Système endocrinien
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- Système urogénital
Création d’un modèle de souris transgéniques permettant l’étude de l’évolution de la maladie rénale et l’évaluation du risque de cancers du rein associés à une maladie rare, la glycogénose de type Ia : EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Sur 1 008 souris nées pour ce projet, 408 seront tuées pour "régulation de population" faute du bon profil génétique, 100 gardées pour la reproduction, 100 réutilisées pour l'apprentissage des gestes techniques, et 400 tuées après six heures de jeûne pour le prélèvement des reins, de l'intestin et du foie. Le niveau de souffrance déclaré est léger pour 608 d'entre elles, modéré pour 240 et sévère pour 160. Ce second établissement les accueille chaque mois à partir de six mois pour une IRM des reins sous anesthésie d'environ trente minutes, avant leur retour par la route. Le porteur décrit la souris comme "la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible", au motif que sa régulation du sucre ressemble à celle des humains et que les anticorps adaptés existent déjà au laboratoire.
Objectifs
La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie génétique rare qui touche environ 150 à 200 patients en France. Contrairement au diabète, caractérisé par des hyperglycémies (trop de sucre dans le sang) liées à une production excessive de glucose, la GSD1a entraîne des hypoglycémies sévères et potentiellement fatales. Bien que ces deux maladies soient opposées sur le plan de la régulation de la glycémie, elles partagent des complications rénales remarquablement similaires. Les patients peuvent développer une maladie rénale chronique pouvant évoluer vers une insuffisance rénale terminale. Des analyses cellulaires ont révélé que, dans ces contextes pathologiques, le rein adopte un métabolisme favorisant la prolifération cellulaire, comparable à celui observé dans les cancers. Un point commun majeur entre les reins de patients diabétiques, GSD1a et les cancers du rein est l’accumulation excessive de glycogène et de lipides dans les cellules rénales. À ce jour, seuls deux cas de cancer du rein ont été rapportés chez des patients GSD1a en France. Toutefois, grâce à l’amélioration de la prise en charge nutritionnelle depuis les années 1980, l’espérance de vie de ces patients a considérablement augmenté, ce qui pourrait conduire à une augmentation de l’incidence des complications rénales liées au vieillissement. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les mécanismes conduisant à la formation de kystes rénaux et à évaluer le risque de cancer dans des reins soumis à un environnement métabolique favorable au développement de cancer. Pour cela, un modèle murin de GSD1a reproduisant fidèlement les atteintes rénales humaines sera utilisé. Dans ce modèle, les chercheurs inactiveront totalement ou partiellement un gène suppresseur de tumeur fréquemment altéré dans les cancers du rein. L’impact de cette inactivation sur la progression de la maladie rénale sera étudié, avec l’hypothèse d’une accélération de la formation de kystes et de tumeurs rénales. Ce modèle inédit permettra d’explorer les liens entre déséquilibres métaboliques, formation de kyste et de cancer du rein. À terme, ce travail pourrait démontrer un risque accru de cancer du rein chez les patients GSD1a, justifiant la mise en place d’un suivi médical spécifique. Il offrira également un outil unique pour étudier les cancers du rein associés à l’accumulation de graisse, comme chez les diabétiques, mais de façon indépendante de toute perturbation alimentaire.
Bénéfices attendus
Ces nouvelles connaissances sont essentielles, car aujourd’hui, il n’existe aucun traitement capable de stopper ou ralentir efficacement la dégradation progressive des reins chez les patients GSD1a, mais également chez les patients diabétiques. Pourtant, cette complication est fréquente puisque 70 et 80 % des patients atteints de GSD1a développer une maladie rénale chronique, qui peut nécessiter une transplantation rénale ou une dialyse. Mieux comprendre les étapes de cette évolution permettra à terme de concevoir des traitements plus ciblés et efficaces pour préserver la fonction rénale et améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes à l’âge de 7-10 j. Le geste sera réalisé sur animaux vigiles en quelques secondes. Au cours du temps, les souris atteintes de GSD1a vont développer une maladie rénale. Des prélèvements spontanés d’urine auront lieu tous les mois à partir de 2 mois. Dès que les animaux auront atteint l’âge de 6 mois, des prélèvements urinaires et sanguins seront réalisés tous les mois. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles par un prélèvement en veine après immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute dans un tube à contention. Au total, au maximum 20 prélèvements d’urine et 20 prélèvements de sang seront réalisés. Également, les souris seront transférées, à partir de 6 mois, tous les mois dans le 2ème établissement situé à moins de 30 min en voiture du 1er. Leurs reins seront analysés par imagerie IRM. Les souris seront anesthésiées pendant environ 30 minutes, puis ramenées à l’établissement d’origine après leur réveil. En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Un prélèvement de sang sera réalisé immédiatement avant la mise à mort et durera au maximum 15 secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie réalisée au bord de l’oreille entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. Le risque de saignement est très faible. Le développement de la maladie rénale reste sans impact sur le bien-être animal. Au stade avancé de la maladie, caractérisée par l’accumulation d’urée dans le sang (autour de 15 mois), les souris atteintes de GSD1a commencent à perdre du poids et peuvent présenter des signes de mal-être, comme une baisse de la fréquence de toilettage, une prostration, une diminution des déplacements. Le développement de lésions du rein, comme les cancers, peut également être à l’origine de douleurs et d’une gêne. Pour suivre le développement de la maladie, les prélèvements urinaires réalisés de façon spontanée peuvent provoquer un très léger stress. Les prises de sang réalisées après immobilisation de l’animal peuvent entrainer un stress de l’animal et une légère douleur, ainsi qu’un léger saignement dans certains cas. La mise à jeun pendant 6h peut entrainer un léger stress
Devenir
Sur ce projet, seuls les 400 animaux qui subiront l’ensemble des procédures seront mis à mort pour prélèvement des reins, de l’intestin et du foie afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires. Une partie des animaux générés lors des reproductions seront utilisés pour la reproduction et le maintien des lignées (environ 100 animaux) ; une autre partie, estimée à 100 souris de phénotype non dommageable, pourra être réutilisée pour l’apprentissage de gestes sur animaux comme la réalisation de prise de sang ; ces souris seront comptabilisées dans le projet de tutorat des zootechniciens et des expérimentateurs de l’établissement en charge de la reproduction des animaux. Les autres animaux (408) seront mis à mort pour régulation de population.
Remplacement
Même si on sait aujourd’hui fabriquer en laboratoire de petits organes miniatures appelés organoïdes, qui reproduisent en partie la structure du rein, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’évolution d’une maladie rénale sur plusieurs mois. Or, pour comprendre le développement d’une maladie chronique ou l’apparition de cancers, il est essentiel de suivre ce qui se passe dans un organisme vivant sur le long terme. C’est pourquoi une approche chez l’animal, en particulier chez la souris, reste indispensable. Le modèle de souris atteintes de GSD1a utilisé ici est unique : il est viable et reproduit fidèlement les atteintes rénales observées chez les patients atteints, grâce à une technique de modification génétique spécifique à l’espèce. De plus, la souris a un métabolisme très proche de celui de l’humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type d’étude. Il faut aussi noter que la majorité des recherches sur l’insuffisance rénale et les reins présentant des kystes ont été menées chez la souris, ce qui offre une base solide de données scientifiques et de matériel pour ce projet.
Réduction
Le but de ce projet est d’étudier comment certaines modifications génétiques favorisent l’apparition de cancers du rein liés à la maladie GSD1a. Pour cela, deux nouvelles lignées de souris ont été créées. Le projet sera réalisé en 2 temps, sur des groupes de souris étudiées à long terme (1ère étude) et à court terme (2ème étude). La première étude permettra à la fois de vérifier si les animaux développent des signes importants de souffrance dès la naissance et jusqu’à 15 mois ; et de caractériser la maladie rénale grâce au suivi de marqueurs biologiques et l’imagerie par IRM des reins. Si un mal-être important est observé, le projet pourra être arrêté rapidement et les animaux prévus pour la 2ème étude ne seront pas produits. Les chercheurs compareront plusieurs groupes de souris ayant différentes combinaisons de mutations génétiques. Cela permettra de déterminer quel modèle est le plus pertinent pour réaliser la 2ème partie des expériences. Pour limiter le nombre total d’animaux utilisés, l’évolution des lésions rénales sera suivie au cours du temps grâce à des techniques d’imagerie non invasives. Le nombre de souris nécessaires a été calculé à partir de données déjà disponibles (études précédentes et littérature scientifique). Une analyse statistique (test de puissance) a montré qu’il fallait au minimum 10 souris par groupe pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre est doublé (soit 20 souris par groupe) afin d’avoir suffisamment de tissu pour les analyses biologiques et histologiques. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques appropriées. Au total, au maximum 400 souris transgéniques seront utilisées pour l’étude. Leur production entrainera la naissance de 1 008 souris car toutes les souris n’auront pas le bon profil génétique. Celles qui ne sont pas utilisées dans les expériences pourront servir être pour de la reproduction et l’entretien des lignées (environ 100 souris) ou être réutilisées dans un projet de formation aux gestes techniques réalisés sur les animaux, comme les prises de sang (environ 100 souris). Ce projet de tutorat est autorisé dans l’établissement de production des souris et permet au personnel technique de se former et de vérifier les compétences de chaque utilisateur. Enfin, les lignées de souris sont conservées sous forme congelée (cryoconservées), ce qui permet de les préserver sans devoir les maintenir leur reproduction en permanence.
Raffinement
Les biopsies seront réalisées chez les souriceaux à 7-10 jours après la naissance, une période durant laquelle les terminaisons nerveuses ne sont pas encore complètement développées, ce qui permet de limiter la douleur. Pour réduire le stress lié à la manipulation, les gants du technicien seront imprégnés de l’odeur de la litière, et les animaux seront manipulés à l’aide d’un petit tunnel. La GSD1a sera induite uniquement dans les reins des souris, ce qui permettra d’éviter les fortes baisses de sucre dans le sang grâce à la fonction préservée du foie, qui continue de produire du glucose. Le bien-être des nouvelles lignées de souris créées (nombre de souris par portée; courbe de croissance…) sera suivi dès la naissance. Les prises de sang seront réalisées dans le respect des volumes de prélèvement selon les recommandations internationales.Une légère pression sera appliquée après la piqûre pour stopper le saignement.Les souris seront habituées à la contention au préalable. L’urine sera récupérée naturellement, sans avoir à isoler les animaux. L’imagerie médicale par IRM permettra de détecter très tôt les éventuelles atteintes des reins. Pendant les examens sous anesthésie, la fréquence respiratoire sera surveillée et la température corporelle sera maintenue grâce à un circuit de réchauffement des souris dans l’appareil. Le comportement des animaux (posture, mobilité, etc.) sera observé régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si des douleurs apparaissent, notamment en lien avec la formation de kystes ou de tumeurs, des traitements anti-douleurs et antispasmodiques adaptés seront administrés. L’état de santé sera également surveillé grâce au suivi du poids (quasi journalier en période de sevrage, puis hebdomadaire ou mensuel), à des tests urinaires mensuels, et à l’analyse de marqueurs biologiques. Si une souris montre des signes de mal-être (perte de poids ou posture anormale, lésions trop importantes, etc.), elle sera prise en charge avec des soins renforcés : nourriture posée au sol, gel hydratant et nutritif. Si son état ne s’améliore pas ou si l’animal atteint un seuil critique, l’animal sera euthanasié dans le respect des protocoles pour permettre l’analyse des reins. Enfin, les souris devront être transportées lors de chaque IRM entre deux lieux d’expérimentation situés à moins de 10 km. Ce transfert se fera en voiture, avec leur litière et leur matériel habituel pour éviter le stress.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car elle présente des similitudes importantes avec l’humain en ce qui concerne la régulation du sucre dans l’organisme. Chez des espèces plus simples comme le poisson, ces mécanismes sont différents et ne permettent pas d’étudier la maladie de manière fiable. De plus, le modèle de souris atteintes de GSD1a est unique car il reproduit très fidèlement les signes de la maladie rénale que l’on observe chez les patients atteints de glycogénose de type 1 sans développer d’hypoglycémies qui pourraient être fatales. De plus, les outils moléculaires spécifiques à la souris, comme des anticorps, sont disponibles en laboratoire pour analyser finement les mécanismes biologiques impliqués. Ainsi, l’utilisation de la souris est aujourd’hui la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible pour faire avancer la recherche sur cette maladie rare. Les souris seront suivies tout au long de leur vie de la naissance à l’âge de 15 mois maximum, car la maladie rénale évolue très lentement. Aucun symptôme n’est observé pendant plusieurs mois avant d’atteindre la dégradation importante du fonctionnement des reins. Des analyses régulières nécessitant des prélèvements d’urine et de sang chez les souris adultes seront réalisées pour suivre l’évolution de la maladie jusqu’à la fin du protocole (15 mois au maximum).
Création d’un modèle de souris transgéniques permettant l’étude de l’évolution de la maladie rénale et l’évaluation du risque de cancers du rein associés à une maladie rare, la glycogénose de type Ia : EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Biopsiées à l'oreille à sept jours, les souris subissent ensuite jusqu'à vingt prises de sang et vingt prélèvements d'urine, des trajets mensuels en voiture vers un second établissement et des IRM sous anesthésie d'une trentaine de minutes, jusqu'à l'âge de quinze mois. 1 008 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 608, modéré pour 240 et sévère pour 160. Seules 400 suivront le protocole complet : les 408 restantes, nées sans le bon profil génétique, seront tuées pour "régulation de population", 100 seront gardées pour la reproduction des lignées et 100 autres utilisées pour entraîner les zootechniciens aux prises de sang. Le porteur affirme que le développement de la maladie rénale reste sans impact sur le bien-être des animaux non-humains, et décrit dans le même paragraphe une perte de poids, une prostration, une baisse du toilettage et des douleurs liées aux tumeurs du rein.
Objectifs
La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie génétique rare qui touche environ 150 à 200 patients en France. Contrairement au diabète, caractérisé par des hyperglycémies (trop de sucre dans le sang) liées à une production excessive de glucose, la GSD1a entraîne des hypoglycémies sévères et potentiellement fatales. Bien que ces deux maladies soient opposées sur le plan de la régulation de la glycémie, elles partagent des complications rénales remarquablement similaires. Les patients peuvent développer une maladie rénale chronique pouvant évoluer vers une insuffisance rénale terminale. Des analyses cellulaires ont révélé que, dans ces contextes pathologiques, le rein adopte un métabolisme favorisant la prolifération cellulaire, comparable à celui observé dans les cancers. Un point commun majeur entre les reins de patients diabétiques, GSD1a et les cancers du rein est l’accumulation excessive de glycogène et de lipides dans les cellules rénales. À ce jour, seuls deux cas de cancer du rein ont été rapportés chez des patients GSD1a en France. Toutefois, grâce à l’amélioration de la prise en charge nutritionnelle depuis les années 1980, l’espérance de vie de ces patients a considérablement augmenté, ce qui pourrait conduire à une augmentation de l’incidence des complications rénales liées au vieillissement. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les mécanismes conduisant à la formation de kystes rénaux et à évaluer le risque de cancer dans des reins soumis à un environnement métabolique favorable au développement de cancer. Pour cela, un modèle murin de GSD1a reproduisant fidèlement les atteintes rénales humaines sera utilisé. Dans ce modèle, les chercheurs inactiveront totalement ou partiellement un gène suppresseur de tumeur fréquemment altéré dans les cancers du rein. L’impact de cette inactivation sur la progression de la maladie rénale sera étudié, avec l’hypothèse d’une accélération de la formation de kystes et de tumeurs rénales. Ce modèle inédit permettra d’explorer les liens entre déséquilibres métaboliques, formation de kyste et de cancer du rein. À terme, ce travail pourrait démontrer un risque accru de cancer du rein chez les patients GSD1a, justifiant la mise en place d’un suivi médical spécifique. Il offrira également un outil unique pour étudier les cancers du rein associés à l’accumulation de graisse, comme chez les diabétiques, mais de façon indépendante de toute perturbation alimentaire.
Bénéfices attendus
Ces nouvelles connaissances sont essentielles, car aujourd’hui, il n’existe aucun traitement capable de stopper ou ralentir efficacement la dégradation progressive des reins chez les patients GSD1a, mais également chez les patients diabétiques. Pourtant, cette complication est fréquente puisque 70 et 80 % des patients atteints de GSD1a développer une maladie rénale chronique, qui peut nécessiter une transplantation rénale ou une dialyse. Mieux comprendre les étapes de cette évolution permettra à terme de concevoir des traitements plus ciblés et efficaces pour préserver la fonction rénale et améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes à l’âge de 7-10 j. Le geste sera réalisé sur animaux vigiles en quelques secondes. Au cours du temps, les souris atteintes de GSD1a vont développer une maladie rénale. Des prélèvements spontanés d’urine auront lieu tous les mois à partir de 2 mois. Dès que les animaux auront atteint l’âge de 6 mois, des prélèvements urinaires et sanguins seront réalisés tous les mois. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles par un prélèvement en veine après immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute dans un tube à contention. Au total, au maximum 20 prélèvements d’urine et 20 prélèvements de sang seront réalisés. Également, les souris seront transférées, à partir de 6 mois, tous les mois dans le 2ème établissement situé à moins de 30 min en voiture du 1er. Leurs reins seront analysés par imagerie IRM. Les souris seront anesthésiées pendant environ 30 minutes, puis ramenées à l’établissement d’origine après leur réveil. En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Un prélèvement de sang sera réalisé immédiatement avant la mise à mort et durera au maximum 15 secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie réalisée au bord de l’oreille entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. Le risque de saignement est très faible. Le développement de la maladie rénale reste sans impact sur le bien-être animal. Au stade avancé de la maladie, caractérisée par l’accumulation d’urée dans le sang (autour de 15 mois), les souris atteintes de GSD1a commencent à perdre du poids et peuvent présenter des signes de mal-être, comme une baisse de la fréquence de toilettage, une prostration, une diminution des déplacements. Le développement de lésions du rein, comme les cancers, peut également être à l’origine de douleurs et d’une gêne. Pour suivre le développement de la maladie, les prélèvements urinaires réalisés de façon spontanée peuvent provoquer un très léger stress. Les prises de sang réalisées après immobilisation de l’animal peuvent entrainer un stress de l’animal et une légère douleur, ainsi qu’un léger saignement dans certains cas. La mise à jeun pendant 6h peut entrainer un léger stress.
Devenir
Sur ce projet, seuls les 400 animaux qui subiront l’ensemble des procédures seront mis à mort pour prélèvement des reins, de l’intestin et du foie afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires. Une partie des animaux générés lors des reproductions seront utilisés pour la reproduction et le maintien des lignées (environ 100 animaux) ; une autre partie, estimée à 100 souris de phénotype non dommageable, pourra être réutilisée pour l’apprentissage de gestes sur animaux comme la réalisation de prise de sang ; ces souris seront comptabilisées dans le projet de tutorat des zootechniciens et des expérimentateurs de l’établissement en charge de la reproduction des animaux. Les autres animaux (408) seront mis à mort pour régulation de population.
Remplacement
Même si on sait aujourd’hui fabriquer en laboratoire de petits organes miniatures appelés organoïdes, qui reproduisent en partie la structure du rein, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’évolution d’une maladie rénale sur plusieurs mois. Or, pour comprendre le développement d’une maladie chronique ou l’apparition de cancers, il est essentiel de suivre ce qui se passe dans un organisme vivant sur le long terme. C’est pourquoi une approche chez l’animal, en particulier chez la souris, reste indispensable. Le modèle de souris atteintes de GSD1a utilisé ici est unique : il est viable et reproduit fidèlement les atteintes rénales observées chez les patients atteints, grâce à une technique de modification génétique spécifique à l’espèce. De plus, la souris a un métabolisme très proche de celui de l’humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type d’étude. Il faut aussi noter que la majorité des recherches sur l’insuffisance rénale et les reins présentant des kystes ont été menées chez la souris, ce qui offre une base solide de données scientifiques et de matériel pour ce projet
Réduction
Le but de ce projet est d’étudier comment certaines modifications génétiques favorisent l’apparition de cancers du rein liés à la maladie GSD1a. Pour cela, deux nouvelles lignées de souris ont été créées. Le projet sera réalisé en 2 temps, sur des groupes de souris étudiées à long terme (1ère étude) et à court terme (2ème étude). La première étude permettra à la fois de vérifier si les animaux développent des signes importants de souffrance dès la naissance et jusqu’à 15 mois ; et de caractériser la maladie rénale grâce au suivi de marqueurs biologiques et l’imagerie par IRM des reins. Si un mal-être important est observé, le projet pourra être arrêté rapidement et les animaux prévus pour la 2ème étude ne seront pas produits. Les chercheurs compareront plusieurs groupes de souris ayant différentes combinaisons de mutations génétiques. Cela permettra de déterminer quel modèle est le plus pertinent pour réaliser la 2ème partie des expériences. Pour limiter le nombre total d’animaux utilisés, l’évolution des lésions rénales sera suivie au cours du temps grâce à des techniques d’imagerie non invasives. Le nombre de souris nécessaires a été calculé à partir de données déjà disponibles (études précédentes et littérature scientifique). Une analyse statistique (test de puissance) a montré qu’il fallait au minimum 10 souris par groupe pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre est doublé (soit 20 souris par groupe) afin d’avoir suffisamment de tissu pour les analyses biologiques et histologiques. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques appropriées. Au total, au maximum 400 souris transgéniques seront utilisées pour l’étude. Leur production entrainera la naissance de 1 008 souris car toutes les souris n’auront pas le bon profil génétique. Celles qui ne sont pas utilisées dans les expériences pourront servir être pour de la reproduction et l’entretien des lignées (environ 100 souris) ou être réutilisées dans un projet de formation aux gestes techniques réalisés sur les animaux, comme les prises de sang (environ 100 souris). Ce projet de tutorat est autorisé dans l’établissement de production des souris et permet au personnel technique de se former et de vérifier les compétences de chaque utilisateur. Enfin, les lignées de souris sont conservées sous forme congelée (cryoconservées), ce qui permet de les préserver sans devoir les maintenir leur reproduction en permanence
Raffinement
Les biopsies seront réalisées chez les souriceaux à 7-10 jours après la naissance, une période durant laquelle les terminaisons nerveuses ne sont pas encore complètement développées, ce qui permet de limiter la douleur. Pour réduire le stress lié à la manipulation, les gants du technicien seront imprégnés de l’odeur de la litière, et les animaux seront manipulés à l’aide d’un petit tunnel. La GSD1a sera induite uniquement dans les reins des souris, ce qui permettra d’éviter les fortes baisses de sucre dans le sang grâce à la fonction préservée du foie, qui continue de produire du glucose. Le bien-être des nouvelles lignées de souris créées (nombre de souris par portée;courbe de croissance…) sera suivi dès la naissance.Les prises de sang seront réalisées dans le respect des volumes de prélèvement selon les recommandations internationales. Une légère pression sera appliquée après la piqûre pour stopper le saignement. Les souris seront habituées à la contention au préalable.L’urine sera récupérée naturellement, sans avoir à isoler les animaux dans des cages spécifiques. L’imagerie médicale par IRM permettra de détecter très tôt les éventuelles atteintes des reins. Pendant les examens sous anesthésie,la fréquence respiratoire sera surveillée et la température corporelle sera maintenue grâce à un circuit de réchauffement des souris dans l’appareil.Le comportement des animaux (posture, mobilité, etc.) sera observé régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si des douleurs apparaissent, notamment en lien avec la formation de kystes ou de tumeurs, des traitements anti-douleurs et antispasmodiques adaptés seront administrés. L’état de santé sera également surveillé grâce au suivi du poids (quasi journalier en période de sevrage, puis hebdomadaire ou mensuel), à des tests urinaires mensuels, et à l’analyse de marqueurs biologiques. Si une souris montre des signes de mal-être (perte de poids ou posture anormale, lésions trop importantes, etc.), elle sera prise en charge avec des soins renforcés : nourriture posée au sol, gel hydratant et nutritif. Si son état ne s’améliore pas ou si l’animal atteint un seuil critique, l’animal sera euthanasié dans le respect des protocoles pour permettre l’analyse des reins. Enfin, les souris devront être transportées lors de chaque IRM entre deux lieux d’expérimentation situés à moins de 10 km. Ce transfert se fera en voiture, avec leur litière et leur matériel habituel pour éviter le stress
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car elle présente des similitudes importantes avec l’humain en ce qui concerne la régulation du sucre dans l’organisme. Chez des espèces plus simples comme le poisson, ces mécanismes sont différents et ne permettent pas d’étudier la maladie de manière fiable. De plus, le modèle de souris atteintes de GSD1a est unique car il reproduit très fidèlement les signes de la maladie rénale que l’on observe chez les patients atteints de glycogénose de type 1 sans développer d’hypoglycémies qui pourraient être fatales. De plus, les outils moléculaires spécifiques à la souris, comme des anticorps, sont disponibles en laboratoire pour analyser finement les mécanismes biologiques impliqués. Ainsi, l’utilisation de la souris est aujourd’hui la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible pour faire avancer la recherche sur cette maladie rare. Les souris seront suivies tout au long de leur vie de la naissance à l’âge de 15 mois maximum, car la maladie rénale évolue très lentement. Aucun symptôme n’est observé pendant plusieurs mois avant d’atteindre la dégradation importante du fonctionnement des reins. Des analyses régulières nécessitant des prélèvements d’urine et de sang chez les souris adultes seront réalisées pour suivre l’évolution de la maladie jusqu’à la fin du protocole (15 mois au maximum).
Compréhension des mécanismes anti-tumoraux de la testostérone dans un modèle de corticosurrénalome chez la souris et recherche de cibles thérapeutiques alternatives
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 384 d'entre elles et sévère pour 192. Toutes subissent l'amputation d'une phalange pour le génotypage, puis reçoivent sous anesthésie un implant de testostérone, de dihydrotestostérone ou un placebo, avant un suivi échographique du corticosurrénalome qu'elles développent par construction génétique, jusqu'au stade métastatique à 18 mois. Le bénéfice avancé pour les patients, de nouvelles pistes contre un cancer dont la survie médiane reste de quinze mois, tient à des mécanismes moléculaires encore à établir. Sur le remplacement, le porteur écrit vouloir éviter les manipulations in vivo autant que possible, puis conclut que les lignées cellulaires disponibles ne répondent pas aux androgènes et que la "nécessité" du recours aux animaux se justifie.
Objectifs
Le carcinome corticosurrénalien est un cancer rare et agressif, caractérisé par un pronostic défavorable. À son diagnostic, près de 50 % des patients présentent des métastases, ce qui explique un faible taux de survie à 5 ans. Actuellement, l’unique option curative pour les patients non métastatiques repose sur une exérèse complète de la tumeur primaire. Cependant, le risque de récidive est élevé (30 à 70 %), constituant la principale cause de décès. Pour les patients métastatiques, la chirurgie est inenvisageable, et les traitements existants, bien que lourds, n’améliorent pas la survie globale médiane, qui demeure autour de 15 mois. Les essais d’immunothérapie dans le carcinome corticosurrénalien ont donné des résultats décevants, probablement en raison de l’immunosuppression induite par l’hyperactivité endocrine observée dans environ 50 % des cas. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il a été récemment montré dans un modèle murin de carcinome corticosurrénalien, que la testostérone produite au moment de la puberté induit un recrutement de macrophages chez les souris mâles, ce qui conduit à une régression de la tumeur. De façon similaire, le traitement des souris femelles portant des carcinomes corticosurrénaliens avec de la testostérone conduit aussi à un recrutement de macrophages et à une diminution de la taille de la tumeur. Ces résultats suggèrent que la testostérone possède un fort potentiel en tant qu’agent antitumoral dans le contexte du carcinome corticosurrénalien. Dans cette étude, l’objectif est d’approfondir la compréhension du rôle antitumoral de la testostérone dans le carcinome corticosurrénalien et d’identifier les mécanismes de réponse en aval, en utilisant des implants de testostérone ou de dihydrotestostérone chez des souris femelles portant des carcinomes corticosurrénaliens. L’objectif global de ces expériences est de comprendre l’importance de la testostérone et de comprendre également comment la testostérone est capable d’avoir un puissant effet antitumoral. Finalement ce projet a pour but d’évaluer la faisabilité d’une modulation hormonale ciblée comme stratégie thérapeutique innovante. La compréhension des mécanismes d’action en aval de la testostérone permettra également de proposer différentes approches thérapeutiques pour les patients atteint de carcinomes corticosurrénalien.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de confirmer le rôle de la testostérone dans la régression du carcinome corticosurrénalien. Elle contribuera à identifier les mécanismes moléculaires antitumoraux impliqués dans cet effet protecteur. Les résultats attendus permettront d’améliorer la compréhension des voies de signalisation impliquées dans la réponse à la testostérone, ouvrant la voie au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Ces approches pourraient reposer sur l’utilisation de la testostérone elle-même ou sur le ciblage des mécanismes moléculaires identifiés grâce à cette étude, dans le but d’améliorer la prise en charge des patients atteints de carcinomes corticosurrénaliens.
Procédures
576 souris seront soumises à une phalangectomie (durée 2 min, 1 fois). 288 souris femelles recevront des implants de testostérone ou de dihydrotestostérone sous anesthésie générale et 288 souris femelles recevront des placebos sous anesthésie générale. L'intervention sera pratiquée 1 seule fois et dure environ 7 minutes.
Impact sur les animaux
La phalangectomie, nécessaire à l’identification et au génotypage des individus, peut entraîner une douleur légère et de courte durée. Cependant, cette procédure n’induit aucune complication durant le développement des animaux et n'affecte pas leur comportement, ni celui des individus de la portée ni de leur mère. L’implantation des implants hormonaux peut entraîner une douleur modérée, localisée et transitoire au site d’insertion. L’insertion des implants pourrait également entrainer une infection locale. L’échographie, réalisée sous anesthésie générale, ne provoque pas de douleur mais peut générer un léger stress lié à la manipulation. Les modèles murins de carcinomes corticosurrénaliens présentent un développement tumoral et éventuellement des métastases.
Devenir
Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer le rôle de la testostérone et de ses mécanismes sous-jacents dans le développement du carcinome corticosurrénalien et ainsi pouvoir potentiellement identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du carcinome corticosurrénalien.
Remplacement
Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux sacrifiés sans manipulation préalable. Cependant, l’ensemble des lignées de carcinome corticosurrénalien actuellement disponibles ne répondent pas aux androgènes, ce qui limite leur pertinence pour l’étude du rôle de la testostérone. De plus, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.
Réduction
Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous mettons en œuvre plusieurs mesures. Nous planifions, lorsque c’est possible, plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque animal soient utilisées. De même, le sang des animaux mis à mort sera systématiquement recueilli pour réaliser des dosages. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration scientifique convaincante, basée sur des arguments statistiques valides et la variabilité biologique attendue. Les groupes expérimentaux comprendront au maximum 12 souris. Une phase préliminaire de mise au point des expériences sera conduite sur un petit nombre d’animaux pour valider la faisabilité des expériences. Les analyses complètes ne seront engagées qu’après validation de cette phase. Pour les souris présentant un carcinome corticosurrénalien avancé, les implants seront maintenus pendant 2 mois afin d’évaluer un effet sur la régression tumorale et la dissémination métastatique. Si des effets anti-tumoraux sont constatés, un groupe supplémentaire sera traité pendant 2 semaines, afin d’évaluer si un traitement court ralenti la croissance tumorale et permettra de caractériser les mécanismes d’action en aval sur des stades de carcinome corticosurrénalien avancés.
Raffinement
Tout au long des procédures, des mesures spécifiques seront mises en place afin d’assurer le bien-être des animaux et de minimiser toute source de stress ou d’inconfort. Du coton sera ajouté dans les cages pour favoriser le maintien de la température corporelle. Pendant la phase de réveil post-anesthésie, les cages seront placées sur un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie. De la nourriture et du gel d’hydratation seront disposés au sol pour faciliter l’accès à l’alimentation et à l’hydratation sans effort. La réalisation de toutes les procédures sera effectuée par du personnel qualifié afin de réduire au maximum la durée de la procédure. Durant toute la procédure, les animaux seront hébergés en cages transparentes et munies d’une grille, qui permettront de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif entre les congénères, limitant ainsi l’isolement social dû à l’hébergement individuel. Les implants seront insérés avec du matériel stérile ce qui réduit fortement l’apparition d’infection chez les animaux. Une surveillance approfondie au niveau du site d’insertion des implants sera réalisée tous les jours pendant 1 semaine. Afin de limiter les nuisances associées aux implants, aux manipulations et les nuisances associés au développement tumoral (inconfort, douleur), les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel formé et expérimenté. Tout animal présentant des signes de souffrance ou atteignant un point limite précis défini sera retiré de l’expérimentation et mis à mort, si nécessaire, conformément aux procédures établies.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant le cancer de la cortico-surrénale. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Au cours de ce projet, une lignée de souris est utilisée. Cette lignée est un modèle préclinique murin de corticosurrénalome reposant sur l’invalidation de gènes suppresseurs de tumeurs mutés chez les patients. Nous réaliserons nos analyses aux 3 stades de développement tumoral identifiés chez les femelles dans ce modèle murin. Un stade d’hyperplasie à 6 semaines, un stade de corticosurrénalome avancé à 16 mois et un stade de corticosurrénalome métastatique à 18 mois.
Mise au point d’un modèle murin d’hyperparathyroïdie primaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris dont l'état général se dégrade au-delà de seuils fixés à l'avance sont mises à mort avant la fin du protocole. 173 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et tissus. Chacune subit jusqu'à deux opérations du cou de quinze minutes sous anesthésie, la seconde retirant la ou les glandes parathyroïdes rendues malades, avec des douleurs cervicales attendues pendant les cinq jours suivants, et une prise de sang à la queue toutes les quatre semaines pendant six mois. Le porteur affirme qu'il est "absolument nécessaire" de comprendre l'ensemble du retentissement de l'hyperparathyroïdie et qu'aucune méthode in vitro ne remplace l'animal dans ce domaine.
Objectifs
L’hyperparathyroïdie primaire est la troisième maladie hormonale en termes de fréquence après le diabète et les pathologies thyroïdiennes. Elle est due à un défaut de sécrétion de parathormone (PTH) et se manifeste sur le plan biologique par une augmentation de la concentration en calcium sanguin. Ses conséquences cliniques sont nombreuses : osseuses, rénales, métaboliques, cognitives. L’ablation de la ou des glandes malades est le seul traitement curateur de cette maladie. L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle d’hyperparathyroïdie primaire réversible après chirurgie chez la souris (élimination de la/des glandes atteintes), afin d’étudier les conséquences de cette pathologie et de sa guérison.
Bénéfices attendus
Les retombées attendues de notre projet au-delà du modèle murin sont de mieux comprendre les conséquences et mécanismes impliqués : 1) dans le développement de cette maladie et 2) les bénéfices de l’ablation chirurgicale de la glande malade. Ces informations nous permettront de mieux soigner les patients atteints de cette maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis au maximum à deux procédures chirurgicales (Durée : 15 minutes) sous anesthésie générale gazeuse et analgésie. Un prélèvement de sang à l’extrémité de la queue sur animaux vigiles sera réalisé avant la première chirurgie, une fois toutes les 4 semaines pendant 24 semaines jusqu’à la seconde chirurgie, puis une fois toutes les semaines pendant 4 semaines (durée par prélèvement : 1 min). Enfin, un prélèvement de sang par ponction cardiaque lors de l’euthanasie (animal sous anesthésie générale pendant le prélèvement : durée 5 minutes).
Impact sur les animaux
Il s’agit de procédures modérées, et aucune mortalité n’est attendue après les différentes chirurgies. Les principaux effets indésirables attendus pourraient concerner : une douleur faible au site d’incision réalisé pour les prélèvements sanguins ; des douleurs au niveau du cou pendant les cinq premiers jours après chirurgie.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés sera mis à mort à l’issu des expérimentations pour collecter des échantillons sanguins et tissulaires nécessaire à la mesure de l’efficacité de la transduction et des conséquences de l’hyperparathyroïdie primaire.
Remplacement
L’hyperparathyroïdie induit de profondes modifications du métabolisme énergétique qui font intervenir des conséquences entremêlées et en cascade sur de nombreux tissus. Les mécanismes moléculaires sont très mal connus et il est absolument nécessaire de comprendre l’impact physiologique dans son ensemble pour développer par la suite d’autres approches. ll n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes ex vivo / in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de l’hyperparathyroïdie.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
Nous avons pris en compte le bien-être animal, une visite quotidienne des animaux par les zootechniciens formés permettra de prévenir les risques de stress et de souffrance. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant des procédures adaptées, notamment un protocole péri-opératoire afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal, basé sur nos précédentes expériences de chirurgie chez la souris. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale. Les animaux reçoivent avant la chirurgie puis pendant une durée de 3 jours une analgésie. Les souris reprendront une alimentation normale dès le jour de la chirurgie. Les souris seront placées en couveuse à 30°C pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis et un dôme ou un tube tunnel en polycarbonate rouge. Afin de limiter les souffrances post-expérimentales, une surveillance attentive des animaux sera réalisée par l'expérimentateur (toutes les 2 heures pendant premières heures post-chirurgie, 2 fois par jour pendant les 5 jours, puis une fois par jour jusqu'à la fin de l’étude). Des signes cliniques définissant les points limites, au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal mis à mort, ont été fixés.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix, il est utilisé depuis de longue date dans l’étude des maladies cardiaques et métaboliques. Il est largement reconnu pour sa pertinence dans la recherche biomédicale et les études précliniques en raison de sa similitude génétique avec l'humain. Les procédures débuteront chez des animaux à 8 semaines de vie, pour travailler sur des adultes jeunes mais matures sexuellement.
Evaluation d’approches pharmacologiques ciblant une protéine mitochondriale sur la chronologie du cancer colorectal, la fonctionnalité des muscles cardiaques, vasculaires et squelettiques chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Pour tester des inhibiteurs d'une protéine mitochondriale sur le cancer colorectal et sur les muscles, 62 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour dix d'entre eux et modéré pour les 52 autres. Ces rats sont génétiquement modifiés et portent une mutation qui déclenche des tumeurs intestinales. Ils reçoivent un traitement anticancéreux dans l'abdomen deux fois par semaine pendant neuf semaines, sont pesés jusqu'à une fois par jour, subissent deux mesures de pression artérielle et une échographie cardiaque sous anesthésie. Le porteur indique que la cachexie cancéreuse leur fait perdre poids, appétit et mobilité, que 52 d'entre eux seront tués pour prélever le bloc cœur-poumons, et que les dix n'ayant subi qu'une échographie partiront vers un autre projet.
Objectifs
L’ion calcium est impliqué dans différents processus favorisant le développement du cancer. A l’échelle cellulaire, les variations de calcium intra-mitochondrial sont essentielles à la production d’énergie pour la cellule. Or, dans les cellules cancéreuses, les mitochondries présentent divers degrés de dysfonctionnement. Ainsi, le développement de nouveaux agents visant spécifiquement ces organites suscite un intérêt croissant dans la lutte contre le cancer. La sortie de calcium de la mitochondrie dépend d'une protéine mitochondriale. Dans le cancer colorectal, cette protéine joue un rôle ambivalent : une diminution de son expression et de son activité entraine une réduction significative de la croissance tumorale, mais semble ensuite favoriser l’apparition de métastases ainsi qu’une résistance à la chimiothérapie. Toutefois, ces résultats proviennent d’expériences in vitro, réalisées sur des cellules probablement adaptées à l’absence de cette protéine. L’utilisation d’approches pharmacologiques ciblant spécifiquement cette protéine apparaît donc indispensable pour mieux comprendre son rôle dans la progression du cancer colorectal. Le calcium mitochondrial joue également un rôle crucial dans la régulation des cellules musculaires. Chez les patients atteints de cancer, le fonctionnement de ces cellules peut être altéré par la maladie elle-même et/ou par les traitements anti-cancéreux, entraînant des complications qui détériorent fortement la qualité de vie des patients. Les effets de stratégies pharmacologiques ciblant la protéine mitochondriale étudiée n’ont pas encore été étudiés sur les organes comportant des cellules musculaires. Ce projet a donc pour objectif d’étudier l’impact systémique du développement du cancer colorectal et des traitements ciblant la protéine d'intérêt, à l’aide d’un modèle de rat génétiquement modifié. Ce modèle est porteur d'une mutation fréquemment retrouvée dans les cancers colorectaux humains et constitue un modèle pertinent pour reproduire fidèlement la tumorigenèse intestinale.
Bénéfices attendus
À court terme (pendant et juste après le projet) : - Meilleure compréhension du rôle de la protéine d'intérêt dans la progression du cancer colorectal. - Acquisition de données sur les effets du cancer colorectal et des inhibiteurs de la protéine d'intérêt sur la physiologie cardiovasculaire, musculaire et intestinale dans un organisme entier. Comparaison entre la chimiothérapie conventionnelle et l’approche innovante (inhibition de la protéine d'intérêt). - Identification de signatures biologiques associées à la modulation de la protéine d'intérêt et au développement tumoral, en tenant compte non seulement de la tumeur mais aussi des organes périphériques (muscles cardiaques et squelettiques, intestin, foie, tissu adipeux). - Meilleure gestion des effets secondaires : compréhension des impacts métaboliques des approches pharmacologiques ciblant la protéine d'intérêt pour mieux anticiper et limiter les complications cliniques chez les patients. - Production de données essentielles pour justifier le passage à des essais cliniques précoces d’inhibiteurs de la protéine d'intérêt. À long terme (5-10 ans et au-delà) : - Développement de nouvelles classes de médicaments ciblant la protéine d'intérêt, pouvant compléter ou remplacer certains traitements classiques du cancer colorectal. - Intégration des connaissances dans les stratégies personnalisées de traitement du cancer colorectal, en tenant compte du profil tumoral et des comorbidités du patient. - Amélioration de la qualité de vie : réduction des complications cardiovasculaires et musculaires liées aux cancers digestifs et à leurs traitements, grâce à des thérapies mieux tolérées. - Extension à d’autres pathologies : les connaissances acquises pourraient bénéficier à la recherche sur d’autres cancers, mais aussi sur des maladies cardiovasculaires et métaboliques.
Procédures
Injection sur animal vigile de traitement anticancéreux par voie intrapéritonéale 2 fois par semaine pendant 9 semaines (< 5 minutes à chaque fois). Pesée des animaux vigiles : 3 fois/semaine pendant 6 semaines puis 1 fois/jour pendant 3 semaines (< 1 minutes à chaque fois). Mesure de la pression artérielle chez le rat vigile, 2 fois par animal (< 10 minutes à chaque fois). Injection par voie intrapéritonéale d’un anesthésique sur animal vigile (1minute) puis échographie cardiaque (5 minutes). Prélèvement du bloc coeur-poumons sous anesthésie générale profonde 1 fois/animal pendant moins d’1 minute.
Impact sur les animaux
Stress durant le transport des animaux. Stress ponctuel lié à la manipulation/contention des animaux lors des pesées, de la mesure de la pression artérielle et des injections intrapéritonéales. Douleur au niveau des sites d’injection du traitement ou du solvant. Le cancer et le développement tumoral peuvent entrainer des symptômes d'intensité limitée : une perte de poids, une perte d’appétit et une réduction de la mobilité à cause de la cachexie cancéreuse.
Devenir
Les rats ayant subis une échographie uniquement seront réutilisés dans un autre projet. Pour les groupes d’animaux témoins et traités, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs ainsi que plusieurs organes pour caractériser l'effet biologique des traitements. Nous devons pour cela procéder au prélèvement du bloc cœur-poumons, ce qui entraine la fin de vie de l’animal.
Remplacement
L’un des principaux défis de la recherche sur les effets systémiques de la tumeur sur l’hôte réside dans les défaillances multi-organiques qui en résultent. Cette complexité rend le développement de modèles expérimentaux particulièrement difficile. À ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro capable de reproduire fidèlement ces interactions. Les altérations métaboliques étendues et les atteintes de plusieurs organes compliquent fortement la conception d’approches pertinentes. La recherche dans ce domaine s’appuie notamment sur l’utilisation de biopsies humaines, exploitées directement ou utilisées pour établir des lignées cellulaires et des organoïdes. Cependant, ces approches présentent des limites : quantité et qualité variables des échantillons, accès restreint à certains organes (cœur, intestin, foie) et contraintes éthiques. De plus, les lignées cellulaires immortalisées ne reflètent pas la complexité fonctionnelle des tissus dans leur contexte physiologique. Ces limites nous conduisent à recourir à des modèles animaux et à des expérimentations in vivo, seules approches permettant d’étudier de manière intégrée l’impact de la tumeur sur l’organisme entier.
Réduction
L’étude comporte une étape préliminaire comportant au maximum 10 animaux ainsi que quatre groupes expérimentaux de rats comprenant chacun 13 animaux, soit un total de 62 rats. Ce nombre a été défini pour maintenir un équilibre éthique et scientifique, en garantissant une puissance suffisante pour détecter des effets modérés à forts à l'aide d'outils statistiques tout en limitant l’usage d’animaux.
Raffinement
Une phase d’habituation sera mise en place pour limiter le stress des animaux. Tous les animaux seront hébergés dans un milieu enrichi. Après chaque mesure expérimentale et chaque administration, l’animal recevra une récompense alimentaire. Les animaux seront étroitement surveillés pendant toute la durée du traitement avec, le cas échéant, l'utilisation d'un analgésique et des points limites adaptés.
Choix des espèces
Notre modèle de rat génétiquement modifié, porteur d'une mutation fréquemment retrouvée dans les cancers colorectaux humains, permet de reproduire fidèlement la tumorigenèse intestinale. Ce modèle ne se limite pas à l’étude du développement tumoral : il offre également la possibilité d’analyser les conséquences systémiques du cancer sur l’organisme entier. Ainsi, il permettra d’évaluer à la fois la charge tumorale et l’impact de la maladie sur des fonctions clés telles que la motilité intestinale, la fonction cardiovasculaire et la physiologie musculaire squelettique. Grâce à cette approche intégrative, ce modèle est idéal pour générer des données essentielles à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques et pour justifier, le cas échéant, le passage à des essais cliniques précoces. Les animaux utilisés dans ce projet seront à un stade adulte et âgés de 12 semaines au début du traitement. Ce choix repose sur des considérations physiologiques et méthodologiques. En effet, il s’agit d’une période où l’organisme a atteint sa maturité fonctionnelle et présente une stabilité métabolique, cardiovasculaire et musculaire, conditions indispensables pour obtenir des données fiables et interprétables.
Rôles de perturbateurs endocriniens dans le develloppement de maladies auto-immunes dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Les souris utilisées portent une mutation déclenchée par gavage, sur une lignée déjà détenue par l'établissement. 2 496 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un perturbateur endocrinien par voie orale, puis deux injections sous anesthésie leur déclenchent une thyroïdite ou une myasthénie auto-immune, avant cinq prises de sang sur animal éveillé, cinq tests cliniques et une évaluation de la fonction musculaire. Le porteur indique que le gavage répété peut blesser l'œsophage et faire perdre du poids, et que ces modèles entraînent une perte de mobilité, les tissus étant prélevés après la mise à mort pour des analyses biochimiques et histologiques.
Objectifs
Dans les pays développés, les maladies auto-immunes touchent 5 à 10 pour cent de la population et représentent la troisième cause de morbidité. Elles sont dues à une déregulation du système immunitaire, qui ne discrimine plus le soi du non soi. L'exposition (via alimentation, air, eau) à des perturbateurs endocriniens s'accroit. Ce projet a pour but de comprendre le rôle joué par ces molécules dans le développement de pathologies auto-immunes. Ce projet va décrypter, au sein du thymus, les modulations cellulaires et moléculaires induites par ces molécules qui participeraient à altérer la tolérance immunitaire au soi et au développement de pathologies auto-immunes.
Bénéfices attendus
Les maladies auto immunes telle que la myasthénie sont des maladies chroniques invalidantes. Les causes de développement de ces pathologies demeurent inconnues. Dans ce projet, nous souhaitons démontrer qu’un facteur de l’environnement peut induire des perturbations au niveau de la mise en place de la tolérance immunitaire et par conséquence serait à l’origine de dysfonctionnement thymique conduisant au développement d'une pathologie auto-immune. Aussi, la compréhension des mécanismes étiologiques est donc importante pour proposer des mesures de prévention et adapter les traitements des personnes affectées par une pathologie auto-immune.
Procédures
Des animaux seront soumis à une induction de la mutation génique par voie orale (3 fois, 1 minute sur 5 jours). Des animaux seront exposés à l’état vigile au perturbateur endocrinien ou une solution contrôle par voie orale (1 fois, 1 minute). Les animaux seront soumis à une induction de la pathologie par des injections sur animal anesthésié (2 fois par animal sur 21 à 30 jours, 10-15 minutes pour les injections). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile (5 fois pendant le projet, moins d’une minute). Les tests cliniques de suivi des pathologies seront réalisés sur animal vigile (5 fois -15 minutes). L’évaluation de la fonction musculaire se fera sur animal anesthésié (1 fois-15 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : Premièrement, pour le gavage, a- une possible douleur au niveau de l’œsophage due à l’insertion répétée de la sonde dans le système digestif. b- Une perte de poids pour les animaux recevant le perturbateur endocrinien. Deuxièmement : Les animaux incluent dans le modèle de pathologie auto-immune pourraient subir a-Un risque d’hypothermie ou de détresse respiratoire suite à l’anesthésie générale pour l’immunisation. b-sensation d’irritation ou la gêne induite par le produit immunisant. c-un risque de douleur et un inconfort post-immunisation. d-Un stress lié à l’analyse comportementale et une perte de mobilité inhérente aux modèles. Troisièmement : une légère et brève douleur lors du prélèvement sanguin et une perte de sang ainsi qu’un stress lors des manipulations nécessitant une contention des animaux.
Devenir
A l’issue de l’expérience, les animaux sont euthanasiés par une euthanasie réglementaire et les tissus d’intérêt seront prélevés pour des analyses biochimiques, histologiques et moléculaires.
Remplacement
Des etudes, au préalable, sur des modèles cellulaires ont été ménées. Nous souhaitons valider nos observations avec des modèles in vivo, afin de démontrer l’impact d’une exposition aux molécules identifiées comme perturbateurs endocriniens sur la physiologie thymique et les conséquences sur la susceptibilité au développement de pathologie auto-immunes.
Réduction
Le nombre total d'animaux dans ce projet est 2496. Pour chaque procédure 1248 animaux seront utilisés pour permettre une analyse statistique des données tout en utilisant le minimum d'animaux. Le nombre de souris par condition expérimentale est déterminé pour permettre une bonne analyse statistique des données tout en utilisant le minimum d'animaux. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous analyserons les variances et différences entre les groupes testés.
Raffinement
Les animaux obtenus par le fournisseur agrée observeront une période d’acclimatation/adaptation de 7 jours. Tous les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (cotons, tunnel en carton, bâton en bois) et un accès à l’alimentation et un abreuvement à volonté. Une litière en aoute pour limiter l’inconfort des animaux au niveau des coussinets plantaires. Lorsqu'il y a apparition de signe clinique de la maladie, de la nourriture humidifiée est mise dans la cage pour éviter aux souris, si elles sont faibles, d'aller chercher la nourriture en hauteur. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie et d'une analgésie pré et post immunisation. Les souris sont surveillées quotidiennement par les animaliers. Les souris sont pesées 2 à 3 fois par semaine et regardées attentivement par la personne menant le projet. Les points limites ont été préalablement définis pour limiter la contrainte et permettre une prise de décision rapide en cas de nécessité.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle murin car il est bien caractérisé pour les maladies auto-immunes. Il permet d’étudier dans un organisme global, les effets de composés sur les différentes populations cellulaires immunes et leur interaction et conséquence sur la physiologie globale de manière fiable. Ces observations sur organisme entier ne sont pas possibles sur des modèles in vitro ou ex vivo. De plus, une lignée murine pour le gène d’intérêt est disponible à l'établissement. Les modèles de thyroïdite et myasthénie auto-immune sont maitrisés par l’équipe et reconnus par la communauté scientifique. Ces modèles sont comparables sur certains points avec la pathologie humaine. Les expériences seront effectuées sur des souris ayant 4 à 7 semaines et 10 à 12 semaines au début de l’expérience ce qui correspond à l’adolescence et au stade adulte, périodes d’apparition des maladies auto-immunes chez l’homme.
Impacts directs et multigénérationnels d’obésogènes et de perturbateurs métaboliques chez le xénope
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Vingt xénopes adultes nagent six mois dans une eau contenant un mélange de six perturbateurs endocriniens, puis reçoivent deux injections hormonales à vingt heures d'intervalle pour être reproduits. Avec leurs descendants sur deux générations et 1 728 larves, 1 828 animaux sont concernés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la quasi-totalité. Le porteur écrit que les concentrations employées ne provoquent pas de stress connu, après avoir indiqué que ces substances peuvent entraîner une surmortalité et des malformations de la colonne vertébrale. Les mâles sont tués au moment de la ponte pour prélever leurs testicules, les femelles après récupération des œufs, et toutes les larves après prélèvement de leur cerveau.
Objectifs
Des études récentes suggèrent que les effets transgénérationnels induits par des polluants tels que les perturbateurs endocriniens (PE) sont impliqués dans le déclin des populations d’amphibiens en altérant la capacité des animaux à se reproduire. Ce projet a pour ambition d’étudier les effets d’une exposition à un mélange de 6 PE présents dans le milieu naturel utilisés à des concentrations environnementales tout au long de la vie des animaux de la 1ère génération, puis les répercussions transgénérationnelles de cette exposition sur les 2 générations suivantes non exposées chez l’espèce Xenopus tropicalis. Les effets seront évalués à chaque génération en regardant l’impact de cette perturbation sur le développement et le comportement de la descendance des animaux exposés (première génération) et non exposés (les 2 générations suivantes). Les effets au niveau thyroïdien et au niveau du développment des animaux, en particulier les effets neuro-développementaux, ainsi que les effets sur la reproduction et la transmission des effets entre génération seront étudiés. Ces animaux seront comparés à des animaux élevés dans les mêmes conditions mais non exposés aux PE, comme contrôles.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les impacts des perturbateurs endocriniens (PE) obésogènes sur les amphibiens et leur conséquence dans le déclin de leurs populations. D'un point de vue scientifique, la recherche générera de nouvelles connaissances et technologies dans les domaines de la physiologie animale, de la perturbation endocrinienne, de l'épigénétique et de l'écotoxicologie. D'un point de vue global, la protection de la biodiversité et de la santé humaine est essentielle. Le concept "EcoHealth" est aujourd’hui mis en avant dans nos sociétés. Sous plusieurs aspects, notre projet s'inscrit parfaitement dans ce concept. Toutes les données générées par ce projet multidisciplinaire seront disponibles pour les organisations qui gèrent la biodiversité ou sont impliquées dans l'évaluation des risques chimiques (OFB, ANSES) et aideront les décideurs à protéger la qualité de l'environnement naturel et à améliorer la santé des écosystèmes.
Procédures
Les xénopes adultes de la première génération (F0) seront exposés à un mélange de 6 perturbateurs endocriniens dilués dans l’eau des aquariums durant 6 mois. Les xénopes adultes des 2 générations suivantes (F1 et F2) seront maintenus en eau normale durant 3 mois. Toutes les reproductions des animaux seront réalisées au cours de ces périodes. Pour la fécondation in vitro, les animaux adultes males et femelles reçoivent deux injections d’hormone à 20 heures d’intervalle. Ces étapes ne durent pas plus de 30 secondes à chaque fois. Les femelles commencent à pondre environ 2 heures après la seconde injection. Les mâles sont euthanasiés à ce moment pour prélever leurs testicules. Les femelles sont soumises à un massage doux pendant 1 à 2 minutes pour récupérer les œufs qui seront fécondés par leur mise en présence avec une solution contenant les spermatozoïdes. Dans le cas de non ponte, les femelles pourront être de nouveau stimulées en respectant un repos minimum de 2 mois entre deux stimulations. Les larves obtenues des descendances des 3 générations produites seront élevées jusqu’à la fin du développement larvaire puis soumis à ce stade à un test de comportement (analyse de la mobilité sur une période de 12 minutes).
Impact sur les animaux
Les concentrations du mélange de perturbateurs endocrinien (PE) utilisées sont celles des normes de qualité environnementales. Il se peut cependant que les effets des PE puissent entrainer une surmortalité ou des malformations. Au stade larvaire des déformations de la colonne vertébrale sont décrites comme pouvant survenir lors d’un stress. Nous effectuons une stimulation hormonale sur femelles vigiles. Les nuisances attendues sont essentiellement de type inconfort/stress et douleur légère et transitoire. Une douleur légère et transitoire peut être induite par l'injection.
Devenir
Tous les adultes males et femelles utilisés pour réaliser les fécondations in vitro seront euthanasiés en fin de procédure. Des tissus seront récupérés pour analyse. L’ensemble de ces animaux étant destiné à une étude multigénérationnelle suite à l’exposition de la première génération à un mélange de perturbateurs endocriniens, il n’est pas possible de réétuliser ces animaux en raison de cette exposition. Toutes les larves utilisées pour étudier les effets direct et transgénérationel du mélange de 6 perturbateurs endocriniens sont euthanasiés en fin de procédure. Des prélèvements d’organes (cerveaux) seront réalisés sur chaque larve en vu de faire des analyses immunologique et d’expression de gène sur ces animaux pour regarder les effets neurodéveloppementaux de l’exposition aux perturbateurs endocriniens.
Remplacement
Les outils informatiques permettant de faire des prédictions ne peuvent pas reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. De la même façon, les expériences réalisées sur des cellules en laboratoire (tests in vitro) ne tiennent pas compte du fonctionnement global, notamment des effets hormonaux ou du développement, qui ne peuvent être observés que chez un animal entier. Dans notre étude, nous cherchons à comprendre comment un mélange de substances peut perturber le système hormonal. Ce type de phénomène dépend des interactions entre plusieurs organes, ce qui ne peut pas être étudié uniquement sur des cellules isolées. C’est pourquoi une approche « in vivo », c’est-à-dire sur des animaux vivants, est nécessaire. Nous avons choisi d’utiliser des grenouilles, car notre objectif est d’évaluer l’effet d’un mélange de produits tel qu’il pourrait exister dans leur environnement naturel. Cette méthode permet d’obtenir des résultats plus fiables et représentatifs des conditions réelles d’exposition.
Réduction
Le projet concerne 1828 animaux. 100 grenouilles adultes (20 animaux de la génération F0, 40 animaux de la génération F1 et 40 animaux de la génération F2) seront utilisées. Pour chaque étape, nous utilisons 5 mâles et 5 femelles afin de réaliser différents types de croisements. Un prélèvement d’organes (cerveau, thyroide…) sur les individus euthanasiés sera effectué. Au total, 1728 larves seront utilisées dans le projet. Ce chiffre correspond à 480 larves par génération, multipliées par 3 expériences répétées (soit 1 440 larves). Nous ajoutons une marge de 20 pour cent pour tenir compte de la mortalité naturelle des têtards. Le nombre de larves utilisé est le nombre minimal pour ne pas mettre en péril les manipulations et avoir des résultats statistiquement fiables : - Pour le comportement, un minimum de 20 animaux testés par condition experimentale est nécessaire pour mesurer une mobilité interprétable et comparable. - Pour l’analyse immunologique, 10 animaux par condition experimentale permettront de tester plusieurs marqueurs immunologiques pour observer les effets du mélange de perturbateurs endocriniens sur le développement neuronal. - Pour l’analyse de l’expression des gènes, 10 animaux par condition experimentale permettront de disposer de suffisamment de materiel génétique (cerveaux) et d’avoir suffisamment de réplicats biologiques pour les analyses. Le nombre de réplicats techniques permettra de prendre en compte la variabilité inter-experimentation généralement associée aux études réalisées sur les animaux vivants. La taille des effectifs a été établie avec un calcul de puissance afin de prendre en compte la robustesse des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. La comparaison des groupes sera réalisée via des tests statistiques permettant une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les protocoles d’exposition permettent de reproduire les conditions naturelles (exposition dans l’eau) pour confirmer et transposer les résultats obtenus à court terme sur le terrain. Ce mode d’exposition est non invasif et n’induit pas de souffrance, contrairement à l’injection dans l’abdomen souvent utilisée en toxicologie. Les grenouilles sont élevées dans des aquariums contenant de l’eau filtrée, déchlorée, oxygénée et maintenue à une température de 26 degrés. Des capteurs mesurent en continu la température, le pH et la qualité de l’eau. Les aquariums sont aménagés avec des tubes, plantes, billes, même si les animaux préfèrent rester au fond. Les déchets et restes de nourriture sont retirés chaque jour, et les parois nettoyées toutes les deux semaines. Avant toute expérience, les animaux s’acclimatent à leur environnement pendant un mois. Ils sont nourris trois fois par semaine à satiété, avec des granulés et des vers de vase. La manipulation s’effectue à la main ou à l’épuisette, sans mouvement brusque. Leur comportement et leur état de santé sont suivis tout au long des protocoles grâce à une grille d’observation. Les concentrations de perturbateurs endocriniens utilisées correspondent aux normes environnementales et ne provoquent pas de stress connu. Toutefois, en cas de signe de stress, le traitement est suspendu et les animaux euthanasiés. Lors des fécondations in vitro, les injections peuvent entraîner de légères douleurs. Les Xenopus sont sortis de l’eau uniquement le temps de l’injection puis isolés dans un bac d’eau déchlorée jusqu’au lendemain. Chez les femelles la ponte est repérée grâce à la dilatation du cloaque, et les œufs non fécondés sont recueillis par massage doux. Les femelles qui ne réagissent pas ne sont pas utilisées. Après la ponte, elles sont replacées en aquarium isolé pendant 48 heures avec surveillance de l’alimentation. Les expérimentateurs observent quotidiennement les animaux. Les points limites de stress déclenchant une euthanasie incluent : perte d’appétit, mouvements anormaux, apathie, dégradation de la peau, état de choc, inconscience ou blessures.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce Xenopus tropicalis est justifiée par trois raisons majeures : 1) son temps de génération court pour un amphibien (environ 10 mois du stade œuf à adulte mature) permet l’étude de l’effet de polluants tels que les perturbateurs endocriniens sur plusieurs générations 2) c’est une espèce non invasive ni en danger ou voie d’extinction et qui est facile à maintenir en laboratoire. C’est un modèle déjà étudié dans notre laboratoire et 3) Le xénope est un vertébré tétrapode non-mammifère et un modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. Le génome de Xénopus tropicalis montre d’importante similitude avec le génome humain et c’est une espèce sur laquelle les études sur le génome sont aisées. Les animaux adultes seront utilisés afin d’être reproduits sur 3 générations pour obtenir à chaque génération une descendance qui sera utilisée pour faire une analyse multigénérationnelle des effets de l’exposition des animaux de la première génération à un mélange de perturbateurs endocriniens. Les larves obtenues pour chaque reproduction seront utilisées à un stade qui se situe à la fin du développement larvaire, car à ce stade, les organes sont bien différenciés, ce qui permet d’étudier la physiologie et la morphologie des animaux. Sur ces larves, un test comportemental (par une analyse de leur mobilité à chaque génération) et une analyse des tissus neuronaux après euthanasie et prélèvement des cerveaux seront réalisés, dans le but de voir les effets neurodéveloppementaux de l’exposition aux perturbateurs endocriniens à travers les différentes générations.
Prolifération cellulaire saisonnière hypothalamique : analyse du rôle biologique sur la fonction de reproduction chez le hamster syrien et évaluation du mécanisme d’action de la mélatonine chez la souris-MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
Hamsters dorés : 452
Transférés en photopériode courte puis hébergés seuls jusqu'à la fin de la procédure, les hamsters syriens subissent une chirurgie de deux heures sous anesthésie générale, puis chaque semaine une mesure de la taille des testicules et un prélèvement sanguin, certains passant en plus des tests de mémoire et d'olfaction d'une semaine chacun. 452 hamsters syriens et 120 souris vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour les hamsters et léger pour les souris, tous tués à l'issue. L'ensemble sert à établir le rôle de la prolifération cellulaire de l'hypothalamus dans la reproduction saisonnière, les souris mutées pour les récepteurs à la mélatonine étant utilisées pour situer le point d'action de l'hormone. Le texte annonce la mise à mort de 540 animaux, soit 452 hamsters et 88 souris, quand la déclaration porte sur 120 souris, écart de 32 individus qu'aucune ligne n'explique.
Objectifs
Il est bien établi que les variations des concentrations de mélatonine nocturne permettent l’intégration des saisons au niveau de l’hypothalamus, une zone cérébrale connue pour contrôler la fonction de reproduction. L’hypothalamus comprend des cellules gliales spécifiques bordant le 3ème ventricule, appelées tanycytes, qui jouent un rôle important dans la physiologie saisonnière et dans la prolifération cellulaire. De récents résultats de l’équipe, obtenus chez le hamster syrien (rongeur saisonnier) indiquent que le nombre de cellules néoformées augmente rapidement après le transfert en photopériode courte (hiver, période de l’année où la durée du jour est plus courte que celle de la nuit). Cette augmentation de la prolifération cellulaire en photopériode courte a été préalablement observée chez une autre espèce saisonnière, la brebis et il a été montré qu’elle participait à la synchronisation saisonnière de la fonction de reproduction. La brebis se reproduit en photopériode courte (automne/hiver), contrairement au hamster qui se reproduit en photopériode longue (printemps/été), ce qui interroge sur le rôle de la prolifération cellulaire hypothalamique sur la fonction de reproduction du hamster. De plus, nous avons récemment observé que l’augmentation de la durée de production nocturne de mélatonine en photopériode courte entraine l’augmentation de cellules néoformées dans l’hypothalamus. De plus, notre étude montre également que la mélatonine n’agit pas classiquement via l’hormone thyroïdienne (T3) intra-hypothalamique, suggérant qu’elle pourrait agir directement via ses récepteurs MT1 et/ou MT2 , pour contrôler la prolifération cellulaire. Pour vérifier notre hypothèse d’un effet direct de la mélatonine, il est nécessaire d’utiliser des animaux génétiquement modifiés, présentant des mutations pour les récepteurs à la mélatonine (MT1 et/ou MT2), ce qui est possible uniquement chez la souris. Ainsi, ce projet vise à évaluer chez le hamster syrien le rôle biologique de la prolifération cellulaire dans l’hypothalamus sur la synchronisation saisonnière de la reproduction, et d’établir chez la souris les mécanismes d’action de la mélatonine sur la prolifération cellulaire saisonnière. MODIFICATION : La production des souris mutées MT2 s'est avérée compliquée et l'âge des animaux s'en est trouvé très variable. Or l'âge des animaux impacte la neurogenèse. La modification porte sur l'ajout de 32 souris d'âge homogène afin de reproduire une des études du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet nous aidera à mieux comprendre d’une part, les mécanismes d’action de la mélatonine sur la prolifération cellulaire hypothalamique, et d’autre part le rôle biologique de cette prolifération cellulaire saisonnière sur le contrôle annuel de l’activité de reproduction chez un mammifère saisonnier. En effet, la neurogenèse (formation de nouveaux neurones) chez les mammifères adultes est un sujet de recherche assez récent, c’est pourquoi la recherche des facteurs environnementaux influençant cette neurogenèse, comme ici les saisons, est nécessaire à la compréhension des mécanismes et du rôle biologique de celle-ci dans le cerveau adulte. Par ailleurs, ces travaux ont des implications cliniques car de plus en plus d’études montrent l’impact physiologique des saisons chez l’humain. Une étude a montré que les concentrations circulantes d’hormones liées au métabolisme, à la reproduction et à la croissance varient selon les saisons. L’étude des mécanismes d’intégration des saisons dans le système nerveux central est donc indispensable pour comprendre comment les différentes espèces, dont l’humain, s’adaptent aux cycles annuels de leur environnement.
Procédures
Les hamsters pourront être soumis à une procédure chirurgicale (d’une durée d’environ 2h00) effectuée sous anesthésie générale. La mesure de la taille des testicules et le prélèvement de sang des hamsters seront effectués sous anesthésie générale à la fréquence d'une fois/semaine sur la durée de la procédure. Chaque geste durera environ 2-3 minutes par animal. Certains hamsters seront soumis à des tests comportementaux (1 à 2 fois) afin d’évaluer la mémoire et l’olfaction (durée d’1 semaine pour chaque type de test). L’hébergement en cage individuelle aura lieu suite au transfert en photopériode courte jusqu’à la fin de la procédure expérimentale. La totalité des souris et certains hamsters seront soumis à une injection sur animal vigile, une seule fois, 24 heures avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Les nuisances suivantes sont attendues : 1) l’intervention chirurgicale est jugée douloureuse et inflammatoire, et donc entrainer une perte de poids post-opératoire ; 2) la préhension de l’animal afin d’effectuer les injections intrapéritonéales pourra engendrer un stress et une irritation de la zone injectée ; 3) les prélèvements de sangs récurrents pourront induire une irritation, une douleur légère, des ecchymoses, une hémorragie, une compensation temporaire via le membre opposé pour se déplacer ou une infection ; 4) les tests comportementaux peuvent induire un stress aigu.
Devenir
Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 540 animaux, soit 452 hamsters syriens et 88 souris. Les animaux seront mis à mort afin de prélever des tissus et organes pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Ce projet est donc une étude de physiologie intégrée, reposant sur un dialogue entre le cerveau et le corps. Par conséquent ce projet ne peut pas être réalisé chez des invertébrés, des lignées cellulaires ou des modèles biomathématiques. Dans ce contexte nous ne pouvons pas proposé d’alternatives pour des études préliminaires dans des modèles hors-champs.
Réduction
Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d’obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l’aide des tests statistiques appropriés. Les études préparatoires sont mises en place afin de maitriser et d’améliorer les gestes techniques ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux dans la procédure en elle-même. Dès que l’expérience s’y prête, un suivi longitudinal a été privilégié. C’est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs semaines, cela permet une réduction du nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Les hamsters et les souris seront hébergés en groupes sociaux ou seront isolés, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress, les cages seront enrichies avec du matériel de nidation, un bâton à ronger, et avec apport d’eau et de nourriture à volonté et un tunnel. Ce tunnel sera utilisé pour déplacer les animaux lors du change ou pour capturer l’animal. Après leur arrivée à l’animalerie, les souris auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, ils seront manipulés quotidiennement pendant 1 semaine avant le début des procédures expérimentales. Toute procédure invasive est réalisée sous anesthésie/analgésie et après entrainement au geste technique. Tous les animaux seront observés et pesés hebdomadairement. Des points limites ont été établis afin de d’identifier les animaux en souffrance et de pouvoir les y soustraire.
Choix des espèces
Le hamster syrien est un modèle de rongeur saisonnier dont les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la physiologie saisonnière sont largement étudiés. De récents résultats ont montré l’existence d’une prolifération cellulaire hypothalamique induite par un transfert en photopériode courte (hiver). Par conséquent, il est opportun d’utiliser la même espèce pour analyser le rôle biologique de cette prolifération saisonnière, d’autant que nous maitrisons les procédures expérimentales proposées chez cette espèce. Des injections quotidiennes de mélatonine pendant 1 semaine augmentent la prolifération cellulaire hypothalamique chez le hamster. La détermination de sites d’action de la mélatonine nécessite des individus mutés pour les récepteurs de la mélatonine. Comme nous ne disposons pas de ces outils génétiques chez le hamster, nous utiliserons des souris mutées pour les récepteurs à la mélatonine. Pour cette étude, nous utiliserons des hamsters syriens jeunes adultes (3-8 mois), et des souris mâle jeunes adultes (7-8 semaines), période où la maturité sexuelle est optimale.
Essai d’une thérapie du diabète en utilisant un modèle de souris humanisées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Une biopsie de la queue, quatre prélèvements sanguins et jusqu'à sept injections par animal, puis un diabète déclenché par une molécule synthétique : 3 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les manipulations commencent dès l'âge de dix jours, et les animaux qui présentent déjà des signes de la maladie sont mis à mort. L'objectif déclaré est une thérapie cellulaire, des cellules injectées venant compenser un défaut immunitaire. La maladie n'est nommée nulle part dans la description, réduite à "la maladie métabolique d'intérêt", pas davantage que les cellules thérapeutiques ou la molécule qui déclenche l'hyperglycémie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer une thérapie cellulaire contre contre le diabète, une maladie métabolique pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitement permettant une guérison des patients. Le développement d’une thérapie pour cette maladie est important car elle est de plus en plus fréquente, en particulier chez les enfants, et affecte très négativement la qualité de vie des individus atteints. Il a été montré que certaines cellules fonctionnaient de manière anormale dans cette maladie. Il est donc possible que l’injection de cellules compensant pour ces défauts puissent guérir cette maladie. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris développant cette maladie pour mieux caractériser les mécanismes impliqués dans cette maladie, et pour développer une thérapie cellulaire. Les résultats obtenus doivent permettent de développer une thérapie cellulaire pour cette maladie chez l’humain.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est le développement d'une thérapie cellulaire pour la maladie métabolique d'intérêt.
Procédures
Identification d'un animal : 1 fois ~10 secondes et 1 fois ~5 secondes. Prélèvement sanguin : 4 fois ~15 secondes. Anesthésie (lors de la mise à mort): 1 fois ~15 minutes. Injections de deux types: répétées (7 fois) ~10 secondes/injection ou 1 fois ~45 secondes. Ces interventions se font sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Injection intra-péritonéale = douleur légère, de courte durée et localisée. Injection intra-veineuse = douleur légère, de courte durée et localisée. Contention dans un tube adapté à la taille de la souris pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Prélèvement sanguin = douleur légère, de courte durée et localisée. Biopsie caudale = douleur modérée, de courte durée et localisée. Identification = douleur légère, de courte durée et localisée. Nuisance liée au modèle : développement du diabète immuno-dépendant: hyperglycémie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour collecte des tissus d'intérêt.
Remplacement
Pour étudier la physiopathologie du de la maladie métabolique d'intérêt, seuls les modèles souris sont capables de refléter la complexité de la maladie et notamment les interactions entre les cellules circulant dans le sang et l'organe métabolique cible. Une veille bibliographique sera mise en place pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques. Les molécules qui seront utilisées pour produire les cellules thérapeutiques ont été soumises à de nombreux tests pour sélectionner les plus prometteuses. Le protocole de production de ces cellules thérapeutiques a été optimisé.
Réduction
Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Des approches sophistiquées d’analyse ont été établies pour réduire le nombre d’animaux à utiliser pour obtenir un maximum d’information. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Le protocole d'induction de la maladie métabolique été raffiné et permet de ne pas utiliser d'immunisation mais seulement une injection de molécule synthétique afin de réduire la souffrance des souris. Dans ce projet, ce protocole sera raffiné davantage pour minimiser la dose de molécule synthétique à injecter. L’induction simultanée de la maladie chez les animaux permet un suivi plus précis des animaux en cours de procédure et permet une détection précoce pour éviter toute souffrance. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés par groupe de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés dans leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés tous les jours par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal, et les expérimentateurs.
Choix des espèces
La souris est le plus petit mammifère permettant d’étudier le développement de la maladie métabolique d’intérêt. C’est également l’espèce dont la connaissance génétique approfondie permet les modifications nécessaires à la création d’un modèle présentant des caractéristiques biologiques proches de celles de l’humain. Ce modèle expérimental permet de tester une approche thérapeutique pouvant être rapidement appliquée chez l’Homme. Par ailleurs, la large gamme d’outils disponibles pour analyser précisément les réponses observées fait de la souris l’espèce la plus appropriée pour ces recherches. Les animaux sont utilisés à partir de l’âge de dix jours pour réaliser les gestes d’identification ainsi que les prélèvements nécessaires à certaines analyses. À partir de quatre semaines, un prélèvement sanguin est effectué afin de confirmer les caractéristiques génétiques des individus. Cet âge est choisi pour garantir que les animaux aient une taille suffisante et que ces manipulations puissent être réalisées sans compromettre leur bien-être. Entre sept et quatorze semaines, les souris peuvent recevoir un traitement destiné à induire la maladie étudiée, période correspondant à une phase de maturité adaptée à l’analyse des mécanismes impliqués. Les animaux présentant déjà des signes de la maladie seront mis à mort.
Effet du fructose sur le microbiote intestinal et comportement : comparaison des fonds génétiques des souris C57BL/6
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Neuf tests comportementaux répartis sur deux semaines, deux gavages de glucose, une injection d'insuline, dix-neuf prélèvements de sang et un jeûne pouvant aller jusqu'à seize heures sont infligés à 96 souris génétiquement modifiées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, pancréas, foie, intestin et contenu du cæcum. L'étude cherche à établir si le fond génétique modifie la réponse des souris au fructose, étape que le porteur présente comme préalable à une future étude sur les mécanismes d'action. Les neuf tests censés mesurer l'anxiété, l'humeur dépressive et la mémoire ne sont pas nommés.
Objectifs
La consommation de fructose a fortement augmenté au cours des dernières décennies, notamment par le biais des produits alimentaires ultratransformés et par les boissons sucrées. Plusieurs études ont montré l’impact négatif de cette surconsommation sur la santé (obésité, diabète de type 2, etc.), troubles de l’humeur (anxiété, dépression). On ne sait pas comment le fructose provoque ces effets néfastes. Dans l’intestin grêle, il est peu absorbé par rapport au glucose. Son excès provoque sa présence en quantités anormales dans le gros intestin et y altère la flore bactérienne. Ce phénomène est amplifié chez près de la moitié de la population qui présente des problèmes d’absorption intestinale du fructose, pathologie encore mal diagnostiquée. Des travaux préliminaires sur la souris montrent que les cellules immunitaires du cerveau sont activées par l’excès de fructose indiquant un état inflammatoire néfaste à long terme. De plus, des tests de comportement révèlent un état dépressif de ces animaux. Mais on ne sait pas si le fructose agit directement sur le cerveau ou/et si ses effets sont la conséquence d’un dysfonctionnement intestinal ou sanguin. Cette étude va nous permettre de déterminer si les différences génétiques ont un impact sur les effets du fructose chez la souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d’évaluer dans quelle mesure le fond génétique des souris et leurs conditions d’hébergement influencent leur réponse au fructose, tant sur le plan comportemental que physiologique. Ces données sont cruciales pour mettre en place une étude sur les mécanismes d’action du fructose.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à des tests de comportement durant 5 à 20 minutes pour permettre d’analyser des comportements émotionnels et de mémoire : 4 tests différents répartis sur 4 jours une semaine (jour de repos le mercredi) et 5 tests différents répartis sur 5 jours une autre semaine. Trois semaines sépareront les 2 semaines de tests. Au cours du protocole expérimental, les animaux vigiles seront soumis à 2 reprises à un test de tolérance au glucose et une fois à un test de résistance à l’insuline. Ils recevront au total 2 gavages de glucose et 1 injection d’insuline pour un suivi de la glycémie pendant 2 heures (glycémie mesurée à 7 et 5 temps différents par prélèvement d’une goutte de sang d’une durée inférieure à 10 secondes, soit un total de 19 prélèvements). Les gavages et injections ne durent qu’une dizaine de secondes, maximum 20 secondes. Les animaux seront mis à jeun 16 heures maximum une fois, et 6h deux fois, une fois 4h, puis 2h en fin de protocole. Un prélèvement sanguin sera effectué une fois, d’une durée d’environ 20 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages et des prélèvements (moins de 20 secondes). Les animaux seront soumis à un stress durant les tests de comportement (10 minutes maximum). Les animaux seront soumis à une légère douleur lors des prélèvements sanguins. Les souris seront soumises à des périodes de jeûne (16 heures, 6 heures et 4 heures) ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever et analyser certains tissus (cerveau, pancréas, foie, intestin et contenu de caecum).
Remplacement
L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives ne peut être faite que sur des animaux vivants, tout comme l’étude des effets physiologiques d’un changement de consommation alimentaire. Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant les remplacer. Enfin, les analyses tissulaires doivent être réalisées sur des organes entiers qui tiennent compte de l’anatomie réelle qui existe chez les individus, en particulier le cerveau constitué d’un réseau de voies nerveuses encore impossible à reproduire.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. D’après de précédentes études, 12 animaux par groupe expérimental semblent nécessaires pour obtenir des résultats rigoureux suite aux tests comportementaux.
Raffinement
Pour réduire au maximum le stress des animaux, une semaine avant le début du protocole, ils seront habitués à être pris de leur cage au moyen d’un tunnel en plastique et à être manipulés pour les gestes de contention. Un suivi visuel quotidien des animaux sera opéré et leur poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués pour limiter au mieux la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le modèle utilisé est la souris, qui est un mammifère comme l’Homme. Les tests de glycémie et de comportement sont bien connus chez ces rongeurs et nous pourrons comparer nos résultats à ceux d’études antérieures. Elles seront étudiées à l’âge adulte (10 semaines) pour reproduire la malabsorption intestinale du fructose observée chez l’Homme lorsque la flore intestinale est mature et évaluer leur santé mentale. Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés qui seront nécessaires pour la poursuite de notre projet, où le transporteur au fructose sera invalidé spécifiquement dans le cerveau ou l’intestin afin de déterminer si l’effet du fructose est du à son action directe au niveau du cerveau ou à sa malabsorption au niveau intestinal.
Etude de la réversibilité de la réponse induite par des perturbateurs endocriniens à l’aide de poissons zèbres génétiquement modifiés_MODIFICATION
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Les poissons zèbres utilisés portent une modification génétique qui rend fluorescent un gène du métabolisme intestinal, ce qui permet de lire à l'œil ce qu'une substance fait dans leur intestin. 700 d'entre eux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés à des perturbateurs endocriniens entre 72 et 120 heures après la fécondation, ils passent ensuite cinq séances d'imagerie sans anesthésie jusqu'à l'âge de trois mois, chacune d'une dizaine de secondes. Ils sont tués pour prélever leurs intestins et mesurer l'expression du gène, et le porteur présente la lignée transgénique comme un moyen de réduire le nombre de poissons employés dans les tests réglementaires.
Objectifs
Dans le cadre de l’étude des perturbateurs endocriniens en lien avec les pathologies métaboliques telles que l’obésité, le diabète ou la stéatose, nous développons une lignée transgénique de poisson zèbre apte à rendre compte d’effets de substances au niveau du métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme. La quantification de la fluorescence dans cette lignée transgénique permet de suivre l'expression de notre gène d'intérêt et est réalisée après exposition d’embryons issus de cette lignée à des substances pendant 48h, de 72 heures post-fécondation (hpf) à 120hpf. Afin d’étudier la réversibilité de la réponse de ce modèle nous souhaitons poursuivre les mesures de fluorescence au microscope au-delà de 120hpf, jusqu’à 3 mois. Les animaux ne seront donc pas exposés aux substances passé 120hpf. L’utilisation de la lignée transgénique apportera des informations complémentaires sur les mécanismes d’action des substances sans augmenter le nombre de poissons nécessaires à la réalisation des essais pour l’identification des perturbateurs endocriniens. A terme, le modèle que nous développons permettra d’évaluer l’impact de perturbateurs endocriniens en ayant recours à des embryons âgés de moins de 120hpf et les données générées au cours de ce projet permettront le développement/l’amélioration de voies de toxicité impactant le métabolisme qui pourront être utilisées pour une meilleure évaluation des dangers et des risques des perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire.
Bénéfices attendus
L’étude la réversibilité de la réponse après exposition des embryons de poissons zèbres aux substances de 72hpf à 120hpf permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes régulant cette réponse. Nous pourrons ainsi analyser si l’expression de la fluorescence, induite ou inhibée à la suite de l’exposition aux substances, persiste ou au contraire revient à la normale alors que les poissons n’y sont plus exposés. Ainsi, la fluorescence étant relative à l’expression de notre gène d'intérêt, acteur clé du métabolisme intestinal chez le poisson zèbre, cette expérimentation permettra d’étudier les effets au long terme (jusqu’à 3 mois) sur ce métabolisme à la suite d’une exposition courte (48h) aux substances inductrices ou inhibitrices de de ce gène. Dans le cadre du développement d’un modèle de poisson zèbre apte à rendre compte des impacts des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme, l’étude de la réversibilité de la réponse aux substances a toute son importance. Ces données participeront à la caractérisation du modèle et de fait à l’élaboration d’un outil d’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme chez l’Homme, au cœur des objectifs du projet européen dans lequel s’inscrivent ces travaux.
Procédures
Les poissons zèbres seront soumis à des prises d'image en microscopie à fluorescence. Les animaux (5, 7, 10, 15 et 20 jours post fécondation) ne seront pas anesthésiés mais resteront dans de l'eau tout le temps de l'imagerie qui ne durera que 10 secondes environ. Chaque animal sera soumis à 5 imageries au cours de l'expérimentation.
Impact sur les animaux
L’exposition aux substances réalisée en début d’expérimentation (de 72hpf à 120hpf) aura un effet sur l'expression de notre gène d'intérêt (et probablement d'autres qui ne seront pas mesurés) sur le court terme et peut être le long-terme mais aucun effet toxique ou développemental n'est attendu aux concentrations sélectionnées. Les manipulations répétées tout au long de l’expérimentation (la prise d'image au microscope à fluorescence) pourraient entrainer un stress chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les intestins pour réaliser des mesures d'expression du gène d'intérêt à l'aide de techniques de biologie moléculaire.
Remplacement
L’étude de la réversibilité de la réponse dans le modèle poisson zèbre que nous développons ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. En effet, cette expérimentation est essentielle à la caractérisation de ce modèle biologique, permettant de renseigner de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme à l’échelle de l’organisme entier, une problématique encore peu investiguée. Les modèles cellulaires ne permettent pas cette approche. Quant aux modèles mathématiques, s’agissant d’une problématique émergente, la modélisation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme est encore balbutiante. A terme, l’expérimentation menée ici permettra d’établir un modèle de poisson zèbre pertinent pour l’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme.
Réduction
L'utilisation d'animaux transgéniques pour le suivi des effets dans le temps des substances permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en réutilisant les mêmes individus à chaque temps d'étude. Les effectifs ont été calculé en tenant compte de la variabilité de l'expression de notre gène d'intérêt et de la mortalité normale au cours du développement afin de pouvoir mettre en évidence des effets des substances de plus de 50% (test statistique).
Raffinement
Les animaux sont conservés dans un environnement controlé connus pour engendrer un minimum de stress (aquariums teintés en bleu si possible avec un fond en décors graviers, paramètres physico-chimiques de l'eau et photopériode contrôlés). Ils sont hébergés en groupe afin de respecter leur comportement grégaire et limiter l’anxiété que pourrait entrainer l’isolement, en gardant des populations faibles afin d’éviter les comportements agressifs. Les poissons sont également nourris en partie avec des artémies vivantes, leur permettant ainsi d’enrichir l’éventail de leurs comportements sociaux, notamment celui de la chasse. Tout au long des expérimentations, les animaux seront suivi avec une grille de bien-être adaptée à chaque stade de développement. L'ensemble de ces procédures est réalisé par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est une des espèces recommandées pour la réalisation de tests réglementaires sur les perturbations endocriniennes. Sa petite taille permet des expositions dans de faibles volumes d’eau d’où une faible consommation de substances toxiques et une quantité de déchets générés moindre. Ces dernières années un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées et se sont avérées être des outils pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens tout en réduisant le nombre d'animaux.
Surdités génétiques et sensibilité au bruit – caractérisation et traitement
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
1 350 souris sont exposées à un traumatisme sonore pouvant durer deux heures, et 1 080 subissent une injection dans la cochlée, opérées pour certaines dès l'âge de deux jours. 2 700 souris sont utilisées au total, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec cinq tests auditifs de quarante minutes sous anesthésie puis une mesure terminale des potentiels de l'oreille interne. Le porteur qualifie la perte auditive provoquée de dommage permanent "sans impact autre sur la santé de l'animal", et affirme que l'exposition sonore ne provoque ni douleur aiguë immédiate ni détresse comportementale manifeste. Les anciens reproducteurs, génétiquement modifiés et donc jugés non adoptables, sont tués au bout de six mois et remplacés.
Objectifs
Selon l’OMS, d’ici 2030, les atteintes de l’audition constitueront la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien soit plus de 500 millions de personnes. Dans plus de 80% des cas la surdité est liée à une atteinte de l’organe neurosensoriel de l'oreille (on parle de surdité neurosensorielle). Parmi les surdités neurosensorielles, on distingue les surdités d’origine héréditaire (on parle de surdité génétiques) et d’origine environnementale. La première cause environnementale des troubles de l’audition est la surexposition au bruit. De ce fait, un encadrement législatif de protection des travailleurs dans le milieu professionnel existe dans de nombreux pays. Mais selon l’OMS plus d’un milliard de jeunes sont confrontés au risque d’une perte auditive permanente en raison d’une exposition prolongée à des sons de forte intensité lors de loisirs tels que l’écoute de musique et les jeux vidéo. Il peut également y avoir un effet combiné : si la surdité génétique peut entraîner une perte d’audition dès la naissance (on parle de surdité congénitale), elle peut également entrainer une diminution des capacités au cours de la vie (on parle de surdité acquise) notamment par une sensibilité accrue au bruit. En d’autres termes pour un environnement acoustique donné, une personne présentant système auditif déjà fragilisé par une mutation génétique sera plus susceptible de développer une perte auditive qu’une personne n’en présentant pas. L’objectif de la présente étude est premièrement d’identifier quelles surdités génétiques entrainent une sensibilité accrue au bruit et deuxièmement de déterminer si un traitement symptomatique médicamenteux ou curatif par thérapie génique (nécessitant une chirurgie de l’oreille interne) de la surdité héréditaire permettrait de diminuer l’incidence ou la gravité de la surdité acquise qui s’y adjoint.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’identifier les surdités génétiques entrainant une sensibilité accrue au bruit et d’en documenter les processus physiopathologiques et, si les résultats sont probants, contribuera à plus long terme à une meilleure prise en charge des patients et une meilleure sensibilisation du grand public à l’adoption de bonnes pratiques d’écoute.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests auditifs (40 minutes en comptant l’anesthésie) et ce 5 fois (reparti entre 1 mois et 2 mois d’âge). En fin de procédure, les animaux seront soumis à des mesures de potentiels endocochléaires qui nécessitent que l’animal soit vivant mais profondément sédaté et qui est une procédure terminale, sans réveil donc et qui dure 20 min. Parmi ces 2700 animaux, 1350 seront soumis à un traumatisme sonore (2h au maximum) Parmi ces 2700 animaux, 1080 animaux seront soumis à une procédure chirurgicale :injection dans la cochlée qui dure environ 10 à 15 minutes
Impact sur les animaux
Le dommage principal et permanent attendu pour cette étude est la perte/diminution des capacité auditive pour les animaux que l’on induit par une exposition sonore sans impact autre sur la santé de l’animal. Les autres dommages attendus pour cette étude sont une peur et un stress physique transitoire lors des traumatismes sonores et une douleur – modérée, contrôlée par des analgésiques - consécutive à la chirurgie de l’oreille interne.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Animaux pour élevage : Les anciens reproducteurs sont des animaux transgéniques ne pouvant être adoptés, ils seront mis à mort au bout de 6 mois et renouvelés Animaux utilisés pour les expériences : Les animaux seront mis à mort pour réaliser nos analyses sur prélèvements.
Remplacement
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central des rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). De plus, il n’est pas possible de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux, et aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.
Réduction
Les tailles des groupes de souris indiquées ont été calibrées pour répondre aux questions posées. Les groupes sont constitués afin de détecter un certain niveau de différences entre groupes. Les groupes seront constitués de 6 animaux et les expériences répétées 2 fois. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet.
Raffinement
Pour la chirurgie : • emploi d’analgésiques et application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. • les souris nouveau-nées anesthésiées seront gardées sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans leur cage initiale. • surveillance pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans notre grille d’évaluation de référence. Surveillance et si nous observions l’atteinte d’un point limite, l’animal serait immédiatement mis à mort. Pour les mesures auditives : • Les mesures auditives sont réalisées sur des souris anesthésiées, application d’un gel ophtalmique. A la fin des enregistrements, les souris seront placées dans des cages sur un tapis chauffant, et surveillées jusqu’à leur réveil complet. Un gel nutritif et hydratant sera disposé dans les cages d’hébergement. • Surveillance et si nous observions l’atteinte d’un point limite, l’animal serait immédiatement mis à mort. Pour l’exposition sonore : La procédure ne provoque ni douleur aiguë immédiate ni détresse comportementale manifeste . • Avant l'exposition au bruit, les souris sont placées dans la cage d'exposition pendant 15 minutes par jour pendant une semaine afin de s'y habituer et d'éviter un stress chez les animaux. • Pendant le traumatisme sonore, les animaux seront surveillés pour s’assurer que les animaux ne présentent aucun signe de douleur aiguë immédiate ni détresse comportementale manifeste. • Surveillance et si nous observions l’atteinte d’un point limite, l’animal serait immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec des souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris en post natal. : Pendant les 8 premiers jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. Les chirurgies de l’oreille interne seront réalisées sur des nouveaux nés, 2 jours après la naissance. Les traumatismes sonores et les tests auditifs seront réalisés à l’âge adulte.