Système endocrinien

864 souris subissent une neurochirurgie de 45 minutes et 288 une chirurgie viscérale, sous anesthésie et analgésie. Au total 1 792 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélever le cerveau ou d'autres tissus. Cinq cent douze d'entre elles passent quatre semaines seules en cage pour un conditionnement opérant, 544 subissent un jeûne de 24 heures, et le régime gras est censé faire grimper leur poids jusqu'à 200 % du poids initial sur vingt semaines. Le porteur annonce des tests comportementaux sur 656 souris, d'une durée de dix à cent vingt minutes, sans préciser lesquels.

Objectifs

L’obésité est problème majeur de santé publique. Cette maladie chronique touche presque 18% de la population française (quasiment la moitié des français.es si l’on compte aussi les personnes en surpoids). Elle s’accompagne de nombreuses comorbidités, notamment le diabète et les symptômes anxieux et dépressifs. On sait aussi que les bactéries de l'intestin (le microbiote) est déréglé dans l'obésité. Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour limiter les comorbidités associées à l’obésité, il est nécessaire de mieux comprendre comment le cerveau contrôle le poids corporel et les émotions, et comment l'intestin communique avec le cerveau. Nous voulons tester l'hypothèse selon laquelle certaines cellules du cerveau, appelées cellules gliales, sont sensibles à des molécules produites par le microbiote intestinal. Nous pensons que les animaux mâles et femelles ne répondront pas de la même façon à ces molécules.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre la communication entre l’intestin et le cerveau, notamment le rôle de certaines cellules gliales dans les dérèglements métaboliques et cognitifs en réponse à un régime riche en calories. Ce projet a une véritable portée translationnelle dans la mesure où s’ils supportent notre hypothèse, l’utilisation de ces molécules produites par le microbiote (également retrouvés dans le sang humain) pourrait éventuellement être proposée pour traiter des personnes souffrant d’obésité avec présence de diabète ou de symptômes anxieux. De plus, si nos résultats diffèrent entre les deux sexes, cela permettra de cibler une population donnée, ce qui participe à la mise en place d’une médecine de précision.

Procédures

1) Analyse de la composition corporelle sur animaux vigiles : 5 min, entre 1 et 5 fois. Nombre d’animaux : 1492. 2) Chirurgie viscérale, sous anesthésie et antalgie, 20 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 288. 3) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 864. 4) Test de tolérance au glucose et à l’insuline sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min. Nombre d’animaux : 560. 5) Enregistrements de la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et l’activité physique. Durée : 16 jours en hébergement individuel. Nombre d’animaux : 144. 6) Mise à jeun, 24h, entre 1 et 2 fois, espacée d’une semaine. Nombre d’animaux : 544 (1 fois), 48 (2 fois). 7) Tests comportementaux. Durée : entre 10 et 120 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de minimum 1 jour. Nombre d’animaux : 656. 8) CONDITIONNEMENT OPERANT. DUREE : 4 SEMAINES en HEBERGEMENT INDIVIDUEL. NOMBRE D’ANIMAUX : 512.

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la mesure des apports et des dépenses énergétiques individuels (calorimétrie indirecte) ou une tâche d’apprentissage avec accès individuel contrôlé aux mangeoires (conditionnement opérant) sont nécessaires. Durée maximum : 4 semaines. Légère perte de poids initiale (5 %) sur les deux premiers jours avant reprise de la croissance normale (basée sur nos observations antérieures). 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD (sur 20 semaines maximum). La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeun (4h ou 24h). La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. La peau et soit le périoste, soit la paroi péritonéale devant être incisés, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins de 2h, sans manipulation) n’induit pas de nuisances sévères (pas de perte de poids attendue). 7. Les complications chirurgicales (mauvaise cicatrisation, hémorragie) devraient rester bien en dessous du seuil de 20% du nombre total d’animaux (d’après nos études antérieures). 8. Stress induit par des prélèvements sanguins répétés (maximum 6 prélèvements consécutifs en 2h). 9. Stress métabolique suite à des variations importantes de la glycémie (hyper ou hypoglycémies pendant 2h maximum).

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Ce projet et notre hypothèse sont basés sur des résultats d’études cliniques chez l’Homme (variation de concentration sanguine des molécules du microbiote chez des populations obèses). Le but de ce projet est de comprendre le rôle de l’axe intestin-cerveau dans la mise en place des désordres métaboliques et cognitifs induits par l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (notamment l’intestin où réside le microbiote intestinal). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Les variables métaboliques (poids, composition corporelle, régulation de la glycémie) et le comportement intégré (anxiété) nécessite l’utilisation d’un modèle animal. En effet, des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés cités plus haut nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe pas encore de modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé des tests mathématiques (test de puissance statistique) pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la stratégie de croisements des animaux reproducteurs afin d’utiliser tous les animaux d’une même portée (animaux contrôles et génétiquement modifiés sont frères et sœurs) et donc ne pas multiplier le nombre de portée avec des animaux qui ne présenteraient pas les caractéristiques (génotype) attendues. De plus, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide de différents tests statistiques adaptés au type de mesures comparées.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. L’environnement sonore permettra de limiter le stress des bruits extérieurs (radio). 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que des mesures de maintien du bien-être animal décrites précisément dans les procédures. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec des mesures conservatoires prévues pour chaque critère.

Choix des espèces

LLes caractéristiques suivantes font de la souris un animal de choix pour notre projet de recherche. 1) sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain ce qui fait que les résultats obtenus chez la souris sont transposables à l’Homme 2) petite taille facilitant son hébergement 3) court cycle de reproduction permettant d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement 4) possibilité d’obtenir des animaux génétiquement modifiés 5) comportement alimentaire et émotionnel depuis longtemps étudiés chez la souris 6) bon nombre des tests comportements existants chez la souris donnent des résultats qui sont transposables à l’Homme Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), âge qui correspond à un stade où le crâne a fini sa croissance, ce qui permet l’utilisation d’une cartographie de référence du cerveau (atlas stéréotaxique) pour les neurochirurgies.

Les animaux qui perdent plus de 20 % de leur poids en trois jours, avec prostration et dos courbé, sont mis à mort. 4 750 souris, rats et hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever foie, sang et tissus. Ils reçoivent des régimes gras et sucrés, parfois additionnés d'éthanol, pendant jusqu'à 60 semaines, avec un ou deux gavages par jour, des tests de tolérance au glucose, des séjours de 40 heures en cage individuelle sans enrichissement et des courses de 20 minutes sur tapis roulant. Le porteur retient le hamster parce qu'il consomme spontanément l'alcool, et rattache ce choix à la hausse de la consommation humaine depuis les confinements liés au COVID-19.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. POUR MESURER LA FORCE MUSCULAIRE, NOUS TESTERONS L'AGRIPPEMENT SUR GRILLE (2 MINUTES DE FACON HEBDOMADAIRE) ET LA DUREE DE COURSE SUR TAPIS ROULANT EN MESURANT LES ECHANGES GAZEUX (20 MINUTES TOUS LES 15 JOURS). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Cela consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Soumises à un régime riche en lipides pendant quatorze semaines, à cinq prélèvements sanguins sur animal éveillé, à deux jeûnes de six heures et à un gavage, 528 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses post-mortem. Le porteur qualifie lui-même de modérément douloureux le prélèvement de sang réalisé sans anesthésie. L'objet du projet tient en une phrase, comprendre le rôle d'un gène dans les cellules immunitaires du tissu adipeux, et les retombées contre l'obésité et le diabète sont renvoyées au long terme. Sur les 528 animaux, il écrit seulement que leur nombre a été calculé pour obtenir une puissance statistique suffisante.

Objectifs

L'objectif du projet est de comprendre le rôle d'un gène particulier dans les cellules immunitaires associées au tissu adipeux, dans des conditions normales et lors d'un régime riche en lipides qui induit de l'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de faire avancer de manière conséquente notre connaissance des cellules immunitaires associées au tissu adipeux, et qui contribuent au développement de l'obésité. Ce projet permettra à plus long terme d'identifier des cibles moléculaires pour envisager de nouvelles thérapies contre l'obésité et les maladies métaboliques telles que le diabète.

Procédures

Prélevement sanguin : maximum 5 fois par animal, 3 secondes; Régime alimentaire spécifique : 14 semaines; Injection intrapéritonéale : maximum 1 injection par animal, 3 secondes; Mise à jeun : une fois pendant 6h et 3 jours après une deuxième fois pendant 6h; Gavage : maximum 1 fois par animal, 5-10 secondes.

Impact sur les animaux

Le régime riche en lipides est susceptible d'engendrer divers effets métaboliques, et conduit généralement à une prise de poids significative et à une réduction de l'activité. Prélèvement de sang sur animal vigile : douleur modérée au moment de la réalisation du geste. Injection intrapéritonéale : douleur légère de courte durée. Mise à jeun : Jeune de courte durée: stress et sensation de faim. Gavage : stress de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative pour réaliser ce travail qui nécessite l’analyse de tissus entiers. Le tissu adipeux est un tissu complexe qui comporte de nombreuses cellules qui interagissent afin de maintenir un équilibre. La dynamique du tissu adipeux, des cellules immunitaires qu’il abrite ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d’autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas être adéquatement reproduites in vitro.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Un suivi de score clinique sera effectué pour éviter toute souffrance inutile des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les cellules immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes pour que leurs tissus soient pleinement développés.

75 souris subissent chacune la totalité du protocole : perçage de l'oreille, douze pesées, deux passages en tube de contention, deux périodes de jeûne dont une de douze heures, une injection de sucre dans le ventre, un gavage d'huile, deux incisions de la queue et dix prélèvements de sang. Elles sont toutes tuées à l'issue, après une ponction cardiaque sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet du projet est de comparer des croquettes formulées à l'huile de palme et à l'huile de colza gélifiée, pour fournir à l'industrie alimentaire des arguments sur de futures margarines et pâtes à tartiner. Le porteur écrit que le recours à l'expérimentation animale est "indispensable à ce stade", après une étude pilote qui avait déjà servi à sélectionner les croquettes.

Objectifs

Les matières grasses sont essentielles pour assurer la texture de nombreux aliments mous. Cette texture est généralement obtenue par l’utilisation d’huiles riches en acides gras saturés, comme l’huile de palme, reconnues pour augmenter le risque de maladies cardiovasculaires. Il est donc nécessaire d’identifier des alternatives plus favorables à la santé tout en conservant les propriétés technologiques des produits alimentaires. Les oléogels constituent une alternative innovante permettant de structurer une huile végétale liquide, ici l’huile de colza, dont le profil lipidique est favorable en raison de sa richesse en acides gras oméga-3. Cette structuration repose sur l’utilisation de petites molécules oléogélatrices dérivées d’acides aminés ou d’endocannabinoïdes (messagers chimiques fabriqués par le corps lui-même). La nature de ces molécules nous permet de faire l’hypothèse, d’après ce qui est décrit dans la littérature, qu’elles pourraient exercer des effets bénéfiques, notamment en régulant la prise alimentaire et contrôlant l’inflammation. L’objectif de ce projet est de comparer les effets métaboliques de différentes croquettes formulées : • soit avec de l’huile de palme, naturellement solide; • soit avec de l’huile de colza structurée sous forme d’oléogel à l’aide de deux oléogélateurs distincts (X et Y). Les analyses porteront sur des paramètres circulants et tissulaires impliqués dans la régulation de la prise alimentaire, le métabolisme lipidique et glucidique, ainsi que l’inflammation. L’oléogélateur X sera testé à deux concentrations (2 % et 4 %), ses propriétés technologiques variant selon la concentration. L’oléogélateur Y sera testé uniquement à 4 %, la concentration à 2 % ne résistant pas aux conditions thermiques de fabrication des croquettes. Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à ce stade afin d’évaluer les effets physiologiques intégrés de ces nouvelles formulations. Une étude pilote préalable a confirmé la bonne consommation des croquettes et l’absence d’impact négatif sur le bien-être des souris.

Bénéfices attendus

À court terme, cette étude apportera des connaissances nouvelles sur les effets métaboliques des oléogels dans un modèle animal bien caractérisé. Elle permettra de mieux comprendre l’impact de la structuration d’huiles végétales sur la régulation de la prise alimentaire, le métabolisme lipidique et glucidique, ainsi que sur les réponses inflammatoires. Ces résultats constitueront une base scientifique solide pour évaluer la valeur nutritionnelle de ces oléogels. À long terme, ce projet contribuera au développement de formulations alimentaires plus favorables à la santé, en fournissant à l’industrie des éléments scientifiques pour remplacer les graisses saturées par des alternatives à base d’huiles végétales gélifiées. Ces innovations pourraient améliorer le profil nutritionnel de produits de consommation courante (margarines, pâtes à tartiner, produits de boulangerie), favoriser un meilleur apport en acides gras essentiels, notamment les oméga-3, et ainsi contribuer à la réduction du risque de maladies métaboliques et cardiovasculaires dans la population.

Procédures

Les 75 animaux subiront un petit perçage de l’oreille permettant leur identification (moins de 30 secondes avec contention). Les 75 animaux seront pesés une fois par semaine pendant 12 semaines, soit 12 pesées par animal (chaque pesée dure moins de 30 secondes). Parmi eux, 60 animaux recevront pendant 12 semaines une alimentation spécifique, constituée de croquettes enrichies en huiles végétales, associées ou non à des oléogélateurs. Les 75 animaux seront placés à deux reprises dans un tube cylindrique afin d’être introduits dans un appareil permettant la mesure de la composition corporelle (répartition de la masse grasse et de la masse musculaire). Chaque mesure dure moins de 2 minutes, et les deux séances seront espacées de 11 semaines. Les 75 animaux subiront deux périodes de jeûne nécessaires à la réalisation des tests métaboliques : – une période de jeûne de 6 heures (entre 7 h 30 et 13 h 30) ; – une période de jeûne nocturne (entre 20 h et 8 h). Ces deux périodes de jeûne seront espacées d’au moins une semaine. Les 75 animaux recevront une injection dans le ventre d’une solution de sucre afin de mesurer la tolérance au glucose (contention et injection : moins de 30 secondes). Les 75 animaux subiront un gavage d’un bolus d’huile afin d’évaluer le métabolisme des graisses (contention et gavage : moins de 30 secondes). Les 75 animaux subiront deux petites incisions à l’extrémité de la queue (moins de 1 mm) afin de permettre les prélèvements sanguins au cours des tests métaboliques (une incision par test, sans contention, durée inférieure à 30 secondes, avec un intervalle d’au moins une semaine entre les deux tests). Dans le cadre du test de tolérance au sucre, les 75 animaux subiront six prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue (moins de 30 secondes par prélèvement, sans contention). Dans le cadre du test de tolérance aux graisses, les 75 animaux subiront quatre prélèvements sanguins réalisés selon les mêmes modalités. En fin de protocole, les 75 animaux recevront une injection d’un mélange d’anesthésiques, permettant le prélèvement de sang au niveau du cœur, suivi de la mise à mort (contention et injection : moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

L’identification des animaux par poinçonnement de l’oreille peut entraîner une légère douleur transitoire, sans conséquence durable. La pesée hebdomadaire constitue une source de stress léger et temporaire. La consommation de croquettes riches en lipides va induire une prise de poids modérée, sans altération de la mobilité ou du comportement. Lors des mesures de composition corporelle, les souris seront placées brièvement (moins de 2 minutes) dans un tube cylindrique, ce qui peut générer un léger stress. Les tests métaboliques (tolérance au sucre et tolérance aux lipides) peuvent également provoquer un stress ponctuel : • les périodes de jeûne (6 heures pour le test du sucre et 12 heures pour le test des lipides) sont susceptibles d’engendrer un inconfort modéré • l’injection de sucre et le gavage d’huile sont associés à une douleur ou un stress transitoire • les prélèvements sanguins se font à partir d’une petite incision (< 1 mm) à l’extrémité de la queue, provoquant une légère douleur momentanée. Au total, six prélèvements de sang seront réalisés pendant le test de tolérance au sucre (une goutte à chaque fois) et quatre prélèvements pendant le test de tolérance aux lipides, sans contention, induisant un stress temporaire. • le placement en cage individuelle pendant les 2 heures suivant l’injection de sucre peut également être une source de stress. En fin de protocole, les animaux seront anesthésiés par injection dans le ventre avant le prélèvement sanguin intracardiaque. Cette étape entraîne une brève douleur et un stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de collecter les tissus d’intérêt et de procéder aux analyses permettant de répondre à l’objectif du projet.

Remplacement

À ce stade, une étude chez l’Homme n’est pas possible, car les oléogélateurs X et Y n’ont pas encore reçu d’autorisation de mise sur le marché. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de la consommation d’huiles de colza rendues solides sur le fonctionnement du métabolisme, en particulier sur la prise alimentaire, la gestion des graisses et des sucres par l’organisme, ainsi que sur les phénomènes inflammatoires. Ces effets résultent de l’action conjointe de plusieurs organes (intestin, foie, tissu adipeux, muscle et cerveau). Ils ne peuvent pas être étudiés de manière satisfaisante à l’aide de cultures de cellules isolées ni de modèles informatiques. Le recours à un modèle animal complet est donc nécessaire pour évaluer l’effet global de ces formulations alimentaires sur l’organisme.

Réduction

La taille des groupes a été déterminée à l’aide d’un calcul permettant de définir le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Ce calcul a conduit à un effectif de 15 souris par groupe. Ce nombre correspond au minimum requis pour obtenir des résultats solides et interprétables, tout en limitant strictement le nombre d’animaux utilisés, conformément au principe de réduction. Le nombre de groupes expérimentaux a été limité aux conditions strictement nécessaires grâce à une étude pilote préalable, qui a permis de vérifier que les croquettes étaient bien consommées par les souris et n’entraînaient pas de modification du comportement alimentaire. Cette approche progressive a permis d’éviter l’utilisation inutile d’animaux.

Raffinement

Plusieurs précautions seront prises pour limiter au maximum stress, douleur et inconfort des animaux, tout en assurant la qualité des résultats. Les manipulations seront réalisées par deux personnes expérimentées (gestes rapides, cohérents et réalisés avec douceur, moins de stress). Les animaux seront surveillés trois fois par semaine. Leur consommation de nourriture sera vérifiée chaque semaine par cage, et leur poids sera mesuré individuellement une fois par semaine. Tout changement de comportement, d’apparence ou d’état général sera immédiatement pris en compte. Pour la mesure de la composition corporelle, un apprentissage préalable sera réalisé (une semaine avant) afin d’habituer les souris à entrer dans le tube de mesure. Cette étape vise à minimiser le stress et à éviter les mouvements brusques durant la procédure, qui dure moins de deux minutes. Pour les tests métaboliques, les quantités administrées (solution sucrée ou huile) sont limitées afin de réduire l’inconfort. Une seule incision de 1 mm sera réalisée à l’extrémité de la queue pour chaque test (pour les prélèvements suivants il suffit simplement de gratter la petite croûte avec une compresse). Les prélèvements sanguins se font sans contention. Les tests seront espacés d’une semaine pour laisser aux animaux le temps de récupérer. Lors du test du métabolisme des sucres, si la glycémie d’un animal ne revient pas à la normale dans les 90 minutes suivant l’injection, un suivi supplémentaire sera réalisé à 240 min, puis à 360 min si nécessaire. À la fin de l’étude, les animaux seront anesthésiés afin de permettre le prélèvement sanguin final. La mise à mort sera ensuite effectuée rapidement par dislocation cervicale. Des points limites prédictifs et adaptés à l’étude ont été établis afin de détecter précocement toute souffrance ou altération de l’état général.

Choix des espèces

La souris représente le modèle le plus approprié pour notre projet. La majorité des études publiées dans le domaine de la nutrition et du métabolisme utilisent cette espèce, ce qui permet la comparaison de nos résultats avec la littérature. Sur le plan physiologique, la souris présente un métabolisme des graisses proche de celui de l’Homme. Ces similitudes en font un modèle de référence pour l’étude des effets métaboliques de nouvelles formulations lipidiques. Par ailleurs, les souris présentent une réponse métabolique stable aux régimes riches en lipides, ce qui permet de limiter la variabilité et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Le recours à la souris est justifié pour évaluer les impacts physiologiques des huiles de colza gélifiées, dans des conditions contrôlées et scientifiquement transposables à l’Homme. Enfin, l’étude pilote permettant de sélectionner les différents types de croquettes testées ici a été réalisée chez la souris. L’administration des croquettes enrichies en différentes huiles et gélifiants débutera chez des souris âgées de 8 semaines, comme au cours de l’étude pilote. À cet âge, les animaux ont terminé leur période de sevrage et le changement de régime alimentaire est généralement bien toléré. Ce moment du développement est également optimal pour éviter que d’éventuelles variations physiologiques observées ne soient confondues avec des effets liés à la croissance (chez des animaux trop jeunes) ou au vieillissement (chez des animaux plus âgés).

Quarante heures d'isolement en cage individuelle sans enrichissement, vingt heures sur grille pour récolter urines et selles, un jeûne avant chacun des huit prélèvements de sang : 3 450 souris subissent ces procédures, classées en souffrance modérée, toutes tuées pour prélever tissus et sang. Un régime enrichi en cholestérol et en acides biliaires leur fait développer des calculs biliaires, avec inflammation du foie, sensibilité accrue à la douleur abdominale et jaunisse possibles, chez des souris génétiquement modifiées qui développent déjà spontanément la maladie. Le porteur qualifie ces complications hépatiques et intestinales de modérées tout en choisissant ce modèle pour étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Il revendique le nombre minimal d'animaux, et cette version du projet en ajoute 1 650 à l'autorisation initiale.

Objectifs

La formation de calculs biliaires peut entrainer des dysfonctions biliaires, hépatiques et intestinales importantes, notamment une inflammation sévère du foie qui peut elle-même entrainer un hépatocarcinome ou autrement appelé cancer du foie. Le but de ce projet est de modéliser ces dysfonctions en provoquant la formation de calculs biliaires et ainsi pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments. L'AJOUT D'UNE PROC2DURE NECESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISE AVEC AJOUT DE 1650 SOURIS.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de valider ou non des traitements limitants le développement de calculs biliaires et donc l’apparition des complications hépatiques et intestinales associées.

Procédures

Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles sur animal vigile ou anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 8 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. A maximum 4 étapes, nous mesurerons divers paramètres urinaires et fécaux (récolte pendant 20h par l’intermédiaire de cages à métabolisme). A maximum 2 étapes, nous mesurerons la composition corporelle (2 min sur animal vigile), la consommation énergétique (40h en cage individuelle sans enrichissement sur animal vigile), la force musculaire (5 minutes sur animal vigile).

Impact sur les animaux

1) La mise sous régime enrichi en cholestérol et en acide biliaire, va accentuer la formation de calculs biliaires. 2)Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3) Les mises à jeun (4h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress. 4)Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 20h. 5)Les mesures de consommation énergétiques impliquent un isolement pendant 40h, ce qui induit un stress à l'animal. 6)Les souris génétiquement modifiées développent spontanément une pathologie chronique. Ces évolutions de la maladie peuvent entrainer des modifications du comportement général, telles que : baisse d’activité, poil terne, diminution de la prise alimentaire ou perte de poids, augmentation possible de la sensibilité à la douleur abdominale ou à l’inconfort lié à l’inflammation chronique, une jaunice dans le sang.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno-marquages et expression de gènes, paramètres métaboliques...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développés pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions associées à la formation de calculs biliaires notamment au niveau du foie et de l’intestin ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. Une analyse statistique permettra d'utiliser le nombre minimal d'animaux tout en assurant la robustesse des résultats.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux. L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une rougeur ou plaies cutanées, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront.

Choix des espèces

La souris développe des calculs biliaires sous régime lithogénique entrainant des complications hépatiques et intestinales de façon modérée. La souris génétiquement modifiée est dépourvue de certains transporteurs, ce qui engendre une accumulation de lipides dans le foie et une accumulation d’acides biliaires dans la circulation sanguine et dans la bile. En utilisant ce modèle génétiquement modifié et prône à développer des calculs biliaires, cela nous permet d’exacerber l’effet du régime lithogénique et donc d’étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Les animaux sont mis sous régime à l’âge de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge de maturité sexuelle.

Porteuses par construction génétique d'une mucoviscidose, les souris de ce projet développent un amaigrissement, des difficultés respiratoires et une constipation qu'un laxatif administré en continu dans l'eau de boisson doit atténuer. 128 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatre-vingts subissent une injection intrapéritonéale par jour pendant six semaines, une mesure de glycémie hebdomadaire par coupe de l'extrémité de la queue, et des tests métaboliques de deux heures comportant cinq prélèvements sanguins. Une perte de poids supérieure à 15 % déclenche la mise à mort, les autres étant tuées en fin de procédure pour le prélèvement du pancréas et des tissus enflammés.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique qui touche environ une naissance sur 3 500 en France. Elle est causée par une anomalie d’un gène qui perturbe le fonctionnement d’une protéine essentielle à la régulation des sécrétions dans l’organisme. Cette anomalie rend le mucus trop épais et collant, ce qui provoque principalement des atteintes respiratoires et digestives chroniques. Grâce aux importants progrès médicaux, l’espérance de vie des personnes atteintes de mucoviscidose a fortement augmenté : elle est passée d’environ 7 ans dans les années 1960 à plus de 50 ans aujourd’hui. Cette avancée permet aux patients de vivre plus longtemps, mais elle s’accompagne aussi de l’apparition de nouvelles complications liées au vieillissement, appelées comorbidités. Parmi elles, le diabète associé à la mucoviscidose est l’une des plus fréquentes. Il concerne près de 50 % des adultes atteints. Ce diabète est dû à un mauvais fonctionnement du pancréas, l’organe qui produit l’insuline et régule le taux de sucre dans le sang. Dans la mucoviscidose, les canaux du pancréas peuvent se boucher, entraînant une inflammation persistante qui abîme progressivement l’organe et favorise l’apparition du diabète. Des travaux réalisés dans notre laboratoire suggèrent que certains mécanismes impliqués dans l’inflammation du pancréas pourraient jouer un rôle important dans l’apparition de ce diabète. Sur la base de ces observations, nous souhaitons mieux comprendre comment ces mécanismes participent à la dégradation progressive du pancréas dans la mucoviscidose. Ce projet de recherche vise donc à étudier l’état inflammatoire du pancréas dans des modèles de la maladie et à évaluer si certaines approches thérapeutiques pourraient permettre de réduire cette inflammation et de préserver le fonctionnement du pancréas. Cette étude contribuera à améliorer les connaissances sur les mécanismes responsables des complications métaboliques associées à la mucoviscidose et pourrait, à terme, aider à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des personnes atteintes.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de construire une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans le diabète associé à la mucoviscidose et d'identifier des cibles potentielles afin de proposer une stratégie thérapeutique plus complète, capable de limiter la progression du diabète chez les patients atteint de mucoviscidose, améliorant, ainsi leur qualité de vie.

Procédures

Les animaux de la procédure 1 (48 souris) subiront un prélèvement de la durée de quelques secondes d'un très petit volume sanguin pour mesurer leur glycémie et un prélèvement de 70 microlitres de sang à la queue pour le dosage d’insuline plasmatique. Ce prélèvement dure moins d'une minute. Les animaux de la procédure 2 (80 souris) subiront plusieurs prélèvements d'un très petit volume sanguin pour mesurer leur glycémie 1 fois par semaine pendant toute la durée du traitement (6 prélèvements sur 6 semaines). Ce prélèvement dure quelques secondes et engendre une douleur légère. Ils subiront 2 prélèvements de sang pour les dosages d'insuline (70 microlitres) : - un prélèvement avant et un prélèvement à la fin du traitement. Ce prélèvement dure moins d'une minute. Les animaux de la procédure 2 subiront des injections répétées de traitement pouvant engendrer une douleur légère (1 injection par jour pendant 6 semaines). Durant les tests métaboliques d'une durée de 2 heures, la 80 souris subiront une injection et 5 prélèvements d'un petit volume sanguin pour le dosage de l'insuline plasmatique et la mesure de glycémie (prélèvement de la durée de moins d'une minute).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont principalement dues au phénotype dommageable des souris mutantes. Dans les 2 lignées utilisées, les mutations touchent le gène impliqué dans la mucoviscidose (2 modifications génétiques différentes) induisant des symptômes proches de ceux des patients atteints de la mucoviscidose : amaigrissement, difficultés respiratoires ou constipation. L’utilisation d’un laxatif dans l’eau de boisson en continu permet de réduire les symptômes de constipation et donc d’amaigrissement. La mise à jeun des animaux constitue une nuisance, correspondant à une privation alimentaire temporaire, susceptible d’entraîner un inconfort transitoire. De plus, des légers effets indésirables seront liés à la piqure lors de l'injection répétée intrapéritonéale du traitement (ou de la solution saline), mais également à la piqure lors de l'injection du glucose, de l'insuline et du pyruvate pendant les tests métaboliques in vivo, ainsi qu'à la coupe de l'extrémité de la queue lors des prélèvements de sang.

Devenir

A l'issue de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort pour permettre les prélèvements des tissus d’intérêt.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans ce projet, puisque l’étude de la mucoviscidose et du DAM ne peut se faire que sur un organisme vivant dans son intégralité afin d’étudier la réponse physiologique globale de l’organisme au traitement. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes qui présentent une inflammation importante (pancréas, poumon, intestin), aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou ex vivo.

Réduction

La stratégie expérimentale visera à étudier les mécanismes impliqués dans l'inflammation du pancréas. Nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur et de valider statistiquement les différences détectées entre les groupes. Pour les tests in vivo des différences significatives pourront être démontrées à partir de groupes de 8 animaux (en référence à nos études précédentes et en accord avec les résultats de tests statistiques).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoir ventilé en groupe pour respecter leur comportement social naturel. Pour les souris mutantes, en raison de leur symptômes digestif, un laxatif doux sera administré en continu dans l'eau de boisson, ce qui permet de réduire l'inconfort digestif. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance portant sur l'apparence physique (manque de toilettage, poils ébouriffés, dos arrondi), le comportement (modification de la prise alimentaire, prostration) et les modifications de poids. Une grille de scoring et des points limites seront mis en place. L'inconfort généré par la piqure d'aiguille sera limité en alternant le coté d'injection. Le traitement pharmacologique pourrait engendre une perte de poids. Si celle-ci est supérieur à 15% l'animal concerné sera mis à mort. Les tissus seront prélevés après la mise à mort qui sera effectuée selon les procédures recommandées pour assurer leur confort et limiter la souffrance

Choix des espèces

Nous développerons notre projet en utilisant deux lignée de souris transgéniques qui présentent des symptômes similaires à la mucoviscidose humaine avec une maladie intestinale chronique aboutissant à une obstruction intestinale en absence de traitement. Les grandes similitudes que ces modèles présentent dans sa physiopathologie avec la maladie chez l’homme, les rendent un modèle de choix pour étudier la mucoviscidose et les maladies associées, telle que le DAM. L’utilisation conjointe des deux modèles murins se justifie par l’absence de caractérisation pancréatique détaillée de ces deux modèles, en particulier concernant l’inflammation et la fonction endocrine. Leur comparaison est nécessaire pour déterminer si les altérations pancréatiques sont liées à l’absence complète ou à une dysfonction partielle du gène impliqué dans cette maladie. Cette approche comparative permet d’optimiser les informations obtenues tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte et seront âgés de 4 à 6 mois au moment du traitement car nous étudions les effets de l'inhibition à l'âge adulte.