Système endocrinien

Pour comparer la digestibilité de protéines végétales fermentées ou germées à celle de la caséine, 50 rats en croissance vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est hébergé seul pendant les 38 jours du protocole, un isolement dont le porteur reconnaît qu'il induit chez ces animaux sociaux une détresse chronique. Les quatre derniers jours se passent en cage métabolique, plus petite, au sol grillagé. Les mesures de force et de coordination sont présentées comme faites sur la base du "volontariat", et une décision sera prise sur l'animal dès qu'il présentera trois points limites notables ou un point sévère.

Objectifs

La transition vers un régime plus végétal et durable fait partie des grandes évolutions de l’alimentation. Augmenter la consommation de sources protéiques végétales telles que les légumineuses et les céréales complètes devient un enjeu majeur. Ces sources végétales sont des vecteurs de fibres et de micronutriments dont la consommation est associée à une prévention des maladies chroniques. Cependant, la qualité nutritionnelle moindre des protéines végétales est à prendre en compte pour proposer des produits adaptés aux besoins de la population. Les protéines végétales issues des céréales et légumineuses ont souvent des profils en acides aminés incomplets par comparaison avec les protéines d’origine animale. De plus, ces protéines végétales contiennent des facteurs antinutritionnels interférant avec l’absorption des micronutriments et réduisant la digestibilité des protéines. Aussi, l’utilisation de bioprocédés tels que la fermentation et la germination permettrait de lever ce verrou tout en respectant le concept de « Naturalité » inscrit dans la transition alimentaire actuelle. Il est apparu récemment un intérêt pour la combinaison de ces deux procédés afin de parfaire la digestibilité protéique des aliments végétaux et d’optimiser la biodisponibilité de micronutriments. Alors que la germination est un processus biologique commençant à l’imbibition d’une graine quiescente et s’achevant au moment de la percée de la radicule, la fermentation résulte de l’action spontanée ou dirigée de communautés microbiennes endogènes, et/ou ajoutées, sur des matières premières d’origine animale ou végétale. Les aliments résultant de ces procédés sont profondément modifiés sur le plan biochimique et contiennent une biomasse microbienne élevée, le plus souvent vivante. La fermentation est bien maîtrisée sur les matrices liquides animales mais elle reste exploratoire et complexe sur les matrices solides végétales. De plus, l’utilisation de ce type de fermentation sur des graines germées n’a, à notre connaissance, jamais été investiguée pour l’alimentation humaine. Aussi, l’efficacité alimentaire de matrices végétales ainsi traitées doit être absolument évaluée chez l’animal avant toute consommation par l’Homme. Le projet a pour but d’évaluer l’impact de la fermentation solide sur la digestibilité protéique et les effets santé de différents prototypes d’aliments germés ou non germés à base de céréales et de légumineuses chez le rat en croissance.

Bénéfices attendus

A court terme, du fait de la composition équilibrée en acides aminés indispensables dans le mélange orge et pois chiche, comparable à celle de protéines animales, et de l’utilisation de façon associée de la fermentation et la germination pour limiter les facteurs antinutritionnels, nous postulons que le régime à base de protéines végétales issues de graines traitées par germination puis fermentation présentera une efficacité métabolique similaire au régime contenant la caséine en termes de croissance, d’accrétion protéique corporelle et de régulation du métabolisme protéique chez le rat jeune. A plus long terme, le projet aura un impact positif sur le plan environnemental et sociétal et contribuera à l’élaboration de nouveaux aliments à forte valeur ajoutée, grâce à l’optimisation des conditions de fermentation solide adaptés au contexte végétal combiné à la germination. Ses bioprocédés répondent pleinement aux attentes actuelles des consommateurs : naturalité, absence de conservateurs et potentiels bénéfices santé. Par ailleurs, la maîtrise croissante des communautés microbiennes et la possibilité de créer et optimiser des consortiums à fonctionnalités ciblées font de ces aliments une mine d’innovations pour l’avenir face aux défis qui attendent nos systèmes alimentaires. Les bénéfices attendus du projet devraient répondre à la fois à des enjeux environnementaux mais aussi de santé publique. En effet, ce projet devrait permettre d’augmenter la part des végétaux dans l’alimentation afin de contribuer à un rééquilibrage de la consommation de protéines animales versus protéines végétales dans le but d’aller vers un modèle alimentaire plus vertueux d’un point de vue nutritionnel et environnemental. Ceci permettra de diversifier l’alimentation et de prévenir les carences nutritionnelles. De plus, le développement de produits de bonne qualité nutritionnelle et sources de protéines pourrait prévenir le risque de dénutrition de populations spécifiques comme les personnes âgées en leur apportant des produits digestibles, ayant des goûts/textures adaptés et répondant à leurs besoins nutritionnels. De plus, ces nouveaux aliments pourraient également prévenir l’apparition de dysbioses intestinales via la consommation d’aliments vecteurs de microorganismes « positifs ». Pour finir, la valorisation par fermentation solide pour l’alimentation humaine permet une nette réduction des émissions de gaz à effet de serre ainsi qu’une sauvegarde des ressources en eau douce.

Procédures

Les rats seront hébergés en cage individuelle pour contrôler précisément leur consommation pendant toute la durée du protocole depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à leur sacrifice soit 38 jours au total. Les animaux subiront diverses interventions au cours du protocole. Elles auront pour but de : (1) mesurer la composition corporelle sur animal vigile via une technique non invasive peu stressante réalisée 2 fois et d’une durée de 2 minutes à chaque fois. (2) mesurer la fonctionnalité musculaire de façon non invasive et sur animal vigile. Cette mesure fait intervenir 3 appareils. Ces mesures seront réalisées sur la base du « volontariat » car il est impossible d’obliger les animaux à réaliser les exercices. L’appareil 1 servira à mesurer la force et sera utilisé 2 fois pour une durée de manipulation de l’animal de 30 secondes à chaque fois. L’appareil 2 permettra d’évaluer l’équilibre et la coordination motrice et sera utilisé 2 fois. La durée dépendra de l’endurance et de la volonté du rat à réaliser l’exercice (5 minutes au maximum). Enfin, l’appareil 3 permettra d’appréhender l’activité ambulatoire totale et ne sera utilisé qu’à la fin du protocole. L’expérience dure 10 minutes et est non stressante. (3) mesurer la rétention azotée (azote ingérée – azote excrétée) au niveau corps entier. Cette mesure nécessite la récupération de la totalité des fèces et de l’urine produits. Les rats concernés hébergés dans une cage métabolique conçue pour permettre cette récupération. La durée du passage sera réduite au maximum (4 jours au total) sans compromettre les résultats du projet. (4) mesurer la synthèse protéique dans les muscles squelettiques en fin de protocole. Après avoir été mis à jeun la veille, les 50 rats subiront, le matin, une injection permettant de mesurer la synthèse protéique 50 minutes avant l’euthanasie. Tous les rats seront ensuite mis à mort sous anesthésie générale gazeuse.

Impact sur les animaux

Dès leur arrivée à l’animalerie et durant toute la durée du protocole expérimental, tous les rats (50) seront hébergés en cage individuelle. Cet isolement affectera le bien-être de ces animaux sociaux en induisant une détresse chronique. Lors de leur séjour en cage métabolique pendant les 4 derniers jours du protocole, les animaux seront soumis à un stress physique et une détresse supplémentaires par rapport à l’hébergement en cage individuelle. En effet, la taille des cages métaboliques est réduite comparativement aux cages d’hébergement standard. De plus, le sol est composé d’une grille qui affecte le bien-être des animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses sur les différents tissus prélevés qui permettront de répondre aux objectifs du projet.

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet, est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire ne permettant pas de mesurer simultanément la digestibilité des différentes sources de protéines, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et tissulaire. Pour l’instant, ce projet ne peut pas non plus être réalisé directement chez l’Homme. En effet, l’utilisation de la fermentation solide sur des graines germées de céréales et de légumineuses n’a, à notre connaissance, jamais été investiguée pour l’alimentation humaine et l’efficacité alimentaire de ces produits doit être absolument évaluée avant son application chez l’Homme. Les régimes alimentaires vont être confectionnés à partir de prototypes d’aliment réalisés à petite échelle spécifiquement pour le projet. Il est à noter qu’avant de réaliser les régimes fournis ensuite aux animaux les différentes farines seront analysées d’un point de vue nutritionnel et microbiologique garantissant leur innocuité.

Réduction

Les résultats d’études antérieures menées sur des rats nourris avec des farines produites à partir de protéines de différents végétaux ont permis de réduire le nombre d’animaux utilisés à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre total de rats nécessaires à la réalisation de ce projet est de 50. Pour analyser les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons plusieurs tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages adaptées à leur poids et leur taille. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision adaptée afin de limiter la douleur à son maximum.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des rats Wistar âgés de 4 semaines au début de la mise sous régime car ces animaux présentent un métabolisme très proche de celui de l'Homme tout particulièrement au niveau de notre métabolisme cible, le métabolisme protéique. C’est pourquoi le choix de cette espèce est préconisée par l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) pour évaluer l’efficacité nutritionnelle d’un régime. Ce modèle est bien connu du laboratoire et de récentes études menées au sein de l’équipe de recherche l’ont utilisé. L’étude vise à évaluer l’efficacité alimentaire et à caractériser l’effet d’un régime à base de protéines végétales issues d’un mélange de graines germées ou non puis ayant été soumis à une fermentation ou non, sur le métabolisme protéique musculaire chez le rat en croissance. Les animaux seront donc âgés de 4 semaines et seront de poids homogène (environ 300g) au début du protocole. Ils seront âgés de 9-10 semaine à la fin de l’étude en tenant compte des 10 jours d’acclimatation

60 souris vont être privées de nourriture pendant vingt-quatre heures, puis tuées pour qu'on prélève leurs îlots pancréatiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jeûne fait baisser leur activité, leur température corporelle et leur poids. L'objet est de séquencer les noyaux de leurs cellules pancréatiques pour repérer les gènes dont l'expression change avec le jeûne, dix souris étant utilisées par point de séquençage. Le porteur écrit à deux reprises qu'un jeûne de vingt-quatre heures ne met "en aucun cas" en danger des souris en bonne santé, pour des procédures qu'il déclare lui-même de gravité modérée.

Objectifs

Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel. Une dérégulation de ce système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont associées, comme le diabète. Au laboratoire, nous étudions le développement de l'obésité et ses altérations métaboliques. Dans cette nouvelle étude, nous nous proposons d'analyser la réponse des tissus actifs en réponse au jeûne. Le jeûne est connu pour induire des changements significatifs dans l'expression génique des tissus tels que le cerveau, le pancréas, le foie, les muscles et le tissu adipeux, qui jouent un rôle crucial dans la régulation énergétique et métabolique. Notre objectif est de caractériser ces changements au niveau moléculaire pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels le jeûne influence la balance énergétique et le métabolisme global. En utilisant des technologies de nouvelle génération, nous chercherons à identifier les gènes dont l'expression est modifiée par le jeûne et à élucider les voies de signalisation impliquées. Les résultats de cette recherche pourraient fournir des informations précieuses pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à améliorer la santé métabolique et à prévenir les maladies associées à une dérégulation de l'équilibre énergétique telles que l'obésité et le diabète.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette recherche pourraient fournir des informations précieuses pour améliorer la santé métabolique et prévenir les maladies associées à une dérégulation de l'équilibre énergétique. Bénéfices attendus pour ce projet : nous pourrons identifier de nouvelles cibles potentielles pour des interventions thérapeutiques visant à traiter ou prévenir les maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète.

Procédures

60 animaux seront mis à jeûn durant 24H.

Impact sur les animaux

Un jeûne prolongé de 24H sera nécéssaire avant le prélèvement des tissus des souris. Ce jeûne va entrainer de nombreux effets, notamment metaboliques, sur le systeme digestif, immunitaire, etc, mais ne met en aucun cas en danger les animaux. Un jeûne de 24H pour une souris en bonne santé tel que dans notre cas peut entrainer une baisse de son activité, de sa température corporelle et une légère perte de poids.

Devenir

Après la période de jeûne de 24H qui ne met pas en danger les animaux, les animaux seront euthanasiés et une préparation d'îlots pancréatiques sera faite afin de recueillir les noyaux des cellules, et de les séquencer. Il en sera de même pour les animaux contrôle qui n'auront pas jeûné.

Remplacement

La régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris. Les modèles in vitro ou d'organismes inférieurs ne permettent pas de reproduire l'intégralité de ces interactions physiologiques complexes. Ainsi, l'utilisation de la souris est essentielle pour obtenir des résultats pertinents et transposables aux mécanismes chez les mammifères, y compris les humains. Nous utiliserons des tissus de souris afin de réaliser des séquençages spécifiques. Cette approche permet d'obtenir des données détaillées sur l'expression génétique à l'échelle cellulaire.

Réduction

Nous utiliserons un total de 60 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Une préparation d'îlots pancréatiques provenant d'une souris permet de recueillir environ 30 000 noyaux. Étant donné que 300 000 noyaux sont nécessaires pour réaliser un point de séquençage, 10 souris seront nécessaires pour chaque point de séquençage. Nous prévoyons de réaliser 6 expériences indépendantes, nécessitant ainsi un total de 60 souris. Cette approche nous permet de maximiser les informations obtenues tout en minimisant le nombre total d'animaux utilisés, en conformité avec les principes de réduction. Nous déterminerons si la distribution des échantillons suit une loi normale. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour déterminer le nombre optimal d'animaux à utiliser et pour analyser les données obtenues.

Raffinement

Les cages seront étiquetées pour cette procédure et les animaux seront surveillés par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort, cependant un jeûne de 24H ne met en aucun cas en danger des souris en bonne santé. Les animaux conservent leurs congénères et leurs conditions d'hébergement avec accès à l'eau de boisson et un carré de chanvre est mis à leur disposition permettant la fabrication d'un nid utile pour préserver leur température corporelle, pendant ces 24H.

Choix des espèces

Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. Ce choix est justifié par plusieurs raisons : Similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain : La souris partage de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain, ce qui permet de transposer plus facilement les résultats obtenus chez la souris aux humains. Cela est particulièrement pertinent pour les études sur le métabolisme et les maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète. Historique de recherche étendu : Il existe une vaste base de données et une longue histoire d'utilisation des souris dans la recherche biomédicale, fournissant un contexte riche et des outils bien développés pour l'analyse des résultats. Les souris sont donc bien caractérisées en termes de biologie et de réponses métaboliques, facilitant les comparaisons et l'interprétation des données. Les souris seront utilisées à l'âge de 10 semaines pour plusieurs raisons importantes: À l'âge de 10 semaines, les souris ont atteint un stade de développement où leur physiologie, y compris leur métabolisme, est généralement stable. Cela permet de minimiser les variations dues à la croissance et au développement, assurant ainsi une plus grande cohérence des résultats expérimentaux. L'utilisation de souris âgées de 10 semaines offre une combinaison optimale de maturité physiologique, de stabilité métabolique, de standardisation des conditions expérimentales et de comparabilité avec la littérature existante, ce qui en fait un choix approprié pour notre étude sur les mécanismes métaboliques en réponse au jeûne.

7 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une administration du composé et trois prélèvements sanguins. Les prélèvements se font par ponction de la veine caudale et par ponction sous la mandibule, et les composés sont administrés par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou par gavage, avec les risques que le porteur énumère lui-même : perforation d'organes internes, œdèmes, hématomes, perforation de l'œsophage, passage du liquide dans les poumons. L'objet reste en amont de tout traitement, il s'agit de mesurer comment cinq variantes d'une protéine antidiabétique se répartissent dans le corps selon la dose et la voie d'administration. Le porteur affirme par ailleurs que trois animaux par condition suffisent, sans que le passage de ce chiffre à 7 560 souris soit détaillé.

Objectifs

Notre recherche porte sur le diabète de type 1 (DT1), une maladie caractérisée par la destruction des cellules du pancréas qui produisent de l'insuline. Cela entraîne des hyperglycémies chroniques pouvant provoquer de graves complications vasculaires. Nous avons identifié une protéine capable de régénérer ces cellules et développé cinq variantes de cette protéine, que nous avons testées sur des souris diabétiques. Nos résultats préliminaires montrent que ces protéines peuvent stimuler la prolifération des cellules productrices d'insuline, ce qui pourrait en faire des traitements prometteurs pour le DT1. Pour développer un médicament antidiabétique, nous souhaitons analyser le comportement de ces nouvelles protéines dans le corps (pharmacocinétique) afin de déterminer la meilleure dose et la meilleure méthode d'administration. Chaque variante de la protéine étant unique, nous devons tester différentes combinaisons de méthodes et de doses pour comprendre leur fonctionnement. Nous testerons donc cinq concentrations différentes avec quatre méthodes d'administration (intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse et orale) sur trois modèles de souris : des souris saines pour garantir des résultats représentatifs des réponses physiologiques normales ; des souris diabétiques pour évaluer l'efficacité des composés dans le contexte du DT1 ; et des souris génétiquement modifiées pour mieux simuler les humains. Notre approche sera séquentielle et hiérarchisée : si l'une des protéines candidates montre de bons résultats avec une méthode et une dose spécifiques, nous pourrons écarter les autres options, réduisant ainsi le nombre de souris nécessaires. Au total, nous prévoyons d'utiliser 7 560 souris pour ce projet, tout en respectant strictement les principes des 3R : Remplacement (l'étude du diabète nécessite l'utilisation d'animaux, car cette maladie ne peut pas être entièrement reproduite en laboratoire), Réduction (nous utiliserons le minimum d'animaux nécessaires et ajusterons les expériences selon les résultats), et Raffinement (une grille de score évaluera la souffrance et le stress des animaux, avec des seuils adaptés).

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude seront essentiels pour déterminer la dose et la voie d’administration qui assurent la meilleure exposition du composé antidiabétique dans les tissus et le sang. Ces données guideront les conditions expérimentales des futures études sur l'efficacité à long terme et la pharmacodynamique du composé candidat. En combinant ces études complémentaires, nous maximiserons les chances de succès dans le développement thérapeutique pour le diabète de type 1 (DT1).

Procédures

Trois prélèvements sanguins seront effectués sur chaque animal, selon les modalités suivantes : deux prélèvements seront réalisés par ponction de la veine caudale (l'un au début de la procédure et l'autre à la fin; durée de l'intervention : 30 secondes) ; et un prélèvement sera effectué par ponction submandibulaire (soit à 0 min, avant administration du composé, soit à 30 min, 60 min, 120 min, 24 h, ou 48 h après l’administration ; durée de l'intervention : 1 minute). Une injection ou une administration du composé sera effectuée sur chaque animal (durée pour les injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et orales : entre 30 secondes et 1 minute).

Impact sur les animaux

Une partie des souris utilisées dans cette étude constitue un modèle classique pour l'étude du diabète de type 1 (DT1), présentant généralement une hyperglycémie modérée. Le prélèvement submandibulaire, réalisé en prélevant du sang sous la mandibule avec une aiguille ou une lancette, peut provoquer du stress et un inconfort local. Il y a également un risque de formation d'œdème autour du site de ponction et d'infection si les conditions d'asepsie ne sont pas rigoureusement respectées. La ponction de la veine caudale, qui implique l'extraction de sang de la veine située dans la queue, peut entraîner une douleur ou un inconfort, avec un risque d'infection si le site n'est pas correctement aseptisé. L'administration par voie orale (ou gavage) peut causer du stress et de l'inconfort, avec des risques de perforation ou de blessure de l'œsophage, ainsi que d'aspiration du liquide dans les poumons, entraînant des difficultés respiratoires si la sonde n'est pas correctement insérée. Les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV) peuvent entraîner des risques d'inconfort et de douleur au site d'injection. Pour les injections IP, il existe également un risque de perforation des organes internes. Concernant les injections SC, les risques incluent la formation d'œdèmes ou d'hématomes si l'injection est trop rapide. Pour les injections IV, les risques comprennent des saignements et des dommages veineux. Dans tous les cas, des infections peuvent survenir au site d'injection si les conditions d'asepsie ne sont pas strictement respectées.

Devenir

À la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre des analyses post-mortem.

Remplacement

Dans notre étude, les composés développés présentent des caractéristiques pharmacocinétiques uniques qui ne peuvent être correctement évaluées que dans des systèmes biologiques complexes, comme ceux des souris. L'étude in vivo est indispensable pour déterminer avec précision comment ces molécules sont absorbées, distribuées, métabolisées et éliminées dans l'organisme, car ces processus ne peuvent pas être simulés de manière fiable par des méthodes in vitro ou par modélisation informatique.

Réduction

Nous utiliserons un nombre minimal d'animaux pour nos expériences. Des tests statistiques sur des échantillons préliminaires ont montré que trois animaux par condition suffisent pour obtenir des résultats exploitables sans nécessiter de répétition supplémentaire. Certaines souris peuvent ne pas développer d’hyperglycémie, mais elles ne seront pas écartées, car elles présentent une infiltration lymphocytaire significative, un indicateur préclinique important du diabète de type 1 (DT1). Ainsi, notre étude inclura les souris diabétiques et prédiabétiques pour obtenir des données complètes et fiables sur la pharmacocinétique de nos composés. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous adopterons une approche séquentielle et hiérarchisée. Si un composé montre un profil d’exposition optimal avec une voie d’administration spécifique et une concentration donnée, les autres conditions expérimentales pourront être écartées. Nous ajusterons les expériences en fonction des résultats obtenus, conformément aux principes de réduction des 3R.

Raffinement

La glycémie sera mesurée par prélèvement d'une goutte de sang de la veine caudale. Avant l'incision, une crème analgésique contenant de la lidocaïne sera appliquée sur le bout de la queue pour une anesthésie locale. La ponction sera effectuée rapidement et avec précision pour minimiser le stress, et une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement et prévenir les hématomes. Le prélèvement submandibulaire sera réalisé par un opérateur expérimenté pour garantir rapidité et précision, réduisant ainsi l'inconfort. Des lancettes ou aiguilles stériles seront utilisées pour minimiser le risque d'infection ou d'œdème. Après le prélèvement, une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement. Pour les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV), une désinfection locale sera effectuée avant et après chaque injection pour réduire le risque d'infection. Des aiguilles de petit calibre seront utilisées pour diminuer la douleur et les traumatismes tissulaires. Avant une injection IV, la queue de la souris sera réchauffée dans de l’eau tiède pour dilater les vaisseaux sanguins, facilitant l'injection et réduisant les tentatives. Les volumes administrés seront limités afin d'éviter tout inconfort. Pour l'administration orale (ou gavage), des sondes d’alimentation appropriées seront utilisées pour minimiser le risque de perforation de l’œsophage ou de blessures internes. Les animaux seront surveillés pour tout signe de détresse ou difficulté respiratoire. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi et en groupes sociaux, dans des portoirs ventilés. Ils auront accès à de l'eau stérilisée et des aliments irradiés pour minimiser les risques de contamination. Durant toute la procédure, les animaux seront surveillés à l’aide d'une grille de score pour évaluer et objectiver les éventuelles souffrances, avec des points limites précoces et des mesures correctives adaptées.

Choix des espèces

Une partie des souris utilisées dans cette étude constitue un modèle classique pour l’étude du diabète de type 1 (DT1), car elles développent spontanément la maladie par des mécanismes similaires à ceux observés chez l'humain. Leur phénotype et les étapes de progression du DT1 sont bien documentés, ce qui permet de mener des études précises et reproductibles. Dans notre recherche, ces souris sont essentielles pour évaluer l’efficacité de nos composés dans le contexte du DT1. Une autre partie des souris de cette étude est dite "humanisée" ; elles ont été modifiées génétiquement pour exprimer un gène humain, ce qui permet de mieux prédire les réponses humaines aux composés étudiés. Des souris non modifiées seront également utilisées afin d’obtenir des données fiables sur le comportement des composés dans un contexte physiologique normal. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 20 semaines pour examiner comment les différents composés se comportent dans le corps. Cet âge correspond à la période adulte, où leur métabolisme est stabilisé, garantissant ainsi des réactions plus prévisibles aux traitements. À ce stade, les souris ont un métabolisme bien développé, ce qui nous permettra d’obtenir des résultats plus fiables et applicables, tout en réduisant les variations liées à la croissance ou au sevrage.

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.