Système endocrinien
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Effet d’une bithérapie versus une monothérapie pour traiter l’insuffisance rénale induite par le diabète chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré pour tester une bithérapie contre l'insuffisance rénale du diabète. Rendues diabétiques, elles sont gavées et injectées chaque jour pendant six semaines, avec une biopsie de la queue et des recueils d'urine, le modèle pouvant atteindre cœur, reins et rétine. Toutes sont mises à mort à la fin ou dès l'apparition de signes cliniques. Le bénéfice annoncé, un effet supérieur de deux médicaments combinés, reste au conditionnel face à des atteintes quotidiennes et certaines.
Objectifs
Le diabète est la première cause d'isuffisance rénale terminale dans le monde. En France, un tiers des patients en insuffisance rénale terminale sont diabétiques. Les nouvelles molécules thérapeutiques, ont des effets bénéfiques sur le rein démontrés mais le risque résiduel de progression vers l'insuffisance rénale terminale chez les patients diabétiques traités avec ces molécules reste important. Il est donc nécessaire de continuer à développer des thérapies pour limiter la progression de la maladie des reins chez les patients diabétique et empêcher le développement de l'insuffisance rénale terminale. Ce projet vise à évaluer une combinaison de deux molécules afin d'identifier si elles peuvent avoir un effet bénéfique supérieur en les combinant.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait avoir un bénéfice direct au profit des patients diabétiques identifiant si une thérapie combinée de deux médicaments pourrait avoir un bénéfice supérieur à l'utilisation seule de l'un de ces médicament pour limiter la progression de la néphropathie diabétique.
Procédures
biopsie caudale (1 fois 20 secondes), gavage quotidien pendant 6 semaines (1minute) , injection quotidienne pendant 6 semaines (20 secondes), prélèvement d'urine (une fois toutes les deux semaines pendant 6 heures maximum), injection sous anesthésie gazeuse (1 fois 1 minute)
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, inconfort lié au gavage. Effets du modèle pathologique de diabète: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines)
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort.
Remplacement
La culture cellulaire ne peut pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. Il n'existe pas de modèle de remplacement à l'heure actuelle pour ces raisons. De plus, ici nous testons l'effet de médicaments sur l'atteinte de l'organe, ceci ne peut pas être réalisé sans animal.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental optimisé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Les effectifs ont été déterminés selon notre expertise du modèle, inluant 2 animaux de plus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental. Le schéma d'accouplement est optimisé pour permettre d'obtenir le meilleur rendement possible d'animaux d'intérêt.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux diabétique par cage est limité à 2 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, le modèle de diabète utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. Nous utilisons les souris du sevrage à l'âge adulte. Les reproducteurs pourront être utilisés jusqu'à 1 an de vie. Les souris d'intérêt sont gavés de 6 à 12 semaines de vie.
Mistime :conséquences métaboliques et cognitives d’une désynchronisation des rythmes métaboliques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Nourries huit semaines d'un régime gras et sucré à des horaires décalés, elles passent des tests métaboliques et cognitifs, avec un prélèvement de sang derrière l'œil sous anesthésie locale. Le projet veut montrer qu'un désalignement des rythmes jour-nuit dérègle le métabolisme et la mémoire. Cette "preuve de concept" reste annoncée au conditionnel, quand les prélèvements et le régime imposé sont, eux, bien réels.
Objectifs
Les mammifères présentent un rythme circadien de 24 heures, permettant de synchroniser les fonctions biologiques aux variations environnementales, notamment l’alternance jour/nuit. Cette synchronisation repose sur l’interaction entre l’horloge centrale et les horloges périphériques, et est principalement régulée par la lumière. La régulation du métabolisme est fortement dépendante de cette coordination pour maintenir l’homéostasie énergétique. Cependant, la pollution lumineuse et/ou des rythmes alimentaires irréguliers peuvent perturber cette synchronisation, induisant un désalignement entre horloges centrale et périphériques. La lumière artificielle nocturne inhibe la sécrétion de mélatonine, perturbant le rythme veille/sommeil et les horloges métaboliques (foie, muscles). Ces désynchronisations augmentent le risque de troubles métaboliques, surtout lorsqu’elles sont combinées à une prise alimentaire durant la phase de repos. L’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien (HHT), régulateur des hormones thyroïdiennes (HT), joue un rôle central dans le fonctionnement du cerveau, le métabolisme et les rythmes circadiens. Les HT influencent la neurogenèse, le métabolisme énergétique et interagissent avec les horloges biologiques. Leur production est essentielle pour maintenir la rythmicité des horloges métaboliques. Des dérèglements métaboliques peuvent entraîner une inflammation chronique favorisant la neuroinflammation. Celle-ci altère la plasticité neuronale, affecte les fonctions cognitives et augmente le risque de neurodégénérescence. La flexibilité métabolique apparaît comme un facteur clé de prévention des déséquilibres métaboliques. Elle dépend des horloges circadiennes, qui optimisent les processus métaboliques selon le cycle jour/nuit. La flexibilité métabolique pourrait être améliorée en synchronisant la prise alimentaire avec le rythme circadien naturel d’utilisation des nutriments. Ainsi, des approches comme le Time-Restricted Feeding (TRF), ou alimentation à horaires restreints, limitant la prise alimentaire à certaines plages horaires, ont montré des effets bénéfiques sur la régulation métabolique, bien que les mécanismes impliqués restent à élucider. Grâce au TRF, nous étudierons à l’aide d’une souche de souris sensible à l’obésité induite, les effets métaboliques, neuroinflammatoires et cognitifs d’une désynchronisation, ainsi que le potentiel de la resynchronisation alimentaire avec le cycle jour/nuit à restaurer l’équilibre métabolique et cognitif.
Bénéfices attendus
Notre projet pourrait apporter la preuve de concept des effets néfastes des perturbations circadiennes sur la régulation du métabolisme et de leurs conséquences sur la cognition. La désynchronisation devrait exacerber les perturbations métaboliques et promouvoir la prise de poids et une augmentation de la neuroinflammation, associée à une diminution de la neurogenèse, pouvant conduire à des altérations cognitives. Toutefois, ces effets devraient être réversibles grâce à la resynchronisation. Ces résultats devraient appuyer l’hypothèse selon laquelle les désalignements circadiens affectent à la fois le métabolisme et la santé cérébrale, augmentant les risques de vieillissement précoce et de neurodégénérescence.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu’à une seule procédure, qui sera constituée de 4 actes : - alimentation riche en gras et en sucre (45 % des calories apportées par la graisse et 17% des calories apportées par du sucrose) restreinte dans le temps (soit à volonté, soit durant le jour, soit durant la nuit) pendant 8 semaines - caractérisation métabolique : prise de poids hebdomadaire, test de tolérance au glucose avec mesure de la glycémie après gavage à partir d'une goutte de sang prise à la queue+prise de sang pour dosages hormonaux, mesure de composition corporelle par bioimpédance, mesure de la production de chaleur par caméra thermique - évaluation de capacités cognitives avec différents tests de comportements - prélèvement sanguin avant euthanasie
Impact sur les animaux
Les animaux ne devraient pas subir d’effets indésirables majeurs, le régime HFHS étant équivalent à une nourriture occidentale. On attend une prise de poids variable entre les individus, mais qui selon notre expérience ne devrait pas dépasser un gain de poids supérieur à 7% par rapport au poids initial.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de procéder aux prélèvements des différents tissus nécessaires à nos analyses.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer le recours aux animaux car les études physiologiques portant sur des influences métaboliques ne peuvent être réalisées que chez des animaux vivants, dans un système intégré. Par conséquent, l’impact du régime HFHS et de la synchronisation/désynchronisation de la prise alimentaire avec le cycle circadien de l’animal sur ses capacités cognitives ne sera observable qu’en réalisant des tests de mémoire sur animaux vivants. De même, nous ne pouvons pas mimer la flexibilité métabolique in vitro ou ex vivo, il est donc nécessaire d’utiliser l’animal entier.
Réduction
Dix animaux par groupe seront utilisés (6 pour les prélèvements de tissus et 4 pour les analyses immunohistochimiques), un nombre estimé à partir de nos expériences passées avec ce type d’analyses et qui est le minimum pour garantir une exploitation et une puissance statistique des résultats obtenus. Un nombre d'animaux plus faible serait dommageable dans l'exploitation de nos données et contribuerait à utiliser des animaux inutilement. Ainsi, nous évaluons le nombre d’animaux à 30 souris pour ce projet. Pour ne pas perdre en puissance statistique, l’analyse des résultats obtenus sera effectuée à l’aide d’un test non paramétrique avec permutation qui utilise une méthode de calcul exact avec une estimation par Monte Carlo
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (gel lidocaïne (gel ophtalmique à 2 %) pour anesthésie locale pendant la prise de sang en rétro-orbital). Les animaux disposent de nourriture selon le rythme décrit (mais leur permettant d’avoir l’apport calorique nécessaire sur 24h) et de l’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de nid en plastique. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de celles-ci grâce à une surveillance attentive (points limites, énoncés ci-après) et des soins adaptés. Même si nous n’attendons pas d’effets délétères marqués suite à notre procédure qui est légère, les indicateurs habituels comme la prostration, détectée par les animaliers ou par l’expérimentateur, l’absence d’alimentation (la diminution des quantités de nourriture disponible entre deux nourrissages est vérifiée par pesée), des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, grattement, léchage) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, agitation anormale ou hyperréactivité) seront particulièrement suivis. Dans le cas où un ou plusieurs des symptômes cités varient de manière significative, l’animal sera dans un premier temps sorti de la procédure, et/ou euthanasié dans les cas les plus extrêmes. Une bonne maîtrise de la procédure et un suivi assidu des groupes expérimentaux doit prémunir de la survenue d’incidents de ce type. Tout signe d'atteinte du système nerveux central (inclinaison de la tête, spasmes, convulsions, troubles de l'équilibre) entraînera systématiquement le retrait de l'animal de la procédure et son euthanasie.
Choix des espèces
Le modèle biologique choisi est la souris. Les connaissances accumulées par la communauté scientifique sur les souris, et particulièrement sur les C57Bl6/J dans les modèles d’obésité, ont permis d’identifier de nombreux mécanismes physiologiques impliqués dans le maintien de la balance énergétique et de valider des tests comportementaux permettant de mesurer les capacités mnésiques des souris. Tous les protocoles utilisés dans ce projet de recherche ont été optimisés et validés pour la souris, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. Nous utiliserons des animaux adultes (âgés de plus de 8 semaines au début de l’expérience), afin que les résultats ne soient pas faussés par la prise de poids induite par la croissance des animaux s’ils sont trop jeunes.
Evaluer l’impact d’une modulation alimentaire en vitamine D sur le microbiote intestinal et la santé métabolique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des points limites gradés déclenchent l'arrêt de la procédure, mais 72 souris vont d'abord être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Pendant douze semaines de régime, elles subissent des gavages, deux prises de sang à la queue, une injection intrapéritonéale, des jeûnes et des isolements répétés. Les tissus sont prélevés après la mise à mort pour étudier l'effet de la vitamine D sur le microbiote. Le porteur précise qu'aucune analgésie n'est prévue pour ce protocole.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’apporter des données permettant de mieux comprendre l’impact de la vitamine D sur la santé, et les conséquences d’une carence en vitamine D sur la santé métabolique et le microbiote. Afin de prendre en compte de possibles effets liés au sexe, des souris mâles et femelles seront nourris pendant 12 semaines avec un régime contrôle, déficient ou non en vitamine D, ou un régime riche en lipides et en sucres, déficient ou non en vitamine D. Les souris carencées seront étudiées et comparées aux souris non carencées pour le suivi de l'evolution pondérale, la prise alimentaire, et l’impact sur le microbiote. Au total, l'etude portera donc sur 8 groupes d'animaux. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9ème semaine et un test de tolérance au glucose à la 10ème semaine. Les fèces seront également récoltées et le microbiote des animaux sera analysé. Les animaux seront mis à mort après les 12 semaines de régime afin d'étudier l’inflammation, l’expression et l’activation de la voie de signalisation de l’insuline dans des organes à forte activité métabolique (foie, muscles, tissus adipeux), l’adiposité, l’expression génique du tissu adipeux, et l’empreinte épigénétique du tissu adipeux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’impact de l’interaction entre la vitamine D et le microbiote intestinal sur la santé métabolique ainsi que sur la composition du microbiote. Ce travail est essentiel pour mieux comprendre le rôle du statut en vitamine D dans la réponse à l’alimentation, notamment dans le contexte d’un régime riche en lipides. Il permettra d’ouvrir de nouvelles perspectives, en particulier en ce qui concerne les recommandations relatives à la supplémentation en vitamine D chez l’Homme.
Procédures
Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé la 6ème semaine. Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test oral de tolérance au glucose et un test de tolérance à l'insuline seront pratiqués respectivement en 9ème et 10ème semaine. Ces tests nécessitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage dans le cas du test de tolérance au glucose, et une injection lors du test de tolérance à l'insuline. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en hébergement individuel des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur valeur de glucose dans le sang. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. Ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution permettant d'évaluer la perméabilité intestinale. Durant le protocole, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.
Impact sur les animaux
Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors de tolérance au glucose et à l'insuline et du recueil de fèces. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors du gavage avec une dose de glucose, ou une dose de colorant visant à etudier la perméabilité intestinale, et lors des injections d'insuline. Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles. Lors des tests, les animaux seront soumis à des restrictions alimentaires afin de réaliser les tests sur animaux à jeun (4h ou 6h). De même, la vielle au soir de l'euthanasie, les animaux seront mis à jeun. Les souris subiront deux gavages durant le protocole, deux prises de sang à la veine caudale et une injection intrapéritonéale, qui pourraient engendrer des douleurs temporaires et reversibles. Contention des animaux à plusieurs reprises lors des tests.
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques, séquencage) et de démontrer les effets métaboliques de la modulation en vitamine D dans l’alimentation, à la fois sur le microbiote et sur la santé métabolique.
Remplacement
L’impact d’une modulation en vitamine D sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test de Student, notamment en ce qui concerne la prise de poids.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton ainsi que du coton de nidification. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.
Choix des espèces
Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 9 semaines à l’achat et d’environ 10 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à des animaux adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.
Impact de l’Obésité sur la Maturation Cardiaque et la Fonction Diastolique chez les souris juvéniles/ »adolescentes » EU1/2
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Mises sous régime gras dès le vingtième jour de vie, prélevées à la queue chaque semaine, soumises à des injections de glucose et d'insuline puis à une échocardiographie et à un cathétérisme cardiaque sous anesthésie, 965 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet cherche à comprendre comment l'obésité de l'adolescence perturbe la maturation du cœur et augmente le risque d'insuffisance cardiaque. Les retombées annoncées pour les patients, un diagnostic plus précoce et des pistes de prévention, restent renvoyées au conditionnel et au long terme. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leur cœur, et les mères sont tuées au sevrage parce qu'elles sont jugées trop âgées pour l'étude.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque est une maladie grave et fréquente. L’une de ses formes, l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (ICFEp), concerne aujourd’hui plus d’un patient sur deux et pourrait représenter jusqu’à 80 % des cas d’ici 2035. Cette pathologie touche principalement les femmes âgées et se caractérise par une altération de la relaxation du cœur, sans modification de sa capacité de contraction. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif ou préventif efficace, en grande partie en raison d’une compréhension encore limitée des mécanismes biologiques impliqués. L’obésité constitue un facteur de risque majeur de l’ICFEp, près de 80 % des patients étant en surpoids ou obèses. Or, la prévalence de l’obésité augmente fortement chez les enfants et les adolescents. Pourtant, l’impact d’une obésité précoce sur le développement du cœur et sur le risque ultérieur d’insuffisance cardiaque demeure peu étudié. Nos travaux récents ont mis en évidence, chez la souris, une phase de développement cardiaque jusque-là méconnue, survenant après le sevrage, entre le 20ème (P20) et le 60ème jour (P60) de vie. Cette période est marquée par l’apparition de structures spécifiques au sein des cellules musculaires cardiaques, essentielles à la maturation de la fonction de relaxation. Leur altération ou leur absence est associée à une dysfonction diastolique conduisant au développement d’une ICFEp. De manière originale, nous avons montré que ces structures sont régulées selon le moment de la journée, suggérant un lien étroit entre développement cardiaque et horloge biologique. Nous avons également identifié un dimorphisme sexuel de ce développement, influencé par les hormones féminines, pouvant contribuer à la plus forte prévalence de l’ICFEp chez les femmes. La période P20–P60 chez la souris correspondant à l’adolescence et au début de l’âge adulte chez l’Homme, ce projet vise à étudier comment l’obésité perturbe le développement cardiaque durant cette fenêtre critique et augmente le risque de dysfonction cardiaque précoce. L’objectif est d’identifier des marqueurs précoces ouvrant la voie à de nouvelles stratégies de prévention et de traitement.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact d’un régime obésogène sur la maturation du cœur au cours de la transition adolescence–jeune adulte permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la perturbation du développement normal de la fonction cardiaque en situation pathologique. Ces connaissances sont particulièrement pertinentes dans un contexte où les régimes alimentaires riches en graisses et en sucres, de type « fast-food », sont de plus en plus répandus chez les adolescents. Les résultats de ce projet contribueront à l’identification de mécanismes précoces associés à la dysfonction cardiaque (ICFEp), susceptibles d’améliorer le diagnostic précoce et d’orienter une prise en charge plus personnalisée, en tenant compte des différences liées au sexe ainsi que des variations biologiques dépendantes du moment de la journée. À plus long terme, ces travaux pourraient participer à l’élaboration de stratégies de prévention visant à réduire le risque de développer une ICFEp à l’âge adulte.
Procédures
Dans le 1er établissement utilisateur, la 1ère intervention sur l’animal au 20ème jour de naissance est une anesthésie sous anesthésie gazeuse pour l’échocardiographie cardiaque. Ensuite, entre le 20ème (P20) et le 40ème (P40) jour de naissance, il y a un prélèvement à la queue sur animal vigile une fois par semaine (moins de 15sec chaque prélèvement). A P40, 2 tests métaboliques (espacés chacun d’une semaine) sont réalisés chez la souris. Cela implique, 1 injection d’insuline (moins de 15 sec) ou 1 injection de glucose (moins de 15 sec) en injection intrapéritonéale à l'aide d'aiguille 30G et neuf prélèvements à la queue pour chaque test selon la cinétique suivante : 15 minutes avant l’injection puis au moment de l’injection puis 15 min après l’injection et ainsi de suite toutes les 15 minutes jusqu’à 120 minutes (un total de 9 prélèvements). Au 60ème jours de naissance, l'échocardiographie nécessite une anesthésie gazeuse et une chirurgie est réalisée impliquant une injection intrapéritonéale avec une aiguille de 30G d’analgésie et 1 une injection sous cutanée au niveau du cou d'anesthésique à l'aide d'une aiguille de 30G. Dans le second établissement, l’euthanasie des souris implique, de la même manière, une injection d’analgésie (moins de 15 sec) au niveau de la cage thoracique en sous cutanées à l'aide d'une aiguille de 30G.
Impact sur les animaux
Lors de la mise sous régime à P20 : modifications digestives (diarrhée, constipation), modification comportementale (légère léthargie). Lors des échocardiographies doppler ou pendant le cathétérisme ventriculaire : une mauvaise gestion de l'anesthésie pourrait entrainer soit la mort prématurée de la souris ou, au contraire, un réveil de cette dernière en cours de chirurgie. Par ailleurs, lors de la dissection de la carotide commune lors de la cathétérisation, il est possible de léser des vaisseaux adjacents entraînant une hémorrhagie légère et un risque d'inconfort. Les effets indésirables potentiels liés aux expérimentations métaboliques : stress de jeûne limité à 2h avant les tests in vivo pour normaliser la glycémie, inconfort et douleur liés à l'injection d'insuline ou glucose (une fois, durée max 15 sec), inconfort et douleur lors des prélèvements sanguins à l’extrémités de la queue et au niveau mandibulaire.
Devenir
À l’issue de chaque procédure expérimentale, les animaux sont tous euthanasiés. Lorsqu'il est nécessaire, un prélèvement du cœur est effectué à des fins d’analyses cellulaires et moléculaires sous anesthésie profonde et analgésie, puis une méthode secondaire réglementaire d'euthanasie est utilisée pour la mise à mort. Les petits arrivant à 15 jours de naissance, ils sont avec leur mère qui est euthanasiée dés le sévrage. En effet, ces femelles sont trop âgées pour entrer dans notre étude.
Remplacement
Ces investigations doivent être réalisées sur des modèles animaux vivants, car elles nécessitent l’étude du cœur en fonctionnement. En particulier, l’impact d’un régime obésogène initié à l’adolescence (20 jours après la naissance) sur la fonction diastolique à l’âge adulte (60 jours après la naissance) ne peut être évalué que dans un organisme vivant, compte tenu de la complexité des mécanismes de développement cardiaque impliqués. Les altérations structurelles et fonctionnelles associées à l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (ICFEp), ainsi que l’influence de facteurs environnementaux tels que l’alimentation ou l’alternance jour/nuit, ne peuvent être étudiées à l’aide de modèles alternatifs. Elles nécessitent à la fois des analyses fonctionnelles in vivo et, lorsque requis, un prélèvement cardiaque permettant un accès direct au tissu et à l’architecture des cellules contractiles cardiaques.
Réduction
L’équipe a développé une méthode de prélèvement cardiaque optimisée permettant de préserver au mieux l’architecture des cardiomyocytes, notre centre d’intérêt dans ce projet, et d’analyser un même échantillon par plusieurs techniques complémentaires. Cette approche optimise l’utilisation des animaux en permettant d’obtenir, à partir d’un seul animal, différents types de données structurales et fonctionnelles. Par ailleurs, l’utilisation de techniques d’imagerie fonctionnelle non invasives, telles que l’échocardiographie Doppler, permet de réaliser un suivi longitudinal de la fonction cardiaque, et ce avant le prélèvement terminal du tissu si nécessaire. Ainsi, un même animal peut être utilisé successivement pour des analyses fonctionnelles in vivo et pour des analyses tissulaires post-mortem. Ces stratégies expérimentales permettent de maximiser l’exploitation des données obtenues, de réduire le nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire et de garantir une analyse statistiquement robuste et une évaluation complète de l'architecture cardiaque et de sa fonction, tout en tenant compte des différents facteurs biologiques étudiés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes à la directive 2010/63/UE, dans le respect des cinq libertés fondamentales. Des enrichissements du milieu (papier, carton, tunnels) sont fournis afin de favoriser la construction de nids, l’expression des comportements naturels, l’activité physique et les interactions sociales. Un test des pièces d’hébergement des animaux est effectué tous les 3 mois pour garantir leur statut sanitaire SPF. Une grille de suivi (grille de scoring de notre projet), élaborée en collaboration avec les zootechniciens, permet une surveillance régulière de l’état de santé des animaux et une adaptation rapide des conditions expérimentales si nécessaire, afin de limiter au maximum toute douleur, souffrance ou détresse (analgésie et anesthésie ont été définies pour éliminer toutes douleurs).
Choix des espèces
La souris constitue un modèle particulièrement pertinent pour nos études en raison de sa forte similitude avec la physiologie humaine, notamment pour les processus cardiaques. En effet, notre équipe a mis en évidence l’impact du jour et de la nuit sur la fonction cardiaque chez l’Homme et la souris, justifiant l’utilisation de ce modèle pour étudier les mécanismes sous-jacents à cette fonction et ses altérations. Par ailleurs, la majorité des travaux portant sur l’impact du sexe sur le fonctionnement cardiaque et sur l’impact de l’obésité ont été réalisés chez la souris, fournissant un cadre méthodologique et conceptuel solide. Ce modèle nous permet donc de poursuivre des recherches en cohérence avec la littérature existante et de capitaliser sur des données validées. Enfin, les techniques employées dans ce projet ont été optimisées pour la souris, garantissant la fiabilité et la reproductibilité des résultats obtenus. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement selon les objectifs spécifiques de chaque expérience, afin d’évaluer les effets du régime obésogène sur le développement et la fonction cardiaque. Au 20ème jour après la naissance, le cœur est encore en pleine maturation. Des processus essentiels, tels que la formation et la structuration des cardiomyocytes sont alors actifs. Ce stade est crucial pour étudier l’impact de facteurs environnementaux précoces, notamment alimentaires, sur le développement du cœur. Comme montré par notre équipe, ce stade de développement est déterminant pour la fonction cardiaque adulte. Au 60ème jour après la naissance, correspondant au jeune adulte, le cœur a terminé son développement structural et fonctionnel. Ce stade permet d’évaluer les conséquences du régime obésogène instauré précocement sur la fonction cardiaque et sur l’architecture des cardiomyocytes à l’âge adulte.
Etude de la modulation des cellules de l’immunité dans le pancréas de souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
4102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir une biopsie de la queue, douze semaines de régime gras, jusqu'à dix injections, des jeûnes de six à seize heures, des gavages et cinq à dix prélèvements de sang à la queue. L'obésité provoquée entraîne prise de poids et baisse d'activité, et le pancréas ainsi que d'autres organes sont prélevés après mise à mort. Le projet cherche à comprendre le rôle des cellules immunitaires du pancréas dans le diabète de type 2, une piste thérapeutique annoncée comme lointaine.
Objectifs
Le pancréas régule la glycémie grâce à des cellules spécialisées qui produisent de l’insuline. Il contient aussi des cellules immunitaires qui participeraient à cet équilibre, mais dont le rôle reste encore mal connu. Ce projet cherche à comprendre comment ces cellules influencent le fonctionnement du pancréas, en particulier dans le cas de consommation excessives de graisses, pouvant conduire au développement d’une obésité et d’un diabète.
Bénéfices attendus
Étudier la fonction des cellules immunitaires du pancréas est essentiel pour mieux comprendre comment le pancréas régule le sucre dans le sang et réagit aux déséquilibres métaboliques, comme ceux causés par une alimentation riche en graisses. Ces cellules immunitaires, longtemps considérées comme de simples défenseurs contre les infections, jouent en réalité un rôle plus complexe dans le soutien des cellules productrices d’insuline et dans le maintien de la santé métabolique. En comprenant les mécanismes par lesquels ces cellules influencent le fonctionnement du pancréas, ce projet pourrait révéler de nouvelles pistes thérapeutiques pour prévenir ou traiter des maladies comme le diabète de type 2.
Procédures
1 biopsie de queue (10s), 1 régime riche en gras et en cholestérol (WD - 12 semaines), 1 régime riche en graisse (HFD - 12 semaines), 1 à maximum 10 injections (20s), 1 à 2 jeun (6h ou 16h), 1 à 2 gavages (1min), 5 à 10 prélèvements de sang à la queue (3s).
Impact sur les animaux
Injections : douleur légère due à la piqure. Obésité : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Coupure du bout de la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Biopsie de queue : douleur modérée. -Gavage : contention soutenue et introduction de la sonde.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de permettre le prélèvement du pancréas ainsi que d’autres organes d’intérêt. Ces prélèvements sont indispensables à la réalisation d’analyses visant à comprendre les mécanismes étudiés dans ce projet, notamment pour identifier les voies de régulation du métabolisme dans différentes conditions expérimentales et caractériser et localiser les différentes populations cellulaires.
Remplacement
Cette étude a pour but d'étudier le rôle des cellules immunitaires du pancréas en condition normale et de surcharge lipidique. Le pancréas répond à la prise et la perte de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux, réduit à son minimum, a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.
Raffinement
Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles pour les étudier. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours (souriceaux) et 22 semaines (adultes).
Rôle d’une voie de régulation cellulaire dans le contrôle de la croissance ovocytaire et de l’atrésie ovarienne chez la truite arc-en-ciel
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Capturées à l'épuisette, anesthésiées et injectées d'un composé pharmacologique, 36 truites arc-en-ciel femelles subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger. La moitié est tuée le lendemain de la première injection, l'autre reçoit une seconde injection au jour 4 puis est tuée au jour 7. Les ovaires sont prélevés pour comprendre pourquoi certains ovocytes cessent de croître, un mécanisme naturel appelé atrésie. Le projet vise la gestion des reproductrices en aquaculture, aucune méthode sans animal n'étant jugée capable de reproduire ce fonctionnement ovarien.
Objectifs
Chez les poissons, le développement des ovocytes représente un investissement énergétique majeur au cours de chaque cycle reproducteur. Tous les ovocytes engagés dans ce processus ne parviennent pas à maturité : selon l’état physiologique et nutritionnel de l’animal, certains poursuivent leur croissance jusqu’à la reproduction, tandis que d’autres sont arrêtés dans leur développement et éliminés par un processus naturel appelé atrésie, permettant à la femelle de réallouer l’énergie mobilisée. La phase de croissance secondaire des ovocytes correspond à une période clé de ce processus. Chez la truite arc-en-ciel adulte, cette phase débute au début de l’été et se caractérise par une croissance rapide des ovocytes, fortement dépendante de la disponibilité et de la mobilisation des nutriments vers les ovaires. Lorsque les conditions sont défavorables, certains ovocytes n’entrent pas en croissance et sont orientés vers l’atrésie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui régulent l’entrée des ovocytes en croissance secondaire et leur orientation éventuelle vers l’atrésie. Une attention particulière sera portée à l’autophagie, un mécanisme cellulaire normal de recyclage des composants cellulaires, impliqué dans l’adaptation des cellules aux variations de disponibilité énergétique. Pour étudier ces mécanismes, un composé pharmacologique connu pour moduler ces voies de régulation cellulaire sera administré par injection à des femelles adultes de truite arc-en-ciel, selon un protocole d’exposition aiguë à deux doses. Les effets du traitement seront évalués au niveau des ovaires par des analyses histologiques, biochimiques et moléculaires, afin de caractériser les processus cellulaires associés à l’arrêt de la croissance ovocytaire et à l’atrésie. Ce projet vise à améliorer la compréhension du contrôle de la reproduction chez la truite arc-en-ciel, dans un contexte pertinent pour la gestion des reproducteurs en aquaculture.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans l’arrêt du développement des ovocytes chez les poissons, en particulier les processus conduisant à l’atrésie ovarienne et au recyclage cellulaire par autophagie. Ces phénomènes sont des mécanismes naturels qui permettent aux femelles d’adapter leur investissement reproducteur en fonction de leur état physiologique et des conditions environnementales. Les connaissances acquises dans ce cadre pourront contribuer à l’identification de marqueurs biologiques permettant de mieux évaluer l’état reproducteur des femelles en aquaculture. À terme, ces marqueurs pourraient être utilisés pour mieux caractériser la performance reproductive des reproducteurs, optimiser la gestion des stocks de femelles et améliorer les pratiques d’élevage. Ces résultats pourront également présenter un intérêt plus large pour l’évaluation de la fécondité des femelles dans le cadre du suivi des populations de poissons, ainsi que pour des programmes de surveillance de la qualité des milieux aquatiques, en utilisant les poissons comme espèces sentinelles. De manière générale, ce projet vise à produire des connaissances fondamentales utiles à la gestion durable des ressources aquatiques et à l’amélioration des systèmes aquacoles.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection réalisée sous anesthésie générale, ainsi qu’à une euthanasie en vue de prélèvements d’organes. Les poissons seront anesthésiés avant la réalisation de l’injection. L’intervention dure quelques minutes par individu (temps de capture, anesthésie, injection et remise en bassin). La moitié des animaux sera échantillonnée un jour après la première injection. Les animaux restants recevront une seconde injection au jour 4, puis seront échantillonnés au jour 7. Les poissons seront alors anesthésiés puis mis à mort afin de permettre le prélèvement des ovaires pour les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour les animaux sont limitées et ponctuelles. Elles sont principalement liées aux manipulations nécessaires à l’administration des traitements et aux prélèvements biologiques. Les injections seront réalisées sous anesthésie afin de limiter le stress et la douleur. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon les protocoles réglementaires en vigueur. Les doses du composé utilisé dans ce projet sont du même ordre de grandeur que celles déjà testées chez la truite arc-en-ciel juvénile, sans mise en évidence d’effets indésirables marqués, ni de mortalité. Aucun effet aigu majeur sur le comportement ou l’état général des poissons n’est attendu dans le cadre de cette exposition de courte durée (7 jours).
Devenir
La mise à mort de l’ensemble des animaux est justifiée par la nécessité de réaliser des prélèvements d’organes internes, en particulier des ovaires, indispensables à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Les analyses prévues (histologiques, biochimiques et moléculaires) ne peuvent pas être réalisées sur des animaux maintenus en vie, ni par des méthodes non létales. La réutilisation, le maintien en vie ou le replacement des animaux ne sont donc pas envisageables à l’issue des procédures expérimentales.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes biologiques impliqués dans le contrôle du développement des ovocytes et leur orientation vers l’atrésie chez la truite arc-en-ciel adulte. Ces mécanismes reposent sur des interactions complexes entre l’état physiologique de l’animal, le métabolisme énergétique et le fonctionnement de l’ovaire dans son environnement hormonal et nutritionnel naturel.À ce jour, ces processus ne peuvent pas être reproduits de manière pertinente par des approches alternatives telles que des modèles in vitro (cultures cellulaires ou tissulaires) ou in silico. En particulier, l’étude de la croissance ovocytaire, de l’atrésie et des mécanismes d’autophagie nécessite un organisme entier, dans lequel les régulations endocriniennes et métaboliques sont intactes.Le recours à des animaux vivants est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet et obtenir des données biologiquement pertinentes.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été défini de manière à être strictement limité au minimum nécessaire, tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Au total, 36 femelles adultes de truite arc-en-ciel seront incluses dans l’étude, réparties en trois groupes expérimentaux correspondant aux différents traitements. La définition de ce design expérimental et des effectifs par groupe repose sur des analyses de puissance statistique réalisées à partir de données préexistantes issues d’expérimentations antérieures menées sur la truite arc-en-ciel, ainsi que sur la variabilité biologique observée pour les paramètres reproducteurs et métaboliques étudiés. Ces analyses ont permis de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour détecter des effets biologiquement pertinents, tout en évitant l’utilisation excessive de poissons. Par ailleurs, la durée limitée de l’expérimentation (7 jours) et le nombre restreint de groupes expérimentaux contribuent à réduire le nombre total d’animaux utilisés. De plus, chaque individu fournira un maximum d’informations grâce à la réalisation de plusieurs analyses complémentaires (histologiques, biochimiques et moléculaires) à partir d’un même prélèvement ovarien. L’ensemble du protocole a ainsi été conçu pour optimiser l’utilisation des animaux, réduire leur nombre et respecter les principes de réduction, sans compromettre la qualité et l’interprétation des résultats scientifiques.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des conditions d’élevage classiques, optimisées et adaptées aux besoins physiologiques de la truite arc-en-ciel. Les bassins utilisés seront de taille et de type adaptés à la taille des poissons ; il s’agira de bassins extérieurs équipés de couvercles et de demi-couvercles occultants, garantissant la protection contre les nuisibles (notamment les oiseaux) et limitant les perturbations liées à l’activité de la pisciculture. Les densités d’élevage seront maintenues à un niveau optimal. Les poissons seront nourris manuellement deux fois par jour, à satiété visuelle. Le bien-être animal sera évalué quotidiennement à l’aide d’une fiche de scoring quantitative basée sur des points limites. Lors des phases d’échantillonnage, les poissons seront capturés avec une épuisette adaptée à la taille des poissons, puis anesthésiés et euthanasiés avant la réalisation des prélèvements tissulaires.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel a été choisie pour ce projet car elle est la principale espèce piscicole produite en France et constitue un modèle largement utilisé pour l’étude des mécanismes métaboliques et reproducteurs chez les poissons d’élevage. Le développement des ovocytes et le cycle reproducteur des femelles élevées sur le site expérimental sont bien connus et suivis. Cela permet d’identifier précisément la période d’entrée en croissance secondaire des ovocytes et de réaliser l’expérimentation au moment le plus pertinent, tout en limitant la variabilité biologique. Cette espèce présente un développement ovocytaire synchronisé avec une seule période de ponte annuelle, ce qui facilite l’étude des mécanismes contrôlant la croissance des ovocytes et leur orientation éventuelle vers l’atrésie. L’expérimentation sera réalisée sur des femelles âgées de 2 ans, d’un poids compris entre 600 et 800 g, au mois de juin, période correspondant à l’entrée des ovaires en phase de croissance secondaire des ovocytes. Ce stade de développement est particulièrement pertinent pour les objectifs du projet, car il correspond à une phase clé de la reproduction, caractérisée par une forte mobilisation des nutriments vers les ovaires et par la mise en place des mécanismes biologiques régulant la poursuite ou l’arrêt du développement ovocytaire.
Impact du microbiote intestinal sur le comportement social chez la souris : identification des mécanismes impliqués
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Livrées à trois semaines, les souris reçoivent une greffe de microbiote fécal par gavage jusqu'à quatre fois par jour, des injections d'anticorps, six prélèvements de sang à la queue et, pour une partie, une section chirurgicale du nerf vague reliant l'intestin au cerveau. 1 734 souris vont ainsi être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le projet cherche à savoir si le microbiote intestinal influence les interactions sociales et l'autisme, en transférant à des souris saines la flore de donneurs au comportement social altéré. Le porteur évoque des tests évaluant le "phénotype social", dont un maintien de 72 heures, sans préciser lesquels, et conclut que la souris est un "modèle de choix" faute d'alternative reproduisant la complexité de l'axe intestin-cerveau.
Objectifs
De nombreuses études récentes montrent que les micro-organismes vivant dans l’intestin, appelés microbiote intestinal, peuvent influencer le comportement via une communication entre l’intestin et le cerveau. Chez la souris, il a été démontré que le transfert de microbiote intestinal d’un animal à un autre, appelé transfert de matière fécale (FMT), permet non seulement de transmettre les bactéries intestinales du donneur, mais aussi certains traits comportementaux. Par exemple, des souris recevant le microbiote de donneurs présentant des troubles des interactions sociales développent à leur tour des difficultés à interagir avec leurs congénères. Des résultats similaires ont été observés lorsque le microbiote provient de patients atteints de troubles du spectre de l’autisme. D’autres travaux ont montré que l’exposition prolongée à une substance produite par certaines bactéries intestinales, le p-crésol, peut modifier la composition du microbiote et entraîner des altérations du comportement social chez la souris. Le microbiote de ces souris suffit ensuite à transmettre ces troubles comportementaux à des souris saines. Ces observations suggèrent que le microbiote intestinal joue un rôle important dans le comportement social. Toutefois, les mécanismes précis reliant l’intestin au cerveau restent mal compris. Plusieurs voies de communication sont envisagées, notamment le système immunitaire, certaines substances produites par les bactéries, ou encore une voie nerveuse directe reliant l’intestin au cerveau, appelée nerf vague. Les objectifs de ce projet sont : 1. Disséquer le rôle de ces voies de communications dans les effets du microbiote sur les comportements sociaux 2. Identifier les cibles thérapeutiques potentielles pour les troubles des interactions sociales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal influence les interactions sociales et les comportements associés à l’autisme. Les résultats attendus offriront de nouveaux éclairages sur l’axe microbiote-intestin-cerveau, en identifiant des cibles pouvant moduler les symptômes comportementaux. À terme, cette recherche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’autisme ou les troubles du comportement.
Procédures
•Anesthésie à l’isoflurane pour identification: durée 10 min ; fréquence 1 fois dans la vie de l'animal • Injection d’anticorps (250 μL) : durée 10s ; fréquence deux fois dans la vie de l’animal. •Test de comportements évaluant le phénotype social: durée 10min et 72h en fonction des tests ; 3 tests de 10 min + 1 test de 72h/animal, le tout une fois dans la vie de l’animal• Prélèvement de sang de 20μL après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence 6 fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois par jour pendant 4 jours à 4 fois par jour pendant 1 jour en fonction de la procédure. •Vagotomie sous anesthésie générale: durée 1h ; fréquence une fois dans la vie de l’animal.
Impact sur les animaux
Transfert de microbiote fécal (FMT) par gavage oral : Cette procédure peut engendrer un stress lié à la contention et au passage de la sonde, parfois une légère irritation buccale ou œsophagienne. Le gavage répété peut générer une perte de poids ou des troubles digestifs, selon la composition du microbiote transplanté. Transfert de microbiote fécal (FMT) par gavage oral (durée 5 sec): Cette procédure peut engendrer un stress lié à la contention et au passage de la sonde, parfois une légère irritation buccale ou œsophagienne. Le gavage répété peut générer une perte de poids ou des troubles digestifs, selon la composition du microbiote transplanté. Administration d’anticorps (durée 10 sec): Elle expose à un inconfort transitoire lors de l’injection, parfois à une douleur légère ou à un risque d’irritation locale ; des réactions inflammatoires ou allergiques sont rares. Prélèvements de sang dans la veine de la queue (durée 10 min): Risques mineurs tels que douleur à la ponction, formation d’hématome ou saignement local. Le prélèvement peut engendrer un stress lié à la contention. L’identification par puce RFID (durée 10 sec) sous anesthésie générale peut provoquer une légère hypothermie. Analyse comportementale (3 tests de 10 min + 1 test de 72h/ animal): Peut engendrer un stress transitoire lié à l’isolement ou aux manipulations, généralement modéré et temporaire. Les souris génétiquement altérées peuvent présenter une susceptibilité accrue aux infections opportunistes, associée à un risque augmenté de morbidité en cas de contamination. La vagotomie bilatérale sous anesthésie générale peut provoquer douleur et inconfort post-opératoires.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement d’organes nécessaires à la réalisation d’analyses biologiques. Ces analyses sont indispensables pour approfondir la compréhension des mécanismes impliqués dans notre contexte d’étude.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal agit sur le comportement social. Ce projet nécessite donc l’utilisation d’animaux. En effet, les alternatives non animales comme les expériences in-vitro ou les modélisations informatiques (in silico) ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du microbiote ni les interactions avec le système digestif, le système immunitaire et le système nerveux ainsi que l’impact sur le comportement social. Par ailleurs, les études de perte de fonction ne peuvent être menées que chez un animal vivant.
Réduction
Pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, nous utiliserons des tailles d’échantillon garantissant une puissance statistique suffisante pour l’analyse des résultats comportementaux, le nombre de souris ayant été réduit autant que possible. Des calculs de puissance réalisés avec un logiciel dédié (GPower) ont permis de déterminer les effectifs de groupe nécessaires pour observer des effets de taille moyenne avec les tests statistiques adéquats : en cas de distribution normale, nous utiliserons des tests paramétriques (t-test pour comparer 2 échantillons, ANOVA pour comparer n échantillons). En cas de distribution non normale, nous utiliserons des tests non-paramétriques (tests de Mann-Whitney ou de Kruskall Wallis), même si ceux-ci sont moins sensibles. Les résultats seront analysés avec le logiciel GraphPad Prism. Au total, 1734 animaux sont requis pour l’ensemble du projet, ce chiffre ayant été réduit au strict nécessaire en respectant les principes de la règle des 3R. Toutes les étapes expérimentales seront réalisées dans un ordre prédéfini, chaque intervention dépendant des résultats obtenus précédemment. Ainsi, toute procédure non pertinente au vu des données déjà recueillies au cours de procédures précédentes ne sera pas réalisée.
Raffinement
Plusieurs stratégies de raffinement seront mises en œuvre: • Utilisation systématique de l’analgésie pour toutes les procédures invasives, afin de réduire la douleur. • Application de techniques de manipulation respectueuses et de contention douce pour limiter le stress avant, pendant et après les interventions. • Administration d’un volume réduit pour minimiser l’impact de l’injection. • Prélèvement d’un volume très faible de sang• Une phase d’habituation aux dispositifs expérimentaux précèdera les tests comportementaux et ceux-ci seront espacés de 2 jours pour favoriser la récupération des animaux. • Le réveil post-opératoire après la chirurgie de vagotomie se fera dans une chambre de réveil chauffée spécifiquement dédiée. •Surveillance attentive des souris pour détecter rapidement tout signe de douleur, de détresse ou de complication, et intervenir avec euthanasie de l’animal si atteinte de point limite conformément aux recommandations si nécessaire. •La surveillance sera biquotidienne et renforcée pour les souris génétiquement altérées et ces souris seront hébergées dans une armoire d’animalerie ventilée permettant un environnement contrôlé et une atténuation de l’expression éventuelle du phénotype dommageable. Afin de limiter le risque infectieux chez ces souris, l’ensemble des équipements utilisés lors des tests comportementaux (arènes, objets, surfaces de contact) sera nettoyé à l’éthanol 70% entre chaque animal ou chaque groupe, selon les procédures en vigueur.
Choix des espèces
L’autisme entraîne d’importants troubles du comportement, et ces altérations peuvent être reproduites chez le rongeur à l’aide de batteries de tests comportementaux adaptés. La souris constitue un modèle de choix, car son système nerveux et le développement de son cerveau présentent de nombreuses similitudes avec ceux de l’humain, contrairement à d’autres espèces. Par ailleurs, les études de perte de fonction ne peuvent être menées que chez un animal vivant, et la souris offre un excellent compromis entre complexité biologique et faisabilité expérimentale. Ce choix de modèle permet donc d’investiguer les mécanismes impliqués dans les effets du microbiote intestinal sur le comportement de manière pertinente et dans un modèle bien caractérisé. Les souris arrivent au laboratoire à l’âge de 3 semaines (21 jours d’âge). Elles restent d’abord 1 semaine sur place pour s’habituer à leur nouvel environnement. Les expériences commencent lorsqu’elles ont 4 semaines (28 jours d’âge). À cet âge, nous réalisons un transfert de microbiote intestinal (c’est-à-dire que nous leur administrons des bactéries dans leur intestin). Leur comportement sera ensuite étudié lorsqu’elles seront adultes, à 8 semaines d’âge (56 jours d’âge). Certaines souris subissent une intervention chirurgicale qui consiste à sectionner une partie du nerf (le nerf vague) qui relie l’intestin au cerveau. Dans ce cas, les souris arrivent à l’âge de 5 semaines (35 jours d’âge) puis sont utilisées dès la semaine suivante après 1 semaine d’habituation au nouvel environnement. La chirurgie sous anesthésie générale sera réalisée sur la souris âgée de 45 jours. Une période de repos de 2 semaines après la chirurgie permettra une récupération optimale. Après récupération, les souris subiront un transfert de microbiote intestinal à l’âge de 8-9 semaines (56-63 jours d’âge). Trois semaines après le transfert de microbiote intestinal, le comportement sera analysé (77-84 jours d’âge).
Rôle d’un neuropeptide dans la détermination de la préférence alimentaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour établir le rôle d'un neuropeptide dans la préférence alimentaire, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles passent cinq jours isolées en cage métabolique, reçoivent des injections quotidiennes pendant cinq jours et subissent sept prélèvements de sang par incision du bout de la queue, au cours de tests glycémiques d'une à deux heures. Le porteur reconnaît que l'isolement peut entraîner un stress et une perte de poids, et que les tests peuvent provoquer une hypoglycémie si la quantité d'insuline injectée n'est pas optimale. Toutes finissent par une ponction cardiaque sous anesthésie, qui provoque la mort, ou par une perfusion intracardiaque, pour prélever le sang et les organes.
Objectifs
Ce projet a pour but d'étudier le rôle d'une molécule dans la détermination de la préférence alimentaire et des intolérances alimentaires chez la souris. Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces intolérances et de maladies inflammatoires intestinales.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons mettre en lumière le rôle d'une molécule dans la préférence alimentaire et faire le lien avec les intolérances alimentaires et les maladies inflammatoires de l'intestin. Cela pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces troubles chez l'humain.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests glycémiques d'une durée de 1h et 2h durant lesquels des prélèvements de sang seront effectués à partir de l'extrémité de la queue des animaux. Ils resteront libres de leurs mouvements (7 prélèvements de microgouttes de sang par animal, moins d'une minute par prélèvement). Les traitements par injections auront lieu une fois par jour pendant 5 jours. On réalisera une mesure de la prise alimentaire des souris grâce aux cages métaboliques où les souris seront isolées pendant 5 jours. Les souris seront également soumises à un prélèvement de sang terminal (ponction cardiaque causant la mort de l'animal) ou à une perfusion intra-cardiaque en étant anesthésiées, cela durera 5 min avant d'être mises à mort.
Impact sur les animaux
L'isolement dans les cages métaboliques pendant 5 jours peut entraîner un stress et une perte de poids chez les souris. Le gavage, les injections et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress. La légère incision à l'extrémité de la queue peut provoquer une douleur. Les tests glycémiques peuvent entraîner une hypoglycémie si la quantité d'insuline injectée n'est pas optimale. Les injections des molécules ont déjà été réalisées lors de précédentes études et n'ont pas montré d'effets indésirables. Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement par le personnel de l'animalerie ou les expérimentateurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car nous avons besoin de prélever leur sang et/ou leurs organes pour les analyser ultérieurement.
Remplacement
Pour étudier le rôle de notre molécule dans la détermination de la préférence alimentaire, nous devons travailler sur des modèles murins in vivo. Nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures cellulaires puisque nous avons besoin de mesurer des paramètres sanguins et métaboliques ainsi que d'étudier le comportement alimentaire, ce qui ne peut être effectué que sur des organismes entiers in vivo. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire.
Réduction
Les expériences seront limitées à un nombre de 24 souris (12 femelles et 12 mâles) par condition de traitement pour être statistiquement analysables. Les tests glycémiques, qui n'impliquent pas d'effet néfaste à long terme pourront êtres menées successivement sur les mêmes animaux en respectant une période de repos aux cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour analyser les résultats efficacement.
Raffinement
L'anesthésie et l'analgésie seront utilisées selon les procédures décrites dans ce document, des points limites seront mis en place et le bien-être des souris sera vérifié régulièrement par le personnel de l'animalerie et les expérimentateurs.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de la molécule dans la détermination de la préférence alimentaire, nous devons travailler sur des modèles murins in vivo. Nous avons besoin de mesurer des paramètres sanguins et métaboliques ainsi que d'étudier le comportement alimentaire, ce qui ne peut être effectué que sur des organismes entiers in vivo. De plus, les modèles animaux invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire. Au cours de cette étude nous étudierons la physiologie de la souris adulte. Elles seront donc âgées d'au moins 8 semaines.
Régulation par les endocannabinoïdes et la corticostérone des processus de mémoire et de la dynamique du calcium dans les cellules hippocampiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Opérées pendant une heure et demie pour recevoir dans le cerveau un tube d'injection ou un dispositif d'enregistrement, les souris de ce projet reçoivent aussi jusqu'à deux injections de molécules agissant sur le système du stress avant des tests de mémoire. 2 856 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Les tests sont nommés, reconnaissance d'objets nouveaux et mémoire de localisation, trois essais de neuf à dix minutes sur trois jours, pour comprendre comment la corticostérone altère la mémoire et si le mécanisme décrit chez les mâles vaut aussi chez les femelles. Le porteur décrit le génotypage comme la coupe de 0,2 cm du bout de la queue entre cinq et douze jours de vie, suivie d'un tatouage des orteils, et reconnaît que cela provoque "un état de stress et de douleur", tout en classant 864 de ces souris en souffrance légère.
Objectifs
Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui régulent les effets cognitifs du stress, via la sécrétion d’une hormone (la corticostérone), et d'établir (et à long terme d'exploiter) les propriétés thérapeutiques potentielles des substances cannabinoïdes dans les troubles liés au stress. On sait qu'une interaction entre les corticostéroïdes et le système endocannabinoïde intervient dans la régulation des processus cellulaires impliqués dans les troubles de la mémoire. Ceci est exclusivement connu pour les animaux mâles. C'est pourquoi, dans ce projet, un premier objectif est d'étudier si les mécanismes d'altération de la mémoire induits par la corticostérone sont les mêmes chez les animaux femelles. Des preuves suggèrent également l'implication d'une autre sous-population de récepteurs cannabinoïdes dans l'altération de l'effet du stress et de la corticostérone sur les processus de mémoire spatiale. Nous souhaitons répondre aux questions suivantes : (i) quel est le mécanisme par lequel la corticostérone altère la mémoire, (ii) comment la corticostérone engage-t-elle le système endocannabinoïde dans les processus de mémoire affectés, et (iii) quel est le rôle de calcium dans cet effet ? Ce projet ouvrira ensuite la voie au développement de stratégies thérapeutiques efficaces pour les troubles de la mémoire liés au stress.
Bénéfices attendus
Le stress est associé à plusieurs états pathologiques, dont les déficits cognitifs. Les actions des corticostéroïdes dans le cerveau peuvent provoquer des effets aigus et chroniques dans plusieurs zones du cerveau qui sont associées à la mémoire. Ce projet contribuera à donner un nouvel éclairage sur la modulation de la mémoire par les corticostéroïdes. Bien que l'effet du stress et des corticostéroïdes sur la mémoire ait été bien décrit dans diverses études humaines et animales et que le rôle du système endocannabinoïde dans ces effets ait commencé à attirer l'attention, les détails de cette interaction corticostéroïde-endocannabinoïde affectant la mémoire sont largement inconnus. Ce projet a pour but de caractériser les processus moléculaires induits par les corticostéroïdes et liés à l'apparition des déficits de mémoire. À cet égard, ce projet aidera à disséquer l'interaction des corticostéroïdes avec le système endocannabinoïde impliquée dans les différents processus de mémoire. En contribuant à disséquer davantage les déficits cognitifs liés au stress, ce projet débouchera sur de nouvelles stratégies de traitement des troubles associés.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les souris seront soumises à des tests comportementaux pour évaluer leur capacité de mémoire (test de reconnaissance d'objets nouveaux ou test de mémoire de localisation d'objets). Ces tests consistent en 3 essais sur 3 jours consécutifs, chacun durant 9 ou 10 minutes, respectivement. Dans le cadre de ces tests de mémoire, l'animal subira des injections de différentes molécules afin de tester l'implication de différentes protéines dans l'effet du stress sur la mémoire. Les animaux recevront au maximum 2 injections de molécules différentes (à au moins 30 minutes d'intervalle), dont une sous-cutanée et une intrapéritonéale. De plus, les souris subissent également une procédure chirurgicale comprenant l'injection d'une molécule ainsi que l'implantation d’un tube d'injection ou un dispositif d'enregistrement. Ces interventions chirurgicales durent typiquement 1,5h.
Impact sur les animaux
Les différentes procédures décrites dans ce projet varient en fonction de leurs effets sur les souris. En fonction des résultats obtenus, la nécessité d'effectuer des expériences supplémentaires conformes aux procédures sera évaluée. Les lignes suivantes décrivent ce que les animaux subiront au maximum. En fonction des retours expérimentaux, certains animaux pourraient ne pas subir l’intégralité de la procédure. Comme nous utilisons des lignées de souris mutantes, chaque procédure comprend le génotypage, qui se fait en coupant 0,2 cm de l'extrémité de la queue des souris à l'âge de p5-p12 et, pour une identification future, les orteils des pattes seront tatoués par micro-tatouage. Cela provoque un état de stress et de douleur chez l'animal. Nous utiliserons des tests de mémoire. Pour tester l'effet des corticostéroïdes sur les performances de la mémoire, les souris recevront une injection des molécules qui interagit avec le system du stress. Un animal ne recevra pas plus de deux injections et ces deux injections seront espacées d'au moins 30 minutes. Ces manipulations conduisent à un état de stress chez les souris. Les niveaux élevés de corticostérone dans le sang, déclenchés par une injection directe de corticostérone, se normalisent en 1 à 2 heures. De même, les autres composés injectés n'agissent pas plus de quelques heures sur l'animal. De plus, les animaux subissent une intervention chirurgicale. Les animaux seront manipulés et soumis à une anesthésie générale [induction à l'isoflurane 5,0 % - entretien à 2,0 %]. Il a 3 phases d’anesthésie lors de la procédure. L’animal peut ressentir du stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boite à induction) et de réveil. Au cours de ces opérations, le scalp des animaux est ouvert, ce qui peut entraîner un risque d'infection et un inconfort après l'opération. Par ailleurs, l’animal peut présenter un inconfort au niveau des sutures dans les heures suivant l’opération. Pour les procédures 3 et 4, l'implantation d'une fibre optique ou d'une canule représente un risque supplémentaire d'infection. De plus, ces implants augmentent le temps d'inconfort après la chirurgie car l'animal doit s'adapter.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'utiliser les cerveaux pour des analyses biochimiques ou électrophysiologiques ou, en cas de manipulation préalable (injection de molécules ou d'implants), pour l'histologie qui permettra de vérifier la présence des molécules et la et l'implantation correcte.
Remplacement
Pour comprendre les mécanismes complexes de la mémoire, qui dépendent du comportement actif du rongeur, nous ne pouvons malheureusement pas utiliser des méthodes alternatives plus simples (cultures cellulaires in vitro, modèles informatiques in silico) car celles-ci fournissent des informations trop limitées et ne peuvent reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. La réponse au stress et aux niveaux élevés de corticostéroïdes dans le cerveau est immensément complexe et peut influencer le comportement des souris et de tout autre organisme de manière cruciale. L'effet des corticostéroïdes sur différentes cellules du cerveau a déjà été décrit. Dans une prochaine étape, l’observation des effets des corticostéroïdes au comportement est cruciale pour mieux comprendre les conséquences cognitives du stress. En ce qui concerne l'effet de la corticostérone sur le calcium, nous utilisons un modèle in vitro complexe d'une région cérébrale majeure impliquée dans les processus de mémoire. Pour relier les résultats obtenus à partir de ces expériences ex vivo aux processus de mémoire, nous nous appuyons malheureusement sur les performances comportementales actives des souris afin de garantir la transposition à une situation in vivo.
Réduction
Pour le R de réduire, en effectuant un petit nombre d'expériences pilotes au début de ce projet, nous pouvons réduire considérablement le nombre d'expériences ultérieures (et donc le nombre d'animaux) nécessaires pour tirer des conclusions. Nous nous engageons à utiliser le nombre minimum d'animaux strictement nécessaire pour dégager une conclusion statistique solide à partir de cette population. La réalisation de l'ensemble de ce projet nécessite l'utilisation d'un maximum de 2856 souris sur une période de 5 ans. Ce nombre est justifié par l'utilisation de différentes approches comportementales et pharmacologiques dans plusieurs lignées de souris avec différentes modifications des protéines que nous souhaitons étudier. Pour les études incluant le comportement et l’analyse moléculaire, les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux ne dépasseront pas le chiffre de 12. Ce nombre de souris est le minimum requis pour avoir une signification statistique et est conforme aux études antérieures utilisant des méthodologies similaires. Cependant, si nos premières expériences montrent qu'il est possible de réduire le nombre de souris, ce nombre sera réduit en conséquence.
Raffinement
Lorsque les animaux arrivent, ils sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et l'environnement d'élevage des souris est enrichi (matériel de nidification). Les animaux sont logés dans des cages collectives et pas dans des cages individuelles, avec un environnement enrichi (matériel de nidification) et un accès libre à l'eau et à la nourriture. Nous attendons au moins 1 semaine (7 jours) pour permettre aux animaux de s'adapter au cycle jour/nuit de notre animalerie expérimentale. Pour le point limite, nous le définissons par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 20% sur deux jours consécutifs, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Cette évaluation est basée sur un gille de score qui comprend des aspects comportementaux et physiques et des mesures seront prises en fonction des scores obtenus. Ainsi, si le score est supérieur à ce qui est décrit sur la grille de score, l'animal sera euthanasié après consultation de la vétérinaire référente. Si le score ne passe pas ce seuil fixe, des mesures conservatoires seront mises en place. Ces mesures comprennent la mise en place de matériel d'enrichissement supplémentaire comme des tunnels ou des grésillements en cas de comportement agressif, des soins adéquats en cas de blessures cutanées, l'application de médicaments analgésiques en cas de signes de douleur, injection de sérum physiologique chaud, hébergement temporaire en enceinte thermostatée et maintien du régime à base de la nourriture humide. En cas de chirurgie, nous procédons à une anesthésie générale des animaux et pendant la procédure chirurgicale, toute hypothermie sera prévenue à l'aide d'un tapis chauffant. Le dessèchement oculaire sera prévenu par administration de gel ophtalmique. Une analgésie de la zone de chirurgie et aussi une analgésie générale sera appliquée. Dans la période postopératoire un analgésique sera administré systématiquement pour éviter la douleur et répétée une fois par jour pour 2 jours. De plus, le poids des souris sera enregistré quotidiennement pendant 5 jours en post-chirurgie. La mise en place des points limites chez l'animal repose sur une évaluation comportementale (voir ci-dessus) et le suivi de leur courbe de poids (réduction de plus de 20% de son poids sur 2 jours consécutifs).
Choix des espèces
Pour évaluer l'implication du système endocannabinoïde dans la régulation des effets du stress et de la corticostérone et de ses conséquences sur l'apprentissage et la mémoire, il n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, que ce soit le rongeur ou l'humain. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement différent serait donc inappropriée. De plus, la grande majorité des études portant sur les circuits cérébraux et les mécanismes de formation de la mémoire ainsi que l'étude du système endocannabinoïde ont été réalisées dans le modèle murin. Par ailleurs, l'utilisation de lignées de souris transgéniques est l'épine dorsale technologique de cette étude. Donc, la grande majorité des outils génétiques disponibles pour étudier la fonction de protéines spécifiques sont disponibles exclusivement dans le modèle murin. Enfin, les infrastructures sont équipées pour l'étude systématique de la souris et pour assurer le bien-être approprié requis. Les souris utilisées seront adultes (âgées de 8 à 14 semaines post natales). Cela se justifie par l’immaturité du système nerveux au cours de l’adolescence, impliquant notamment une fluctuation de l’abondance et de la répartition du récepteur CB1 lors de cette période. En outre, cela nous permet de rester cohérents avec la littérature, car la plus grande quantité de souris adultes utilisées pour des expériences comportementales est âgée de 8 à 14 semaines.
Production d’anticorps chez le lama immunisé (lama glama) – MODIFICATION
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies des plantes
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Jusqu'à huit épisodes d'injections d'antigènes et d'adjuvant, une prise de sang finale de cinq à dix minutes dans un couloir de contention avec licol et sangles sous-ventrières, et pour les meilleurs répondeurs jusqu'à trois campagnes supplémentaires espacées de six mois. 375 lamas vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous gardés vivants, 200 restant à l'élevage comme reproductrices et 175 placés chez des détenteurs qualifiés. Les anticorps polyclonaux obtenus sont produits à la demande de clients, un anticorps monoclonal étant ensuite sélectionné pour son potentiel thérapeutique. Le porteur affirme qu'il est "indispensable", "du moins pour le moment", de passer par le système immunitaire d'animaux, les banques d'anticorps synthétiques demandant selon lui encore une dizaine d'années de recherche.
Objectifs
MODIFICATION : L’objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux à usage thérapeutique. Les anticorps polyclonaux ont plusieurs cibles sur l'antigène, tandis que les anticorps monoclonaux n'en ciblent qu'une seule. Après plusieurs étapes de sélection, un anticorps monoclonal sera sélectionné parmi la masse d’anticorps polyclonaux sur la base de son potentiel thérapeutique, par example le traitement de maladies inflammatoires comme la myasthénie grave. Les anticorps polyclonaux sont obtenus par immunisations de lamas, car les anticorps du lama ont une structure très proches des anticorps humains, ce qui pourrait de fait limiter les risques de rejet thérapeutique chez l’homme et accélérer le développement pré-clinique. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors d’une stimulation spécifique. Le lama ne sera pas utilisé pour la production en masse du produit thérapeutique, mais celle-ci se fera en laboratoire. L’objectif de ce projet est donc de produire des anticorps à la demande de clients (prestation de services) à but thérapeutique dans le cadre des recherches translationnelles ou appliquées réalisées par ceux-ci. La recherche translationnelle (ou recherche de transfert) se situe entre la recherche fondamentale, dont le travail consiste à comprendre les mécanismes à l’origine du développement d’un cancer par example, et la recherche clinique (ou appliquée) qui vise à évaluer l’efficacité et thérapeutique dans des champs d’application aussi variés que: La prévention, la prophylaxie, le diagnostic ou le traitement de maladies, de mauvais états de santé ou d’autres anomalies, ou de leurs effets chez l’homme, les animaux ou les plantes. L’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques chez l’homme, les animaux ou les plantes. Le bien-être des animaux et l’amélioration des conditions de production des animaux élevés à des fins agronomiques. La protection de l’environnement naturel dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal. MODIFICATION : L’objectif additionnel améliore l’affinité et augmente la réactivité croisée des anticorps candidats grâce à la réutilisation des animaux les plus réactifs pour entre une à trois immunisations supplémentaires (rappel utilisant un déterminant antigénique éprouvé ou un changement d’antigène) après un délai minimal de six mois entre chaque procédure.
Bénéfices attendus
MODIFICATION: Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez des patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques. Ils sont particulièrement petits, ce qui leur permet de pénétrer des tissus autrement impénétrables (barrière sang/cerveau) et de plus elles résistent à des environnements hautement acides ou des températures élevées. Leurs qualités se sont avérées très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre de nombreuses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Chaque immunisation a pour but d’augmenter la réponse immunitaire et d’accroitre l’affinité des anticorps générés par le lama pour obtenir une grande variété de candidats anticorps à portée thérapeutique. Plus le nombre de candidats est élevé, plus la chance d’avoir un anticorps efficace en clinique dans une maladie donnée est élevée. MODIFICATION : Les immunisations supplémentaires (au maximum 3) accroissent la probabilité d’obtenir des anticorps de plus forte affinité et/ou à réactivité croisée vers des gènes communs à différents espèces et réagissant spécifiquement entre eux. Ceci permet des programmes non cliniques plus efficaces tout en épargnant des espèces supérieures. Les comparaisons intra-individuelles réduisent la variabilité et diminuent le nombre d’animaux requis.
Procédures
MODIFICATION - Au jour 0, un prélèvement de sang non-encore immunisé est prélevé du lama (durée du geste 1 à 2 minutes), après quoi l'animal reçoit immédiatement la ou les injections d’immunisation qui prennent quelques secondes. La quantité totale injectée ne dépassera pas les 4ml. L'injection du cocktail d'antigènes et de l'adjuvant est effectuée 1x/semaine ou à des intervalles de temps plus longs (2 semaines, ou jusqu’à 4 semaines dans de rares projets pour lesquels le nombre d’injections sera alors réduit à 3), répétée généralement 6 fois, rarement jusqu’à un maximum de 8 épisodes d’injections. Un prélèvement sanguin unique (1 à 2 minutes) ou à intervalles réguliers (2-4 semaines) pendant les séquences de « vaccination » pourra permettre d’évaluer la réponse immunitaire avant la fin de la procédure. Dans un délai de 4 à 14 jours après la dernière injection d'antigène, un prélèvement de sang sera réalisé en bas du cou. La prise de sang finale dure 5 à 10 minutes pendant lesquelles l'animal sera immobilisé dans un couloir de contention à l'aide d'un licol et de sangles sous-ventrières. Tous les gestes sont réalisés sur animal vigile. MODIFICATION - Les lamas ayant produit les meilleures réactions à la première immunisation pourront être utilisés pour 1 à 3 campagnes supplémentaires maximum (après un délai de repos d’au moins six mois entre chacune d'elles), suivant un protocole similaire à la première immunisation (prélèvements décrits ci-dessus). Ceci pour créer premièrement des réactions croisées améliorant les anticorps identifiés pendant la première campagne, en se concentrant sur les parties de la protéine qui importent le plus, afin d’augmenter leur efficacité. Le deuxième but est de trouver des anticorps capables de réagir avec différentes espèces afin de développer des traitements tout en réduisant l’utilisation d’espèces supérieures, conformément au principe du bien-être animal.
Impact sur les animaux
L’utilisation d'un adjuvant lors des immunisations peut provoquer une réponse inflammatoire locale classique, accompagnée d'un gonflement. Comme pour toute vaccination, un épisode de fièvre peut survenir accompagnant cette inflammation. Les injections peuvent provoquer des douleurs aiguës transitoires (selon le produit injecté), ainsi qu’un inconfort dû à la contention légère nécessaire à la réalisation des gestes, un bras autour du cou pour quelques secondes. Même s’il peut y avoir un risque théorique de choc anaphylactique par l’utilisation d’un cocktail antigénique, il est finalement quasi nul, car les antigènes utilisés (protéines ou séquences ADN humaines) n'ont rien en commun avec le lama. Les prises de sang finales nécessitent une immobilisation plus longue, source d’un inconfort, voire d’un stress de 10 à 15 minutes, d’intensité et de durée variable selon les individus.
Devenir
Les femelles resteront en grande partie à l'élevage en tant que reproductrices, les mâles et les autres femelles seront placés chez des détenteurs qualifiés. Ceci après inspection par notre vétérinaire sanitaire en vue de leur état de santé et de leur socialisation.
Remplacement
Il est indispensable, du moins pour le moment, d’obtenir les anticorps polyclonaux en utilisant le système immunitaire d’animaux (in vivo). En effet, les techniques pour produire des anticorps à partir de librairies d’anticorps synthétisées (in vitro) ne sont pas encore au point et leur utilité est limitée à un nombre de domaines restreint (certains experts estiment qu’il faudrait au moins encore une dizaine d’années de recherches pour améliorer leurs capacités même dans ceux-ci). Elles génèrent des anticorps de moins bonne qualité car nous sommes encore loin de la complexité et de l’efficacité des anticorps obtenus via le système immunitaire des mammifères (ou même des humains dans le cas du covid), qui a évolué sur des millions d’années. De produire des anticorps à l’aide d’animaux fait usage d’une série de processus naturels améliorant, entre autres, leur capacité de se lier aux molécules de la maladie. Ceci car l’organisme animal est capable de sélectionner l’anticorps le mieux à même de se lier à une cible spécifique parmi mille milliards d’anticorps à l’aide un processus hautement complex, impossible à réaliser in vitro. Ce processus est déclenché par le démarrage de la réponse immunitaire de l’animal. La plus efficace des techniques in vitro arrive à gérer dix milliards. Étant donné que les anticorps des camélidés sont structurellement très proches des anticorps humains, il n'y aura que des modifications minimes qui seront nécessaires pour convertir les anticorps de lamas en anticorps pleinement tolérés par le système immunitaire humain. Ces qualités rendent les petits camélidés uniques. Les anticorps polyclonaux obtenus par immunisations de lamas sont la base pour les anticorps thérapeutiques sélectionnés (monoclonaux) qui seront séquencés et produits en masse en laboratoire (in vitro) sans utilisation d'animaux. Les anticorps prennent une place de plus en plus importante dans la recherche et les thérapeutiques humaines et vétérinaires, voir même agricoles. Nous avons donc besoin d’anticorps de la plus haute qualité. Naturellement les conditions dans lesquelles ces immunisations sont réalisés doivent obligatoirement se faire sous les meilleures conditions, afin d’éviter toutes souffrances inutiles aux animaux.
Réduction
MODIFICATION: En utilisant des cocktails de différents antigènes cibles, sous forme de protéine purifiée par exemple, le nombre d'animaux dans les essais est fortement réduit, tout en préservant le rendement expérimental. Nous visons une compatibilité suffisante des différentes protéines pour maximiser le nombre de cibles dans le cocktail. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors de chaque stimulation spécifique. Pour chaque expérience d’immunisation ciblée, 2 à 4 animaux maximum seront utilisés, car un individu seul pourrait produire des réactions atypiques ou non-concluantes. Le nombre d'animaux est basé sur les résultats des expériences précédentes. Des lamas non consanguins sont utilisés; donc des lamas qui sont génétiquement éloignés les uns des autres, ce qui rend leurs systèmes immunitaires plus efficaces. MODIFICATION : L’utilisation continue d’animaux présentant une forte réponse immunitaire réduit la nécessité de constituer de nouveaux groupes d'animaux naïfs pour des objectifs similaires, diminuant ainsi le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
MODIFICATION: Toutes nos installations sont conçues pour permettre aux lamas de vivre de sorte que soient respectés le mieux possible leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les animaux sont logés en groupes sociaux stables, formés d’individus compatibles. Nous élevons des animaux de pâturage et les hébergeons sur nos 30 hectares de prairies permanentes et de bois. Dans le cours des soins de routine, nos lamas sont régulièrement manipulés. Traitements vermifuges par injections sous-cutanées et par solutions administrées oralement, tous les trois mois (Moxidectine, Praziquantel, Fenbendazol). Prises de sang pour les analyses de santé, tonte, coupe des ongles etc. La tonte annuelle étant l’intervention la plus stressante dans ce cadre, mais entièrement réalisée pour le confort des lamas, nous ne commercialisons pas la laine. Ces interventions ont comme effet collatéral d’habituer les animaux aux interventions humaines, ce qui nous permet de limiter le stress ou l’inconfort liés aux gestes d’injection ou de prélèvements sanguins répétés. Comme nos lamas sont destinés à une utilisation en tant qu’animaux de loisirs et de bât, voir de médiation animale, ils suivent également un entrainement à la longe. Nous sélectionnons nos lignées depuis plus de 30 ans selon des critères d’anatomie, de laine, de couleur, mais avant tout de caractère. Même dans ces conditions il y a toujours des individus plus sensibles que d’autres, qui auront droit à des séances d’éducation complémentaires. Nos interventions durant les procédures expérimentales prévues ne dépassent pas le cadre de ce qu’ils sont habitués à subir pour leurs soins courants et sont réalisés sur des animaux vigiles. L’impact léger de ces procédures ne donne pas lieu à prévoir des points limites, ni de traitements antalgiques. Naturellement les animaux peuvent avoir un problème de santé sans relation avec la procédure durant celle-ci, en quel cas la vétérinaire les traitera selon leurs symptômes et décidera, en consultation avec le donneur d’ordre, s’ils doivent être retirés de la procédure. Les gestes réalisés sont de nature à ne provoquer qu’un inconfort voire du stress sur les animaux les plus sensibles au contact, malgré les séances d’habituation lors des soins quotidiens. MODIFICATION : Un intervalle minimal de six mois entre deux nouvelles campagnes d’immunisation est systématiquement respecté.
Choix des espèces
Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez les patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques telles que leur taille et leur stabilité. Leur spécificité et leur sélectivité se sont avérés très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre diverses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin, c’est à dire 250ml pour les lamas de moins de 100kg et entre 250 et 400ml pour les individus plus lourds. Nos clients potentiels nous indiquent que 250ml pourraient désormais être la norme et que le maximum de 400ml sera normalement abandonné, ce qui constituerait un raffinement de la procédure.
Etude des mécanismes conduisant au développement de la cachexie rénale (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Une partie des souris porte une mutation qui détruit progressivement leur fonction rénale et les fait maigrir, l'autre reçoit un régime qui produit le même effet. 1 636 souris au total vont être utilisées, toutes tuées, dont 512 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des mesures toutes les deux semaines, des prélèvements sanguins sous anesthésie, jusqu'à sept jours d'isolement en cage métabolique et, pour certaines, deux injections par jour pendant quinze jours. Le porteur qualifie chacune de ces nuisances de légère et affirme que l'insuffisance rénale ne provoque ni douleur ni stress avant les stades avancés, tout en indiquant que les animaux seront gardés plusieurs mois, jusqu'à ce qu'ils aient développé cette insuffisance accompagnée d'une cachexie.
Objectifs
La cachexie est un syndrome d’amaigrissement sévère et involontaire qui ne peut pas être corrigé simplement par une approche nutritionnelle, et qui réduit fortement la qualité et l’espérance de vie des patients. Elle touche souvent les patients à des stades avancés de maladies chroniques telles que le cancer, les maladies rénales, cardiaques et pulmonaires ou maladies infectieuses. Jusqu'à présent la plupart des études se sont concentrées sur la cachexie associée au cancer, les autres types de cachexie, et en particulier celle associée aux maladies rénales chroniques (MRC), ont été peu étudiées. Les maladies rénales constituent un grave problème de santé publique, puisqu'elles touchent plus de 850 millions de personnes et représentent l'une des dix principales causes de décès prématurés dans le monde. À un stade avancé de la maladie rénale, notamment chez les patients sous dialyse, un syndrome appelé cachexie rénale peut apparaître. Elle se caractérise par une perte de masse maigre et/ou grasse menant à une altération fonctionnelle des patients. Il n’existe aujourd’hui aucune norme de soin pour la cachexie rénale et une meilleure compréhension des altérations métaboliques menant à son développement représente un enjeu crucial. L’objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce et de nouvelles cibles thérapeutiques pour une meilleure prise en charge de la cachexie rénale. A l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro qui permette de reproduire la complexité de la physiopathologie de la cachexie rénale, ce qui rend indispensable le recours à des modèles animaux pour appréhender les interactions biologiques complexes associées à cette pathologie. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
La cachexie rénale est un syndrome grave qui touche de nombreux patients atteints d’insuffisance rénale chronique. Elle réduit l’espérance de vie, entraîne une fatigue importante, des hospitalisations fréquentes, et rend difficile une vie sociale et professionnelle normale. Elle contribue donc au très fort impact économique des maladies rénales en Europe, qui est à la hauteur de 140 milliards d’euros par an. Ce projet de recherche vise à court terme à mieux comprendre la cachexie rénale et à développer des outils de diagnostic. À plus long terme, il pourrait mener à de nouveaux traitements, et ainsi améliorer la qualité de vie et la survie des patients.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subiront des mesures de composition corporelle (3 minutes/animal), de force musculaire (5 minutes/ animal) et de fonction rénale (45 minutes/animal) au maximum toutes les 2 semaines à partir de l’âge de 6 semaines. Ces mesures se font chez les animaux vigiles et sont non-invasives, les animaux pourront cependant être anesthésiés pendant quelques minutes pour certains gestes techniques. Des prélèvements sanguins (2 minutes) seront réalisés sous anesthésie toutes les 2 semaines également. Les animaux seront mis en cages métaboliques une fois pendant une durée maximum de 7 jours. Certains lots d’animaux recevront des traitements : soit 3 injections par semaine pendant une durée maximale de 2 mois ; soit 2 injections par jour pendant une durée maximale de 15 jours ; soit une injection unique. Certains animaux seront mis sous régime particulier. Dans le second établissement utilisateur, seules les procédures terminales seront réalisées.
Impact sur les animaux
Certains animaux de sont porteurs d’une mutation génétique responsable du développement d’une maladie rénale chronique. Celle-ci provoque une détérioration de leur fonction rénale et un amaigrissement, qui sont les critères recherchés dans notre projet. D’autres groupes d’animaux sont soumis à un régime alimentaire qui induit également une détérioration de leur fonction rénale et un amaigrissement. Le poids des animaux et leur état général seront suivis attentivement. L’insuffisance rénale ne provoque pas de douleur, ni de stress avant des stades avancés au cours desquels une baisse de l’alimentation et une altération de l’état général peuvent apparaitre. Tous les animaux seront soumis à : (1) suivi régulier de leur poids : léger stress lié à leur manipulation de la cage à la balance et vice-versa (2) prise de sang à la queue : léger stress et risque de saignement (3) mesure de leur composition corporelle: léger stress lié à leur contention transitoire (3 minutes) (4) mesures du métabolisme : léger stress lié à l'isolement (7 jours au maximum) dans une cage individuelle (5) mesure de la fonction rénale: légère douleur liée à l’injection, et léger stress lié à la présence du capteur pendant 1h maximum (6) traitements pharmacologiques : léger stress dû à la contention + légère douleur liée à l’injection
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vus de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.
Remplacement
La cachexie est un syndrôme multifactoriel, initiée par le tissu affecté (ici le rein), qui va conduire à l’altération métabolique et à la dysfonction de nombreux tissus vitaux. Ces tissus vont à leur tour sécréter de nombreux médiateurs pro-cachectiques, initiant un cercle vicieux qui aggrave la fonte des tissus musculaires et adipeux. De telles interactions inter-tissulaires dans un contexte d’insuffisance rénale sont donc impossibles à reproduire in vitro. Une approche complémentaire ex vivo sur des cellules primaires en culture est également utilisée, elle permet d’obtenir une grande quantité de cellules à partir d’un nombre restreint d’animaux
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 1636 souris. Les résultats seront interprétés en utilisant des tests statistiques.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature et les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés, par groupes de 2 à 5 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement par les zootechniciens et plusieurs fois par semaine par les expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être . Une grille de scoring et des points limites ont été établis. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (des anesthésiques et antalgiques seront utilisés pour les gestes qui le nécessitent, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont transportés dans leur cage d'origine afin de minimiser le stress, pour un transport d'une durée de moins de 10 minutes.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale et la cachexie. Pour l’un des 2 modèles, nous utiliserons des souris âgées de 6 semaines au début de l'expérience, afin d’effectuer des mesures en conditions basales avant tout amaigrissement et perte de fonction rénale. Pour l’autre modèle, nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines au début du protocole. A cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques chez l’adulte. Nous garderons les animaux jusqu’à ce qu’ils aient développé une insuffisance rénale accompagnée d’une cachexie (processus se mettant en place sur plusieurs mois).
Modèle de neuropathie induite par un anticancéreux : évaluation des atteintes nerveuses, rénales et musculaire
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Développer un modèle vendable de neuropathie, d'atteinte rénale et de fonte musculaire liées aux anticancéreux, telle est la finalité annoncée pour 900 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'anticancéreux de façon chronique, subissent des mesures de sensibilité mécanique de trente minutes, jusqu'à huit prélèvements sanguins et vingt heures en cage métabolique individuelle sans litière. Le porteur décrit une perte de poids musculaire importante, une perte d'appétit, une hypersensibilité à la douleur et une baisse de production d'urine, et signale que les traitements répétés génèrent un stress chronique. L'établissement présente ce modèle comme une ouverture de son "catalogue" d'études précliniques à un domaine où les organes atteints constituent son expertise.
Objectifs
Certaines thérapies anti-cancéreuses ont des effets néfastes sur la fonction rénale, les fibres nerveuses et/ou le poids et la masse musculaire. De nombreuses stratégies thérapeutiques sont en cours d’étude pour limiter ces effets secondaires irréversibles. Pour pouvoir tester ces stratégies, il nous faut mettre en place des modèles animaux adaptés tels qu’un modèle de rats traités chroniquement avec un composé anti-cancéreux pour induire la neuropathie (atteinte nerveuse), la néphropathie (atteinte rénale) et la cachexie (atteinte musculaire) associé aux traitements anti-cancéreux.
Bénéfices attendus
En proposant un modèle de rat d’étude préclinique de neuropathie, de néphropathie, de cachexie associées à l’utilisation d’anti-cancéreux, nous ouvrons notre catalogue à un nouveau modèle d’étude préclinique dont les organes atteints constituent notre expertise et nous permettra l’étude de nouvelles molécules. Également par la mise en place de ce modèle, nous permettrons d’éclaircir les mécanismes mis en place pour le développement de ces atteintes et nous permettrons ainsi un gain de connaissance.
Procédures
Les rats recevront des administrations de divers composés (anticancéreux et composés à tester), les administrations se font sur animal vigile (environ 30 secondes) ou sur animal anesthésié (environ 2 minutes). La composition corporelle est réalisée sur animal vigile et dure environ deux minutes et est indolore et peu stressante. La sensibilité mécanique est réalisée sur animal vigile et dure environ 30 minutes où l'animal est dans une petite cage et un stimulus mécanique est appliqué maximum 5 fois 10 secondes à intervalle de 5 minutes. La force musculaire est réalisée sur animal vigile, cette mesure dure envrion 5 minutes (3 mesures de quelques secondes espacées de 30 secondes). Pour mesurer le débit de filtration du rein, l'animal est anesthésié pendant 5 minutes pour placer le moniteur sur dos et injecter le composé fluorescent puis il est réveillé et maintenu en cage individuelle pendant 2h de mesure. Le moniteur est ensuite retiré et l'animal est remis dans sa cage d'origine. Toutes ces mesures seront réalisées 2 fois durant la période de traitement. En fin de période de traitement, nous récolterons l'urine sur une durée de 20h, l'animal sera donc mis en cage individuelle à métabolisme. Des prélèvements de sang auront lieu jusqu'à 2 fois par semaine (soit 8 prélèvements maximum) , sur animal anesthésié (2 minutes) ou vigile (30 secondes).
Impact sur les animaux
1 – l’intoxication avec l'anticancéreux : les animaux vont être atteints d’effets secondaires altérant leur bien-être tels qu’une perte de poids notamment musculaire importante, une perte d’appétit, une neuropathie se traduisant par une hypersensibilité au stimuli mécanique, une atteinte rénale altérant leur production d’urine et leur prise hydrique 2 - Les mesures réalisées : L’analyse de la sensibilité mécanique au niveau de la voûte plantaire et la mesure de la force musculaire peut induire un inconfort ou possiblement une douleur. La mesure de débit de filtration du rein nécessitant une anesthésie entraine des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal. La mesure de la composition corporelle consiste à restreindre l’animal pendant quelques minutes dans un tube à contention limitant ses mouvements 3 – Les traitements réalisés à répétition génèrent un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé : apathie, prostration, agressivité, etc.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever et analyser les organes cibles.
Remplacement
Les effets secondaires à l’utilisation d’anticancéreux touchent de nombreux organes (neurones, reins, muscles). Nous pouvons reproduire certains effets in vitro en mettant en culture des neurones et en les mettant en contact avec l'anticancéreux. Les atteintes au niveau du rein peuvent être étudiées à partir de culture de cellules rénales in vitro mais le modèle est discutable car il ne mime par réellement l’organisation cellulaire du rein. Ces deux possibilités sont actuellement étudiées mais ne répondront pas totalement au besoin puisque les effets secondaires des anticancéreux sont multiorganiques et nécessitent l’utilisation d’un animal vivant dans son entier.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation des effets secondaires aux anticancéreux ou leurs résolutions, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude.
Raffinement
Une double litière sera déposée en fond de cage en cas de polyurie pour éponger l'urine produite au maximum et garantir le confort de l'animal. Dès la première injection de l'anticancéreux, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids 3 fois semaines) par les zootechniciens et la SBEA (Structure du Bien Etre Animal). Jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une diarrhée, ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites fixés, ce dernier sera mis à mort. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution de réhydratation est envisagée sur 2 à 3 jours maximum au-delà, l’animal sera mis à mort. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante pendant maximum 2-3 jours. Les prélèvements de sang effectué en cours et en fin d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques et avec une couverture anesthésique et analgésique adaptée. Une phase d'habituation sera réalisée pour la mise en cage a métabolisme et la mesure de sensibilité mécanique (sans stimulation) pour limiter le stress de l'animal. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’utilisation de cage métabolique se fait la veille de la mise à mort. Pour limiter le stress, les cages étant transparentes et les unes à côté des autres, les rats peuvent voir leur congénère à proximité. Mais pour laisser la possibilité au rat de se cacher, un papier occultant à moitié la vue sera positionné sur les cages. Enfin, en cas d'apparition de plaies en cours d’étude, des soins seront réalisés.
Choix des espèces
Le rat est une espèce répondant correctement à l'anticancéreux. Les rats seront commandés à l’âge adulte.