Système endocrinien

Jusqu'à 25 injections intracérébrales sur animal éveillé, une à deux neurochirurgies de 45 minutes, une à deux semaines en cage individuelle : 6 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau et d'autres tissus. Le régime hyperlipidique imposé peut doubler leur poids initial, et des jeûnes de 4 à 24 heures alternent avec des tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le porteur veut comprendre le rôle des cellules immunitaires de l'hypothalamus dans la prise de poids, et présente la souris comme un bon modèle prédictif du contrôle de la prise alimentaire humaine. Les retombées thérapeutiques annoncées restent suspendues à l'hypothèse de départ, qu'il formule au conditionnel, "dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse".

Objectifs

L’obésité est un fléau dans nos sociétés modernes. Cette maladie chronique touche presque un quart de la population mondiale et s’accompagne de nombreuses comorbidités (diabète, maladies cardio-vasculaires, anxiété, cancers…). Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité, il est notamment nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Le cerveau orchestre cette régulation en engageant une « communication » avec les différents organes du corps. Pour cela, il reçoit des signaux les renseignant sur l’état énergétique de l’organisme. Ces signaux sont captés par des neurones spécialisés, situés dans l’hypothalamus. Outre les neurones, certaines populations de cellules immunitaires du cerveau sont aussi impliquées dans la régulation du poids corporel. L’hypothalamus réagit à la consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses (High fat diet, HFD), en déclenchant une neuroinflammation locale, qui correspond à une activation des cellules immunitaires hypothalamiques. On peut imaginer que c’est un peu comme quand les cellules immunitaires réagissent à un microbe. Cette inflammation est néfaste à long-terme car elle dérègle le fonctionnement des neurones hypothalamiques, et donc le contrôle du poids corporel. Dans ce projet, nous souhaitons mieux comprendre comment fonctionnent les différentes cellules immunitaires hypothalamiques dans le développement de l’inflammation en réponse à un régime HFD qui déclenche l’obésité. Ces connaissances permettront de mettre en place des stratégies pour mieux limiter l’inflammation, prévenir la prise de poids et les comorbidités associées à l’obésité. Notre ambition à terme est de permettre l’ouverture de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints d’obésité. Pour cette étude, nous allons utiliser des approches pharmacologiques et génétiques (utilisation d’animaux mutés génétiquement). Nous utiliserons un modèle animal d’obésité, c’est-à-dire des animaux nourris avec une alimentation hypercalorique obésogène (HFD). Nous réaliserons un suivi métabolique des animaux (prise alimentaire, tests métaboliques et comportementaux), ainsi que de nombreuses études moléculaires à partir des cellules cérébrales isolées. Ce projet comprend huit procédures.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires hypothalamiques dans le développement de l'obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans l’hypothalamus. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation des cellules immunitaires hypothalamiques afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

1) Analyse de la composition corporelle sur tous les animaux vigiles : 5 min, entre 2 et 5 fois. Nombre d’animaux : 6496. 2) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, entre 1 et 2 fois. Nombre d’animaux : 1712 (1 chirurgie) et 384 (2 chirurgies). 3) Test de tolérance au glucose (GTT) et d’insuline (ITT) sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min), répétée 2 fois (GTT) et 1 fois (ITT). Nombre d’animaux : 3648 (GTT) et 1248 (ITT). 4) Enregistrements de la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et l’activité physique. Durée : entre 1 et 2 semaines en hébergement individuel. Nombre d’animaux : 992 pour une semaine, 1392 pour deux semaines. 5) Injections intracérébrales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 3-4 min (contention d’une minute maximum). Répétition : entre 14 (toutes les 24h) et 25 fois (tous les 4 jours). Nombre d’animaux : 384 pour le groupe « 14 fois », 864 pour le groupe « 25 fois ». 6) Injections intrapéritonéales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 30 sec max, entre 1 et 9 injections. Nombre d’animaux concernés : 1120. 7) Tests comportementaux de la mesure de l’anxiété. Durée : entre 10 et 40 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de 2 jours. Nombre d’animaux : 2400.

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la prise alimentaire individuelle est nécessaire. 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser le double du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeûne (4h ou 24h). 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. Suite aux incisions chirurgicales, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins d’une heure, sans manipulation) n’induit pas de nuisances sévères (pas de perte de poids attendue).

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle des cellules immunitaires présentes dans une région du cerveau sur la régulation du poids, de la masse grasse et du taux de sucre dans le sang (glycémie). Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. Enfin, les modèles d’animaux génétiquement modifiés (pour tester nos hypothèses) sont largement développés chez la souris.

Réduction

Ce projet a fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures primaires de cellules) afin de tester différentes hypothèses en amont. Nous avons utilisé des tests mathématiques (test de puissance) pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la stratégie de croisements des animaux reproducteurs afin d’utiliser tous les animaux d’une même portée (animaux contrôles et génétiquement modifiés sont frères et sœurs) et donc ne pas multiplier le nombre de portée avec des animaux qui ne présenteraient pas les caractéristiques (génotype) attendues. De plus, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide de différentes tests statistiques adaptés au type de mesures comparées.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. La surveillance des animaux sera quotidienne et renforcée durant les périodes expérimentales et au constat possible de dégradation du bien-être des animaux. 2) L’évaluation de la prise alimentaire individuelle nécessite parfois l’hébergement individuel des animaux. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres (maintien d’interactions olfactives, visuelles et sonores). L’environnement sonore permettra de limiter le stress des bruits extérieurs (radio). 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que l’évaluation du maintien du bien-être animal. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec l’utilisation d’un tableau (arbre décisionnel pour chaque composante étudiée : anatomique, physiologique et comportementale). Si le bien-être animal venait à se dégrader, des mesures conservatoires et des critères d’arrêt de l’expérimentation seront rapidement mis en place, en accord avec notre vétérinaire.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, du comportement alimentaire et de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux modifiés génétiquement, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, les effets cérébraux d’un régime hypercalorique est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 7 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neurochirurgie ainsi que de s’affranchir des effets de la croissance pubertaire.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour la collecte de sang et de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique de vingt à vingt-cinq minutes pour l'implantation d'une canule dans le bulbe olfactif, puis vit isolée pour que le dispositif ne soit pas abîmé. Suivent un test de tolérance au glucose de deux heures avec prélèvements sanguins répétés à la queue, cinq heures de privation de nourriture, et un test consistant à chronométrer le temps mis pour retrouver un morceau de cookie au chocolat enfoui dans la litière. L'espoir affiché, un traitement contre l'obésité, repose sur l'hypothèse qu'une protéine stimulerait l'appétit en améliorant l'odorat. Le porteur affirme avoir calculé l'effectif au plus juste, sans donner ni méthode ni chiffre.

Objectifs

La protéine ACBP se lie aux acides gras et interagit avec d’autres molécules. Chez les humains, elle est présente à des niveaux plus élevés chez les personnes obèses et plus faibles chez celles souffrant d’anorexie. Chez les rongeurs, elle stimule l’appétit : lorsqu’on leur administre de l’ACBP, ils mangent davantage et prennent du poids, ce qui peut mener à l’obésité. La majorité des recherches ont étudié son action sur l’hypothalamus, mais son rôle dans le bulbe olfactif (zone du cerveau liée à l’odorat) reste peu exploré, bien qu’il soit connu qu’ACBP y est bien exprimée avec son récepteur GABAarD, rendant son étude dans cette zone pertinente. Puisque l’odorat influe sur l’alimentation, l’ACBP pourrait, en améliorant l’odorat, stimuler l’appétit. Bloquer cette protéine pourrait donc réduire la consommation de nourriture et offrir une piste de traitement contre l’obésité. Pour tester cela, nous allons injecter ACBP dans le bulbe olfactif de souris ou utiliser des anticorps pour bloquer son action, en comparant avec un groupe témoin. Pour se faire, 2 groupes distincts seront mis en place : un premier pour évaluer les effets immédiats sur l’odorat et la régulation du glucose et un second groupe recevra des injections similaires pour observer leur prise alimentaire, avec ou sans aliments appétents. Ce projet cherche à mieux comprendre l’influence d’ACBP sur l’odorat et l’appétit, avec l’espoir de développer des traitements contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Chez les rongeurs, la protéine ACBP influence l’alimentation : quand on leur administre cette protéine, ils mangent plus, prennent de la graisse et deviennent obèses sur le long terme. La plupart des études ont examiné l’effet de l’ACBP sur une région du cerveau appelée l’hypothalamus, mais on sait peu de choses sur son rôle dans le bulbe olfactif, la partie du cerveau responsable de l’odorat. Pourtant, l’odorat joue un rôle clé dans l’alimentation. Si l’ACBP améliore l’odorat, cela pourrait expliquer pourquoi les souris mangent davantage. À l’inverse, bloquer cette protéine pourrait réduire l’appétit. Cela pourrait offrir une nouvelle piste pour traiter des maladies comme l’obésité et ses complications.

Procédures

Dans cette étude, les souris subiront une opération d'environ 20 à 25 minutes pour installer un tube dans leur bulbe olfactif, permettant d’y injecter les protéines nécessaires. Ensuite, pour évaluer comment leur corps utilise le glucose, un test de tolérance au glucose sera effectué : leur taux de glucose dans le sang sera mesuré à plusieurs moments (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) en déposant une goutte de sang sur un appareil similaire à ceux pour humains. De petites quantités de sang (environ 20 microlitres) seront également prélevées aux temps 0, 15 et 90 minutes pour mesurer l’insuline, l’hormone qui régule le glucose, ce qui suffira pour suivre son évolution tout en limitant le volume de sang prélevé. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline durent chacun deux heures. De plus, pour évaluer l'impact de la molécule dans le bulbe olfactif sur la recherche et/ou l'envie pour de la nourriture palatable, des tests comportementaux seront réalisés une fois sur chaque animal, en espacant chacun des tests (métabolique et comportemental) de deux semaines. Le "buried-food test", traduit comme le test de la nourriture enfouie, consiste à mesurer le temps que met la souris à retrouver un bout de nourriture, le plus souvent un morceau de cookie au chocolat odorant, caché dans la litière. Il dure quelques dizaines de minutes et permet d'estimer la performance olfactive de l'aimal, accompagnée de la motivation à chercher de la nourriture. La prise alimetaire d'aliment standard ou d'aliment palatable est également évaluée pendant 3h après une courte période privation de nourriture (5h), ce qui permet de voir si l'animal présente une modulation de son appétit selon la catégorie d'aliment.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirugie stérotaxique, avec inhalation d'anésthesiant et injection d'analgésiant, cependant une douleur modérée est susceptible d'être ressentie au réveil. Concernant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, des nuisances légères peuvent survenir avec les prélèvements de sang à la queue de l'animal (légère douleur) , et avec un faible risque d'hypoglycémie suite à l'administration d'insuline. Les tests comportementaux (capacité olfactive pour retrouver un aliment enfouï, et prise alimentaire) ne présentent pas d'effets indésirables hormis la privation de nourriture préalable au test. Après la chirurgie, les animaux sont isolés afin d'éviter que les cannules de perfusion ne soient endommagées, ce qui représente un stress dû à l'isolement susceptible d'être ressenti par les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin de collecter du sang et des tissus pour analyses ultérieures. Au cours des procédures, si l'animal ne se remet pas correctement de la chirurgie ou qu'un problème survient malgré le suivi post opératoire, perte de poids ou autres problèmes de santé ou de bien-être (problème de locomotion, prostration et qualité du poil, etc.)), l'animal sera mis à mort.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôlent les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est impossible de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiables et robustes, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible.

Raffinement

Nous avons prévu les prélèvements de sang en calculant au plus près les volumes nécessaires aux mesures de l'insuline donc les volumes sont minimes, afin de peu impacter le bien-être animal. Concernant la chirurgie stéréotaxique permettant d’installer les canules d'injection dans le bulbe olfactif, intervenant dans les 2 procédures (et donc toute l’étude), nous avons mis en place une anesthésie et analgésie adaptée avant, pendant et après la chirurgie. Les animaux seront maintenus isolés après chirurgie dans des cages standards avec des milieux enrichis (nids végétaux, tubes) ce qui permettra d'améliorer leur bien-être. Ils seront également observés quotidiennement afin d'identifier les animaux en souffrance et éventuellement d'euthanasier les animaux dont les points-limites auraient été atteints. Une légère perte de poids peut-être observée après les premiers jours suivants l’opération, et un complément alimentaire de type gel enrichi en calorie pourra être proposé aux animaux pour leur permettre une meilleure récupération. Cependant, après une semaine, les animaux qui sont en perte constante de poids (supérieure à 15% de leur poids initial) seront mis à mort. A tout moment, si un point limite est atteint l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Nos modèles murins, les souris C57BL6 adultes sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre et représentent une souche murine adéquate comme modèle d'étude des maladies humaines. De plus, nous avons l'expertise du suivi du bien-être de l'animal après injection, du phénotypage métabolique des souris.

Mis en quarantaine vingt et un jours puis engagés dans le protocole dès l'âge de trois mois, des lapins New Zealand White sont immunisés par paires, deux par commande d'anticorps. 3 615 lapins vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dix injections d'antigène mêlé à un adjuvant, qui peuvent ulcérer les points d'injection et provoquer fièvre et baisse de mobilité, puis subit cinq prélèvements de sang de vingt-cinq à quarante minutes, jusqu'à un dixième de son volume sanguin. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive aussi efficace, les banques d'anticorps produites hors animal ne donnant pas, selon lui, une gamme comparable en temps, en budget et en matériel.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une substance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

10 injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 5 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à un adjuvant (hors adjuvant complet de Freund) peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Quinze prélèvements de sang par incision du bout de la queue, chacun sur une souris maintenue une minute: 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent dix-huit semaines de régime hypergras jusqu'à l'obésité et le diabète, avec gavages au glucose, mesures de glycémie tous les quinze jours et 72 heures d'hébergement individuel réparties en quatre tests de dix-huit heures. L'objet réel est de vérifier si des "faux lipides" conçus par l'équipe agissent sur un récepteur lingual du goût du gras et coupent l'appétit. Le porteur retient la souris parce que sa lignée génétiquement modifiée n'existe que dans cette espèce, et cite aussi la disponibilité des réactifs et des "coûts limités de maintenance".

Objectifs

Des études récentes effectuées chez l’homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors, TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Le récepteur CD36 est le récepteur du gras qui est impliqué dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Dans le but de réduire la prise alimentaire des aliments gras. Nous avons développé des faux lipides qui sont soit des analogues d’acides gras ou un extrait d’origine végétale. Ces molécules sont capables d’interagir avec le lipido-récepteur CD36 et de mimer le goût du gras comme des acides gras naturels. Cela, ouvre des perspectives de l’utilisation de ces « faux lipides » comme modulateurs du gout du gras et du comportement alimentaire Le but de cette étude est de 1-Vérifier si nos molécules agonistes de CD36 « faux lipides » sont capables d’induire la satiété et de réduire l’incidence de l’obésité. Le test de comportement « test double choix » la mesure de prise alimentaire, du poids corporel ainsi que la glycémie à jeun fourniront des éléments de réponses à ce sujet. 2-Démontrer par l’utilisation de souris qui n’expriment pas le récepteur du gras uniquement dans les papilles linguales, l’implication, in vivo, de ce récepteur lingual dans l’action des faux lipides

Bénéfices attendus

Il a été rapporté que le goût du gras représente une sixième modalité gustative aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. Le récepteur du gras CD36 est responsable non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. L’altération du gout du gras conduit à une attirance excessive pour les aliments gras, favorisant ainsi l’installation de l’obésité et les maladies métaboliques associées tels que l’insulinorésistance et le diabète de type 2. Les études réalisées chez les souris n’exprimant pas récepteur du gras CD36 ont démontré qu’elles perdent la perception du goût du gras. A court terme, ce projet permettra la description et l’utilisation ultérieure d’une nouvelle lignée génétiquement modifiée, qui n’exprime pas le récepteur du gras uniquement dans les papilles linguales,qui pourra servir de modèle animal pour les études ou les interrogations relatives au rôle de CD36 dans le gout du gras. A long terme ce projet nous permettra de développer de nouvelles molécules anti-obésité ciblant le récepteur du gras « CD36 »

Procédures

L’ensemble des souris sera nourri avec un régime standard ou hypergras et sera pesé de façon hebdomadaire. Des mesures de la glycémie tous les 15 jours pendant 18 semaines au niveau de la queue ainsi qu’un test tolérance au glucose en fin de protocole nécessitent une mise à jeun de 6h, un gavage au glucose (moins d’une minute) et une incision de l’extrémité de la queue, ces mesures de glycémie seront réalisées par bandelette glucomètre Ainsi pour la mesure de la glycémie, chaque souris subira un total de total 15 prélèvements d’une goutte de sang après incision de queue. Le prélèvement sera réalisé réalisés sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). Les souris seront hébergées individuellement en tout pendant 72 h (4 tests de 18h) pour réaliser un test comportemental. Un prélèvement sanguin terminal intracardiaque (sous anesthésie générale) sera réalisé avant la mise à mort (toujours anesthésiées). Après euthanasie, les organes d’intérêt seront prélevés.

Impact sur les animaux

- Inconfort lié à l’obésité induite par le régime alimentaire hyper-gras : l’obésité ou le surpoids peut réduire la mobilité des souris qui développent également un diabète de type 2. Nous avons limité la durée du régime alimentaire à 18 semaines. Durée optimale pour observer les effets des molécules anti-obésité limitant ainsi les inconforts liés à l’obésité. - Douleur lors des prélèvements sanguins au niveau de la queue. Les prélèvements sanguins (une goutte sur une bandelette de glycomètre) nécessitent une section de 0.5 à 1mm de l’extrémité de la queue qui peut induire une douleur et une infection locale. Les souris subiront en tout 15 prélèvements sanguins (10 prélèvements tous toutes les deux semaines pour suivre l’installation du diabète type 2 et 5 prélèvements lors du test un test de tolérance au glucose). Pour pallier à cette nuisance, nous effectuons une anesthésie locale (crème emla 5%) avant incision et nous désinfectons (solution antiseptique) la queue avant et après l’incision de même que les instruments (ciseaux) à l’alcool. - Irritation de la gorge lors des gavages : le test de tolérance au glucose (OGTT) nécessitant un gavage avec une solution de glucose, afin de minimiser cette irritation malgré la qualification de l’expérimentateur nous utilisons des sondes en plastique souple adéquates pour souris (38 mm longueur et 1,2 mm de diamètre de la pointe). -Stress lors des manipulations : les gavages nécessitent également une contention. Pour pallier à ce stress, nous limitions la durée de contention à quelques secondes. - Stress lors d’hébergement individuel des souris : les souris seront en hébergement individuel en tout pendant 72 h pour réaliser des tests de doubles choix (4 tests de 18h). Nous avons limité cette durée d’hébergement individuel à 18h qui représente la durée minimale pour réaliser ce test comportemental

Devenir

A l’issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort..

Remplacement

L’obésité est une maladie multifactorielle impliquant l’altération du métabolisme des lipides et glucides, les dérégulations hormonales (hormones du tissu adipeux), l’activation du système immunitaire, l’inflammation. Ainsi malgré les résultats obtenus, in-vitro, le recours à l’animal est indispensable. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après une estimation statistique, la taille minimale des groupes est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien-être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront hébergées individuellement, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo et matériau de nidification en cellulose). Les souris seront habituées à la contention pour diminuer le stress, lors des pesées et des prélèvements. Un anesthésiant local sera appliqué sur la queue lors des prélèvements sanguins et une anesthésie générale sera réalisée avant la mise à mort.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix pour des études sur l’obésité et le comportement alimentaire. Bien que techniquement plus difficile que l’utilisation du rat, notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (anticorps, kits de dosage etc…) et les coûts limités de maintenance contribuent au choix de modèle souris. De plus, l’élevage et l’induction de la modification génétique étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix pour notre étude. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 8 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. Des souris mâles de 4 à 5 semaines seront mises sous régime obésogène pour maitriser l’induction de l’obésité. Il y’a pas de référence pour déterminer l’obésité chez la souris tels que l’indice de masse corporelle chez l’humain. Cependant les souris ayant un poids corporel au-delà de 45 g sont considérées comme obèses et développent une hyperglycémie à jeun. A la fin de l’étude, les animaux auront alors entre 22-23 semaines et seront donc adultes. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique (induites par des régimes obésogènes) telles que le diabète de type 2 normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.

Six injections intrapéritonéales sur animal vigile, quatre semaines de corticostérone dans l'eau de boisson, quatre prélèvements sanguins hebdomadaires puis un test de tolérance au glucose ou à l'insuline après cinq heures de jeûne : 144 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux tiers d'entre elles reçoivent une dernière injection abdominale sept minutes avant d'être tuées, toutes l'étant pour prélèvement du pancréas, du foie, des muscles et des tissus adipeux. Le porteur indique que la corticostérone peut faire monter la glycémie, augmenter l'émission d'urine et la prise de boisson, et provoquer une perte de poids. L'enjeu déclaré reste une étape de connaissance sur la contribution du muscle squelettique à l'adaptation du pancréas, sans application annoncée pour les 4,3 millions de personnes diabétiques que le porteur cite à l'appui du projet.

Objectifs

Les diabètes de type 1 et 2 sont caractérisés par une augmentation de la concentration du sucre dans le sang entrainant notamment des maladies du cœur et des reins mettant ainsi en jeu la vie des patients diabétiques. L’excès de sucre dans le sang se met en place lorsque le pancréas produit de façon insuffisante l’insuline qui est l’hormone capable de baisser la concentration de sucre dans le sang. Le pancréas est capable d’augmenter sa production d’insuline en réponse à une résistance à l’insuline des tissus périphériques tels que le foie, le tissu adipeux et le muscle squelettique. Toutefois, la communication entre ces organes et qui sous-tend cette adaptation pancréatique reste méconnue. Le laboratoire a développé un modèle murin d’insulino-résistance par traitement chronique aux glucocorticoïdes (GC) et a caractérisé l’adaptation pancréatique qui en découle. Cependant, la contribution des différents tissus sensibles à l’insuline reste méconnue. Des résultats indiquent un rôle important des muscles squelettiques en réponse aux GC. L’objectif du projet est de définir la contribution des muscles squelettiques dans les conséquences métaboliques et l’adaptation pancréatique en réponse à un traitement chronique aux GC chez la souris.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 1 est caractérisé par un déficit total en cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline, la seule hormone hypoglycémiante de l’organisme. Le diabète de type 2 est caractérisé par une résistance à l’insuline associée à une carence relative en insuline. En France, on dénombre 4,3 millions de personnes diabétiques. La prévalence augmente depuis des années et est passée de 5,6 pour cent en 2015 à 6,07 pour cent en 2021 (source Santé Publique France et Fédération Française des diabétiques). Si les tendances restent identiques, 520 000 personnes deviendront diabétiques d’ici 2027 en France. 90 pour cent des diabétiques sont atteints du diabète de type 2, maladie touchant préférentiellement les adultes et associée à l’obésité. 10 pour cent des patients sont atteints du diabète de type 1 dont le déclenchement est observé majoritairement chez l’enfant et est lié à une dérégulation du système immunitaire. Des traitements contre cette maladie existent avec notamment des anti-diabétiques oraux pour le diabète de type 2 et des injections quotidiennes d’insuline pour le diabète de type 1. Il est bien connu que le pancréas est capable de produire plus d'insuline lorsque les tissus comme le foie, le tissu adipeux et les muscles deviennent moins sensibles à cette hormone, ce qui est appelé résistance à l'insuline. Cependant, on comprend encore mal comment ces organes communiquent entre eux pour permettre cette adaptation du pancréas. Nous avons développé un modèle chez la souris où la résistance à l'insuline est induite par un traitement prolongé avec des glucocorticoïdes (un type de médicament souvent utilisé pour réduire l'inflammation). Ce modèle nous permet de mieux comprendre comment le pancréas réagit à cette situation. Le but de notre projet est de découvrir le rôle des muscles dans cette réponse et dans les changements métaboliques qui surviennent suite à un traitement prolongé avec ces médicaments chez la souris.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement par injections intrapéritonéales afin d’induire la modification génétique, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours puis une injection unique de rappel 4 semaines après, soit un total de 6 injections par souris. Les injections seront effectuées sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Les animaux seront ensuite soumis à un traitement via l’eau de boisson durant 4 semaines. Nous réaliserons des prélèvements sanguins de faible volume effectués une fois par semaine pendant 4 semaines. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal soit 4 prélèvements sur la durée de traitement. A la fin des traitements, les souris seront soumises à l’un des deux tests pour évaluer soit la tolérance au glucose ou celle à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun courte (5h), les souris seront injectées en intrapéritonéal et 5 à 7 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Une partie des animaux (environ 2/3) subira une injection unique au niveau de l’abdomen 7 minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. L’ensemble des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

L’induction du modèle génétiquement modifié reposent sur une injection intrapéritonéale tous les jours pendant 5 jours puis une injection unique un mois après, pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection pour les animaux. Aucun effet secondaire n’a été décrit dans la littérature pour cette administration. L’administration de corticostérone via l’eau de boisson pourrait induire un stress de courte durée lors de sa mise en place en raison de la peur de la nouveauté des souris (néophobie) et après plusieurs semaines le traitement pourrait induire un une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et éventuellement une perte de poids. De même, le suivi glycémique longitudinal des animaux pourra induire un stress et une douleur de courte durée. Les tests métaboliques, qui comprennent une injection intrapéritonéale puis plusieurs prélèvements sanguins de faible volume afin de suivre la glycémie, peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Ils peuvent également induire un stress et une légère sensation de faim pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun.

Devenir

Notre étude nécessite le prélèvement d’organes afin de caractériser l’effet des traitements sur les adaptations métaboliques et pancréatiques en présence ou non du récepteur des glucocorticoïdes dans les muscles squelettiques. Ainsi, l’euthanasie des animaux est strictement nécessaire afin de répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Les cellules bêta pancréatiques produisent l’insuline qui va agir sur ses tissus cibles pour stimuler le stockage du glucose, inhiber la production de glucose et la lipolyse. Lorsque l’insuline est produite en quantité insuffisante, la concentration de glucose dans le sang n’est plus régulée et augmente de façon chronique. C’est l’hyperglycémie qui est le symptôme premier du diabète, maladie multi-organes. Nous développons des stratégies afin de définir comment produire un plus grand nombre de cellules produisant de l’insuline dans le pancréas et notamment comment le muscle squelettique produit des facteurs qui induisent l’adaptation pancréatique. Nous étudions donc la communication inter-organes adaptative. Un organisme vivant est nécessaire pour définir la contribution spécifique des organes et notamment des muscles squelettiques. Il n’est pas possible de recréer en culture de cellules la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires rentrant en jeu.

Réduction

Un total de 144 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous analyserons sur chaque souris les cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline mais également les tissus cibles de l’insuline tels que le foie, les différents types de muscles squelettiques et les tissus adipeux gonadiques et sous cutanés. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe tout en nous assurant que nous obtiendrons des résultats statistiquement fiables. En effet, en raison des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (formation, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés. La principale contrainte concerne les injections intrapéritonéales pour induire le modèle génétiquement modifié qui seront effectuées par du personnel formé au geste. De même, l’administration via l’eau de boisson de glucocorticoïdes sera surveillée et les biberons changés 3 fois par semaine afin de garantir une bonne qualité de l’eau de boisson. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids et de la glycémie sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous avons montré qu’il existait une adaptation pancréatique chez les souris traitées aux glucocorticoïdes (GR). Le projet actuel vise à caractériser plus en avant cette adaptation en absence du GR dans le muscle squelettique. Ce modèle d’invalidation du GR est disponible chez la souris. C’est la raison pour laquelle nous souhaitons réaliser nos expériences chez la souris. Justification des stades de développement Les études se feront avec des animaux adultes. En effet, le projet s’intéresse aux adaptations métaboliques et pancréatiques en réponse à un traitement chronique aux GC, ce qui nécessite de réaliser les expériences dont le métabolisme glucido-lipidique est fixe, c’est-à-dire chez des souris adultes, post-sevrage et post-puberté. En effet, le sevrage est associé à des modifications profondes de l’utilisation des substrats énergétiques car l’alimentation pré-sevrage est principalement lipidique (lait maternel) tandis que l’alimentation post-sevrage est majoritairement glucidique. D’autre part, la puberté est associée à une insulino-résistance transitoire qui pourrait impacter nos études métaboliques.