Oncologie

Pour établir le rôle d'un neuropeptide dans la préférence alimentaire, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par ponction cardiaque ou perfusion intracardiaque sous anesthésie. Chacune subit sept prélèvements de sang après incision de l'extrémité de la queue, des injections quotidiennes pendant cinq jours et cinq jours d'isolement en cage métabolique. Le porteur indique que les tests glycémiques peuvent provoquer une hypoglycémie si la dose d'insuline n'est pas optimale, et que l'isolement peut entraîner un stress et une perte de poids. Le raffinement tient en une phrase, qui annonce des points limites sans en préciser un seul.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier le rôle d'une molécule dans la détermination de la préférence alimentaire et des intolérances alimentaires chez la souris. Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces intolérances et de maladies inflammatoires intestinales.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous souhaitons mettre en lumière le rôle d'une molécule dans la préférence alimentaire et faire le lien avec les intolérances alimentaires et les maladies inflammatoires de l'intestin. Cela pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces troubles chez l'humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests glycémiques d'une durée de 1h et 2h durant lesquels des prélèvements de sang seront effectués à partir de l'extrémité de la queue des animaux. Ils resteront libres de leurs mouvements (7 prélèvements de microgouttes de sang par animal, moins d'une minute par prélèvement). Les traitements par injections auront lieu une fois par jour pendant 5 jours. On réalisera une mesure de la prise alimentaire des souris grâce aux cages métaboliques où les souris seront isolées pendant 5 jours. Les souris seront également soumises à un prélèvement de sang terminal (ponction cardiaque causant la mort de l'animal) ou à une perfusion intra-cardiaque en étant anesthésiées, cela durera 5 min avant d'être mises à mort.

Impact sur les animaux

L'isolement dans les cages métaboliques pendant 5 jours peut entraîner un stress et une perte de poids chez les souris. Le gavage, les injections et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress. La légère incision à l'extrémité de la queue peut provoquer une douleur. Les tests glycémiques peuvent entraîner une hypoglycémie si la quantité d'insuline injectée n'est pas optimale. Les injections des molécules ont déjà été réalisées lors de précédentes études et n'ont pas montré d'effets indésirables. Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement par le personnel de l'animalerie ou les expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car nous avons besoin de prélever leur sang et/ou leurs organes pour les analyser ultérieurement.

Remplacement

Pour étudier le rôle de notre molécule dans la détermination de la préférence alimentaire, nous devons travailler sur des modèles murins in vivo. Nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures cellulaires puisque nous avons besoin de mesurer des paramètres sanguins et métaboliques ainsi que d'étudier le comportement alimentaire, ce qui ne peut être effectué que sur des organismes entiers in vivo. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire.

Réduction

Les expériences seront limitées à un nombre de 24 souris (12 femelles et 12 mâles) par condition de traitement pour être statistiquement analysables. Les tests glycémiques, qui n'impliquent pas d'effet néfaste à long terme pourront êtres menées successivement sur les mêmes animaux en respectant une période de repos aux cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour analyser les résultats efficacement.

Raffinement

L'anesthésie et l'analgésie seront utilisées selon les procédures décrites dans ce document, des points limites seront mis en place et le bien-être des souris sera vérifié régulièrement par le personnel de l'animalerie et les expérimentateurs.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle de la molécule dans la détermination de la préférence alimentaire, nous devons travailler sur des modèles murins in vivo. Nous avons besoin de mesurer des paramètres sanguins et métaboliques ainsi que d'étudier le comportement alimentaire, ce qui ne peut être effectué que sur des organismes entiers in vivo. De plus, les modèles animaux invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire. Au cours de cette étude nous étudierons la physiologie de la souris adulte. Elles seront donc âgées d'au moins 8 semaines.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du pancréas par chirurgie de trente minutes, un gavage quotidien pendant trente jours, jusqu'à deux injections par semaine durant cinq semaines et deux échographies hebdomadaires sous anesthésie pendant quatre semaines. La chimiothérapie peut provoquer une nécrose de la queue, une perte de poids et des douleurs. Les probiotiques ou antibiotiques censés améliorer le pronostic des patients restent une espérance, alors que le porteur affirme que les organoïdes et les tumeurs sur puce ne permettent pas d'étudier les interactions avec le système immunitaire et qu'il faut donc "travailler avec des animaux vivants".

Objectifs

Nous travaillons sur le cancer du pancréas qui a un pronostic très sombre car il ne répond pas bien aux traitements (chimiothérapie, immunothérapie). Le but de ce projet est de comprendre comment certaines bactéries naturellement présentes dans notre organisme (microbiote) favorisent la résistance de ce cancer aux traitements. Il a été démontré que certaines bactéries du microbiote, naturellement présentes dans l’intestin ou la cavité orale pouvaient se retrouver dans les tumeurs au sein même du pancréas. Certaines de ces bactéries lorsqu’elles étaient présentes dans les tumeurs étaient même corrélées à un mauvais pronostic. Le but de notre projet est de comprendre comment les bactéries migrent du système digestif jusqu’à la tumeur et comment elles interagissent avec la tumeur. Nous cherchons à comprendre comment ces bactéries interagissent avec les cellules tumorales mais aussi les cellules immunitaires présentes dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels du cancer du pancréas sont décevants car bien souvent la tumeur est résistante aux traitements. Et lorsqu’elle est initialement sensible aux traitements, elle développe petit à petit des résistances. La résistance aux traitements est une des clefs pour traiter cette maladie. Une partie de la résistance aux traitements vient des bactéries naturellement présente dans notre organisme. : le microbiote. En comprenant comment ces bactéries migrent dans la tumeur et comme elles interagissent avec les cellules tumorales et les cellules du système immunitaire, il sera possible d’agir à la fois sur leur mécanisme d’action voir directement sur les bactéries à l’aide de probiotiques et d’antibiotiques. Nous espérons à terme améliorer l’efficacité des traitements et donc le pronostic des patients.

Procédures

Pour la chirurgie (greffe des cellules tumorales) : Celle-ci n’a lieu qu’une fois par animal, d’une durée de 30 minutes. Ce geste est réalisé sous anesthésie générale. Pour les injections de traitements Dans cette étude, un traitement est donné par la bouche (gavage) aux souris pendant 30 jours (moins de 30 secondes). Les animaux pourront recevoir jusqu’à deux injections par semaine pendant cinq semaines maximum (3 à 5 minutes). Pour les échographies : Elles sont pratiquées pendant 4 semaines, à raison de 2 fois par semaine sur un animal sous anesthésie générale. Chaque échographie dure environ 10 min (de l’endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Les traitements de chimiothérapie peuvent induire une nécrose de la queue de la souris. Le développement de tumeur ainsi que le traitement par chimiothérapies peuvent s’accompagner d’une perte de poids, et de douleur. L’administration des traitements peut rajouter du stress à l’animal ansi qu’une douleur modérée ou un inconfort lors de leur réalisation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de procéder à l’analyse des tissus. En effet, nos recherches nécessitent l’analyse des organes des animaux. Les expériences sont conçues pour permettre la récupération de la tumeur ainsi que des organes de métastases. Les tumeurs seront collectées soit pour des analyses histologique, soit pour l’analyse des cellules immunitaires présentes dans la tumeur.

Remplacement

L'identification des phénomènes de résistances aux thérapies ne peut être réalisée que directement chez l’animal car il met en jeu des interactions entre de nombreuses populations cellulaires (interactions cancer / microenvironnement (réaction fibreuse) / réaction de l’hôte) qui ne peuvent pas encore être mimées in vitro, notamment le rôle complexe du système immunitaire. Les modèles précliniques classiques, comme les organoïdes ou les tumeurs sur puce, ne permettent pas d'étudier efficacement les interactions complexes entre les organes et le système immunitaire. Cependant, dès que possible, nous remplacerons les études faites sur les modèles murins par des expérimentations réalisées sur des cultures de cellules isolées de nos modèles murins, qui peuvent être maintenues plusieurs semaines en culture et permettront de tester nos hypothèses. Ce projet est multidisciplinaire et vise à mieux comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans le contrôle d'un modèle murin mimant le cancer du pancréas. De ce fait nous devrons travailler avec des animaux vivants afin de pouvoir analyser le rôle des différents organes et différents types cellulaires suspectés d'être impliqués dans le développement de cette pathologie et dans l'immuno- et chimiorésistance.

Réduction

Nous avons calculé que le nombre minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables, reproductibles et statistiquement interprétables est de 6 souris par groupe, avec deux répétitions indépendantes de chaque expérience afin de valider la robustesse des résultats. Nous avons pris plusieurs mesures pour réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés, tout en maintenant la qualité des données : 1-maximisation des analyses par animal en réalisant plusieurs types d’analyses sur un même animal afin d’optimiser chaque inclusion expérimentale, incluant des analyses histologiques sur plusieurs tissus atteints (pancréas, foie, poumon, péritoine), des analyses immunologiques multiparamétriques par cytométrie en flux pour caractériser la nature, le phénotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires post-mortem, ainsi que des analyses sanguines ; 2-optimisation du design expérimental, avec un protocole conçu pour limiter la variabilité inter-individuelle, permettant ainsi d’avoir un nombre réduit d’animaux par groupe tout en conservant une puissance statistique suffisante ; 3-réutilisation de données biologiques, les mêmes échantillons biologiques (sang, tissus) pouvant dans certains cas être utilisés pour plusieurs types d’analyses complémentaires. Le nombre total d’animaux a donc été défini en tenant compte d’un équilibre rigoureux entre nécessité scientifique, réduction des effectifs animaux et qualité des données attendues d’un point de vue scientifique.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d’acclimatation lors de leur arrivée à l’animalerie. Ils sont pris en charge par le personnel de la zootechnie qui les observent quotidiennement afin de détecter d’éventuelles blessures, un comportement anormal ou un amaigrissement. Un enrichissement adapté est disposé dans les cages des souris avec alternativement des dômes en plastique, morceaux de bois, sopalin. Les souris sont regroupées par lot de 5 animaux maximum et en groupe homogène si le nombre est inférieur. Lors de la mise en place des procédures expérimentales, l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Afin de préserver le bien être animal, nous avons mis en place pour chaque procédure qui pourrait engendrer du stress ou de la douleur des procédures afin de les dmininuer au maximum. Les animaux seront habitués à chaque nouvel environnement, nous réaliserons des injections d’antalgique avant et après chaque procédure douloureuse. Nous surveillerons de près le poids de l’animal, anticiperons les pertes thermiques lors de l’anesthésie générale, anisi que le déssèchement occulaire et la potentielle deshydratation de l’animal. Pour chaque procédure, nous avons établi un système de « scoring » de la douleur et une procédure à appliquer en fonction de celui-ci. Le système de scoring prend notamment en compte les paramètres suivants : poids (prise du poids initial à l'arrivée des animaux puis suivi constant et régulier (au moins 2 fois par semaine), signes extérieurs de stress tels que le comportement, la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisants ou bien collés et gras, etc…), volume tumoral (suivi par échographie). Lors de l'apparition des symptômes, les souris seront scorées pour évaluer la gravité de la pathologie. En cas de perte de poids trop importante, de volume tumoral ayant dépassé les limites ou de douleur non soulagées par les antalgiques, nous procéderons à la mise à mort de l’animal. Toutes les procédures seront réalisées par un personnel diplômé et entrainé aux gestes.

Choix des espèces

Lors de notre étude, nous cherchons à comprendre comment le microbiote agit sur le système immunitaire et comment cela entraîne une résistance aux traitements d’immunothérapie. Pour comprendre cela, nous avons besoin de travailler avec des systèmes entiers (être vivant). En effet, les autres modèles qui existent, tumeurs sur puce, organoïdes ne peuvent pas reproduire le système immunitaire d’un être vivant. Les souris ont l’avantage de pouvoir à la fois reproduire la pathologie cancéreuse pancréatique mais aussi le système immunitaire complexe qui entre en jeu. Les souris seront utilisées entre 8 et 12 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Cinq injections en une semaine déclenchent chez des souris transgéniques adultes des néoplasies prostatiques, laissées ensuite évoluer vers des tumeurs de taille importante aux points de cinétique les plus tardifs. 6 312 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever la prostate et d'autres organes. S'y ajoutent jusqu'à trois prélèvements sanguins par animal, des traitements deux fois par jour pendant une semaine, des injections de radiomarqueur suivies de trois anesthésies et des palpations abdominales répétées tout au long de leur vie. Le porteur décrit une douleur abdominale reconnaissable à une posture inhabituelle, au poil hérissé et au dos voûté, et annonce que toute souris dans cet état sera sortie de l'étude, alors que le protocole prévoit d'observer ces tumeurs jusqu'aux stades tardifs.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020 . Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables . Une meilleure caractérisation de la progression des tumeurs est donc requise afin d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate développés au laboratoire sont basés sur l’expression de la recombinase chimérique Cre-ERT2 dont l'activité est induite par le tamoxifène dans l’épithélium prostatique, afin d'inactiver à l’âge adulte le gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines (Pten). Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme . À noter que l'inactivation de Trp53 dans les cellules épithéliales prostatiques déficientes en PTEN permet de lever la barrière de sénescence, accélère le développement d'adénocarcinomes et favorise l'apparition de tumeurs sarcomatoïdes métastatiques. De plus, la perte de l'expression du récepteur à la vitamine D (VDR) favorise le developpement de métastases et de tumeurs aggressives. De récentes études, dont les notres, suggèrent un rôle important des neutrophiles, des cellules myéloïdes du système immunitaire, dans la tumorigènese prostatique. Cependant, peu d'information sont disponible sur leur hétérogénité au cours de la tumorigénèse, ni sur l'efficacité de les cibler, voire de les utiliser comme biomarqueur. L'objectif de ce projet est de déterminer en utilisant des technologies innovantes si les neutrophiles contribuent à la progression des lésions précancéreuses de la prostate induites par injection de tamoxifène. Ce projet ce déroulera dans deux Etablissement Utilisateur

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate est un des cancers masculins les plus fréquents et meurtriers, notamment en raison de limite d’efficacité pour les traitements et les options diagnostiques. Ce projet vise à démontrer l’intérêt des neutrophiles comme nouvel outil diagnostique et comme cible thérapeutique pour ces cancers réfractaires.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections réalisées au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance) (EU1). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur des animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours (EU1). Une injection prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris (EU2). Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris. Un sous groupe subira sous anethesie générale, une injection suivi du sacrifice (EU1). (maximum 5 minutes sous anethesie gazeuse). Des cohortes independantes seront injectées avec le radiomarqueur et anesthésiées au maximum 3 fois (30 min max) (EU2). Des cohortes indépendantes seront traitées (10 secondes de contentions) 2 fois par jour pendant une semaine (EU2).

Impact sur les animaux

Suite à l'injection, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection, dans ce cas la souris sera sortie de l'étude. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN (néoplasie prostatique intraéphithéliale), à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. Dans ce cas la souris sera sortie de l'étude. Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris, dans ce cas une administration de solution saline sera réalisée. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement. Des secheresses ophtalmiques peuvent apparaitre au cours de l'anesthésie, dans ce cas un gel ophtalmique sera appliqué.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. De plus, les études longitudinales chez l'homme ne sont pas ethique puisqu'elle nécessite des biopsies à répétition. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points de cinétique ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. L’hétérogénéité des résultats des expériences antérieures demande des cohortes de 20 animaux par point de cinétique, ce qui justifie l’utilisation des test statistiques paramétriques. Afin d’obtenir des résultats significatifs, un nombre d’animaux utilisés par condition (d’un génotype donné à un âge donné) a été calculé en fonction de la différence attendue et de l'hétérogéneité observée. Dans ces conditions, on aura besoin de 20 animaux par groupe. La tomographie par émission de positrons (TEP) est un examen d'imagerie en médecine nucléaire qui est peu invasif, les quantités de produits injectées sont faible et permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.

Raffinement

Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids et par palpations abdominales. Les premières cohortes d’animaux, injectés et divisés en sous-groupes de cinétique (précoce, intermédiaire et tardive) seront palpées afin d’établir la corrélation la plus précise entre la palpation et l’histologie de la tumeur au moment de la mise à mort de l’animal. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Enfin, nous procéderons à une habituation à la contention pour les injections intrapéritonéales. Lors des examens d'imagerie, un gel ophtalmique est appliqué pour éviter le dessèchement oculaire et une injection sous cutanée de NaCl 0.9% à température corporelle est réalisée pour éviter la déshydratation. De même, la température rectale et la fréquence respiratoire sont monitorées en continu à l'aide d'une sonde rectale et d'un capteur de pression posé sur le thorax. Pendant les séances d'imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée afin de maintenir la température corporelle et anesthésiés à l'isoflurane . La durée d'analyse par imagerie est restreinte au maximum (3 semaines max par souris). Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des effets de la pathologie. Le transport se fera dans un vehicule adapté dans des cages de transcports adaptées et enichies afin d'assurer la sécurité des animaux (en terme de manipulations, d’équipements utilisés, moyens de transport, conditions de transport). Des points limites sont mis en place sont une perte de poids supérieure à 20%, paralysie des membres, absence de toilettage, prostration et respiration difficile.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans les gènes Pten, Trp53 et VDR le plus fréquemment impliqués dans les cancers de la prostate humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à la prostate qui est un organe qui termine son developpement post-puberté.

144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant une biopsie de la queue à trois semaines puis, à huit semaines, une injection de cellules tumorales, avant huit injections supplémentaires étalées sur quatre semaines. Une partie reçoit ces cellules par voie intracardiaque sous anesthésie gazeuse, d'autres dans la glande mammaire au cours d'une chirurgie, et la croissance des tumeurs se mesure au pied à coulisse à chaque manipulation. Le porteur indique que les tumeurs pourraient causer une douleur et une perte de poids, et que les souris sont tuées en fin de procédure ou à l'atteinte d'un point limite pour récupérer des échantillons. Le bénéfice annoncé, identifier de nouveaux marqueurs de prédisposition au cancer du sein et les valider comme cibles thérapeutiques, reste formulé au conditionnel.

Objectifs

Nous avons fait la découverte surprenante que les ostéoblastes (les cellules qui synthétisent les os) sont capables de stimuler à distance la croissance de tumeurs mammaires ainsi que leur dissémination métastatique dans l’ensemble de l’organisme. Nous avons découvert que les ostéoblastes sécrètent des molécules pro tumorales qui circulent dans le sang et stimulent la croissance des tumeurs partout où elles se trouvent. Nous avons identifié une molécule sécrétée par les ostéoblastes potentiellement responsables de ces effets : RANKL. Notre hypothese est que la secretion de RANKL par les osteoblastes puisse etre un facteur pro-tumoral direct favorisant la croissance tumoral a distance de l'os, supprimer ca secretion nous informera du role de RANKL issu des osteoblastes. Cependant, les données de la littérature indiquent que RANKL produit dans l'os pourrait egalement réguler la production cellules immunosuppressives provenant du lignage lymphocytaire B qui produisent de l’IL10. Nous supposons alors que le RANKL, lorsqu’il est produit par les ostéoblastes, exerce un contrôle négatif sur la production de ces cellules immunodépressives, de manière directe ou indirecte. Ainsi, lorsque la production de RANKL est interrompue, ces cellules deviennent plus nombreuses et favorisent la croissance du cancer du sein. Le premier objectif est de tester le rôle de RANKL produite par les ostéoblastes dans la progression du cancer du sein, à l’aide de modèles génétiques murins où la formation osseuse est augmentée par la réduction de la résorption osseuse du a labsence de RANKL, facteur d'osteoclastogenese. Notre deuxième objectif est de tester l’hypothèse selon laquelle RANKL produite par les ostéoblastes participent au contrôle systémique de la progression du cancer du sein en modulant la réponse immunitaire antitumorale via les cellules B IL10+. Ces travaux sont nécessaires afin de déterminer si le ciblage des molécules produites par les ostéoblastes est capable de limiter, voire prévenir le développement des cancers du sein.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra d’identifier de nouveaux marqueurs de prédisposition aux cancers du sein et de valider ces marqueurs en tant que cibles thérapeutiques. Ceci pourrait permettre de prévenir l’apparition, ou du moins de limiter la progression de tumeurs mammaires métastatiques. Ce travail pourrait notamment permettre d’améliorer les traitements visant à activer l’immunité antitumorale.

Procédures

À l’âge de trois semaines, chaque souris subira une biopsie de la queue afin de permettre l’identification des modifications génétiques présentes chez l’individu. À huit semaines, une partie des souris sera soumise à une injection de cellules tumorales. L’intervention dure environ dix minutes par individu et n’est réalisée qu’une seule fois. Au cours de la croissance tumorale, les souris pourront être injectées à une fréquence de deux fois par semaine pendant quatre semaines, avant d’être euthanasiées. La mesure de la croissance tumorale se fait à l’aide d’un pied à coulisse, ne dure que quelques secondes et est réalisée en même temps que les injections durant la phase de croissance.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des tumeurs ce qui pourrait causer une douleur et une perte de poids. Les manipulations successives des animaux (anesthésies, injections, mesures des tumeurs au pied à coulisse) peuvent engendrer un stress chez les animaux

Devenir

En fin de procedure ou lors d'atteinte de point limite, euthanasie des souris, et recuperation d'echantillions biologiques.

Remplacement

Le tissu osseux comprend de nombreux types cellulaires en plus des cellues qui fabriques l'os, qui interagissent et s’influencent mutuellement. Des travaux visant au développement de modèles synthétiques capables de récapituler l’environnement osseux sont en cours, mais les versions existantes restent très rudimentaires. De plus, notre projet vise à évaluer les effets directs et indirects des ostéoblastes sur la croissance de tumeurs primitives et la dissémination de la tumeur. Tous ces processus sont d’une grande complexité et ne peuvent être reproduits de façon fidèle synthétiquement.

Réduction

La principale méthode de réduction du nombre d’animaux utilisés dans notre projet repose sur un calcul statistique de taille d’effectif nécessaire pour chaque expérience afin d’avoir une puissance d’au moins 80 % pour détecter une différence correspondant à une taille d’effet estimée pour chaque expérience, grâce aux données préliminaires disponibles. Nos expériences sont réalisées séquentiellement avec des groupes relativement petits de souris contrôles et mutantes (2 à 5 animaux/groupe) car il nous est impossible de générer des groupes importants d’animaux du même âge en une seule fois. Ceci permet éventuellement de réduire en cours de projet le nombre de souris impliquées dans une expérience donnée, en arrêtant plus tôt que prévu cette expérience, une fois que le test statistique démontre que la/les différences observées sont significatives. Le suivi longitudinal de la croissance tumorale par imagerie de bioluminescence in vivo permet d’éviter de devoir euthanasiés...

Raffinement

Les injections intracardiaques se feront sous anesthésie gazeuse permettant un réveil rapide, moins impactant que l’anesthésie par injection. Les animaux inoculés dans la glande mammaire subiront une chirurgie mineure et seront anesthésiés ayant des propriétés analgésiques. Un gel oculaire sera appliqué sur ces animaux afin d’éviter l’assèchement durant la phase de sommeil. Le lendemain de la chirurgie, les animaux présentant des signes de souffrance recevront une dose d’analgésique. De la nourriture gélifiée sera en outre ajoutée dans les cages concernées. Tous les animaux seront observés pendant les deux heures suivant la procédure afin de confirmer une activité cardio-respiratoire normale et une bonne reprise de la mobilité. Dans tous les cas, un examen clinique et comportemental sera réalisé quotidiennement lors de la première semaine après l’intervention, puis tous les 2 à 3 jours jusqu'à la fin de la procédure, afin de détecter tout signe de souffrance animale. La croissance tumorale est monitorée par bioluminescence, permettant d’évaluer l’état des animaux et de surveiller les points limites par une méthode non invasive. Au cours de cet examen, les animaux sont anesthésiés par gaz, ce qui permet un réveil plus rapide et moins stressant que l’anesthésie chimique. Des points limites précis ont été définis et seront surveillés tout au long des procédures. En cas d’atteinte d’un point limite, les mesures décidées seront mises en place immédiatement.

Choix des espèces

L’influence des ostéoblastes présents dans notre squelette sur la croissance et la dissémination métastatique de tumeurs mammaires doit être étudiée dans un modèle animal vertébré (présence d’un squelette) et mammifère (présence de glandes mammaires). De plus, notre projet requiert l’utilisation d’animaux transgéniques et la souris est le mammifère de choix pour cela. Il est relativement facile d’évaluer les troubles comportementaux et les signes de souffrance de la souris du fait des nombreuses études préalables réalisées avec ce modèle animal (recherches en cancérologie notamment). Nous possédons une expérience importante de l’utilisation de la souris en recherche et les protocoles que nous prévoyons d’utiliser ont été mis au point pour cette espèce. La souris constitue donc l’espèce la plus adaptée pour répondre à nos questions scientifiques et éviter la souffrance de nos animaux du fait de l’expérience que nous avons déjà acquise. Toutes nos expériences seront réalisées à partir d’animaux âgés de 8 semaines, stade auquel le phénotype osseux des animaux mutants est bien marqué et où les glandes mammaires et le système immunitaire sont correctement développés.

Jusqu'à vingt prélèvements sanguins par animal, cinq injections intraveineuses d'un virus sur lapin vigile, puis une exsanguination par ponction intracardiaque sous anesthésie. 60 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le porteur ne retient de ces gestes qu'un léger stress lié à la contention et une possible montée de température, et écrit n'avoir constaté aucune autre nuisance importante en plusieurs dizaines d'années. La mise à mort vise à obtenir "le maximum de sérum" et à prélever des organes, le nombre de lapins étant fixé par la quantité de sérum attendue par le client.

Objectifs

Nous développons depuis plusieurs dizaines d’années des anticorps pour la recherche. Les résultats obtenus grâce aux anticorps générés par notre entreprise ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires. Ce projet s’inscrit dans cette continuité pour poursuivre la génération d’outils biologiques pour la recherche et le développement. Le but du projet est la collecte d’échantillon (notamment de sérum) après de multiples injections d’un virus afin d’étudier la temporalité de l’apparition d’anticorps spécifique.

Bénéfices attendus

Depuis sa création, notre entreprise se spécialise dans le développement d’anticorps polyclonaux de lapin, principalement destinés aux acteurs du monde académique. Chaque projet d’immunisation vise à créer un nouvel outil de recherche sur mesure, répondant à des besoins spécifiques. Bien que le marché propose déjà une large gamme d’anticorps standards, notre expertise en conception d’immunogènes nous permet d’atteindre un taux de réussite exceptionnel - supérieur à 95 %, tout en garantissant des anticorps polyclonaux de haute qualité et en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nos anticorps ont déjà contribué à des avancées significatives, avec des publications dans des revues prestigieuses comme Nature ou Science. Ils ont notamment permis d’explorer des pathologies variées, telles que la surdité infantile ou différents types de cancers. À terme, ces recherches visent à éclairer les mécanismes biochimiques du vivant et à poser les bases de nouvelles thérapies pour les décennies à venir. Ce nouveau projet représente une avancée majeure : il nous permettra d’étudier en détail l’apparition et l’évolution des anticorps dans le sérum après l’injection de virus Oncolytique. À l’issue de ce processus, nous pourrons récupérer plusieurs lots de sérum, offrant ainsi une ressource précieuse pour analyser la réponse immunitaire.

Procédures

- Injection intraveineuse sur animaux vigiles, environ 1 min, maximum 5 injections. - Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 20 prélèvements. - Exsanguination en intracardiaque sous anesthésie, sans réveil

Impact sur les animaux

La contention lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une augmention de la température des animaux peux apparaitre après l’injection des virus. Avec l’expérience de notre société depuis plusieurs dizaines d’années, nous n’avons pas constaté d’autres nuisances importantes. Nous resterons néanmoins vigilants à tout effet imprévu.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant la coopération entre de multiples types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent, ces approchent n’apportent pas la même qualité d’anticorps. Pour palier partiellement à ce défaut, cela nécessite d’utiliser des banques dites « immunes » qui nécessitent d’immuniser le lapin et n’apporte aucun bénéfice en termes de remplacement. De plus ces technologies de développement d’anticorps monoclonaux chez le lapin, ne sont pas encore matures. Ils nécessitent un matériel particulier et des réactifs adaptés.

Réduction

Le nombre de lapins utilisé pour chaque expérimentation est réduit au minimum, il est déterminé par la quantité de sérum attendue par le client. Une précédente étude a permis de conforter le choix de cinq animaux par groupe.

Raffinement

Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Si l’animal présente une souffrance qui ne diminue pas avec l’arrêt des injections et les soins apportés, et que les points limites sont atteints alors, l’animal sera mis à mort pour éviter des toutes souffrances.

Choix des espèces

Le lapin est l’animal de laboratoire bien adapté au développement d’anticorps pour la recherche. Il montre en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs il permet de récolter une quantité de sérum conséquente suffisante pour les applications en recherche. Nous utilisons des jeunes adultes car c’est chez les jeunes adultes que la réponse immunitaire est la meilleure et par là même la génération d’anticorps.

Dès que le serpent prend la posture enroulée typique du sommeil, une stimulation le réveille, et la privation se poursuit ainsi jour après jour, à chaque température testée. 6 serpents vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans un programme de recherche comparative. Ils passent une IRM et un scanner sous sédation, subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes sous anesthésie générale, puis sont transportés sédatés dans un sac opaque entre deux établissements, pour caractériser un sommeil encore inconnu chez cette lignée de reptiles. Le choix s'est porté sur de grands serpents calmes, non venimeux et faciles à obtenir en élevage, les espèces protégées ou dangereuses ayant été écartées.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser le sommeil des serpents, dernière grande lignée de reptiles encore non étudiée dans l’évolution du sommeil. Le projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Leur physiologie atypique (absence de paupières, forte inactivité, faible métabolisme) en fait un modèle pertinent pour redéfinir les critères de sommeil chez les reptiles. Pour ce faire, nous allons enregistrer en télémétrie l’activité cérébrale et les paramètres physiologiques associés (tonus musculaire, fréquence cardiaque, respiration, activité des yeux) chez des serpents, et en les comparant aux états d’éveil calme et actif. Afin de déterminer si les animaux dorment, nous évaluerons leur seuil de réveil et leur réponse à la privation de sommeil. L’effet de la température sera aussi évalué du fait que le comportement de ces animaux est extrêmement lié à la température ambiante.

Bénéfices attendus

Ce projet aidera à mieux définir les critères comportementaux et physiologiques du sommeil chez des espèces qui ne présentent pas les signes typiques observés chez les mammifères. Il complétera aussi notre compréhension parcellaire sur l’évolution des états de sommeil et notamment du sommeil paradoxal. Les résultats de ce projet pourraient aussi avoir un impact sur le bien-être animal en identifiant les conditions favorables à un sommeil réparateur chez les serpents, ces données pourront ainsi améliorer les pratiques d’élevage, de détention et de conservation des reptiles, notamment pour les espèces menacées ou maintenues en captivité (zoos, centres de sauvegarde).

Procédures

Les animaux subiront une sédation pour passer une IRM et un scanner dans l’EU2 (1 journée). Ensuite, ils subiront une anesthésie générale permettant une intervention chirurgicale dans l’EU1 EU1 afin de mettre en place des électrodes d’enregistrement, suivie d’un traitement antalgique postopératoire. Après une phase de récupération (1 semaine), les animaux seront à nouveau sédatés pour passer un nouveau scanner (EU2) et vérifier la position des électrodes. Ils seront ensuite enregistrés dans l’EU1 en télémétrie dans leur propre terrarium à différentes températures, 4 jours par température. Après 1 jour d’acclimatation, ils seront privés de sommeil par une stimulation douce (dès que l'animal prendra une posture enroulée sur lui-même, typique d'une posture de sommeil) et sa récupération sera monitorée. Enfin, après 4 jours, une évaluation du seuil de réveil (à l’aide d’un micro-vibreur induisant des vibrations légères) sera réalisée pour estimer les latences de réveil et la profondeur du sommeil (4 jours). Pendant la durée des enregistrements, les animaux seront stabulés dans un terrarium adapté à leur taille et ne seront pas dérangés outre le remplacement des batteries du dispositif d’enregistrement entre chaque protocole.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues concernent l’intervention chirurgicale d’implantation d’électrodes et la phase expérimentale de privation de sommeil. L’implantation d’électrodes, bien que réalisée sous anesthésie générale, constitue une procédure invasive. Elle peut provoquer une douleur transitoire post-opératoire, une réduction temporaire de la mobilité, une perte d’appétit ou une altération du comportement. Un inconfort local (lié à la cicatrisation ou à la présence des électrodes) est également possible dans les jours suivant l’intervention. Chez les reptiles, ces effets sont souvent discrets mais seront systématiquement recherchés. La phase d’enregistrement, bien qu’exempte de contrainte physique, impose le port d’un dispositif fixé sur le crâne. Celui-ci peut gêner légèrement les mouvements ou induire un stress comportemental transitoire, notamment au moment de sa mise en place. Toutefois, les serpents étudiés étant peu mobiles et dociles, ces effets sont attendus comme modérés. La privation de sommeil, réalisée par stimulation douce manuelle en période de repos, peut entraîner une augmentation du stress, une agitation ponctuelle ou une altération du comportement exploratoire. Chez les reptiles, les effets secondaires restent généralement limités mais incluent une possible fatigue, une baisse de vigilance ou une altération temporaire des rythmes biologiques. Aucune douleur n’est induite par cette procédure. Des manipulations régulières sont nécessaires pour les soins post-opératoires, le changement de batterie et les tests de réactivité. Elles peuvent provoquer un stress ponctuel ou une réponse de défense, bien que les individus soient habitués au contact humain. Enfin, un risque faible de complications chirurgicales (infection locale, mauvaise cicatrisation, rejet du matériel) existe, bien qu’il soit réduit par l’expérience de l’équipe et le protocole appliqué. Ces effets sont rares mais potentiellement délétères pour l’individu concerné.

Devenir

Il est prévu que les animaux soient réutilisés après l’expérimentation dans un programme de recherche comparative.

Remplacement

Le sommeil est un phénomène à la fois comportemental, neurophysiologique et physiologique, impliquant de nombreuses fonctions intégrées telles que l’activité cérébrale, les rythmes circadiens, les régulations hormonales, métaboliques, cardiovasculaires et thermiques. Ces fonctions interconnectées ne peuvent pas être reproduites ni simulées de manière fiable à l’aide de modèles in vitro, in silico ou ex vivo. De plus, l’étude de l’évolution des états de sommeil nécessite une approche comparative entre espèces vivantes, dans leur intégrité biologique, afin de caractériser les similitudes et différences entre groupes phylogénétiques. Chez les reptiles, et en particulier les serpents, aucun modèle substitutif n’existe aujourd’hui pour étudier les états de sommeil de manière complète (comportement, physiologie, activité cérébrale). Ainsi, l’utilisation de l’animal est indispensable et constitue la seule méthode permettant de répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Il n’existe donc actuellement aucune alternative éthique ou technique permettant de se passer de l’animal pour ce type d’étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en tenant compte à la fois des exigences méthodologiques et des principes de réduction. L’objectif principal est de caractériser un phénomène biologique présent dans une espèce : le sommeil. Pour cela, il est nécessaire d’observer ce phénomène chez plusieurs individus afin de démontrer sa constance et de contrôler les variations interindividuelles. Nos travaux antérieurs et ceux d’autres équipes ayant étudié les lézards ont montré que 6 individus étaient suffisants et nécessaires pour identifier et caractériser finement un état de sommeil, son homéostasie et son seuil de réveil associé. Le design expérimental a été rigoureusement conçu pour limiter le nombre d’animaux tout en assurant la robustesse des données. Une étude pilote sur un python tapis a permis de déterminer notre capacité à obtenir des signaux de qualité en ciblant des structures cérébrales précises. L’utilisation de techniques d’imagerie pré- et post-opératoire (IRM/Scanner) pour guider l’implantation, ainsi que la maîtrise technique des interventions, permet de garantir un taux de succès élevé, réduisant ainsi le nombre d’animaux. L'ensemble des procédures suit une logique intra-individuelle : chaque animal sert de témoin à lui-même avant et après privation, avant et après nourrissage, avant et après changement de température, ce qui permet de réduire considérablement le nombre total requis tout en augmentant la puissance des comparaisons.

Raffinement

Les études sur le sommeil nécessitent des observations sur des animaux non anesthésiés vivants dans de bonnes conditions psychophysiologiques. Le bien-être des animaux est donc une condition sine qua non de chaque étape de l’expérimentation. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. L'environnement sera notamment enrichi de branches et de substrats adaptés pendant les périodes d’acclimatation et de récupération. Durant les enregistrements, l’animal est libre de ses mouvements dans son propre terrarium. Les animaux seront transportés entre les établissements, sédatés, dans un sac opaque, adapté au transport de serpent afin de réduire leur stress. Les mesures de raffinement lors du transport incluent le maintien d’une température stable et adaptée à l’espèce, la réduction des vibrations et du bruit, ainsi qu’une manipulation minimale pour limiter le stress et tout risque de réveil ou de blessure. Par ailleurs, une grille de suivi du bien-être animal, et des points limités adaptés et précoces, spécifiques à l’espèce ont été mis en place en consultant des spécialistes (vétérinaires, éleveurs, herpétologues). Les décisions relatives aux points limites sont prises en concertation avec le vétérinaire référent et des spécialistes des serpents, si un comportement inhabituel est identifié.

Choix des espèces

L’objectif est d’étudier le sommeil des serpents, dernière grande lignée de squamates encore peu étudiée dans l’évolution du sommeil. Leur physiologie atypique (absence de paupières, forte inactivité, faible métabolisme) en fait un modèle pertinent pour redéfinir les critères de sommeil chez les reptiles. Toute espèce appartenant au sous-ordre des serpents pourrait donc être choisie. Cependant, beaucoup d’espèces de serpents ne sont pas adaptées à cette expérimentation, pour des raisons de statut de protection, de taille, de disponibilité en élevage et de dangerosité. Nous nous tournons ainsi vers des espèces de serpent de grande taille, calmes, non venimeuses et disponibles facilement en élevage. Les individus doivent avoir une tête de taille adaptée à l’implantation stable d’électrodes pour l’étude du sommeil. Leurs morphologies et leurs comportements moteurs doivent aussi faciliter les interventions, avec un risque minimal de blessure ou de stress durable. Phylogénétiquement, M. spilota, et B. constrictor sont tous les deux des représentants du groupe des serpents qui pourraient convenir. Les individus choisis, seront adultes (>5 ans) nés en captivité, et habitués aux manipulations . M. spilota, et B. constrictor par exemple, offrent un compromis optimal entre pertinence scientifique, faisabilité technique et respect du bien-être animal. Par ailleurs, les deux espèces présentent le même mode de vie semi-arboricole et le même régime alimentaire, et ce sont deux espèces assez courantes en élevage. Elles constituent donc des modèles cible.