Système endocrinien

540 souris vont être utilisées, chacune subissant jusqu'à vingt-quatre prélèvements sanguins sur douze semaines de régime gras et sucré, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chez les autres, une injection unique détruit une partie des cellules du pancréas pour provoquer un diabète. Toutes reçoivent ensuite une mini-pompe implantée sous la peau lors d'une chirurgie de quinze minutes, puis passent un test de tolérance au glucose ou à l'insuline précédé de cinq heures de jeûne. Le porteur écrit que l'induction du diabète est "malheureusement strictement nécessaire", et que la mise à mort l'est tout autant, les organes devant être prélevés.

Objectifs

Les diabètes de type 1 et 2 sont caractérisés par une augmentation de la concentration du sucre dans le sang entrainant notamment des maladies du cœur et des reins mettant ainsi en jeu la vie des patients diabétiques. L’excès de sucre dans le sang se met en place lorsque le pancréas produit de façon insuffisante l’insuline qui est l’hormone capable de baisser la concentration de sucre dans le sang. La piste thérapeutique explorée vise à augmenter la production d’insuline par le pancréas pour traiter ces maladies à l’aide d’un traitement chronique. Les muscles squelettiques de souris peuvent produire différents facteurs capables d’augmenter le nombre de cellules productrices d’insuline sur des pancréas de souris mis en culture, en stimulant la formation de nouvelles cellules productrices d’insuline à partir de cellules souches du pancréas. L’objectif sera donc de tester si ces facteurs peuvent également agir chez la souris de laboratoire diabétique (dans un modèle de diabète de type 1 et un modèle de diabète de type 2), en augmentant le nombre de cellules productrices d’insuline et par conséquence la quantité d’insuline produite.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 1 est caractérisé par un déficit total en cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline, la seule hormone hypoglycémiante de l’organisme. Le diabète de type 2 est caractérisé par une résistance à l’insuline associée à une carence relative en insuline. En France, on dénombre 4,3 millions de personnes diabétiques. La prévalence augmente depuis des années et est passée de 5,6 pour cent en 2015 à 6,07 pour cent en 2021 (source Santé Publique France et Fédération Française des diabétiques). Si les tendances restent identiques, 520 000 personnes deviendront diabétiques d’ici 2027 en France. 90 pour cent des diabétiques sont atteints du diabète de type 2, maladie touchant préférentiellement les adultes et associée à l’obésité. 10 pour cent des patients sont atteints du diabète de type 1 dont le déclenchement est observé majoritairement chez l’enfant et est lié à une dérégulation du système immunitaire. Des traitements contre cette maladie existent avec notamment des anti-diabétiques oraux pour le diabète de type 2 et des injections quotidiennes d’insuline pour le diabète de type 1. Néanmoins, des nouvelles pistes de traitement doivent être explorées pour tenter de restaurer une production endogène d’insuline, permettant une régulation physiologique de la glycémie, notamment en stimulant la formation de nouvelles cellules productrices d’insuline dans le pancréas. Le projet actuel a donc pour objectif de définir le potentiel thérapeutique de différents facteurs administrés de manière continue pour restaurer chez la souris diabétique un nombre suffisant de cellules productrices d’insuline et ainsi permettre de normaliser la concentration de sucre dans le sang.

Procédures

Une partie des animaux connaitra une induction d’un diabète qui se fera par injection unique sur animal vigile d’une molécule nocive pour une population de cellules du pancréas (quelques secondes par animal) effectuée après une mise à jeun courte (4h). Des prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) effectués quotidiennement pendant 5 jours après l’injection permettront de confirmer l’induction du diabète. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal à raison de 5 prélèvements par animal sur la durée de maintien. Une autre partie des animaux sera nourri par un régime riche en graisse associé à l’administration de sucre dans l’eau de boisson pendant 12 semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) effectués 2 fois par semaines permettront de confirmer l’induction du diabète. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal à raison de 24 prélèvements par animal sur la durée de maintien. Les souris seront ensuite implantées par des mini-pompes en sous cutané lors d’une unique chirurgie effectuée sous anesthésie générale et analgésie afin de délivrer notre traitement en continue durant 28 jours. Cette chirurgie sera de 15 minutes par animal. A la fin des traitements, les souris seront soumises à l’un des deux tests pour évaluer soit la tolérance au glucose ou celle à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun courte (5h), les souris seront injectées au niveau de l’abdomen avec une solution et 5 à 7 prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les souris concernent l’induction d’un diabète chez les souris. Le diabète est associé à une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et éventuellement une perte de poids. L’induction de cette pathologie est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet puisque notre objectif vise à identifier des thérapies innovantes pour traiter le diabète. L’induction du diabète de type 1 sera effectuée par administration unique d’un agent par injection au niveau de l’abdomen pouvant être source de stress et d’une douleur de courte durée au point d’injection. L’induction du diabète de type 2 sera effectuée en alimentant les animaux avec un régime hyperlipidique et du sucre dans l’eau de boisson. Le changement de régime pourra induire un léger stress. De même, le suivi glycémique longitudinal des animaux pourra induire un stress et une douleur de courte durée. Les traitements reposent sur la pose de mini-pompes en sous-cutané qui implique une courte chirurgie effectuée sous anesthésie et analgésie. Cet acte pourrait causer différentes contraintes liées à l’acte chirurgicale lui-même et notamment des douleurs post-opératoires et les risques inhérents à une chirurgie (stress thermique ou arrêt cardio-respiratoire lors de l’anesthésie, inflammation locale au niveau des cicatrises ou encore dans de très rare cas une infection). Le traitement pourrait induire une production accrue d’insuline chez les souris non diabétiques. De ce fait, des épisodes d’hypoglycémies modérées pourraient prendre place chez les souris non diabétiques. D’autres effets secondaires pourraient être observés mais sont difficiles à prévoir et une surveillance accrue des souris sera réalisée quotidiennement. Les tests métaboliques, qui comprennent une injection intrapéritonéale puis plusieurs prélèvements sanguins de faible volume afin de suivre la glycémie, peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Ils peuvent également induire un stress et une légère sensation de faim pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun.

Devenir

Notre étude nécessite le prélèvement d’organes afin de caractériser l’effet des traitements mis en œuvre sur la pathologie étudié (le diabète). Ainsi, l’euthanasie des animaux est strictement nécessaire afin de répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Les cellules bêta pancréatiques produisent l’insuline qui va agir sur ses tissus cibles pour stimuler le stockage du glucose, inhiber la production de glucose et la lipolyse. Lorsque l’insuline est produite en quantité insuffisante, la concentration de glucose dans le sang n’est plus régulée et augmente de façon chronique. C’est l’hyperglycémie qui est le symptôme premier du diabète, maladie multi-organes. Nous développons des stratégies afin de former de nouvelles cellules bêta dans le pancréas. Dans un premier temps, par des études in vitro sur un modèle d’explant de pancréas avec des résultats très prometteurs, puis in vivo sur un modèle de souris diabétiques pour augmenter la production d’insuline et résoudre l’hyperglycémie. Un organisme vivant est nécessaire pour établir la preuve d’efficacité des traitements par nos différents facteurs dans des modèles animaux de ces maladies humaines. Il n’est pas possible de recréer en culture de cellules la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires rentrant en jeu et de tester le potentiel thérapeutique de nos facteurs sur la résolution du diabète.

Réduction

Un total de 540 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous analyserons sur chaque souris les cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline mais également les tissus cibles de l’insuline tels que le foie, les muscles squelettiques et les tissus adipeux gonadiques et sous cutanés. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe tout en nous assurant que nous obtiendrons des résultats statistiquement fiables. En effet, en raison des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (formation, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés. La première contrainte concerne le développement du diabète nécessaire pour mener à bien ce projet. Nous assurerons un change supplémentaire des animaux dans le cas où une polyurie (production excessive d’urine) est constatée afin d’assurer un confort optimal d’hébergement. La deuxième contrainte concerne la procédure chirurgicale d’implantation de mini-pompes en sous cutané au niveau dorsale pour ne pas gêner les déplacements qui sera réalisée dans des conditions aseptiques, sous anesthésie générale et avec une prise en charge de la douleur à l’aide d’analgésique. Un soutien thermique (plateau chauffant) sera également apporté tout au long de la chirurgie pour limiter le stress thermique au cours de l’anesthésie générale. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés à la pathologie avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids et de la glycémie sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésie, soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nos résultats ont montré chez la souris adulte que le muscle squelettique rendu insulino-résistant produisait des protéines appelées myokines pour lesquelles nous avons montré qu’elles possédaient in vitro la capacité de stimuler la formation de nouvelles cellules bêta sur un modèle d’explants pancréatiques. Notre projet vise à tester cette même capacité chez la souris adulte normale et diabétique de type 1 et de type 2 justifiant le choix de cette espèce. Justification du stade de développement : Notre projet vise à définir le potentiel thérapeutique de nos traitements administrés en continue pour former de nouvelles cellules bêta et à permettre une nouvelle production d’insuline par le pancréas adulte dans des modèles de souris diabétiques de type 1 et de type 2. Il convient donc d’utiliser des souris adultes pour ce projet.

Pour relier la stéatose du foie aux troubles cardiaques, 960 souris sont rendues obèses et diabétiques par un régime suivi pendant 16 à 24 semaines. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélever leur foie, leur cœur et leur tissu adipeux. S'y ajoutent une injection quotidienne pendant 12 à 24 semaines, deux injections par jour deux fois par semaine pour induire une fibrose du foie, des mises à jeun, des gavages avec risque de lésion de l'œsophage, six prises de sang en deux heures et des explorations cardiaques sous anesthésie. Le porteur indique qu'un traitement agissant sur la voie étudiée est déjà commercialisé contre des maladies auto-immunes et pourrait voir son indication étendue.

Objectifs

La prévalence des maladies métaboliques du foie (MASLD) est en constante augmentation et touche environ un tiers de la population mondiale. Les études de cohortes chez l’Homme ont révélé son lien complexe avec les maladies cardiovasculaires. La MASLD a été associée à un risque accru de cardiopathie métabolique (CM) incluant arythmie, cardiopathie ischémique et insuffisance cardiaque. L'impact de la MASLD sur la CM va au-delà des facteurs de risque traditionnels et prédit de manière indépendante le risque de mortalité cardiovasculaire. Ces observations soulignent la nécessité d'étudier les liens entre la MASLD et la CM pour comprendre comment les troubles métaboliques hépatiques peuvent influencer la pathogénèse de la cardiopathie métabolique.

Bénéfices attendus

Les stéatopathies métaboliques (MASLD) sont en pleine expansion car elles sont très associées au développement de l’obésité et du diabète de type 2. Elles affectent environ 40 pourcent de la population mondiale. La morbi-mortalité cardiovasculaire représente la première cause de décès chez ces patients atteints de MASLD. Ce projet a pour but de comprendre le rôle d'un lipide particulier d’origine hépatique et de ses récepteurs cardiaques dans la physiopathologie de la cardiopathie métabolique. En effet, cet axe pourrait être une cible thérapeutique dans le traitement de ces maladies étant donné que des agonistes de cette voie existent actuellement sur le marché et sont utilisés dans le cadre de maladies auto-immunes et inflammatoire. Ce traitement déjà sur le marché pourrait avoir une extension de son indication pour les patients avec MASLD présentant une cardiopathie métabolique.

Procédures

Les animaux sont soumis à une injection pour l'administration d'un agent viral (sous anesthésie, une fois, quelques minutes) et seront nourris avec des régimes spéciaux (régime induisant une obésité, un foie gras, une inflammation hépatique (animal vigil, en continu pendant 16 à 24 semaines ) ou un traitement injectable pour induire une fibrose hépatique (animal vigil, 2 fois par semaine pendant 12 semaines, 1 minute). Pour les animaux recevant le traitement ou un placebo, une injection par jour sera réalisée pendant 12 à 24 semaines sur animal vigil, 1 min. Pour les souris sous traitement induisant une fibrose hépatique, le nombre d'injections est porté à 2 par jour 2 fois par semaine. Des explorations métaboliques seront réalisées pour explorer la sévérité du diabète (animal vigil, 2 fois car un pour le test de tolérance à l'insuline et un pour le test de tolérance au glucose), 6 prélèvements de sang de faible volume au total sur une période de 2h) ainsi que des analyses cardiaques (sous anesthésie, 2 fois car un pour l'enregistrement du rythme cardiaque à l'électrocardiogramme et un pour l'échographie cardiaque), 10 minutes). En fin de projet, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (électrocardiogramme, échocardiographie) 2) les conséquences de la maladie hépatique (insulinorésistance, diabète, obésité) et les conséquences sur le coeur (arythmie, insuffisance cardiaque) 3) le stress et la douleur légère lié à la manipulation et la contention durant les tests métaboliques (tests de tolérance à l'insuline et test de tolérance au glucose), mise à jeun avec la sensation de faim, risque de lésion/irritation oesophagienne lors du gavage 4) le stress et la douleur légère de courte durée liée au prélévement de sang lors des tests métaboliques 5) la douleur ponctuelle liée à l'injection 6) risque de saignement ou d'hématome lors des injections.

Devenir

Une fois les explorations cardiaques réalisées au terme du régime et du traitement, les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les tissus d’intérêt (tissus adipeux, foie et coeur) en vue d’analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de comprendre l’influence du métabolisme hépatique en cas de MASLD sur l’activité cardiaque. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, des biopsies de tissu provenant d'études antérieures seront utilisées pour ne pas reproduire les expériences

Réduction

Le nombre total d’animaux sera de 960 souris. Ce nombre a été calculé grace à un test de puissance afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau (Changement de la litière, jusqu'à deux fois par semaine si nécessaire, en cas de souillure par les urines liée à l'apparition d'un diabète induit par les différents régimes/traitement Nourriture hydratée en fond de cage pour les animaux obèses ou qui perdent du poids). Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés (anesthésie) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Les souris sous régime ou traitement fibrotique seront surveillées quotidiennement. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Les points limites sont évalués par un personnel compétent. Lors des anesthésies, application d'un gel olphtalmique pour la protection oculaire, utilisation tapis chauffant (37 degrés celcius) pour limiter l’hypothermie durant l'anesthésie

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques d’obésité et de diabète ont été validés chez la souris. Sa physiologie est connue et il est bien décrit qu'un régime obésogène et ou diabétogène est capable d'induire une insulinorésistance quelques semaines après le régime. Les animaux seront étudiés à partir de 6-8 semaines de vie car atteinte de la maturité sexuelle et les souris sont métaboliquement stables (arrêt de la croissance), et pour la reproductibilité et standardisation des résultats internationaux (les études déjà publiées travaillant sur l'obésité et le diabète utilisent ces souris à partir de ces âges)

Des prises de sang toutes les six minutes pendant deux heures, deux séances d'IRM de deux heures et deux semaines d'isolement en cage individuelle après la pose chirurgicale d'une pompe sous la peau : 72 souris de 12 à 14 mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Ces souris portent des mutations qui reproduisent des traits de la maladie d'Alzheimer et perdent progressivement leurs capacités cognitives. Le projet évalue si une hormone de la reproduction délivrée en continu restaure leurs connexions cérébrales, piste ouverte par des résultats obtenus chez des personnes porteuses d'une trisomie 21. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale ne permet de mesurer en même temps performances cognitives, connectivité cérébrale et effets secondaires.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la démence la plus fréquente chez les personnes âgées. Sa prévalence augmente exponentiellement après 65 ans et elle touche 23% de la population après 80 ans. Compte tenu du vieillissement démographique, le nombre de personnes touchées pourrait doubler d’ici à 2050. Les mécanismes de neurodégénérescence évolutive de la MA ne sont pas encore clairement compris, néanmoins on sait que les phénomènes d’agrégation de protéines caractéristiques de la maladie sont responsables de modifications/pertes de connectivité entre différentes structures du cerveau avec des conséquences fonctionnelles. Il parait donc essentiel de comprendre et tenter de rétablir les connexions cérébrales dans cette maladie. Dans un modèle de souris mimant la MA, des troubles de la mémoire caractéristiques de la maladie évoluent progressivement entre 3 et 12 mois de vie. Une étude récente en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) a révélé que, dès 5 mois, ces souris présentent des modifications de la structure et de la fonction du cerveau. Par ailleurs, une diminution de la sécrétion d’une hormone, l’hormone principale de la reproduction (gonadotropin-releasing hormone) a été observée à l’âge de 12 mois chez ces animaux, période où les déficits cognitifs sont bien marqués. Récemment, il a été démontré que chez des patients atteints de trisomie 21, rétablir la libération pulsatile de GnRH à l’aide de pompe, améliore les connexions cérébrales ainsi que la cognition. Dans notre modèle de souris, ce traitement a permis de restaurer la mémoire à un niveau similaire à celui des animaux sains. L’objectif de ce projet est d’étudier par IRM l’effet d’un traitement hormonal de GnRH sur la structure et le fonctionnement du cerveau d’un modèle de souris génétiquement modifiée mimant la maladie d’Alzheimer. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU) différents EU1 et EU2. Plus précisément, nous chercherons à : • caractériser les modifications cérébrales de ces souris en lien avec la maladie d’Alzheimer, afin d’avoir une référence pour évaluer les effets du traitement ; • étudier l’impact du traitement sur la structure et le fonctionnement du cerveau, pour vérifier s’il améliore ces paramètres. Pour cela, nous réaliserons des images cérébrales par IRM avant et après le traitement hormonal afin d’observer d’éventuels changements dans l’anatomie et les connexions du cerveau.

Bénéfices attendus

Près de 70 millions de personnes dans le monde sont atteintes de la maladie d'Alzheimer, et aucun traitement réellement efficace n'existe à ce jour. Les thérapies actuelles, notamment celles visant à éliminer certaines protéines impliquées dans la maladie, n'ont montré que des effets limités. Face à cette situation, les professionnels de santé disposent de peu d’options pour soulager les patients, tandis que leurs proches doivent faire face à une évolution inexorable de la maladie. Un traitement hormonal, déjà testé avec succès dans une autre maladie neurologique (la trisomie 21), pourrait offrir une nouvelle piste. En étudiant son effet sur un modèle de souris, nous espérons mieux comprendre son impact sur le cerveau et ouvrir la voie à un essai clinique chez l’humain. L’objectif est de développer une approche qui améliore la qualité de vie des patients et offre un nouvel espoir aux familles concernées.

Procédures

Afin d’évaluer la perte cognitive (anxiété/locomotion), la mémoire spatiale à court terme et la discrimination d’odeurs, des tests comportementaux (maximum trois tests, espacés d’au moins deux jours) seront réalisés dans l’EU2 chez les souris, tous les deux mois à partir de l’âge de 4 mois. La durée maximale d’un test est de 15 minutes. À l’âge de 12 à 14 mois, les souris seront transférées sur le site de l’EU1. Les interventions ci-dessous se dérouleront dans l’EU1. Les animaux seront soumis à une chirurgie courte sous anesthésie générale de 25 minutes pour implanter une petite pompe pour délivrer le traitement . Après la chirurgie les animaux seront placés dans des cages individuelles pendant deux semaines . Les souris subiront deux sessions d’IRM, espacées de 15 jours : une avant et une après le traitement. Le passage en IRM est prévu pour une durée moyenne de deux heures, sous anesthésie. Entre les deux sessions d’IRM, les animaux seront soumis à des tests comportementaux visant à évaluer différentes fonctions cognitives et motrices. Ces tests seront réalisés dans un environnement calme, après une période d’habituation de 30 minutes pour limiter le stress. Chaque souris passera 2 tests, espacés d’au moins deux jours pour éviter toute surcharge.. Afin de s’assurer de l’efficacité du traitement, les animaux subiront 4 jours après le début du traitement, des prélèvements de sang toutes les 6 minutes pendant 2h Les surfaces et équipements seront nettoyés entre chaque passage pour éviter toute influence extérieure. Deux prélèvements vaginaux seront effectués après la première et la deuxième IRM. La durée du prélèvement vaginal est de 3 secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l’implantation de la pompe sous la peau pour délivrer le traitement peut générer de la douleur chez l’animal. Les lavements vaginaux sont non douloureux mais peuvent être inconfortables pour la souris. Les prises de sang peuvent générer une douleur ponctuelle au moment de la piqure. L’hébergement en cage individuelle peut provoquer un stress. Les tests de comportement consistant à déterminer l’activité locomotrice, l’anxiété et le stress des souris ou les performances cognitives peuvent entraîner une augmentation temporaire du stress. Une légère réduction de l’activité spontanée peut être observée après certaines manipulations, mais celle-ci reste transitoire. Les sessions d’IRM, bien que réalisées sous anesthésie pour éviter tout inconfort, nécessitent une récupération progressive de l’animal après l’examen. Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort. Notre modèle de souris mime la maladie d’Alzheimer avec une perte des fonctions cognitives progressives, à partir de 3 mois et maximale à 12 mois.

Devenir

À l’issue du protocole, toutes les souris seront mises à mort afin de procéder à des analyses anatomiques et histologiques. Ces analyses sont indispensables pour compléter les données d’imagerie et vérifier les effets du traitement à un niveau cellulaire et tissulaire. L’examen des structures cérébrales permettra d’évaluer d’éventuelles modifications induites par le traitement, telles que des changements dans l’intégrité des tissus ou la connectivité entre différentes régions du cerveau. De plus, des analyses histologiques permettront d’étudier des marqueurs spécifiques impliqués dans la maladie, afin de mieux comprendre les mécanismes d’action du traitement et d’évaluer son potentiel pour une application clinique future.

Remplacement

Nous étudions les effets d’un traitement sur la structure et le fonctionnement du cerveau chez un modèle préclinique de souris afin d’évaluer son efficacité et sa sécurité avant d’envisager des études cliniques chez l’humain. À ce jour, il n’existe pas d’alternatives non animales permettant de mesurer simultanément les performances cognitives, la connectivité cérébrale et d’éventuels effets secondaires du traitement. Les approches in silico ou in vitro, bien qu’utiles pour certaines analyses moléculaires et cellulaires, ne permettent pas d’étudier l’effet global du traitement sur un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour évaluer l’impact du traitement sur les fonctions cérébrales, identifier d’éventuels effets indésirables et déterminer les conditions optimales d’administration. Ces données sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes d’action du traitement et appuyer son éventuelle application clinique.

Réduction

Notre recherche vise à explorer des processus physiologiques et physiopathologiques de l’anatomie cérébrale et de sa fonctionnalité en réponse à l’administration du traitement hormonal. Nous avons déterminé le nombre d’animaux nécessaire et suffisant en fonction des nécessités expérimentales pour réaliser des statistiques significatives. Nous avons choisi une méthode permettant de faire un suivi au cours du temps. Ainsi, les mêmes souris sont utilisées pour la première IRM, pour le traitement et pour l’observation des effets du traitement après la seconde IRM. De plus, l’IRM est une méthode qui permet de regarder de nombreux paramètres sur un même animal : la structure et le fonctionnement du cerveau et tous les paramètres cérébraux qui pourraient être modulés avec le traitement. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux et le nombre d’expériences à réaliser pour obtenir ces informations si nous n’avions pas recours à l’IRM.

Raffinement

Les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés par le même chercheur qui ne changera pas au cours du protocole. Ils seront manipulés par cette personne pour s’habituer à lui et à son odeur. Cela permet de limiter le stress de la souris lorsqu’elle commence le protocole. Les souris devront être transportées entre deux animalerie où le projet se réalise. Un raffinement sera apporté lors du transport. Un temps de 15 jours sera laissé pour leur permettre de s’habituer à la nouvelle animalerie et se remettre du stress généré par le transport. Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée conventionnelle, en groupe jusqu’à la chirurgie puis placés dans des cages individuelles. Les animaux seront de nouveau manipulés par le chercheur pour se réhabituer à lui dans la nouvelle animalerie. Une première IRM sera réalisée par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen chez la souris. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous simple anesthésie générale. Les souris subiront ensuite une chirurgie courte pour implanter les pompes sous cutanées permettant de délivrer le traitement. La chirurgie se fera sous anesthésie générale avec application d’un antiseptique sur la plaie pour éviter tout risque d’infection. Pour la prise en charge de la douleur, une analgésie sera assurée 30 minutes avant la procédure. Une ré-administration pourra être effectuée si nécessaire, selon l’évaluation clinique des animaux. Si des signes de douleurs persistants se manifestent, l’animal sera sorti du protocole. Mise en place de points limites précoces. La seconde IRM se pratiquera dans les mêmes conditions que la première. La mise à mort sera effectuée par un chercheur habitué à réaliser cette intervention et après injection d’un analgésique et sous anesthésie

Choix des espèces

Le protocole d’étude du traitement hormonal (GnRH) a été mis au point chez la souris, nous gardons cette espèce pour obtenir une répétabilité du protocole dans des conditions identiques. Le traitement est étudié chez un modèle génétiquement modifié qui permet d’obtenir un phénotype mimant des traits pathologiques de la maladie d’Alzheimer (MA), pathologie pour laquelle nous étudions le traitement. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est donc indispensable à l’étude du traitement en phase pré-clinique. Les animaux utilisés sont des adultes de 3 à 15 mois ; en effet l’étude de l’hormone GnRH dans ce modèle de souris nécessite d’utiliser des animaux adultes qui commencent à développer des altérations cognitives marquées autour de l’âge de 12 mois et ces troubles persistent jusqu’à la fin de la vie de l’animal. Nous avons déjà des données préliminaires dans cette tranche d’âge et pour pouvoir comparer les données il est nécessaire de respecter cette limite d’âge.

1 460 killifish turquoise d'Afrique vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, hébergés seuls dans des bacs de trois litres. Ils sont nourris un jour sur deux pendant quatre semaines, placés dans une eau refroidie de 3 °C, traités par des molécules dont le porteur reconnaît la toxicité possible, et une partie subit une amputation de la nageoire caudale pour génotypage. Un lot est laissé vieillir jusqu'à la mort naturelle ou jusqu'à une mise à mort sur signes cliniques. Les autres sont tués pour prélever leur sang et leurs organes, l'espèce ayant été choisie parce qu'elle est le vertébré à la durée de vie la plus courte en captivité, six mois. Le porteur conclut que ce poisson est un modèle "unique et indispensable" à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Une problématique importante inhérente à la recherche sur les maladies associées au vieillissement est le temps nécessaire pour laisser les animaux développer naturellement certaines caractéristiques trés symptomatiques du vieillissement. En effet, les animaux modèles vertébrés utilisés couramment dans la recherche biomédicale comme la souris ou le poisson-zèbre ont des durées de vie pouvant dépasser les 3 ans. Ce temps incompressible ralentit énormément les avancées de la recherche visant à diminuer les effets négatifs associés à l’âge. Afin de bénéficier de modèles de vieillissement accélérés permettant d’augmenter considérablement l’efficacité de la recherche, nous proposons d'utiliser le modèle de vieillissement accéléré, l'African Turquoise Killifish, et d'étudier l'efficacité (i) de modulations nutritionnelles, (ii) de traitements chroniques avec des substances naturelles ou synthétiques, ou (iii) l'impact d'une manipulation génétique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires en jeu au cours de l'âge. Nous pourrons évaluer quels événements biologiques sont à l'origine de la diminution de la locomotion ou du déclin cognitif par exemple. Ceci permettra d'identifier de nouveaux gènes candidats et/ou de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques comme les modulations nutritionnelles afin de mieux prendre en charge les pathologies liées à l'âge.

Procédures

Les seules interventions prévues au cours de ce protocole, sont des interventions de type nutritionnelle, avec la mise à jeûn intermittent qui consiste à nourrir les poissons un jour sur deux sur une durée de 4 semaines, intervention qui chez le poisson Killifish a par ailleurs donné lieu a une publication qui montre les effets bénéfiques sur l'animal avec un allongement de la durée de vie. En plus de cette intervention, certains groupes d'animaux auront une alimentation supplémentée avec des metabolites d'intêret suspectés de jouer un rolé majeur dans les flux métaboliques au cours du viellissement. Un génotypage par amputation de nageoire caudale est également prévu. Celle-ci sera réalisée une seule fois au cours de la vie des poissons concernés et seulement dans le cas où la transmission ne peut être détecter par la présence de sondes fluorescentes. D'autre part, pour activer le metabolisme des poissons, nous utiliserons une exposition "au froid", comme déja employé et publié par une équipe de recherche, qui a eu pour conséquences majeures d'allonger la durée de vie des poissons Killifish incubés dans une eau dont la temperature est reduite de 3°C.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement naturellement rapide chez l'African Turquoise Killifish. Les autres effets à évaluer concernent les conséquences du traitement avec des molécules naturelles ou synthétiques (avec des effets toxiques possibles). Les individus peuvent présenter une réduction de la pigmentation de la peau, une perte de poids, ou émaciation, accompagnées de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Amputation de la nageoire caudale : Les effets indésirables potentiels se produisent généralement immédiatement après la blessure et comprennent l'hyperventilation et des changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Celles-ci ne durent généralement que quelques minutes.

Devenir

Au terme de la procédure 1 : - tous les animaux du lot 1 seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures. - les animaux du lot 2 mourront de manière naturelle ou seront mis à mort lorsqu'ils présenteront des signes cliniques le nécessitant. Au terme des procédures 2 et 3, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures. Si les expériences proposées sont concluantes (c’est-à-dire si les modifications génétiques sont effectivement obtenues et si un phénotype métabolique est observé), alors une nouvelle DAP sera soumise en vue de faire le suivi des élevages pour maintenir les lignées respirantes dans la zootechnie et établir les procédures en aval.

Remplacement

Dans le cadre de ce protocole nous comptons manipuler 4 gènes. Ces manipulations génétiques combinées à la puissance exploratoire du modèle Turquoise Killifish font de ce poisson un modèle unique et indispensable à l'échelle de l'organisme entier pour étudier de manière intégrée le rôle de nos cibles d'intérêts dans la progression du vieillissement.

Réduction

Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 10 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques.

Raffinement

Les animaux inclus dans les procédures sont hébergés individuellement dans un bac de 3 litres dans l'eau osmosée dont les paramètres biologiques sont trés controlés avec notamment une température de 28°C, un pH de 7, 5 et une salinité de 1000uS. Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental.

Choix des espèces

Pour étudier les mécanismes en lien avec le viellissement, l'African Turquoise killifish est l'espèce idoine, puisqu'il est le vertébré dont la durée de vie est la plus courte en captivité avec 6 mois. En tant que vertébré, il possède une anatomie comparable à celle du rongeur et de l'Homme. Une abondante littérature montre comment chez le mâle et la femelle, ce poisson présente un viellissement systémique, là aussi comparable aux rongeurs et à l'Homme (sarcopénie, déclin cognitif ou maladies métaboliques). Pour toutes ces raisons, l'African Turquoise Killifish est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans des laboratoires académiques, de plus en plus nombreux, pour modéliser un large spectre de pathologies liées à l'âge, avec la possibilité d'aller très en profondeur pour l'exploration fonctionnelle in vivo et mécanistique post mortem. Toutes les explorations et expérimentations seront réalisées sur poissons adultes puisque l'ensemble de la physiopathologie que nous étudions se développe à l'âge adulte.

Les souris qui perdent plus de 5 % de leur poids d'une pesée hebdomadaire à l'autre sont mises à mort, comme celles qui montrent des signes de mal-être. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes. Elles reçoivent trois semaines de régime riche en lipides, une contention de deux minutes pour la mesure de la masse grasse et, en fin de procédure, une incision de 1,5 mm au scalpel dans la veine de la queue. Le projet doit préciser le rôle d'une protéine dont le porteur affirme qu'elle protège de l'obésité, et il décrit la prise de poids obtenue comme sans impact sur le bien-être des animaux non-humains tout en classant l'ensemble en gravité modérée.

Objectifs

Le diabète de type 2 est un problème majeur de santé publique. Il est en constante augmentation dans notre société. En cause une augmentation de la prévalence de l'obésité, soit une augmentation de la masse du tissu adipeux. Le développement excessif du tissu adipeux perturbe les fonctions de l'adipocyte, cellule majoritaire du tissu adipeux, qui ne peut plus remplir ses fonctions pour le maintien de la glycémie. Lors de l’obésité, on observe un changement d'expression d'un grand nombre de protéines dans l'adipocyte. Nous étudions une de ces protéines dont l'expression est fortement augmentée dans l'adipocyte de souris et de patients avec une obésité. Nos données montrent que l'augmentation d'expression de cette protéine est un mécanisme de protection contre le développement de l'obésité. Notre objectif est d'identifier les mécanismes responsables de cette protection contre l'obésité.

Bénéfices attendus

L'ensemble des expériences décrites dans ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans la protection contre l'obésité. Cela pourrait permettre de proposer cette protéine comme une nouvelle cible pour limiter la prise de poids et ainsi lutter contre l'obésité et ces complications métaboliques telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Les souris seront nourries pendant trois semaines avec un régime riche en lipides. Elles vont subir un seul examen par Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN) d’une durée de 2 min environ, 2 jours avant la fin de la procédure. Elles seront pesées une fois par semaine pendant les trois semaines de régime. Un prélèvement d’une goutte de sang à la veine caudale qui dure moins de 30 secondes sera effectué sur souris vigiles en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Le régime riche en lipides, appliqué sur une courte durée, induit une prise de poids limitée (inférieure à 10 %), sans ni altérations métaboliques à ce stade, et sans impact sur le bien-être des animaux. La mesure de la masse grasse nécessite une contention de l’animal d’environ 2 minutes, pouvant induire un stress modéré et transitoire. Le prélèvement sanguin est réalisé par ponction de la veine caudale, après une incision d’environ 1,5 mm à l’aide d’un scalpel. Cette procédure est brève et peut entraîner une douleur légère à modérée, de courte durée. L’ensemble des interventions conduit à une classification de la procédure en gravité modérée, en raison du caractère invasif du prélèvement sanguin et du stress associé à la contention.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer des organes.

Remplacement

Nos premières études avaient montré un rôle de la protéine que nous étudions in vitro dans des adipocytes en culture. Les mécanismes du developpement de l’obésité et de ses complications métaboliques sont complexes faisant intervenir un dialogue inter-organe, le système immunitaire, et le microbiote intestinal. Il n’est pas possible pour l’instant d’utiliser des systèmes cellulaires reproduisant cette complexité biologique. Des études complémentaires dans les souris sont nécessaires pour caratériser les mécanismes.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer des d’animaux en excès. Un calcul de puissance a été réalisé pour réduire le nombre de souris par groupe. Nous étudions les souris mâles dans la procédure. Cependant, les souris femelles qui ne sont pas utilisées pour la reproduction, sont utilisées pour préparer des adipocyte en culture, utiles pour comprendre les phénotypes observés in vivo.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe et l'environnement est amélioré pour minimiser le stress (igloo, papier, bâtonnets en bois) pour favoriser leur confort en limitant le stress. La manipulation des animaux se fait par la technique de "cup" par des expérimentateurs formés. Le suivi du bien-être animal est quotidien par du personnel formé pour identifier rapidement des souris souffrantes. Les souris souffrantes seront mises à mort. Pendant toute la durée de la procédure, les conditions d’hébergement, de manipulation et de suivi restent identiques à celles de l’hébergement. Les deux interventions dans la procédure sont de gravité modérée. Pour la mesure de la masse grasse, les souris rentrent et sortent de façon volontaire du tube de contention, ce qui permet de minimiser le stress. Le prélèvement sanguin unique en fin de protocole est effectué sur la veine caudale, par un expérimentateur expérimenté, afin de garantir une exécution rapide et maîtrisée de l’acte. En cas de blessures, de pertes de poids de plus de 5 % entre les pesées hebdomadaires, et de signes de mal-être, les souris seront mises à mort.

Choix des espèces

L'utilisation de souris se justifie par le fait que cette espèce est très utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques car lorsqu'elle est nourrie avec un régime riche en lipide, elle devient rapidement obèse. Ce temps relativement court par rapport à d'autres espèces permet d'étudier facilement l'impact de modifications génétiques ou de composés pharmacologiques sur l'obésité. L'obésité des souris est assez proche de celle de l'homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Les animaux sont étudiés au stade adulte pour étudier le développement de l'obésité induit par un régime riche en lipide. Notre modèle nutritionnel d'obésité consiste à mettre les animaux sous régime riche en lipides à l'âge de 6/7 semaines pour une durée de 3 semaines.

130 souris vont être utilisées, chacune soumise à vingt semaines de régime riche en graisses avant d'être tuée à l'âge de 24 semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatorze fois par animal, la veine caudale est incisée sous anesthésique local pour prélever deux à deux microlitres et demi de sang. Pendant douze jours, trois composés bloquant un récepteur sont administrés par gavage, l'obésité provoquée pouvant gêner l'accès à la nourriture et à l'eau et entraîner des dermatites. Le porteur présente ces bloqueurs comme prometteurs au vu d'un essai clinique de phase II déjà évalué positivement chez l'être humain pour un composé de la même famille.

Objectifs

L’obésité et ses conséquences métaboliques sont de plus en plus répandues et souffrent d’un manque de traitements pharmacologiques fiables. Nous développons de nouveaux composés à but thérapeutique ciblant le récepteur X et l’objectif de ce projet est de testé le potentiel anti-obésité de trois nouveaux composés chez la souris rendue obèse suite à une alimentation riche en graisse.

Bénéfices attendus

L’obésité représente un véritable enjeu de santé publique ; cette pathologie étant classée parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir son évolution. L’étude, le développement et la caractérisation de nouvelles cibles et de nouveaux agents pharmacologiques apparaît donc primordial afin de remédier à ce besoin médical non satisfait. Les bloqueurs des récepteurs X présentent un intérêt certain, l’un deux ayant récemment été évalué de manière positive lors d’une étude clinique de phase II pour l’obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime riche en graisse pendant 20 semaines. Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et n’aura lieu que 14 fois par animal. Les injections de glucose d’insuline n’auront lieu qu’une seule fois et nécessiteront l’immobilisation de l’animal pour une durée de 5 secondes. Pendant les 12 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage. Pour chaque gavage, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes.

Impact sur les animaux

Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses sera surveillé quotidiennement car bien que cette pathologie ne soit pas un point limite, ses conséquences peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peut également entraîner le développement passager de dermatite. Aucune autre nuisance n’est attendue mis à part un potentiel stress des animaux lors des tests métaboliques.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

L’obésité est une pathologie multifactorielle entraînant une résistance à l’insuline, des dépôts ectopiques de graisse, une élévation du glucose sanguin, le tout ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur ce type de molécules, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de réaliser des effets doses, ni de multiplier les temps de traitements, pour un large spectre de molécules, dont celles utilisées dans ce projet. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux et le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Depuis leur arrivée en provenance du fournisseur, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 2 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Toutes les précautions sont prises en terme d’analgésie, d’euthanasie et d’application stricte des points limites spécifiques au modèle d’étude et au type d’interventions prévues dans ce projet.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Son métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction de l’obésité sera réalisée chez des souris de 6 semaines. Les souris seront âgées de 22 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 24 semaines lors de la mise à mort. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.

Privées de nourriture pendant vingt-quatre ou quarante-huit heures, soumises à différents régimes pendant quatre-vingt-dix jours, puis à un antibiotique dans l'eau de boisson et à un probiotique par voie orale, 1 700 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que le jeûne peut provoquer une perte de poids, un affaiblissement et parfois une hypothermie, et que les antibiotiques peuvent donner des diarrhées passagères. Toutes sont tuées à la fin pour analyser leurs tissus et leurs organes. Le projet cherche des composés qui miment les effets du jeûne pour déclencher l'autophagie, le bénéfice invoqué visant l'obésité et les maladies métaboliques qui toucheraient, selon le porteur, un quart de la population mondiale.

Objectifs

L’autophagie est un processus physiologique, très conservée au cours de l’évolution, qui régule l’homéostasie cellulaire. L’autophagie est un mécanisme d’adaptation cellulaire en condition de stress et son absence est souvent observée dans des maladies métaboliques, neurodégéneratives et cancers. La restriction calorique est un inducteur physiologique majeur de l’autophagie. Nous avons identifié et sélectionné in vitro des composés capables de mimer les effets biochimiques du jeûne, et qui sont capables, donc, d’induire l’autophagie. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du métabolisme des polyamines dans l’organisme pour l’induction efficace de l’autophagie en présence d’une modulation du métabolisme et du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Les liens entre nutrition et santé sont de mieux en mieux connus, et le risque de développer de nombreuses maladies - cancer, maladies cardiovasculaires, obésité ou encore de diabète de type 2 – peut être réduit en suivant les recommandations nutritionnelles nationales. Ces résultats permettront d’identifier des nouvelles cibles pour les traitements des pathologies métaboliques et de l’obésité, qui affectent dans le monde environ le 25 pour cent de la population et qui deviennent des problématiques de santé significatives.

Procédures

Une partie des animaux sera soumis à un jeûne de 24h ou 48h. Une partie des animaux sera soumise à différents régimes pour 90 jours. Une partie des animaux sera soumise à des traitements administrés sur animal vigile (2 administrations au maximum en 48 heures, 2 minutes/animal). Une partie des animaux sera soumise (1 fois) à un traitement antibiotique via eau de boisson (pour 3 jours) et, la moitié de ces animaux (vigiles), recevra (1 fois par voie orale, 2 minutes/animal) l’administration d’un probiotique intestinale.

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. Les régimes spéciaux peuvent induire une augmentation et/ou perte d’appétit et de poids. Les conditions d’hébergement des animaux seront modifiées ponctuellement lors des mises à jeûne (pour 24h ou 48h) nécessaires pour le déroulement des expériences. Le jeûne peut induire une perte de poids, l’affaiblissement de l’animal et parfois de l’hypothermie. Le traitement avec des antibiotiques peut induire des diarrhées passagères.

Devenir

Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. A la fin des expériences, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du métabolisme des polyamines dans l’organisme pour l’induction efficace de l’autophagie en présence d’une modulation du métabolisme et du microbiote intestinal. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du métabolisme systémique et la réponse à la modulation du microbiote intestinal.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1700 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 10 souris seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux commerciaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, tunnels en carton, maisonnettes, etc). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long des expériences. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Les mâles qui se battent seront hébergés individuellement. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Si les souris apparaissent affaiblies pendant la procédure, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. La souris a une génétique bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire actif.