront soumises à une seule prises de sang qui seront réalisées par des personnels qualifiés.La durée de la prise de sang pour chaque animal est inférieure à 10 secondes.
Impact sur les animaux
Nous n’attendons pas de nuisances ou effets indésirables sur les animaux. La prise de sang sera effectuée par des personnes expertes.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en vue de prélèvements de tissus par étourdissement électrique suivi d'une saignée. Cette mise à mort entre dans le cycle d’activités de routine du sélectionneur, le bâtiment accueillant une nouvelle génération d’animaux après un vide sanitaire de quelques semaines.
Remplacement
L'objectif de l'étude étant d'évaluer la contribution génétique et épigénétique à la variabilité des caractères liés à la production, la persistense de la ponte, la qualité des œufs et l’efficience alimentaire chez la poule pondeuse à un âge avancé de production, il n'est pas possible de remplacer les animaux par des analyses in vitro.
Réduction
Nous n'avons pas produit d'animaux pour cette étude car nous utilisons les animaux produits par le sélectionneur privé pour son programme de sélection. Ceci nous donne la possibilité d’avoir accès à un grand nombre de phénotypes ainsi qu'au pedigree des animaux sans avoir besoin de produire d’avantage d'animaux. Notre étude consiste à ajouter aux phénotypes fournis par le sélectionneur des phénotypes métaboliques et à produire des données de génotypage et d'épigénotypage afin de pouvoir identifier des QTL (quantitative trait loci : variants d'ADN associés à un phénotype) et des QTM (quantitative trait methylation : variants de méthylation associés à un phénotype). Les caractères que nous souhaitons étudier sont multifactoriels et sous le contrôle de multiples gènes situés à différents QTL et/ou QTM. L'approche que nous prévoyons d'utiliser pour identifier ces régions est l'étude d'association génétique/épigénétique à l'échelle du génome (GWAS) qui nécessite l'analyse d'un grand nombre d'individus. C'est tout l'intérêt d'utiliser des animaux qui sont produits par le sélectionneur dans le cadre de sa sélection, plutôt que de produire de nouveaux animaux expérimentaux. On attend ainsi une puissance raisonnable, supérieure à 70%, avec notre échantillon de 512 descendants.
Raffinement
À l'âge de 90 semaines, juste avant l’abattage des animaux, nous effectuerons une prise de sang et une échographie. Ces procédures seront effectuées par du personnel qualifié afin de causer le moins d'inconfort possible aux animaux, en particulier la prise de sang au niveau du sinus occipital (voir plus loin) qui est très rapide mais nécessite d’être faite par une personne expérimentée. Toutes les activités jusqu'à l'âge de 90 semaines (phénotypages divers, prise de sang à 70 semaines) sont liées aux activités de sélection de l'éleveur privé et ne font pas partie de cette DAP. La possibilité d'avoir accès à une lignée parentale commerciale nous permet d’avoir un dispositif animal puissant, qui devrait nous permettre de transposer nos résultats à d'autres lignées commerciales sans avoir besoin de mettre en place de nouvelles expériences.
Choix des espèces
Nous sommes intéressés par l'identification des régions génomiques et des variants de méthylation qui contribuent à la variation des caractères d'intérêt tels que la persistance de la ponte, la qualité des œufs, l'efficacité alimentaire et la composition corporelle chez la poule pondeuse à un âge avancé de production. La poule domestique est donc l’espèce de choix. Nous travaillerons avec des poules adultes de 90 semaines pour étudier les performances et l'efficacité à la fin de leur carrière productive. La nécessité de collecter des données à un âge aussi tardif est due au fait que les performances antérieures ne sont pas nécessairement corrélées aux performances tardives.
Etude d’un apport de provitamine A chez des animaux carencés en vitamine A
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
28 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont soumises pendant huit semaines à des régimes carencés ou enrichis en provitamine A, la seule intervention déclarée douloureuse étant l'injection anesthésique terminale, pour évaluer si des larves d'insectes peuvent servir de source de vitamine A. Le porteur présente ce débouché alimentaire comme pertinent pour les pays où la carence persiste. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'analyser la digestion et le métabolisme des vitamines chez un mammifère.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier la conversion de précursseurs de la vitamine A en vitamine A chez la gerbille consommant des aliments enrichis en précursseur (provitamine A). Ceci afin de pouvoir considérer les insectes riches en caroténoïdes comme de futurs aliments pour l’homme. Des études antérieures ont montré que les larves de l’insecte Hermetia Illucens (mouche soldat noire) sont capables de bioaccumuler de fortes concentrations de provitamine A quand elles sont élevées sur des substrats riches en cette provitamine. Mais on ne sait pas si ces larves pourraient servir de source de vitamine A chez l’homme ou l’animal de rente. L’objectif est donc de déterminer, en utilisant le modèle gerbille qui est un modèle reconnu pour étudier l’activité provitaminique A de caroténoïdes, si des larves enrichies en provitamine A sont capables de rétablir le statut vitaminique A de gerbilles carencées en cette vitamine.
Bénéfices attendus
Des nombreuses recherches sont axées depuis une vingtaine d’années sur la biodisponibilité des caroténoïdes. Dans le contexte du changement climatique et des changements des habitudes alimentaires qu’il implique, il est particulièrement pertinent d’étudier la capacité des insectes comestibles à être des sources complémentaires et durables de caroténoïdes provitaminiques A. En effet, la carence en vitamine A persiste dans de nombreux pays en développement et pouvoir utiliser des insectes comme source de cette vitamine serait très intéressant à la fois pour l’alimentation des animaux de rente dans ces pays, et pour certaines populations qui consomment des insectes depuis de nombreuses générations. Par ailleurs, l’insecte que nous allons utiliser dans ce projet est un insecte qui a la capacité de croitre sur des déchets organiques et qui est utilisé pour les recycler et les valoriser. Montrer que l’on peut aussi l’utiliser pour recycler des déchets de fruits ou légumes riches en caroténoïdes provitamine A, e.g. patate douces oranges, et obtenir des larves riches en caroténoïdes provitamine A capables de rétablir le statut vitaminique A d’un animal modèle serait très intéressant pour cette filière de l’entomoconversion. Utiliser des insectes comme source de caroténoïdes pour l’homme pourrait être envisageable à long terme pour certains pays en voie de développement ou les carences en vitamine A sont toujours d’actualité pour certaines populations.
Procédures
Cinq jours d’acclimatation sont prévus à l’arrivée des animaux – Pendant cette période l’habituation progressive des animaux à être pesé sera réalisée. Ces pesées auront lieu 2 fois à 3 fois par semaine afin d’assurer le suivi de croissance. La seule intervention que subiront les animaux est l'anesthésie finale. La modification du régime alimentaire n’a aucun effet sur la croissance normale des gerbilles, et n’occasionnent aucune souffrance. Les gerbilles des groupes dits « carencés en vitamine A » sont en fait nourries pendant 5 semaines avec un régime classique avec un apport faible en vitamine A (1050 UI). Ces témoins ont déjà étaient utilisés et les résultats publiés ont indiqués une croissance et une consommation normale.
Impact sur les animaux
Il s’agit de tester plusieurs régimes alimentaires, éventuellement carencés en vitamine A, sur une durée maximale de 8 semaines. Il n’y a pas d’effets indésirables graves ni de perte de poids prévus sur la durée de l’expérience, relativement courte. Les effets indésirables attendus sont le stress des animaux liès à la manipulation (pésée) et à l'injection terminale d'anesthésique
Devenir
A l'issue des 8 semaines de régime alimentaire carencé ou non les animaux sont euthanasiés
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives permettant d’analyser les capacités nutritionnelles d’un aliment pour mammifères, comprenant la digestion et le métabolisme des vitamines.
Réduction
Il s’agit d’une étude pilote permettant d’évaluer, en 8 semaines, l’interêt potentielle d’une source alimentaire permettant de lutter contre les carences en vitamine A. Afin d’éviter de multiplier le nombre d’expériences, deux suppléments alimentaires sont testés en parallèle : les patates douces et les insectes, permettant ainsi de limiter les groupes témoins.
Raffinement
Aucune douleur n’est attendue au cours de l’expérimentation. Des maisons en cartons et bâtons de peuplier sont ajoutés dans les cages.
Choix des espèces
La gerbille est un modèle animal très intéressant pour les chercheurs qui veulent mimer le taux de bioconversion des caroténoïdes provitaminiques A en vitamine A chez l’homme. En effet, contrairement à l’homme et à la gerbille, le rat et la souris ont des taux de conversion très élevés, proche de 100%, et quand on leur fait consommer de la provitamine A on ne retrouve pratiquement que de la vitamine A dans leur organisme. Chez l’homme et la gerbille, le taux de conversion est compris entre quelques % et 80% (ce taux dépend de nombreux facteurs dont le statut vitaminique A, le sexe et la matrice alimentaire dans laquelle est la provitamine A) et on retrouve donc dans l’organisme à la fois de la vitamine A et de la provitamine A absorbée mais non convertie en vitamine A. Gerbilles de 7 semaines âge minimum pour être sevrées
Évaluation de l’impact de l’activité physique sur la réponse à l’immunothérapie dans un modèle de tumeur sous cutanée induite par injection de cellules cancéreuses prostatiques (APICaP).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, quarante étant classées en gravité sévère. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses prostatiques puis sont soumises à un exercice forcé, pour voir si l'activité physique lève la résistance à une immunothérapie. Le porteur prévoit une anesthésie sans réveil pour la totalité des animaux en fin de projet, afin de prélever tumeur et organes. Il affirme qu'aucune alternative in vitro n'existe et que la recherche "rend incontournable" le recours à la souris.
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'identifier l'impact d'une activité physique régulière sur la réponse à l'immunothérapie et de décrypter les mécanismes moléculaires impliqués, dans un modèle murin de cancer de la prostate. L’anti-PD1 utilisé est celui décrit dans de nombreuses publications : BioXCell, InVivoPlus anti-mouse PD-1 (CD279). Dans notre modèle, cette immunothérapie n’a pas d'efficacité et nous cherchons à déterminer si l’activité physique peut lever cette résistance à l’immunothérapie. Le modèle TRAMP-C2 n’engendre pas de métastases.
Bénéfices attendus
L'activité physique sur tapis roulant pourrait ralentir la croissance tumorale comparativement aux souris ne pratiquant pas d'AP. Cela rejoindrait des résultats précédemment obtenus. L'activité physique pourrait améliorer la perfusion tumorale et donc améliorer les effets de l'immunothérapie (anti-PD1) dans le modèle de souris TRAMP-C2. Il s’agit de nouveaux traitements et de nouvelles alternatives de prise en charge de patients avec cancer de la prostate. Le tout, sur un modèle déjà bien utilisé dans notre laboratoire.
Procédures
Les animaux sont soumis à une injection en sous cutanée (aiguille 26G) de 100µl d'une solution contenant un million de cellules TRAMP-C2 de cancer de prostate. Aucune procédure chirurgicale, ni prélèvement sur animaux vigiles, ne seront effectués.
Impact sur les animaux
De possibles problèmes de locomotion chez les animaux porteurs de la tumeur peuvent être observés. Nous analyserons donc la mobilité, le toilettage, la perte de poids (ne doit pas être inférieure à 20% du poids initial à aucun moment, pendant la durée de la procédure), et le volume de la tumeur qui ne doit pas excéder 1500mm3. Dans ce modèle de TRAMP-C2, aucune perte de poids supérieur à 20% n’a été documentée sur la durée du projet. Si ces changements sont observés, ils seront considérés comme un point limite et les animaux seront euthanasiés.
Devenir
A l'issue de la procédure 1-4, les animaux sont gardés en vie. A la fin du projet une anesthésie sans réveil est prévue pour la totalité des animaux. En fait, nous avons besoin de prélèvements sanguins ( Il s'agit de 0.3-0.5 ml de sang que nous récupérons à l'aide d'une seringue dans la cavité du coeur de l'animal, aprés avoir été euthanasié) , de prélever la tumeur,le foie, la rate, les intestins, les poumons, les reins, les muscles gastrocnémiens, tibialis antérieurs, extensor digitorum longus et soleaires pour les analyses ultérieures. Ces analyses nous permettront d'identifier l'impact d'une activité physique régulière sur la réponse à l'immunothérapie et de décrypter les mécanismes et les acteurs moléculaires impliqués.
Remplacement
L'objectif de ce projet de recherche est d'identifier l'impact d'une activité physique régulière sur la réponse à l'immunothérapie et de décrypter les mécanismes moléculaires impliqués. Ceci n'est pas démontrable "in vitro". Nous cherchons ici à étudier les interactions entre la tumeur, le plasma et le muscle. Il n'existe donc pas d'altérnative in vitro pour ce type d'évaluation. La nécessité de la recherche biologique, en vue de contribuer à améliorer la prise en charge médicale, rend incontournable le recours à l'expérimentation animale pour faire progresser les connaissances et améliorer la prise en charge et la survie de patients atteints de cancer de la prostate.
Réduction
Les cohortes seront constituées de 10 souris par groupe afin d’obtenir un nombre d'animaux suffisant pour juger du caractère significatif des résultats. La taille de l’échantillonnage de chaque groupe a été définie à partir d’un test statistique (Sample size test). Afin de juger des effets de l'activité physique et de l'immunothérapie sur le cancer de la prostate, des ANOVA à deux facteurs seront utilisées. En cas de différences significatives sur ce test, un Bonferroni post hoc test sera employé pour isoler les effets et les interactions entre les différentes conditions expérimentales.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent un hébergement en cage individuelle car il est indispensable de mesurer la consommation quotidienne de nourriture mais des précautions sont prises. Les animaux seront hébergés dans des cages transparente, individuelle, côte à côte et enrichies avec des jouets et du matériel adapté ce qui permet de limiter l'isolement social et le stress. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel des animaux. Un questionnaire pour mesurer le niveau de souffrance des rongeurs est mis à disposition et disponible dans les locaux de l’animalerie. Le questionnaire demande de suivre et de noter les signes visibles d’inconfort chez le rongeur (vocalisation, agressivité, retrait d’un membre, autres). En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procéderons à la sortie de l'animal du protocole.
Choix des espèces
Le modèle de souris syngéniques C57/BL6 est un modèle pertinent pour étudier le cancer de la prostate car il va permettre l'injection de cellules cancéreuses prostatiques murines et l'evolution de la tumeur. De plus, c'est un modèle de souris immunocompétent. L'implantation de la lignée cellulaire TRAMP-C2 dans ce modèle permet de développer un modèle de cancer de la prostate similaire à ceux observés chez l'Homme. C'est-à-dire qu’il s’agit d’un modèle de tumeur sous cutanée induite par injection de cellules cancéreuses prostatiques. Les cohortes seront constituées de 10 animaux par groupe afin d'obtenir un nombre de sujets suffisant pour juger de la significativité de notre étude. Dans le cas présent, nous avons fait le choix d’une injection sous-cutanée afin de suivre la croissance tumorale plus aisément et comparer les résultats avec ceux déjà obtenus dans notre laboratoire. Mâles, agés de 8 semaines.
Evaluation pré-clinique de nouvelles cibles et molécules anticancéreuses seules ou associées dans les modèles murins de mélanome uvéal (MU)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
743 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules de mélanome de l'œil humain leur sont injectées pour générer tumeurs et métastases, suivies par imagerie et prélèvements sanguins, la mise à mort intervenant quand la tumeur atteint sa taille maximale ou quand les métastases couvrent 40 % du péritoine. Le porteur indique qu'entre 20 et 50 % des animaux dont la tumeur ne prend pas sont aussi tués. Il présente ces essais précliniques comme "indispensables" pour augmenter la survie des patients, aucun traitement n'existant contre la forme métastatique.
Objectifs
Le cancer reste parmi les premières causes de décès dans le monde. Le mélanome de l’uvée est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. Même s’il existe des traitements efficaces pour éliminer la tumeur primaire (chirurgie ou radiothérapie), aucun traitement n’existe actuellement contre la phase métastatique de la maladie. L'évaluation des nouvelles thérapies disponibles aujourd'hui nécessite le développement des modèles pertinents. Un modèle métastatique a été développé dans le laboratoire suite à l’injection de cellules tumorales humaines sur souris ce qui permet la réalisation d’études pharmacologiques dont le potentiel prédictif clinique est très élevé. Ce modèle nous a permis d’observer le développement de métastases principalement au niveau hépatique mais également au niveau péritonéal dans certains cas. Ainsi elles constituent un outil primordial pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments ou encore de nouvelles combinaisons ou schémas d'administration de médicaments. Ces essais précliniques ont différents objectifs : déterminer le type tumoral qui présentera le plus de bénéfice au traitement, déterminer les combinaisons et les fréquences d’administration qui seront les plus efficaces mais également effectuer des études moléculaires de la tumeur qui permettront d’expliciter le mécanisme d’action des molécules testées ou encore les mécanismes de résistance de ces tumeurs par rapport à ces thérapeutiques. Ces essais précliniques sont des phases préliminaires aux phases cliniques. Ils permettent d’orienter les développements futurs des nouvelles molécules et d’optimiser des traitements qui seront ensuite utilisés chez l’homme. Les modèles murins de mélanome uvéal de notre laboratoire représentent des tumeurs générées par injection de lignées cellulaires humaines tumorales. Ces tumeurs représentent la diversité de la maladie chez l’homme et sont utilisées dans le cadre de collaboration avec des partenaires pour évaluer des nouvelles drogues. L’évaluation de l’effet de ces molécules comprend l’étude de la tolérance qui permet de déterminer la dose des molécules ou des associations de molécules sur de petits groupes d’animaux jusqu’à l’étude de l’efficacité anticancéreuse de ces mêmes molécules.
Bénéfices attendus
Le mélanome uvéal (MU) est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. Dans la grande majorité des cas, le mélanome uvéal apparait suite à une surprolifération des mélanocytes au niveau de la choroïde, qui est une des couches de la paroi du globe oculaire. Mais il peut également survenir dans deux autres couches de l’œil, l’iris ou le corps ciliaire. Il représente 5% de tous les mélanomes et se distingue du mélanome cutané au niveau biologique et génétique. Il existe des thérapies efficaces comme la chirurgie et la radiothérapie pour éliminer la tumeur primaire. Cependant plus de 30% des patients développent des métastases principalement au niveau hépatique et péritonéal. Malheureusement il n’existe actuellement aucun traitement de référence contre la phase métastatique de la maladie. A la fin de l’expérience la tumeur primaire et les métastases seront prélevées pour étude post-mortem. Une partie sera congelée à sec pour analyse génomique et une autre sera fixée pour analyses histologiques. Le but de ces expériences in vivo est donc dans un premier temps de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du MU (croissance de la tumeur primaire ainsi que des métastases). Cette étude a également pour but de trouver un traitement afin de lutter contre la croissance de la tumeur au niveau de sa localisation initiale mais surtout d’évaluer l’efficacité de différentes « molécules actives » ou nouvelles cibles thérapeutiques sur le développement métastatique de la maladie. Ces avancées sont indispensables et majeures afin d’augmenter le pourcentage de survie des patients.
Procédures
>Injection intradermique sur animal vigile de cellules dans un volume de 100µL de tampon dans le derme de la souris au niveau du flanc droit / 1 fois en début d’expérience >Injection intrasplénique sur animal anesthésié de cellules dans un volume de 50µL de tampon / 1 fois en début d’expérience. Durée de l’anesthésie : 30 minutes >Imagerie sur souris anesthésiées en gazeuse après injection de sonde colorimétrique en IP sous un volume de 100µL / 1 fois toutes les 2 semaines puis une fois par semaine tout au long de la procédure. Durée de l’anesthésie : 15 minutes >Prélèvements sanguins sur animal vigile au niveau du sinus rétro-orbital / 1 fois en début d’expérience et 1 fois en fin d’expérience avant sacrifice >Injection/ingestion de molécules chimiques sur animal vigile (dont le volume maximal ne dépassera pas 10% du volume sanguin total de l’animal) / de 1 fois par semaine à 2fois par jour selon le traitement tout au long de la procédure
Impact sur les animaux
Avant passage chez l’animal tout effet antitumoral d’une molécule est validé sur des modèles cellulaires in vitro. Afin d’évaluer l’effet de différentes molécules actives sur le développement du mélanome uvéal, l’apparition de tumeurs de MU chez la souris doit être induite. Ces tumeurs sont générées au début de l’expérience par injection de cellules tumorales humaines. Cette étape est indispensable pour l’étude de potentiel anti-cancéreux au niveau de la localisation initiale de la tumeur Pour l’étude de la croissance métastatique un modèle d’injection représentant le développement métastatique de la maladie chez le patient (c’est-à-dire apparition de métastases au niveau hépatique et péritonéal) doit également être utilisé. Un système luminescent permet alors de suivre la dissémination métastatique chez la souris vivante au cours du temps. Les animaux seront pesés et leur état général sera contrôlé toutes les semaines. Les tumeurs seront mesurées et les souris seront sacrifiées lorsque la taille éthique atteinte. L’évolution des métastases sera également suivie par imagerie tous les 15jours au début de l’expérience puis toutes les semaines quand les métastases commenceront à se développer. Les souris seront sacrifiées lorsque le pourcentage de métastases aura atteint 40% de la surface du péritoine de l’animal. Pour chaque procédure, si un animal montre des signes de douleur, des antalgiques lui seront administrés.
Devenir
Dans chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem dès l’apparition des points limites (taille de la tumeur primaire maximale atteinte ou pourcentage métastatique atteint) ou bien en fin de l’expérience (durée de traitement prévu). Les animaux dont la tumeur ne s’est pas développée après l’injection seront mis à mort. Ce nombre est très variable d’une tumeur ou d’une injection de lignées à l’autre et en moyenne de l’ordre de 20% des animaux suite aux injections intradermique ou de l’ordre de 40-50% suite aux injections intrasplénique. Le délai de la décision de sortie des souris dépend de la vitesse de pousse des tumeurs et peut aller de 2 à 8 semaines selon le type d’injection.
Remplacement
L’efficacité antitumorale de tous les traitements est préalablement évaluée sur des cultures cellulaires (système in vitro). Seules les molécules ayant montré une efficacité in vitro sont alors ensuite utilisées in vivo. En effet il est nécessaire de valider l’effet observé dans un système intégré et tenant compte de la complexité d’un organisme vivant avec les multiples interactions, la toxicité possible ou encore la difficulté de la molécule à atteindre sa cible. L’injection de lignées cellulaires tumorales constitue l’outil d’analyse pharmacologique des nouveaux composés le plus proche de l’utilisation clinique aujourd'hui. Pour sélectionner les meilleurs composés antitumoraux, l'évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d'un médicament avant son utilisation clinique. Cette évaluation conduit à optimiser les modalités thérapeutiques, prédire les effets du médicament en association et identifier des marqueurs de réponse ou de résistance. Les effets des thérapies testées sur la dissémination métastatique et sur les cellules initiatrices de tumeurs sont également étudiés.
Réduction
En se basant sur notre expérience, pour les expériences de toxicité, l’utilisation de 3 souris/dose est le minimum suffisant pour déterminer les effets secondaires des molécules. Dans les expériences d’efficacité, le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence de réponse de 20% (= biologiquement significative via les tests statistiques t-test ou ANOVA) entre les groupes traités et contrôles. Ce nombre tient compte du taux de prise tumorale et l’hétérogénéité des réponses des animaux.
Raffinement
Les injections de cellules tumorales par voie intradermique sont peu invasives, avec un suivi de croissance tumorale facile et avec peu de manipulation. Pour les injections par voie intrasplénique, les souris reçoivent des antalgiques avant et après la chirurgie La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Les précautions suivantes seront prises : - Réduction de l’hypothermie lors de la chirurgie : tapis ou lampe chauffante dès l’anesthésie des animaux et jusqu’à leur réveil - apport gel nutritif(dans la cage , en post chirurgie Evaluation de l’état général de la souris : une grille de score déterminera le point limite. Les animaux sont mis à mort dès atteinte d’un point-limite Si l’animal montre des signes de douleur des antalgiques lui seront à nouveau administrés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce a été fait pour plusieurs raisons : - La souris est un mammifère comme l’Homme et sa physiologie est proche de celle de l'Homme. - La réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première instance et il permet d’acquérir un grand nombre d’informations pour un investissement contrôlé. - L’existence de souches immunodéficientes chez la souris permet la greffe de cellules humaines sans risque de rejet. Cette greffe de cellules humaines est plus difficile dans d’autres espèces (le Zebrafish est moins permissif) Jeune adulte : L’injection a lieu entre 5 à 8 semaines. Les souris ont ainsi fini leur croissance mais sont suffisamment jeunes pour que la tumeur greffée puisse prendre sur les animaux car l’immunodéficience pourrait diminuer avec l’âge. De plus le temps de croissance des cellules tumorales MU est long ainsi que l’apparition des métastases. Les animaux à cet âge supportent également mieux le transport à partir de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie, la chirurgie et les traitements
Recherche d’un traitement pour une maladie neurologique rare MCOPS12.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Porteuses ou non d'une mutation liée à une maladie neurologique rare, elles reçoivent quatre traitements par injection, gavage ou alimentation, suivis de tests comportementaux répétés, avant d'être tuées par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque. Le porteur affirme que le modèle murin "n'est pas remplaçable" et que la mutation "n'engendre aucune souffrance". Les doses testées sont décrites comme faibles, très en deçà de la dose létale.
Objectifs
Des mutations ponctuelles du recepteur à l’acide rétinoique beta (Rarb) sont à l’origine d’une maladie neurologique rare responsable de symptomes cognitifs et moteurs importants et progressifs. En effet, cette pathologie possède un caractère neurodeveloppemental ainsi qu’un caractère neurodégénératif (perte progressive de mobilité, perte de la coordination des membres), avec un pronostique vital ne dépassant pas l’adolescence. Des modèles murins de cette pathologie ont été générés et nous permettront d’étudier les mécanismes associés à ces mutations ponctuelles. Les souris mutantes présentent des symptomes moteurs similaires à ceux observés chez les souris porteuses d’une mutation invalidant complètement l’activité du récepteur. Nos études antérieures ont permis d’identifier le rôle du récepteur dans le dévelopement et dans l’homéostasie de striatum, la structure cérébrale impliquée dans le contrôle moteur et la cognition. Nous avons montré que pendant le développement embryonnaire RARb contrôle le développement d’une sous-population de neurones dans le striatum exprimant le récepteur à la dopamine 1 (Drd1+), alors que à l’âge adulte nous avons identifié son rôle dans la neuroprotection d’une sous population de neurones exprimant le récepteur à la dopamine 2 (Drd2+). Notre premier objectif est de normaliser les symptomes moteurs et cognitifs en modulant la signalisation dopaminergique de deux manières : - Par l’augmentation simultanée de l’activité de la signalisation par les neurones Drd1+ et Drd2+, à la suite de l’administration du traitement L-DOPA, un précuseur de la dopamine, utilisé pour le traitement de la maladie de Parkinson. - Par l’augmentation de l’activité dopaminergique liée aux neurones Drd2+ par l’administration de pramipexol. Notre deuxième objectif est d’utiliser des traitements précoces, déjà utilisés dans la maladie de Parkinson, afin de prévenir l’apparition des symptomes : - L’utilisation de la molécule cGP connue pour son implication dans le neurodégénrescence lorsque qu’elle est dérégulée. C’est un traitement qui est déjà utilisé dans la maladie de Parkinson pour favoriser la survie neuronale. - L’utilisation de rétinyl acetate permettra quant à elle la normalisation de la voie de l’acide rétinoïque qui est extrêmement importante pour le développments et les fonctions striatales.
Bénéfices attendus
Pour chacun des quatre traitements (pramipexol, L-DOPA, cGP et rétinyl acetate), nous testerons des doses faibles afin de normaliser la signalisation dopaminergique dans le striatum ou de prévenir l’apparition des premiers symptomes liés à la neurodégénérescence. Dans ce but, le pramipexol sera injecté (et comparé à des injections de salin (véhicule), qui permettra de contrôler les effets de l’injection) à une dose très faible de 0.2 mg/kg et à une dose faible de 2 mg/kg avant des tests comportementaux (5 differents). Ces traitements seront réalisés sur le même lot d’animaux à 1 semaine d’écart afin d’étudier l’effet dose réponse du traitement. En résumé, la procédure se déroulera comme suit : J 1 : Injection n°1 (0.2mg/kg) suivie des tests 1 (30min) et 2 (3 x 5min) J 4 : Injection n°2 (0.2mg/kg) suivie du test 3 (32h) J 7 : Injection n°3 (0.2mg/kg) suivie du test 4 (30min) J 9 : Injection n°4 (0.2mg/kg) suivie du test 5 (30min) Une semaine de battement entre les injections J 17 : Injection n°1 (2mg/kg) suivie des tests 1 (30min) et 2 (3 x 5min) J 20 : Injection n°2 (2mg/kg) suivie du test 3 (32h) J 23 : Injection n°3 (2mg/kg) suivie du test 4 (30min) J 26 : Injection n°4 (2mg/kg) suivie du test 5 (30min) Toutes les injections seront effectuées avec des aiguilles fines. Les molécules sont injectées à des doses pharmacologiques faibles. Ce dosage est couramment utilisé dans les tests comportementaux chez les souris sans poser de problème. Il est d'ailleurs très largement en deça à la dose létale murine de 168,8mg/kg par injection intra-veineuse. L’administration de L-DOPA se fera par gavage des animaux à une dose de 10mg/kg, qui se fera avant chaque test comportemental. Ces tests seront réalisés de la même manière et dans le même ordre que pour le pramipexol. Le traitement cGP se fera par l’eau des biberons à une dose de 3mg/kg pendant 8 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux. Le traitement se fera donc par l’intermédiaire des mamans qui allèteront les jeunes souris. A la suite du traitement, les cinq différents tests comportementaux se feront dans le même ordre et de la même manière que décrit pour les traitements au L-DOPA. Enfin, le traitement au rétinyl acetate se fera grâce à une supplémentation de la nourriture avec du rétinyl acetate (1.8mg/kg). Ce traitement sera effectué pendant 8 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux et sera suivi des mêmes tests comportementaux indiqués pour lestraitements au L-DOPA.
Procédures
Tous les traitements notifiés ci-dessous se feront sur 3 groupes distincts d’animaux porteurs, ou non, d’une mutation agés de 15 à 30 semaines pour les traitements au pramipexol et L-DOPA et agés de 6 à 10 semaines pour les traitements au cGP et rétinyl acetate. Dans un premier temps, un traitement au pramipexol (5 secondes par traitement, 12 animaux traités/groupe à 0.2 et 2 mg/kg) et d’un traitement contrôle (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 54 mâles et 54 femelles = 108 animaux au total. Ce traitement sera suivi d’un test comportemental et sera réitéré avant chaque nouveau test comportemental (test 1 = 30min; test 2 = 3 x 5min; test 3 = 32h; test 4 = 30min; test 5 = 30min). Les tests comportementaux 1 et 2 feront suite à la même injection. Les souris changeront de groupe pramipexole-véhicule à chaque test selon un roulement et recevront donc au maximum 8 injections, dont 6 maximum de pramipexol. Dans un deuxième temps, un traitement au L-DOPA (15 secondes par traitement), admisnistré par gavage, (12 animaux traités/groupe) et d’un traitement avec de la solution saline (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 54 mâles et 54 femelles = 108 animaux au total. Ce traitement sera suivi d’un test comportemental et sera réitéré avant chaque nouveau test comportemental (voir ci-dessus). Les souris changeront de groupe L-DOPA-véhicule à chaque test selon un roulement et recevront donc au maximum 4 traitements, dont 3 maximum de L-DOPA. Dans un troisème temps, un traitement au cGP administré dans l’eau des biberons pendant 6 à 10 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux (12 animaux traités/groupe) soit un total de 36 mâles et 36 femelles = 72 animaux. Ce traitement sera suivi par 5 tests comportementaux visant à évaluer la motricité et la cognition des animaux traités (identiques aux autres traitements). Dans un quatrième temps, un traitement au rétinyl acetate administré par l’intermédiaire de la nourriture pendant 6 à 10 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux (12 animaux traités/groupe) soit un total de 36 mâles et 36 femelles = 72 animaux. Ce traitement sera suivi par 5 tests comportementaux (identiques aux autres traitements). La moitié des animaux de chacun des quatre traitements = 180 animaux, sera ensuite euthanasiée par perfusion intracardiaque après anesthésie générale. Une vérification de la perte des reflexes au niveau des membres et palpébral est réalisée avant tout acte chirurgical.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ne dépasseront pas la douleur occasionnée par l’introduction d’une aiguille dans l’abdomen de l’animal. En effet, les tests comportementaux moteurs effectués avant et après les traitements ne sont pas sujet à causer de la souffrance. Une légère modification de l’activité motrice et cognitive est à prévoir après les traitements, sans toutefois causer d’effets indésirables. Ces effets légers seront perceptibles jusqu’à deux heures après le traitement. De plus, la mutation n’engendre aucune souffrance chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permettent de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires. D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque sera effectuée pour la réalisation de marquages immuno-histochimiques qui nécéssitent une fixation complète et homogène de l’échantillon prélévé, permise par le PFA4% administré de manière sistémique par voie intracardiaque.
Remplacement
Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les réseaux neuronaux dans leur ensemble. En effet, la complexité biologique des signalisations dopaminergique et rétinoïdiennes ne permet par de remplacer les animaux par des modèles mathématiques ou in vitro, parce qu’il ne reflettent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.
Réduction
Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés : le nombre d'animaux utilisé (groupe de 12) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues chez des souris à la suite du test qui est le moins discriminant parmis les tests effectués ici, ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques provenant d’autres laboratoires. Une différence significative entre les groupes (de même sexe) sera recherchée par application d’un test statistique cohérent avec les analyses effectuées. De plus, les animaux traités avec le vehicule (contrôle de l’effet des traitements pramipexol et L-DOPA) seront reparti dans deux groupes de 6 animaux (et pas 12 comme pour les autres groupes). En effet la méthode de traitement ne devrait pas modifier le comportement de l’animal, ce qui permettra de regrouper les deux sous groupes lors des analyses.
Raffinement
En vue de RAFFINER les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses. Elles consistent uniquement en des études comportementales, effectuées avec ou sans injection préalable de composés pharmacologiques. Les molécules pharmacologiques sont utilisées à des doses faibles permettant simplement de révéler des dysfonctionnements ou de limiter/supprimer le phénotype. Des plus, les points d’injections de promipexol seront alternés entre les côtés gauche et droit de l’abdomen de l’animal. Ils seront attentivement surveillés pendant les heures suivant l’injection afin d’éviter toute infection.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de les mutations du gène RARb (identifiée chez l’homme) dans la mise en place et la progression de la maladie MCOPS12, les performances comportementales et les fonctions du système dopaminergique, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain et de la disponibilité de différentes lignées porteuses de mutations géniques ciblées permettant de couvrir l’ensemble des processus physiopathologiques : neurodégénérescence et neurodéveloppement. Pour les tests programmés nous utiliserons dans la plupart des cas des animaux adultes d’entre 15 et 30 semaines afin d’oberver les changements de comportements des animaux à la suite des traitements et de diminuer l’hétérogénéité des résultats qui pourraient être apporté par l’augmentation de l’âge des souris. Pour les tests au cGP et au rétinyl acetate, les animaux seront testés entre 6 à 10 semaines pour évaluer l’effet des traitements directement après l’arret de ces derniers.
Impact du stress prenatal sur le développement des troubles anxieux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
371 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de l'anesthésie sans réveil à modéré. Des femelles gestantes sont soumises à un stress répété, trois séances de 45 minutes par jour pendant sept jours, pour induire chez leurs descendants un phénotype anxieux étudié par des tests comportementaux d'exploration. Le porteur indique ne pas pouvoir limiter ce stress puisqu'il est "le but recherché", et que tous les animaux sont ensuite tués pour analyser leur cerveau. Il décrit le modèle rongeur comme "incontournable", les bénéfices pour l'humain étant renvoyés au long terme.
Objectifs
Le projet a pour but d'étudier l'émergence des troubles anxieux dans un modèle de stress précoce. Nous avons précédemment montré que les souris soumises à un stress développemental in utero (stress prénatal) présentent à l'âge adulte de nombreux troubles comportementaux caractérisés notamment par un phénotype de type anxieux. Sur la base de ces résultats, notre objectif est de déterminer à quel moment du développement ces troubles se mettent en place et d'en étudier les substrats neuroanatomiques. En particulier, nous nous interessons aux neurones granulaires du gyrus denté dont nous avons montré par ailleurs qu'ils étaient impliqués dans les troubles anxieux. Nous testerons donc l'hypothèse que le stress prénatal modifie la genèse ou l'activité des ces neurones, et que ces modifications sont associées à une augmentation de l'anxiété.
Bénéfices attendus
Ces expériences fourniront des informations uniques sur l'émergence des troubles anxieux et sur les processus neuronaux impliqués. Elles permettront à moyen terme d'identifier des marqueurs biologiques précoces prédictifs d'une vulnérabilité comportementale ultérieure. La transposition à l'humain, à plus long terme, permettra la prise en charge des individus à risque.
Procédures
Trois groupes d'animaux sont à considérer: le premier est constitué de femelles dont le niveau d'anxiété sera évalué par deux tests comportementaux d'une durée de 10 min et 5 min, respectivement à 2 jours d'intervalle (n=173) et dont une partie sera soumise à un stress comportemental léger durant la gestation (n= 40 souris; stress divisé en 3 sessions quotidiennes de 45 min pendant 7 jours); le deuxième est constitué de leurs descendants qui seront soumis à des tests comportementaux basés sur l'exploration spontanée avant étude des structures cérébrales impliquées (n=168 souris: un lot subit 3 tests comportementaux de 10 min maximum à raison d'un test par jour pendant 3 jours et le deuxième lot subit 1 test de 10 min); le troisième est constitué des descendants servant de population témoin puisqu'ils ne subissent aucun test comportemental (n=60). Pour analyser les structures cérébrales, tous les descendants (groupe 2 et 3) subiront au jour postnatal P1 une injection intrapéritonéale d'un marqueur de division cellulaire.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes sont soumises à des stress répétés qui vont générer un état de léger stress chronique. Il ne nous est pas possible de limiter ce stress ou de compenser cet état puisqu'il est le but recherché, et qu'il a pour objectif de mimer la situation observée chez l'humain (le modèle a été établi pour comprendre les mécanismes impliqués dans les troubles comportementaux observés dans la population humaine soumise à des situations environnementales délétères durant la vie intra utérine). Les tests comportementaux qui seront effectués sur les descendants sont quant à eux non invasifs et basés sur le comportement exploratoire naturel de la souris. Nous n'attendons pas d'effet indésirable de leur mise en oeuvre.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis mort à l'issue des procédures pour une étude de l'impact du stress sur les structures cérébrales.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation de souris de laboratoire. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons : 1) les troubles anxieux que nous analysons sont des troubles du comportement; à ce titre, ils nécessitent une approche intégrée prenant en compte l'ensemble de l'organisme et ils ne peuvent pas être récapitulés sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux.
Réduction
Nous avons travaillé sur la réduction du nombre d'animaux sur 2 plans: 1) lorsque cela est possible (pas d'impact attendu sur les résultats obtenus), les souris seront utilisées dans plusieurs tests comportementaux afin de réduire le nombre total d'animaux nécessaires; 2) Un effectif de 14 souris par groupe représente un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet. En effet, pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique, compte tenu de la variabilité comportementale attendue chez les souris, il faut obtenir un effectif final minimum de 12 individus. Etant donné que le pourcentage de perte liée aux aléas expérimentaux est estimé à 20% en fin d’expérience, il nous faut démarrer l’expérience avec un groupe de 14 souris.
Raffinement
Dès leur arrivée les souris sont hébergées en cages transparentes munies d’enrichissement (carrés de coton et de cellulose permettant l'élaboration d'un nid et tunnels). Durant les sessions de stress, les souris sont observées et manipulées 3 fois par jour et pesées tous les 2 jours. Hors périodes de stress les femelles et leurs descendants sont observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité et réactivité, aspect du pelage) et une pesée hebdomadaire est réalisée. Dans tous les cas, dès qu’un animal présent un signe de mal-être (pour les adultes: poil hérissé, prostration, plaie , perte de poids de plus de 15% par rapport à la pesée précédente; pour les jeunes: absence de poche de lait, corpulence anormale par rapport à la portée, couleur des muqueuses anormale, comportement aggressif de la mère), il sera isolé.
Choix des espèces
Le modèle d’étude employé doit permettre de reproduire un système biologique fonctionnel et complexe, dont les mécanismes ontogénétiques sont comparables à ceux qui régissent le développement des mêmes fonctions chez l’humain. Dans ce cadre, le modèle rongeur constitue un outil incontournable. Nous avons opté pour l'utilisation de souris dans un souci d'homogénéité de l'ensemble de nos expériences, ce qui permet une réduction du nombre d'animaux utilisés. Le but du projet étant d'étudier l'émergence des troubles anxieux au cours du développement, les souris seront étudiées à 3 stades de développement: période juvénile (entre 3 et 4 semaines) , période adolescente (entre 6 et 7 semaines), et âge adulte (entre 12 et 13 semaines).
Implication des canaux sodiques dépendants du voltage dans la progression du cancer colique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
482 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du côlon humain sont greffées dans leur caecum par chirurgie, puis la tumeur est suivie chaque semaine par imagerie sous anesthésie jusqu'à trois mois, 266 souris recevant en plus douze injections d'inhibiteurs dans la queue. Le porteur décrit des atteintes digestives et un amaigrissement liés au développement tumoral, et vise à valider les canaux sodiques NaV comme cible thérapeutique. Il affirme que la complexité multicellulaire du cancer ne pouvant pas être étudiée in vitro, le recours aux souris est "indispensable".
Objectifs
Il a été montré l’expression aberrante des canaux sodiques dépendants du voltage NaV dans les cellules cancéreuses et leur implication dans la progression des cancers. Ces canaux sont anormalement exprimés dans les biopsies humaines de carcinomes, et dans des cellules cancéreuses non-excitables de différentes origines épithéliales. C’est le cas de NaV1.5 qui est anormalement exprimé dans le cancer du sein et dans le cancer sporadique du côlon, et dont le niveau d’expression semble associé à un mauvais pronostic chez les patients. La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse. Quant à NaVBeta4, son niveau d’expression est réduit dans les tissus cancéreux coliques en comparaison des tissus non-cancéreux appariés. L’inhibition de l’expression de NaVBeta4 dans les cellules cancéreuses coliques SW60 et HCT116 augmente l’invasivité cellulaire in vitro. L'hypothèse de notre client est que les canaux NaV1.5, qui peuvent être inhibés par des composés pharmacologiques existants ou en cours de développement, pourraient représenter des cibles pour des nouvelles thérapies anticancéreuses. Pour valider cette hypothèse, il est important d’utiliser un modèle orthotopique de cancer colique qui consistera à greffer au niveau du caecum de souris, des cellules cancéreuses coliques humaines (HCT-116 ou SW620) bioluminescentes. Les souris que nous utiliserons seront donc des souris immunodéficientes, à phénotype dommageable, qui seront hébergées en portoir ventilé dans des conditions n'entraînant pas l'expression du phénotype.
Bénéfices attendus
La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse. La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse.
Procédures
482 souris auront des greffes de cellules tumorales au niveau du caecum (procédures 1, 2, 3, 4) Elles seront placées sous paracétamol (analgésique) dans l'eau de boisson la veille de l’intervention (500mg dans un biberon de 200mL) jusqu’à 24h post induction. L'induction sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2% dans l'air). A la fin de l’intervention, une injection de tolfédine 4mg/kg (anti inflammatoire) sera réalisée en sous cutané (50μL) et renouvelée le lendemain de l'intervention. Elles subiront une seule chirurgie lors de l'induction tumorale qui durera 20 minutes maximum. 482 souris auront une imagerie de bioluminescence 1 fois par semaine à partir du 7ème jour post greffe sous anesthésie gazeuse Isoflurane 2% dans l’air avec injection vigile 4 minutes avant l’examen de 100µL de luciférine par voie intrapéritoléale pour le suivi de la prolifération tumorale. En parallèle une échographie sera réalisée 1 fois par semaine ou toutes les 2-3 semaines en fonction de la vitesse de prolifération des tumeurs. Ces 2 examens successifs ont chacun une durée inférieure à 10min et seront réalisés sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (2% dans l'air), sur support chauffé à 37°C. Par ailleurs, un monitoring cardio respiratoire est réalisé simultanément en cours d’échographie qui permet de s’assurer que l’animal supporte bien l’examen. Soit sur une durée de 3 mois (temps maximal de l’étude) chaque souris aura 11 séances d’imagerie de bioluminescence et 11 séances d’imagerie échographique au maximum. 266 souris vigiles (procédures 2, 3 et 4) recevront 3 fois/semaine pendant 4 semaines (= 12 injections par souris) 150-200μLd’inhibiteurs par voie intraveineuse au niveau de la queue.
Impact sur les animaux
Les dommages attendus pour les animaux sont liés au développement d'une tumeur primaire au niveau du colon et éventuellement de métastases (problèmes digestifs, amaigrissement).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chque procédure.
Remplacement
Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes, tissus et types cellulaires, conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur survie et dissémination dans l’organisme. Ces paramètres complexes, multicellulaires et multiorganes, ne pouvant pas être étudiés in vitro, le recours aux animaux est indispensable. Par ailleurs, afin de développer de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, des études pharmacologiques sur animaux sont nécessaires. Les expérimentations pourront mettre en évidence un nouvel acteur du développement métastatique, les canaux NaV, qui pourraient servir de nouveau marqueur prédictif et éventuellement de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement du cancer colique.
Réduction
La mise en oeuvre de l'imagerie permet un suivi longitudinal du même animal ce qui permet de réduire leur nombre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations.
Raffinement
Le suivi de la croissance tumorale primaire et secondaire (métastases) sera réalisé par imagerie de bioluminescence in vivo et d’échographie, approches non invasives et indolores pratiquées par ailleurs sur animal anesthésié. Des antalgiques seront utilisés lors de la chirurgie et 24h après. Par ailleurs, les souris seront hébergées en portoir ventilé et en accord avec les directives européennes. des grilles de scoring avec des points limites prédictifs seront mis en place et le personnel observera quotidiennement les animaux afin d'anticiper la souffrance animale.
Choix des espèces
Dans notre projet, les informations attendues ne peuvent pas être obtenues in vitro car à ce jour l'animal de laboratoire reste le seul recours permettant d'étudier le développement tumoral et l'efficacité thérapeutique en tenant compte de la complexité de la physiologie d'un organisme vivant. La souris est un animal chez qui il est possible d'obtenir le développement de tumeurs d'origine murine et humaine. La souris est ainsi une espèce animale classiquement utilisée, pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), de par la possibilité d’avoir accès à des animaux immunodéprimés permettant l’implantation de cellules cancéreuses humaines, ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo (bioluminescence, échographie). Modèle de cancer réalisable chez la jeune souris adulte (6 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, nous avons rencontré des difficultés pour implanter des cellules tumorales humaines avec un taux de prise de greffe moins important.
Impacte de l’alimentation et l’activité physique dans un modèle de tumeur sous cutanée induite par injection de cellules cancéreuses prostatiques (NuPac).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, quarante d'entre elles étant classées en gravité sévère. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses prostatiques, sont hébergées seules puis soumises à un exercice forcé sur tapis roulant et à des tests d'endurance, pour mesurer l'effet de l'activité physique et de l'alimentation sur la tumeur. Le porteur reconnaît que l'entraînement peut provoquer détresse et souffrance liées à la fatigue, et que les souris atteignant les points limites sont tuées par anesthésie sans réveil. Il affirme qu'aucune alternative in vitro n'existe et conclut que la recherche "rend incontournable" le recours à la souris.
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'identifier l'impact de l'activité physique et de la nutrition sur la reprogrammation de certains biomarqueurs dans le cancer de la prostate.
Bénéfices attendus
L'Activité Physique sur tapis roulant pourrait ralentir la croissance tumorale comparé aux souris ne pratiquant pas d'AP. Cela rejoindrait des résultats précédemment obtenus et l'activité physique pourrait potentialiser l'effet des AGPI et ainsi conduire à la reprogrammation de biomarqueurs dans le modèle de souris TRAMP-C2.
Procédures
Les animaux serons soumis a une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses, hébergé en isolement, pratiqué de l’activité physique, de test d'endurance et subirons une régime alimentaire.
Impact sur les animaux
1. Injection avec des cellules tumorales induira l'aparition d'une tumeur. 2. L'entrainement sur tapis roulant et le test de force peuvent induire comme nuisance la détresse, souffrance due a la fatigue. 3. Le régime AGPI ne contient que des ingrédients conventionnels et n’est pas connu pour induire des pathologies ou des effets secondaires chez les animaux. Cependant nous sourveillons la perte d'apetit comme possible nuissance à ce geste experimentale.
Devenir
A l'issue de la procédure 1-4, les animaux sont gardés en vie. Les animaux qui présentent de signes de souffrance et détresse, pendant le protocole, seront sorties du protocole et ses souffrances abrèges avec une anesthésie sans réveil.
Remplacement
Dans ce projet, nous cherchons à identifier l'impact de l'activité physique et de la nutrition dans un modèle murin de cancer de la prostate. Ceci n'est pas démontrable "in vitro" car il est impossible de mimer l'activité physique sur des cultures cellulaires. Nous cherchons ici à étudier les interactions entre la tumeur, le tissu adipeux et le muscle. Il n'existe donc pas d'altérnative in vitro pour ce type d'évaluation. La nécessité de la recherche biologique, médicale rend incontournable le recours à l'expérimentation animale pour faire progresser les connaissances et améliorer la prise en charge et la survie de patients atteints de cancer de prostate.
Réduction
Les cohortes seront constituées de 10 souris par groupe afin d’obtenir un nombre d'animaux suffisants pour juger du caractère significatif des résultats. La taille de l’échantillonnage de chaque groupe a été définie à partir d’un test statistique (Sample size test). Afin de juger des effets de l'activité physique et de la nutrition sur le cancer de la prostate, des ANOVA à deux facteurs seront utilisées. En cas de différences significatives sur ce test, un Bonferroni post hoc test sera employé pour isoler les effets et les interactions entre les différentes conditions expérimentales.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent un hébergement en cage individuelle car il est indispensable de mesurer la consommation quotidienne de nourriture mais des précautions sont prises. Les animaux seront hébergés dans des cages ouvertes, transparente, individuelle, côte à côte et enrichies avec des jouets et du matériel adapté ce qui permet de limiter l'isolement social et le stress. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel des animaux. Un questionnaire pour mesurer le niveau d'iconfort des rongeurs est mis à disposition et disponible dans les locaux de l’animalerie. Le questionnaire demande de suivre et de noter les signes visibles d’inconfort chez le rongeur (vocalisation, agressivité, retrait d’un membre, autres). En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procéderons à la sortie de l'animal du protocole.
Choix des espèces
Le modèle de souris syngéniques C57/BL6 est un modèle pertinent pour étudier le cancer de la prostate car il va permettre l'injection de cellules cancéreuses prostatiques murines donc c'est un modèle de souris immunocompétentes. L'implantation de la lignée cellulaire TRAMP-C2 dans ce modèle permet de développer un modèle de cancer de la prostate similaire à ceux observés chez l'Homme. Les cohortes seront constitués de 10 animaux par groupe afin d'obtenir un nombre de sujets suffisants pour juger de la significativité de notre étude. Agées de 12-15 semaines, les souris seront des adultes afin de se rapprocher de l'âge médian de cancer de prostate chez l'homme.
Pacage en Polyculture d’étang
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 332 poissons, carpes, tanches, gardons et sandres, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés ou gardés comme géniteurs. Ils sont répartis dans des étangs expérimentaux et pesés puis mesurés à deux reprises sous anesthésie, pour tester l'effet d'une séparation temporaire des espèces sur la productivité et la biodiversité d'une polyculture d'étang. Le porteur décrit un projet à finalité zootechnique visant à optimiser les pratiques d'élevage tout en préservant la richesse en espèces. Il affirme que la modélisation in silico de ces interactions n'est pas encore possible mais que les données recueillies doivent y contribuer.
Objectifs
L’expérience Pacage en étang s’inscrit dans le cadre d’un projet financé par l’Europe, qui a pour objectif d’établir de nouvelles pratiques alliant le respect de l’environnement, la biodiversité et la productivité des polycultures de poissons en étang. La définition de la composition de la polyculture est le thème central de ce projet, c’est-à-dire d’être capable de définir les différentes espèces de poissons à élever et d’en établir leurs effectifs. Ces propositions de pratiques prendront en compte l’ensemble des compartiments biologiques du système et la diversité qui le compose pour produire la ressource de manière plus durable. Ce projet s’appuie sur une co-construction de scenarii avec des représentants professionnels et sur une démarche expérimentale en étang. L’expérience Pacage en étang vise à tester l’effet d’une segmentation temporaire de l’étang, permettant la séparation des espèces (carpes, tanches, gardons, sandres), sur la productivité totale en poisson, la croissance de chaque espèce, le recrutement en juvéniles, les paramètres physicochimiques du milieu et la biodiversité en invertébrés (macro-invertébrés et zooplancton) et en macrophytes.Le projet vise à caractériser les interactions entre les facteurs du milieu, les différentes espèces et la biodiversité aquatique, dans la conduite de la polyculture de poissons en étang. En particulier, nous cherchons à caractériser l’effet du regroupement temporaire des espèces ayant différents rôles fonctionnels et trophiques sur la productivité totale en poisson, la croissance de chaque espèce, le recrutement en juvéniles, les paramètres physicochimiques du milieu et la biodiversité en invertébrés (macro-invertébrés et zooplancton) et en macrophytes. Les rôles majeurs des différentes espèces retenues sont, pour la carpe commune : bioturbation et croissance rapide ; pour la tanche et le gardon : production de juvéniles et alimentation opportuniste ; pour le sandre : prédateur pour invertébrés et juvéniles de poisson. Les données récoltées permettront d’alimenter une modélisation trophique des systèmes d’étangs en polyculture, à même de représenter l’effet des interactions entre espèces.
Bénéfices attendus
L’expérience pacage en étang doit permettre d’éclairer les interactions entre espèces dans le cadre de polyculture de poisson en étang. Le rôle de ces espèces et de leur conduite sur la biodiversité sera mis en évidence dans l’objectif d’optimiser les pratiques d’élevage pour améliorer les impacts sur l’environnement et préserver la richesse en espèces, tout en maintenant une production rentable pour l’exploitant. De façon plus générale, ce travail doit contribuer aux réflexions en cours sur le rôle de la diversité sur la robustesse et la résilience des systèmes d’élevage.
Procédures
Mesures biométriques non invasives réalisées deux fois, de façon ponctuelle.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances pour les animaux consistent en la manipulation en début et fin d’expérience, afin de réaliser des mesures (poids, longueurs) individuelles et les répartir dans leurs structures d’accueil (étangs expérimentaux en début d’exprience, étangs de stockage en fin d’expérience).
Devenir
Les poissons n’ayant subi aucun traitement invasif, pourront être réutilisés dans des expériences ultérieures ou servir de géniteurs pour utilisation interne à l’installation expérimentale.
Remplacement
Cette expérience est principalement à vocation zootechnique. Elle nécessite le recours aux espèces utilisées en élevage classique. Le manque de recul et de modèle sur les interactions entre les espèces aquatiques d’élevage, il n’est pas encore possible de réaliser ce type d’expérience in silico. Néanmoins, les données récoltées dans le cadre de l’expérience, ont vocation à alimenter des démarches de modélisation qui vont dans le sens de la limitation au recours aux animaux à l’avenir.
Réduction
Les proportions des différentes espèces et leurs effectifs ont été déterminés pour représenter les pratiques d’empoissonnement en polyculture d’étang courrantes. Il est n’est pas possible de les diminuer sans perdre le caractère plausible des pratiques. Le nombre de trois répliquats est le minimum que nous pouvons admettre pour obtenir des résultats statistiquement exploitables.
Raffinement
Afin de limiter les nuisances envers les poissons, les conditions de contention sont surveillées, notamment en maintenant un renouvellement d’eau lors des stockages temporaires et le contrôle des comportements. Avant chaque manipulation pour mesures (non invasives), les poissons sont anesthésiés, afin de limiter le stress, les risques de chute, limiter la durée hors d’eau en augmentant la rapidité des mesures de biométrie. La phase de réveil est contrôlée dans des bassins séparés par espèce, avec renouvellement d’eau.
Choix des espèces
Les espèces choisies : carpe commune (Cyprinus carpio), tanche (Tinca tinca), gardon (Rutilus rutilus) et sandre (Sander lucioperca), sont représentatives des polycultures de poissons d'étangs extensifs ou semi-intensifs en France. Ce sont par ailleurs, des espèces particulièrement tolérantes aux bas niveaux de qualité d’eau, ce qui les rend tolérantes aux manipulations. Les carpes et les sandres sont de petites tailles (un an de croissance), afin d’optimiser leur croissance dans le dispositif. Les tanches et les gardons sont des géniteurs afin d’optimiser leur reproduction.
Production de tumoroïdes pour l’étude de l’hétérogénéité des fibroblastes tumoraux dans les cancers cutanés.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules cancéreuses cutanées leur sont injectées dans le derme sans anesthésie, puis les tumeurs se développent avant une mise à mort par dislocation cervicale pour les prélever. Le porteur indique qu'une perte de poids importante ou des difficultés respiratoires déclenchent la mise à mort, et présente le projet comme un moyen de produire des tumeurs destinées à des cultures qui réduiraient à terme le recours aux animaux. Il reconnaît qu'aucun modèle en boîte de culture ne reproduit à ce jour la complexité des tumeurs.
Objectifs
Les lésions cancéreuses de la peau sont constitué de plusieurs types cellulaires en plus des cellules cancéreuses, on y trouve notamment des fibroblastes tumoraux, qui jouent un rôle fondamental dans le développement de ces cancers. Ces cellules favorisent la croissance, l’invasion, le dissémination métastatique et la résistance aux chimiothérapies des cellules tumorales. Les fibroblastes tumoraux sont une population hétérogène issue de l’activation des fibroblastes du derme par les cellules tumorales. Un challenge majeur dans le traitement des cancers cutanés est leur résistance aux agents de chimiothérapies. Le but du projet est de déterminer les mécanismes moléculaires et cellulaires de l’activation des fibroblastes tumoraux afin de contrecarrer leur capacité de promouvoir le développement et la résistance des cancers de la peau. A ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro permettant de récapituler chacun des constituants cellulaires de la tumeur. Le but de ce projet est de produire chez la souris, des cancers cutanés qui permettront l’établissement en boite de culture, de modèle de cancer cutanés, contenant chacun des constituants cellulaires de la tumeur.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra la production de tumeurs cutanées qui seront ensuite utilisées en boite de culture pour l’étude de l’hétérogénéité des fibroblastes tumoraux. Les bénéfices de ce projet sont nombreux, notamment, I) la compréhension des mécanismes cellulaires de l'activation des fibroblastes tumoraux par chacun des constituants cellulaire de la tumeur, II) le développement d'un modèle de tumeur en boite de culture en trois dimension, représentatif de l'hétérogénéité tumorale, III) la réduction du nombre de souris utilisées au travers de la production de petites tumeurs en boite de culture, IV) nous pourrons réaliser un criblage de drogues sur les cancers en boite de culture, réduisant ainsi le nombre de souris, la quantité de drogue utilisée et la souffrance des animaux, enfin V) cette étude facilitera la mise en place du model de cancer cutané en boite de culture qui pourra être étendu à d’autres équipes de recherches.
Procédures
Les 264 animaux de cette étude seront soumis à la même intervention unique, à savoir l’injection en intradermique de cellules tumorales cutanées SCC38. Les cellules SCC38 seront injectées dans un des flancs de la souris.
Impact sur les animaux
Toutes les souris utilisées, au total 264, au cours de cette étude recevront le même traitement, à savoir l’injection de cellules tumorales en intradermique. Ainsi, les nuisances ou effets indésirables attendus seront les mêmes pour tous les animaux. Les effets indésirables majeurs seront sur une perte de poids importante ou des difficultés respiratoires majeurs qui entraineront la mise à mort de l’animal. L’injection des cellules tumorales sera faite en intradermique sans anesthésie, limitant ainsi le stress de l'animal. Pour toutes les nuisances, une fiche de score détaillée a été mise en place et un suivi à raison de deux visites par semaine sera instauré.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale pour effectuer le prélèvement des tumeurs
Remplacement
La production de tumeurs en boite de culture est une méthode de remplacement pour l’étude du développement tumoral. Nous souhaitons développer une méthode alternative qui permettra à terme de réduire fortement l’utilisation des animaux en recherche. Ainsi, nous souhaitons développé au laboratoire un modèle de cancer en boite de culture qui nous permettra de vérifier le rôle des cellules cancéreuses dans l’activation des fibroblastes tumoraux. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de modèle en boite de culture récapitulent toute la complexité des tumeurs, c’est pourquoi nous souhaitons développer le modèle présenté ici.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été choisi afin d’être capable de détecter toute différence significative entre les groupes avec un nombre de souris minimum. Nos groupes expérimentaux sont composés de 8 animaux en accord avec la pénétrance du modèle de cancer cutané des cellules SCC38 chez la souris et l'analyse prévisionnelle réalisée avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris a donc été calculé pour être capable de détecter toute variation significative du traitement sur les tumeurs en boite de culture. Une fois les résultats obtenus, les analyses statistiques seront effectuées dans les règles de l’art.
Raffinement
Le suivi des animaux sera évalué grâce à une grille de score permettant le suivi du bien-être des animaux. Les souris seront pesées 2 fois par semaine, le volume tumoral et donc le poids de la tumeur sera mesuré au moyen d’un pied à coulisse 2 fois par semaine. Une perte de poids supérieure à 20%, sans compter le poids de la tumeur, en référence au jour de l'injection des cellules tumorales est un point limite. Une taille de tumeur supérieure à 1 cm3 sera considérée comme un point limite. Ainsi, toute souffrance des animaux pourra donc être évaluée de manière objective grâce à la fiche de score. Un anti- inflammatoire pourra être donné aux souris pour un score intermédiaire, alors que tout point limite atteint entrainera la mise à mort de la souris. Une attention toute particulière sera donc apportée à l’analyse de la douleur des souris.
Choix des espèces
Le protocole de développement de tumoroïdes cutané nécessite l’emploi de souris FVB femelle adulte pour avoir un modèle tumoral syngénique. En effet, les cellules tumorales SCC38 que nous injecterons sont issues d’un cancer cutané chimiquement induit chez la souris FVB femelle adulte.