Système endocrinien

Tester les molécules candidates de clients contre l'inflammation liée à l'obésité : un laboratoire de recherche contractuelle va utiliser 600 souris et 300 rats dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont d'abord rendus obèses par un régime hypercalorique prolongé, puis soumis à un à six jeûnes de deux à douze heures, jusqu'à six tests de tolérance au glucose ou à l'insuline de deux heures trente, des séjours de 72 à 120 heures seuls en cage de calorimétrie, des injections répétées du composé du client et des prélèvements sanguins. Le porteur ramène les nuisances de la surcharge pondérale à un "léger inconfort" pour la mobilité dans la cage, et indique que l'enrichissement peut varier "en concertation avec le souhait du client". Tous les animaux sont tués en fin de procédure pour prélever leurs organes et caractériser leur statut inflammatoire et métabolique terminal.

Objectifs

Le surpoids est défini comme une accumulation excessive de masse grasse dans l’organisme. L’obésité est une maladie chronique complexe définie comme une accumulation excessive de masse grasse pouvant altérer l’état de santé d’un individu. Actuellement, 2,5 milliards de personnes dans le monde sont atteintes de surpoids, dont plus de 800 millions sont obèses (OMS, 2022). La prévalence du surpoids ne cesse de croître depuis les dernières décennies et l’un des facteurs prépondérants de cette évolution est la surconsommation de régimes déséquilibrés, riches en graisses et en sucres. L’obésité s’accompagne d’une inflammation systémique constante et d’intensité faible voire modérée, dite de bas-bruit. Cet état inflammatoire chronique contribue à développer d’autres maladies, telles que le diabète, la stéatose hépatique et bien d’autres, et cause ainsi quelques millions de morts chaque année. Dans ce contexte, l’importance de contenir ce statut inflammatoire et surtout, de stimuler sa résolution, est capitale. L’administration prolongée de régime hypercalorique chez le rongeur est l’un des moyens les plus simples et les plus couramment utilisés pour modéliser le surpoids et l’obésité chez l’animal. En faisant varier la durée du régime ainsi que sa valeur calorique, ce modèle permettra de collecter et d’étayer des données cruciales sur les mécanismes inflammatoires cellulaires et moléculaires impliqués. Le premier objectif consiste donc à détenir au sein de notre laboratoire le modèle de surpoids/obésité induit par un régime hypercalorique. Notre laboratoire étant un organisme de recherche contractuelle, notre activité consiste à étudier le potentiel résolutif de molécules candidates dans différents contextes inflammatoires, ici dans l’obésité. Ainsi, l’objectif final de ce projet est de tester l’administration conjointe de molécules candidates dans la résolution de l’inflammation induite par le surpoids ; et ainsi contribuer à terme à réduire voire supprimer l’impact délétère de l’obésité à tous les niveaux ; humains, sociaux, sociétaux et économiques. De plus, l'ajout d'une méthode d’analyse métabolique nécessite une modification du projet initial autorisé sans ajout d’animaux, faite dans un 2eme EU. Le projet devient multisite : Cette APAFIS est une modification d’un projet autorisé.

Bénéfices attendus

Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des altérations induites par le surpoids/obésité. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour réduire les altérations multiples dues au surpoids et à l’obésité.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être soumis à : 1. 1 à 6 cessions de jeûne d’une durée de 2h à 12h sur la période diurne ou nocturne, espacées d’une semaine minimum. (EU0548 (Nouveau EU0775)_ EU 1/2) 2. Au maximum, 6 tests de tolérance au glucose et/ou à l’insuline (durée 2h30 environ). (EU0548 (Nouveau EU0775)_ EU 1/2) 3. Des mesures de composition corporelle, l’acquisition dure au maximum 2 minutes et cette mesure sera effectuée 1 à 5 fois au cours du protocole. (EU0549_EU 2/2) 4. Des expériences de calorimétrie : les souris seront isolées en cage individuelles entre 72h et 120h. Chaque animal sera soumis une seule fois à ce genre de procédure. (EU0549_EU 2/2) 5. Des administrations répétées du composé-client selon les modalités suivantes : Les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéales, sous- cutanées, intravasculaires, intradermiques. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront moins d’une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). (EU0548 (Nouveau EU0775)_ EU 1/2) 6. Un prélèvement sanguin unique ou répété, précédé ou non d’un jeûne de 2 à 6h, suivi d’une semaine de récupération minimum sur souris vigile ou anesthésiée et sur rats anesthésiés, selon le volume prélevé. La durée d’un prélèvement sera de l’ordre d’une minute par animal; (EU0548 (Nouveau EU0775)_ EU 1/2)

Impact sur les animaux

Les trois principales nuisances attendues concernent la surcharge pondérale des animaux, la réalisation de prélèvements sanguins répétés sur la durée du protocole expérimental, l’administration répétée des molécules- clients à tester. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les types d’injection (intrapéritonéale, sous-cutanée, gavage, intradermique, intravasculaire). La surcharge pondérale pourra induire un léger inconfort chez les animaux, en comparaison avec des souris de poids normal, notamment pour leur mobilité au sein de la cage.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire et métabolique terminal.

Remplacement

Lorsque ce sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement ou en complément des tests animaux afin de remplacer le nombre d'animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement complet de l'expérimentation animale par des essais in vitro n'est pas envisageable pour une étude portant sur le surpoids. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires et cellulaires de la physiopathologie d'un animal entier. De plus, les étapes de validation d'une molécule thérapeutique nécessite qu'elle soit testée chez l'animal avant de pouvoir passer à l'étape de validation suivante : l'Homme.

Réduction

La problématique de ce projet faisant intervenir la régulation métabolique et inflammatoire sur du moyen/long terme (semaines, mois), induit intrinsèquement une variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes (n=12 souris / groupe expérimentaux). Le nombre de rats et de souris nécessaires a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples, en particulier sur des protocoles de plus courte durée. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. D’autre part, si plusieurs prélèvements sanguins sont à réaliser, nous les réaliserions sur des animaux dédiés (6 et 6 au sein d’un même groupe) afin de respecter les volumes, les délais de récupération et limiter le nombre de gestes invasifs sur un même animal. Enfin, nous utiliserons en priorité (sauf exigence spécifique de la part de nos clients) des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. C’est la conjonction de tous ces éléments qui nous a conduit à considérer des groupes de 12 animaux maximum.

Raffinement

Leur environnement sera enrichi (igloo, carré de coton et buchette de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole. Une boule en bois et/ou tunnel pourront être ajoutés, en concertation avec le souhait du client) afin de leur permettre de se distraire, d’éveiller leur curiosité et de réaliser un peu d’activité physique. Les animaux seront vus quotidiennement. En cas de signe de mal-être (défini dans la procédure), un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Enfin, l'utilisation de rats et de souris comme modèle de surpoids/obésité est très largement documentée dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), car toutes leurs fonctions biologiques sont alors matures. L'âge des animaux pourra exceptionnellement être inférieur à 7 semaines, si le client souhaite étudier les conséquences du surpoids/obésité juvénile sur l'âge adulte. Dans ce cas, le régime hypercalorique pourra débuter au plus tôt à l'âge de 3 semaines.

Anesthésiées, saignées jusqu'à cinq fois, opérées pendant une heure pour interrompre puis rétablir la circulation sanguine dans un rein, 360 des 480 souris de ce projet subissent une ischémie-reperfusion rénale. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les douleurs postopératoires peuvent se manifester pendant environ 72 heures et annonce des antalgiques. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever des organes, ensuite placés dans une banque mutualisée avec d'autres projets.

Objectifs

La transplantation est aujourd’hui une solution reconnue pour soigner des patients dont un organe ne fonctionne plus. Mais il y a un vrai problème : le manque d'organes de qualité à greffer. Les médecins doivent donc parfois utiliser des organes dits "marginaux", provenant de personnes âgées ou ayant eu certains problèmes de santé. Ces organes sont plus fragiles et réagissent mal à un phénomène appelé ischémie-reperfusion. Ce phénomène se produit inévitablement lors d’une transplantation. Il correspond à l’arrêt temporaire de la circulation du sang dans l’organe, puis à son retour. Cela provoque un manque d'oxygénation et des lésions qui abîment fortement l’organe et peuvent compromettre la réussite de la transplantation. Il est donc primordial de développer des stratégies thérapeutiques afin de limiter ces lésions. Des travaux précédents ont montré que la régulation de certaines molécules énergétiques appelées métabolites permettrait de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion et ainsi améliorer la qualité du greffon rénal. Ce projet cherche à mieux comprendre comment certains métabolites et les transporteurs qui les font circuler, protègent les reins de souris contre les dommages causés par un manque temporaire de circulation sanguine et donc d’oxygènation.

Bénéfices attendus

A court et moyen termes, ce projet permettra d’identifier les mécanismes cellulaires et tissulaires mis en jeu par les transporteurs de métabolites afin de définir une cible thérapeutique protectrice des lésions induites par l’ischémie-reperfusion rénales. A long terme, ces résultats pourront être étendus à d’autres organes, tels que le foie, le coeur, le pancréas. Ce projet vise à améliorer la qualité, la fonction et la survie des greffons après transplantation chez l’humain.

Procédures

Tous les actes décrits se feront sous anesthésie. Tous les animaux (480) subiront au maximum 5 prélèvements de sang (durée de moins de 1 minute) et 1 injection (durée de moins de 1 minute) ou 1 chirurgie (durée de moins de 15 minutes) pour administrer des molécules d'études des récepteur aux métabolites. Les prélèvements de sang (durée de moins de 2 minutes) seront espacés d'au moins 2 jours. Une partie des animaux (360) aura en plus une chirurgie d'une durée de 1 heure pour provoquer une ischémie-reperfusion et auront un maximum de 2 injections (durée de moins de 1 minute) pour administrer des molécules d'études des récepteur aux métabolites.

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un stress transitoire peu intense et un léger inconfort au réveil d'une quinzaine de minutes. Suite au prélèvement sanguin sous anesthésie, un stress de moins de 5 minutes peut être observé chez l'animal. Suite à la chirurgie sous anesthésie générale, les douleurs, qui peuvent se manifester pendant environ 72 heures, seront minorées par l'utilisation d'antalgiques. De plus, après chirurgie, peuvent être observées une légère perte de poids, une fatigue et une légère perte d'activité qui disparaissent sous 72 heures. Les prises de sang répétées sous anesthésie (acte de moins de 2 minutes) peuvent induire des douleurs qui peuvent se manifester pendant moins de 4 heures, ces douleurs seront minorées par l'utilisation d'antalgiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédures. Des prélèvements d’organes et tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

A ce jour, il existe des modèles in silico et in vitro permettant de recréer un rein, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la physiologie rénale. Il est donc nécessaire d’évaluer sur un organisme entier, en utilisant un modèle animal, l'impact d'une réponse systémique suite à une séquence d’ischémie-reperfusion.

Réduction

Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi régulier de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape. Les prélèvements sanguins et injections seront réalisés sous anesthésie en asepsie stricte. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie stricte, sous anesthésie générale, et les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire.

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. Des souris adultes seront utilisées ; ce stade de développement est approprié pour ce type d'étude nécessitant des reins matures notamment au niveau du réseau de vaisseaux sanguins.

Quand l'injection d'insuline fait tomber leur glycémie sous 40 mg/dL, les souris reçoivent du glucose pour les remonter. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après seize semaines d'exposition à une privation intermittente d'oxygène pour prélever leurs organes. Elles sont habituées progressivement au tube de contention servant aux mesures de pression artérielle, transportées entre trois établissements distincts, et certaines portent un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Le porteur écrit que dix animaux par groupe suffisent pour ses analyses métaboliques et que cinq suffisent pour la télémétrie, sans détailler comment ces effectifs aboutissent aux 390 souris déclarées pour ce volet.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.

Procédures

Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines : 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles subissent trois séries de tests de stimulation à l'insuline, au glucagon, à l'adrénaline ou à la dexaméthasone, trois électrocardiogrammes et trois échographies sous anesthésie, quarante-huit heures en cage de mesure des échanges gazeux, et des mesures de pression artérielle en tube de contention. Le protocole, réparti sur trois établissements voisins entre lesquels les animaux sont transportés, prévoit aussi soixante-dix chirurgies de trente minutes pour implanter un émetteur de télémétrie, suivies de quatorze jours de surveillance. La thérapie espérée contre les dérèglements métaboliques de l'apnée du sommeil reste énoncée au conditionnel, quand la privation d'oxygène, elle, court sur quatre mois.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.

Procédures

Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

Pour comprendre comment un transporteur intestinal du fructose influe sur la glycémie, 1 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever pancréas, foie, intestin et contenu du cæcum. Chaque animal reçoit trois gavages de glucose, une injection, jusqu'à six prélèvements sanguins et cinq coupures à l'extrémité de la queue, et subit deux jeûnes de quatre et six heures. Le porteur décrit ces gestes comme un stress de moins de vingt secondes et affirme que les jeûnes n'entraînent aucune hypoglycémie. Il justifie l'espèce par des lignées génétiquement modifiées disponibles uniquement chez la souris et par l'absence, selon lui, de tout modèle capable de simuler in vitro les interactions entre organes.

Objectifs

La régulation de la glycémie est placée sous le contrôle de l’insuline dont la sécrétion est fortement stimulée par le glucose lui-même et pas du tout par le fructose, lequel représente pourtant 50% des sucres consommés dans notre alimentation. Le fructose est structurellement proche du glucose mais est transporté, notamment au niveau de l’intestin, par un transporteur spécifique qui ne transporte que le fructose et est ensuite métabolisé par une enzyme également spécifique au fructose. Les souris dont ce transporteur ou cette enzyme ne sont pas présents, absorbent mal le fructose et présentent une modification de leur flore intestinale. De façon intéressante, elles présentent également une forte augmentation de leur glycémie et une diminution de l’insuline dans le sang. De plus, ces variations de glycémie ne sont pas les mêmes en fonction de leur alimentation. Ainsi, La découverte d’une nouvelle voie de régulation de la glycémie via ce transporteur et cette enzyme spécifique du fructose liée à l’alimentation, semble très importante à caractériser et c'est le but du projet proposé. Ce travail vise à déterminer chez des souris mâles et femelles qui absorbent mal le fructose, quel est l’effet de l’alimentation sur la régulation de la glycémie et quels sont les mécanismes impliqués via l’utilisation de différents régimes connus pour interagir avec la flore intestinale.

Bénéfices attendus

Les caractéristiques observées chez les souris dépourvues du transporteur du fructose et de l’enzyme responsable de sa métabolisation, à savoir une importante augmentation de la glycémie et une baisse du taux circulant d’insuline, reflètent ce qui est observé dans le diabète de type 1. Le diabète de type 1 représente environ 10% des cas de diabètes en France et dans le monde. Depuis une vingtaine d’années, le nombre de personnes atteintes de diabète de type 1 ne cesse d’augmenter (+ 3 à 4% /an). Les raisons de ces évolutions sont inexpliquées à ce jour, mais certaines modifications de l’environnement et leurs interactions avec le génome sont suspectées telles que les facteurs nutritionnels ou la modification de la flore intestinale. Bien que le fructose soit suspecté de conduire à la mise en place d’un diabète de type 2 (mise en place progressive de l’insulino-résistance) le rôle de son transporteur et de la principale enzyme de son métabolisme, dans la sécrétion de l’insuline et dans la régulation de la glycémie n’a jamais été étudié. Notre projet permettra possiblement d’identifier une nouvelle voie impliquée dans cette régulation et peut-être de mettre en évidence des cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

Les animaux vigiles recevront 3 gavages de glucose (intervention d’une durée inférieure à 5 secondes), 1 injection (intervention d’une durée inférieure à 5 secondes), 5 petites coupures à l’extrémité de la queue (intervention d’une durée inférieure à 1 seconde) et ils auront au maximum 6 prélèvements sanguins (intervention d’une durée inférieure à 20 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages, prélèvements et de l’injection (moins de 20 secondes). Les animaux seront soumis à stress lors du passage de leur salle d’élevage à la salle d’expérimentation. Les animaux seront soumis à une légère douleur lors des prélèvements et lors de l’ injection. Les souris seront soumises à 2 périodes de jeûne (4 et 6h) ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever et analyser certains tissus (pancréas, foie, intestin et contenu de caecum).

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro ou ex vivo permettant de simuler les interactions inter-organes impliquées dans le contrôle de la glycémie d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des paramètres spécifiques à chaque souris (génétique, microbiote, alimentation) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie, insulinémie), des tissus producteurs d’hormones (pancréas), intestinaux (tissus permettant de stimuler la sécrétion d’insuline via la production de molécules de type hormonales) et impliqués dans le métabolisme des sucres (foie).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 10souris par groupe expérimental, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives. De plus, nous avons fait le choix d’utiliser les mêmes groupes de souris ente 6 et 19 semaines et de n’effectuer les prélèvements finaux de tissus qu’à 19 semaines afin de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la contention avant le démarrage des gavages pour limier le stress lors de la procédure expérimentale. Les expérimentations étant effectuées dans une salle différente de la salle d’élevage les animaux seront habitués à la salle d’expérimentation et maintenus dans leur cage d’élevage avec les mêmes congénères afin de réduire le stress. Les animaux seront surveillés visuellement 1 fois par semaine et leur poids mesuré 1 fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques. De plus, les données préliminaires existantes ont été obtenues à partir de ces modèles animaux qui sont des modèles génétiques originaux disponibles uniquement chez les souris et surtout nécessaires pour décrypter le mécanisme posé ici (rôle du transporteur et du métabolisme du fructose dans la régulation de la glycémie). Il est désormais bien établi que la nutrition lors de la gestation et de l’allaitement, joue un rôle clé dans la programmation métabolique à long terme. Dans cette optique, l’alimentation durant les premières semaines de vie semble particulièrement déterminante dans l’établissement de la capacité à réguler la glycémie. Afin de clarifier l’impact de la nutrition au cours de cette période dite périnatale, nous comparerons les effets d’un apport en fibres et de la malabsorption du fructose sur la régulation de la glycémie, selon que ces interventions soient mises en place dès la naissance ou seulement à partir du sevrage. Nous avons choisi de travailler principalement sur des souris âgées de 6 semaines, car nos données préliminaires mettent en évidence des différences marquées au niveau de la glycémie et du taux d’insuline dans le sang à cet âge. Par ailleurs, afin d’évaluer la persistance ou non de ces différences au cours du temps, la mesure de la glycémie de ces mêmes animaux sera suivie et analysée également à 12 et 18 semaines d’âge.

1 440 souris, chacune pesée chaque semaine, gavée ou injectée, saignée neuf fois à l'état vigile puis mise à jeun dix-huit heures avant un dernier prélèvement, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant vingt semaines un régime riche en graisses ou en sucres destiné à leur faire développer une maladie du foie, puis des médicaments anti-inflammatoires dont l'équipe veut mesurer l'effet sur la fibrose. Toutes sont tuées à l'issue pour analyser leur foie. Le porteur affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour étudier ces effets de manière intégrée et que les explorations sur animal vigile ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie représentent plusieurs syndromes qui vont de la simple stéatose du foie à la stéatose du foie inflammatoire et peuvent évoluer vers la fibrose et le cancer. L'inflammation est un facteur clef de l'évolution de ces maladies. Dans ce projet, nous souhaitons tester des médicaments ayant un effet anti-inflammatoire. Lors de cette étude, des souris ayant développées ces maladies du foie par une alimentation riche en graisse et/ou en sucres seront traitées avec des médicaments et nous caractériserons l'évolution de ces maladies afin de voir les effets positifs de ces molécules et les voies impliquées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet est la potentielle mise en évidence d'un effet anti-inflammatoire et anti-fibrosant d'une nouvelle molécule pharmacologique. Nous pourrons en plus de cette mise en évidence étudier les voies impliquées dans la protection d'un régime

Procédures

La contention, le gavage et les injections causent un stress et une douleur modérée et de courte durée pour les animaux. Les animaux auront des injections (durée 15 secondes) ou des gavages (durée 1 mn/souris) et seront pesés une fois par semaine (30 secondes/souris). Un prélèvement de sang sera effectué 9 fois et prendra 1 mn/souris. Ils seront soumis un changement de régime ainsi qu’à une mise à jeun de 18h avec un prélèvement de sang (1mn/souris). Tous les prélèvements sont effectuées sur souris vigiles.

Impact sur les animaux

La contention, le gavage et les injections sont des sources de stress modéré pour les animaux. Les animaux seront soumis à des régulations nutritionnelles avec des changements de régime pendant 20 semaines pouvant induire un stress léger par une prise de poids avec possiblement une activité réduite . La mise à jeun peut entraîner un stress modéré aux souris.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin d'analyser l'effet des molécules sur le développement de la fibrose hépatique.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier de manière intégrée les effets de ces molécules sur l’inflammation et la fibrose. Par ailleurs, l'identification et la validation de ces cibles thérapeutiques nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo mimant le plus fidèlement la pathologie humaine ). La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement in vitro.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux nécessaires afin de vérifier nos résultats et les valider. Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

La durée des régimes utilisés et les traitements relatifs aux tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et lors de la mise à jeun l'accès à l'eau est conservé. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés entraînant la mise à mort anticipée si nécessaire. En effet, l’application des points limites établis pour chaque procédure de ce projet sera effectuée.

Choix des espèces

L’espèce souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons de souris adultes âgées de 10 à 30 semaines, car le métabolisme énergétique est régulé de manière différente chez les jeunes adultes et/ou pendant le vieillissement.

Tuées à l'issue du protocole pour qu'on leur prélève des tissus musculaires, 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont nourries dès l'âge de six semaines et jusqu'à trente semaines avec un régime enrichi en graisse et en sucre, puis reçoivent des injections sous-cutanées, jusqu'à trois par semaine pendant six semaines, avec pesées répétées. Le porteur indique que ce régime provoque obésité, diabète et stéatose hépatique, troubles qui peuvent engendrer de la douleur, et cherche à savoir si un antidiabétique fait perdre aux souris de la force et de la masse musculaires. Il affirme qu'il n'existe "aucun moyen de remplacer" de telles études et que "seule l'expérimentation animale" permet ce suivi.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérées comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline et au diabète de type 2. L'hypothèse générale est que l'augmentation des niveaux de tissu adipeux entraîne des changements fondamentaux dans la composition et la fonction des fibres musculaires, qui à leur tour conduisent à une altération de la fonction métabolique. L'obésité est un ensemble d'altérations métaboliques associées à la sédentarité et à la redistribution du tissu adipeux qui précèdent le diabète de type 2. La résistance à l'insuline du muscle est une altération métabolique majeure associée à l'obésité et au syndrome métabolique. En effet, le muscle est le principal tissu responsable de l'élimination du glucose stimulée par l'insuline. Les muscles squelettiques jouent ainsi un rôle important dans ce syndrome et sont des régulateurs de la masse corporelle totale et également de la consommation d'énergie des muscles. Pour traiter le diabète et l'obséité, de nouveaux traitements existent en modulant la satiété et la régulation du glucose. Ces molécules peuvent avoir de multiples rôles et ainsi influer sur la masse et la fonction des muscles. L'objectif de cette étude est de déterminer chez la souris obèse l'effet d'un traitement aigu ou chronique aux molécules antidiabétiques ou anorexigènes sur la fonction et la masse musculaire.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est de déterminer si un traitement aigu ou chronique à base de molécules thérapeutiques destinées à traiter le diabète ou à contrôler la prise de poids chez la souris obèse a un effet sur la fonction et la masse musculaire. On peut ainsi s'attendre à ce que ce type de molécule induise une diminution de la force musculaire associée à une perte de masse musculaire. La mise en évidence de ce problème serait primordiale pour le patient obèse traité par cette molécule car il serait alors possible de mettre en place une action préventive telle qu'un programme d'activité physique adapté pour renforcement musculaire.

Procédures

Les animaux sont nourris à partir de l'âge de 6 semaines chez le fournisseur avec un régime riche en graisse et sucre puis tout au long du protocole. Il y a une étude aigue où l'animal reçoit une injection sous-cutanée et sera pesé chaque jour pendant 3 jours. Dans une deuxième étude, l'animal reçoit trois injections sous-cutanées par semaine et sera pesé trois fois par semaine pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 30 semaines d’âge au maximum) avec des régimes enrichis en graisse et en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les pesées peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère au moment de l'injection.

Devenir

A la fin du protocole, tous les animaux utilisés seront euthanasiés pour prélever des tissus musculaires.

Remplacement

Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse pathophysiologique, et seule l’expérimentation animale permet un suivi complet des altérations métaboliques et musculaires associées au diabète, comme la résistance à l'insuline.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé en fonction de la littérature et à l’aide d'un logiciel d'analyse statistique. Il est ainsi nécessaire d’inclure 10 animaux par groupe en tenant compte du risque d'échec à la dissection et aux mesures de contractilité musculaire. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons un même animal pour plusieurs mesures.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. Nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel et la prise alimentaire seront mesurés afin de s'assurer de leur bien-être 3 fois par semaine pour le protocole long. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge. Des soins tels que l'hydratation et la mise en place de nourriture dans la litière, si nécessaire, seront effectués.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal parfaitement caractérisé et validé pour l'étude du diabète, de l'obésité et de la dysfonction musculaire, par la communauté scientifique en général et par notre laboratoire. Les animaux sont traités avec un régime riche en gras et sucre à partir de 6 semaines d’âge, pendant 16 semaines, chez le fournisseur afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique). Ils arriveront au laboratoire à l'âge de 22 semaines. Les tests démarrent 2 semaines après, soit au stade adulte, pour une durée de 3 jours ou de 6 semaines.

Nourries pendant seize à vingt-quatre semaines avec un régime destiné à leur provoquer obésité, foie gras et inflammation hépatique, une partie des souris reçoit en plus deux injections par semaine pendant douze semaines pour induire une fibrose du foie. 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du sang, du foie, du tissu adipeux et du nerf sciatique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un gavage quotidien pendant douze à vingt-quatre semaines, des jeûnes de six heures suivis de six prélèvements sanguins en deux heures, et le porteur décrit une neuropathie allant jusqu'à la perte de la sensibilité. L'objectif est de tester un médicament déjà développé pour limiter l'accumulation d'un lipide, sans que les trois analyses neurologiques annoncées soient nommées.

Objectifs

La neuropathie diabétique est une complication fréquente du diabète qui touche environ 40 pourcents des patients. Elle provoque une perte de sensation, en particulier dans les pieds, ce qui peut entraîner des blessures et, dans les cas graves, des amputations. Actuellement, il n'existe pas de traitement permettant de restaurer la sensibilité perdue. En plus du diabète, d'autres facteurs comme l'obésité et le syndrome métabolique peuvent aussi causer des atteintes nerveuses similaires. Des recherches ont montré qu'un certain type de graisse pourrait jouer un rôle important dans ces dommages nerveux. Un médicament a été développé pour limiter l'accumulation de ces lipides. Ce projet de recherche veut tester si le traitement employé pour limiter cette graisse particulière pourrait aussi être utile contre la neuropathie diabétique en réduisant la synthèse de ces dérivés lipidiques et en protégeant les nerfs. Si cela fonctionne, cela pourrait ouvrir une nouvelle piste de traitement pour améliorer la qualité de vie des patients diabétiques.

Bénéfices attendus

La neuropathie liée au diabète peut entraîner de graves complications, comme des plaies aux pieds pouvant aller jusqu’à l’amputation. En France, environ 8 000 amputations par an sont dues à cette maladie. Ce projet de recherche s’intéresse à certains lipides et à leur rôle potentiel dans ces atteintes nerveuses. Un médicament agit justement sur la synthèse de ces mdérivés lipidiques. L’idée serait d’explorer s’il pourrait aussi aider les patients diabétiques en réduisant le risque de complications graves, comme les amputations.

Procédures

Les animaux seront nourris avec des régimes spéciaux (régime induisant une obésité, un foie gras, une inflammation hépatique (animal vigil, en continu pendant 16 à 24 semaines ) ou un traitement injectable pour induire une fibrose hépatique (animal vigil, 2 fois par semaine pendant 12 semaines, 1 minute). Pour les animaux recevant le traitement ou un placebo, un gavage par jour sera réalisé pendant 12 à 24 semaines sur animal vigil, 1 min. Des explorations métaboliques seront réalisées pour explorer la sévérité du diabète (animal vigil, 2 fois car un pour le test de tolérance à l'insuline et un pour le test de tolérance au glucose), 6 prélèvements de sang de faible volume au total sur une période de 2h, après une mise à jeun de 6h) ainsi que des analyses neurologiques (2 tests sur animal vigil (2 et 10 min respectivement et 1 test sous anesthésie, 30min; chaque test étant espacé de 2 jours, 10 minutes). En fin de projet, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) risque de réduction de la prise alimentaire lié à la néophobie des souris au changement de régime, 2) la maladie hépatique induite par régimes spéciaux ou par injection bihebdomaire intrapéritoneale d'un traitement (douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille) et ses conséquences métaboliques avec insulinorésistance provoquant un diabète (polyurie-polydipsie) et une obésité et les conséquences sur le nerf (neuropathie périphérique avec troubles de la sensibilité ou perte de la sensibilité) 3) dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie 4) le stress et la douleur légère lié à la manipulation et la contention durant les tests métaboliques (tests de tolérance à l'insuline et test de tolérance au glucose) 5) le stress et la douleur légère de courte durée liée au prélévement de sang lors des tests métaboliques et durant les tests de sensibilité et de conduction nerveuse. 6) risque de perte de poids, d’hémorragie lié au prélèvement et risque d’hypoglycémie ainsi que la mise à jeun de 6h avec sensation de faim pour les tests métaboliques. 7) irritation oesophagienne liée au gavage quotidien du médicament testé

Devenir

A la fin de la période de maintien des animaux, les souris seront euthanasiées afin de prélever les tissus d’intérêt (sang, tissus adipeux, foie et nerf sciatique) en vue d’analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de comprendre l’influence du métabolisme lipidique en cas de MASLD (maladie métabolique du foie) sur la neuropathie périphérique. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Le nombre d'animaux pour notre étude est calculé pour avoir des résultats statistiquement fiables. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Le nombre total d’animaux sera de 960 souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. En cas d'obésité avec difficulté à se mouvoir, la nourriture sera déposée en fond de cage. Le change de la cage augmenté si necessaire pour s'adapter à la diurèse induite par le diabète et permettre aux souris de rester au sec. Les souris sous régime ou traitement fibrotique seront surveillées quotidiennement. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Les points limites sont évalués par un personnel compétent.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques d’obésité et de diabète ont été validés chez la souris. De plus sa physiologie est connue et il est bien décrit qu'un régime obésogène et/ou diabétogène est capable d'induire une insulinorésistance quelques semaines après le régime. Dans les protocoles, les souris seront mises en conditions expérimentales à partir de l'âge de 6-8 semaines afin que le métabolisme des animaux soit stabilisé.

Pour mettre au point une technique de synchronisation des chaleurs à partir de progestérone extraite de plantes, 52 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une ovariectomie sous anesthésie générale, opération d'une trentaine de minutes, suivie de 12 prélèvements sanguins à la jugulaire, les brebis entières en subissant 31. La finalité reste zootechnique, remplacer les hormones de synthèse par des molécules végétales dans la maîtrise de la reproduction des troupeaux. Les brebis ne sont pas tuées à l'issue, elles retournent à l'unité expérimentale où le porteur les décrit comme "potentiellement réutilisables".

Objectifs

Mise au point, pour l'élevage caprin et ovin, d'une technique de synchronisation des oestrus et des ovulations à partir de progestérone et molécules associées, issues de plantes, en remplacement des techniques actuelles qui utilisent des substances de synthèse issues de l'industrie du médicament. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

1. Mise au point d'une technique durable de synchronisation des oestrus et des ovulations chez la chèvre et la brebis. 2. Fin de l'utilisation de substances chimiques de synthèse, remplacées par des molécules naturelles issues de plantes 3. Meilleure connaissance des contenus de certaines plantes en progestérone et molécules associées et du déterminisme génétique de ces contenus

Procédures

1. Ovariectomies réalisées en une seule fois sous 1 anesthésie générale dans l'EU1. L'opération dure une trentaine de minutes. Elle est réalisée par un chirurgien expérimenté. 2. Prélèvements sanguins à la veine jugulaire réalisés par des techniciens expérimentés. Chacun de ces animaux fera l'objet de 12 (ovx) ou 31 (entières) prélèvements ponctuels. Chaque prélèvement dure quelques secondes et sera réalisé dans l'EU2. 3. Pose d'une éponge intra vaginale contenant du FGA sur 15 chèvres de la partie 2 (chèvres entières) réalisée dans l'EU 02.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations, de la phase pre opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible, ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthsie, une irritation de l'appareil respiratoire supérieur (lié à lintubation) peut apparaître, mais c'est rare. Un hématome peut apparaître suite aux prises de sang à la veine jugulaire, ainsi qu'aux injections intramusculaires, mais c'est rare. Du fait que la progestérone, au contraire d'autres stéroïdes comme l'oestradiol, est plutôt connue par ses effets protecteurs que néfastes sur le fonctionnement cellulaire et sur le système nerveux central, nous n'attendons pas de nuisances ou d'effets indésirables sur les animaux liés à l'administration de progestérone. Toutefois, compte-tenu du fait qu'il y a des molécules associées à la progestérone et d'autres composés encore inconnus dans la plante étudiée, nous mettrons en place au cours de l'expérimentation, des observations précises (troubles comportementaux, digestifs ou autres manifestations visibles) sur les animaux recevant les préparations testées.

Devenir

Les expérimentations prévues n'occasionneront aucun désordre de long terme ni aucune invalidité permanente. Les animaux retourneront donc dans l'unité expérimentale où ils seront potentiellement réutilisables.

Remplacement

Nous nous intéressons à une réponse physiologique complexe. Des méthodes de remplacement, telles que des cultures de cellules ou une modélisation mathématique, ne peuvent, du fait de cette complexité extrême, être utilisées.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été rationalisé afin de ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire, tout en conservant une bonne mise en évidence statistique. Sur la base d’un test-t et avec les concentrations de P4 attendues et des effectifs de 20(contrôle) et 20 (P4), on obtient une puissance de test de 100% .

Raffinement

Les animaux ovariectomisés recevront un traitement anti-douleur ; tous les animaux seront hébergés en groupe social sur paille et avec enrichissement (caisse en bois pour grimper). Le nombre de prises de sang a été réduit au minimum (ovx: 4 pour le premier jour et 2 par jour ensuite pendant 5 jours; entières : 1 par semaine pendant 3 semaines, puis 1 par jour pendant 4 semaines). Le transport des animaux entre l'EU1 et l'EU2, distants de 300 mètres, sera réalisé dans une bétaillère agréée, conduite par un chauffeur et un animalier diplômés et expérimentés. La vitesse sur le centre est limitée à 30 kms/heure et, de ce fait, n'occasionnera pas de trouble supplémenaire aux animaux. De la paille fraîche sera répandue sur le sol du véhicule prélablement nettoyé, ocassionnant ainsi un confort certain aux animaux transportés.

Choix des espèces

Les ovins sont une des espèces qui utilisent ces traitements en ferme sur le terrain. Aucun traitement de synchronisation analogue n’existe sur des espèces modèles de type souris, rat, poisson-zèbre ou C. elegans et l’effet mâle n’existe pas dans ces dernières espèces, ce qui justifie l’utilisation de l’espèce caprine choisie qui est, en même temps, l’espèce modèle et celle à qui s’adressera la technique si celle-ci débouche sur le terrain. Animaux adultes femelles et mâles (pour l'induction des ovulations), donc âgés de deux ans ou plus et qui sont choisis pour être dans la moyenne des âges des brebis et béliers en production susceptibles, dans les élevages cibles, de recevoir le traitement utilisant la la plante de nos campagnes contenant de la progestérone naturelle.