Système endocrinien

2 528 souris vont être utilisées, tuées à l'issue ou mourant en cours d'étude pour les cohortes de longévité, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent injections, gavages, régimes gras sur plusieurs mois, tests métaboliques avec jeûne et prélèvements sanguins répétés, et passages en cage de calorimétrie. Le porteur reconnaît que régime gras, jeûnes, contention et transport sont des sources de stress. Il justifie l'espèce par l'espérance de vie courte de la souris, qui permet une étude de vieillissement en cinq ans, et présente le bénéfice thérapeutique comme lointain.

Objectifs

L’étude de la longévité et de l’espérance de vie en bonne santé est un enjeu actuel majeur. En effet, de par leurs forts impacts sur la santé publique, le vieillissement et les maladies chroniques font parties des thématiques prioritaires en recherche. Réduire le vieillissement et étendre l’espérance de vie en bonne santé est un enjeu économique majeur, en diminuant les maladies chroniques associées à l’âge. Ce projet de recherche s’inscrit dans cette thématique, en décrivant de façon originale le rôle méconnu des glucocorticoïdes (hormones circulantes impliquées notamment dans le métabolisme glucidique) dans le vieillissement des tissus sensibles à l’insuline, en particulier le tissu adipeux et le muscle squelettique ; et dans le vieillissement physiologique. Notre projet vise donc à définir l’impact des glucocorticoïdes sur le vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra in fine de proposer une approche thérapeutique ciblée afin de limiter l’impact métabolique néfaste des glucocorticoïdes et traiter les troubles métaboliques liés à l’âge pour étendre l’espérance de vie au global et/ou l’espérance de vie en bonne santé. De plus, ce projet déterminera si l’âge modifie la sensibilité aux glucocorticoïdes, notion importante sachant que les individus de plus de 65 ans sont surreprésentés dans la population traitée par les glucocorticoïdes.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront exposés à différents gestes techniques afin de répondre aux objectifs scientifiques. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les différentes séries de gestes réalisés sur les souris pourront être au choix selon les questions scientifiques : 1-Injections intrapéritonéale (1 fois par jour pendant 5 jours, 5 sec animal vigile), Administration de traitement dans l’eau de boisson (4 semaines maximum), Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte), 2h pour chaque tests, 2 tests espacé d’une semaine minimum), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 2-Injections intrapéritonéale (1 fois par jour pendant 5 jours, 5 sec animal vigile), Administration de traitement dans l’eau de boisson (4 semaines maximum), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 3-Utilisation de régimes spéciaux (20 semaines de régime maximum), Mesure de la pression artérielle (30 minutes pendant 5 jours, 2 fois au cours de la vie), transport optionnel vers un autre établissement, Mesure de la composition corporelle (5 à 10 minutes, animal vigile) et cages calorimétrie (5 jours maximum), Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests, 2 tests espacé d’une semaine minimum), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 4-Deux prélèvements sanguins espacés de 7 jours (20 secondes par prélèvement, 2 fois au cours de la vie sur animal vigile), Injection intrapéritonéale unique (5 sec par animal sur animal vigile), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 5-Etude de longévité incluant uniquement le maintien des animaux à long terme en conformité avec la réglementation et incluant un suivi avec établissement d’un score (5 min par animal, 1 fois toute les 6 semaines à partir de 18 mois et jusqu’à la fin de vie) Chaque point représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet les animaux seront impliqués dans différents actes pouvant induire un stress ou une douleur qui sera systématiquement prise en compte. Pour la quasi-totalité des animaux du projet, les administrations/prélèvements entraineront une contrainte/stress liée à la contention, au gavage et/ou à la piqure de l’aiguille pour les injections qui sont légers et de courte durée. Certains animaux seront exposés à des traitements aux glucocorticoïdes ou seront exposés à un régime gras pouvant induire une obésité et/ou une insulino-résistance. Ils seront également amenés à suivre des challenges métaboliques pouvant entrainer un stress ou des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie. Les animaux seront impliqués dans des mesures de la composition corporelle, de la pression artérielle et aux mesures de calorimétrie qui peuvent induire un stress de courte durée lié à leur placement en boites de contention ou de durée plus longue lors de l’isolement en cage de calorimétrie. De même, le transport possible des animaux vers un autre établissement qui pourra être mis en œuvre sera également source de stress pour les animaux. Enfin, les animaux inclus dans les cohortes de longévité pourront ressentir une contrainte/stress liée à la contention lors de l’évaluation de l’index de fragilité. Les animaux seront également exposés aux effets indésirables inhérent au vieillissement.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour limiter la souffrance animale et pour l’étude histologique ou biochimique des tissus sensibles à l’insuline des animaux. Dans le cadre de l’étude de vieillissement certains animaux seront susceptibles de décédés naturellement au cours de cette procédure de longévité ou seront euthanasiés par une méthode règlementaire en cas d’atteinte des points limites définis.

Remplacement

Il s’agit d’un travail de physiologie intégrée qui permettra de comprendre les communications inter-organes et les régulations métaboliques entre différents tissus. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire les interactions inter-organes et la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. D’un point de vue évolutif, le récepteur aux glucocorticoïdes apparait chez les vertébrés terrestres et plus particulièrement chez les mammifères, justifiant l’utilisation d’un modèle mammifère dans ce projet. Enfin, l’utilisation d’un modèle rongeur tel que la souris, se justifie par l’espérance de vie relativement courte de ces animaux, permettant la réalisation du projet dans le temps imparti (5 ans).

Réduction

Le projet impliquera un total de 2528 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte-tenu des données de la littérature et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. En effet, les procédures expérimentales et les tests statistiques ont été validées dans des études précédentes. L’effet de l’âge sur la mortalité des animaux et la variabilité des résultats a été pris en compte en augmentant le nombre d’animaux dans les groupes les plus âgés afin d’obtenir des résultats valides. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de leur vie grâce à une surveillance attentive (scoring, points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Nous avons inclus dans les protocoles de longévité des grilles d’évaluation spécifique, incluant des observations cliniques détaillées et le suivi du poids des animaux. Les animaux fragiles identifiés seront suivis avec une vigilance accrue. En cas d’atteinte d’un point limite préalablement défini, cela entrainera l’euthanasie de l’animal dans les plus brefs délais afin de limiter la contrainte au maximum.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Le récepteur aux glucocorticoïdes, tel que présent chez l’homme, est spécifique des mammifères et ne permet pas l’utilisation d’autres organismes modèles plus simples. Les expériences de longévité justifient l’utilisation de petits mammifères présentant une espérance de vie courte, tels que la souris. Plusieurs modèles murins transgéniques seront utilisés au cours de notre projet afin de répondre aux différentes questions scientifiques. Justification des stades de développement : Des souris commerciales et transgéniques seront utilisées de 10 semaines à 60 semaines afin d’étudier les adaptations métaboliques des animaux en cours de vieillissement. De plus, des animaux « gériatriques » (24 mois et plus) seront utilisés afin d’évaluer l’espérance de vie maximale des individus et leur sensibilité aux glucocorticoïdes. Justification du sexe : Les glucocorticoïdes sont connus pour induire un dimorphisme sexuel. Nous étudierons donc dans ce projet des animaux des deux sexes afin de déterminer si le dimorphisme sexuel en réponse aux corticoïdes est présent aussi avec l’âge.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie cérébrale, des tests sanguins après jeûne, un examen vaginal quotidien pour les femelles, et sont hébergées seules du début à la fin du projet. Le porteur reconnaît que l'isolement et le jeûne sont des sources de stress et de perte de poids. Il affirme que les interactions entre le cerveau et les organes ne peuvent être modélisées in vitro, l'objectif restant de comprendre le rôle d'un gène dans l'obésité.

Objectifs

Dans le cerveau, un liquide stérile circule dans des cavités appelées ventricules. Dans une region particulière du cerveau, la paroi du ventricule est constituée de cellules particulières que l’on nomme tanycytes. Or, les tanycytes jouent un role dans la balance énergétique, à savoir l’équilibre entre la prise, le stockage et et la dépense de calories, qui détermine le poids corporel. Ce rôle est particulièrement intéressant dans un contexte d’épidémie mondiale d’obésité. En outre, ces cellules produisent une molécule appelée Tbx3, dont le dysfonctionnement dans d’autres types cellulaires est connu pour favoriser le développement de l’obésité et du diabète. Cependant, le rôle de Tbx3 dans les tanycytes est encore mal connu. Notre objectif dans cette étude est d’empêcher la production de Tbx3 par les tanycytes, afin d’en étudier les conséquences sur le poids, la prise alimentaire et le contrôle de la glycémie (taux de sucre dans le sang), en particulier en situation d’alimentation hypercalorique. Nous souhaitons également en étudier les effets sur la maturité et le comportement sexuels, qui sont des fonctions biologiques influencées par les tanycytes.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de Tbx3 dans les tanycytes dans le développement de l'obésité et du diabète, en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements moléculaires associés au niveau cérébral. De plus, les tanycytes sont présents aussi bien chez la souris que chez l’Homme, ce qui renforce la portée translationnelle de ces résultats. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de restauration de la fonction des tanycytes pour lutter contre l’obésité, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Les 400 souris de ce projet sont concernées par l’ensemble des gestes suivants (sauf indication contraire) : 1) Neuro-chirurgie : cette technique est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 1 heure. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée durant toute l’étude. 2) Examen vaginal : cet examen d’une durée d’environ 10 secondes, légèrement invasif, est réalisé quotidiennement pendant 2 semaines, sur des souris adultes vigiles. Seules les femelles sont concernées, pour des raisons évidentes. 3) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite l’immobilisation de la souris dans un appareil, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris ne subiront cette analyse qu’une fois au cours de leur vie. 4) Tests sanguins : après un jeûne de 3 heures, les souris reçoivent une injection, puis 7 prélèvements sanguins (espacés d’au moins 15 min). Ces tests sont réalisés sans anesthésie. Deux tests seront réalisés sur les mêmes souris, séparés d’une semaine. 5) Hébergement : les souris de cette étude seront hébergées de manière individuelle. L’isolement débutera une semaine avant la chirurgie et se pousuivra jusqu’à la fin du projet.

Impact sur les animaux

L’hébergement individuel des animaux peut être sour ce de stress. Un stress d’immobilisation est également à prévoir lors de l’analyse de la composition corporelle. Les tests sanguins nécessitent au préalable un jeûne de 3 heures, pouvant engendrer une perte de poids le jour suivant. Les prélèvements sanguins réalisés à l’extrémité de la queue peuvent générer une légère douleur et un inconfort. Enfin, des douleurs post-opératoires sont attendues après la neurochirurgie.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort pour des pour réaliser des études moléculaires et biochimiques sur certains organes.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre l’effet de Tbx3 dans les tanycytes sur un ensemble de phénomènes, tels que le poids, la composition corporelle, la régulation de la glycémie, le cycle menstruel et les comportements sexuels. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec différents organes (foie, pancréas, organes sexuels…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante d’une communication entre tous ces acteurs. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire et sexuel nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé nos différentes expériences sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 semaines et seront habitués pendant au moins 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres, de sorte que chaque souris garde un contact visuel avec ses congénères. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une neuro-chirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de modification de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le contrôle de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, les tanycytes sont un type cellulaire présent à la fois chez la souris et chez l’Homme, ce qui renforce le potentiel translationnel de nos résultats. Toutes les souris de cette étude arriveront dans notre animalerie juste après leur sevrage (3 semaines). Pour certaines souris, les expériences débuteront au début de leur adolescence (4 semaines) alors que pour d’autres, nous attendrons l’âge adulte (9 semaines), afin de différencier les résultats obtenus à ces différents stades de développement.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les unes reçoivent de la streptozotocine par injection cinq jours de suite pour induire un diabète, les autres un régime gras pour devenir obèses, puis toutes sont gavées douze jours avec trois composés bloquant les récepteurs CB1. Le porteur indique un risque important de déshydratation chez les animaux diabétiques et une possible dermatite chez les animaux obèses. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur l'organisme entier et qu'aucun modèle cellulaire ne peut se substituer totalement au modèle animal.

Objectifs

L’obésité et ses conséquences métaboliques sont de plus en plus répandues et souffrent d’un manque de traitements pharmacologiques fiables. Les pathologies liées à l’obésité sont nombreuses et incluent le diabète lui-même facteur de risque de néphropathie. La néphropathie diabétique (ND) consiste en une perte de fonction rénale pouvant déboucher sur insuffisance rénale chronique touche des millions de patients dans le monde et malgré les efforts de recherches, peu d'options thérapeutiques sont disponibles. Récemment, 3 composés visant à bloquer une nouvelle cible (A , B et C) ont été sélectionnés pour être testés in vivo après avoir démontré une absence de toxicité à travers plusieurs approches de modélisation informatique et de tests in vitro. Ainsi, notre objectif est de tester l’efficacité in vivo de ces 3 composés chez 2 modèles animaux différents. Procédure 1 : chez un modèle de souris diabétique de type 1 Procédure 2 : chez un modèle de souris rendue obèse suite à une alimentation riche en graisse.

Bénéfices attendus

Le diabète et l’obésité représentent un véritable enjeu de santé publique ; ces pathologies étant classées parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir l’évolution de ces pathologies et de leurs complications. L’étude, le développement et la caractérisation de nouvelles cibles et de nouveaux agents pharmacologiques apparaît donc primordial afin de remédier à ce besoin médical non satisfait. Les bloqueurs des récepteurs aux cannabinoïdes 1 présentent un intérêt certain, l’un d’eux est d’ailleurs actuellement en cours d’évaluation au sein d’une étude clinique de phase II avec comme indication, la ND.

Procédures

Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et n’aura lieu que 2 fois par animal pour la procédure 1 et 7 fois pour la procédure 2. Les injections intrapéritonéale de streptozotocine auront lieu quotidiennement pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. Pour chaque injection, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes. Pendant les 12 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage. Pour chaque gavage, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes.

Impact sur les animaux

Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses et des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que ces pathologies ne soient pas des points limites, les conséquences qu’elles génèrent peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont très importants chez les animaux diabétiques et nécessite une attention particulière. Pour le modèle d’obésité, une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peux également entraîné le développement passager de dermatite.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

L’obésité et le diabète sont des pathologies multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

Pour le modèle STZ, la sévérité de la pathologie est estimée par la mesure du degré d’hyperglycémie et d’albuminurie développé par les animaux. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney. Le minimum d’animaux par groupe pour atteindre la significativité de différence de traitement est de 8-10. Toutefois, ce nombre pourra être réduit dès que la significativité sera atteinte. Pour le modèle d’obésité, la même approche sera employée en analysant la perte de poids et la diminution de quantité de graisse contenue dans le foie.

Raffinement

Depuis leur arrivée en provenance du fournisseur, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 4 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Tout au long de ce projet, plusieurs mesures de raffinement sont prévues.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Son métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction du diabète et de l’obésité sera réalisée chez des souris de 6 semaines. Pour le modèle STZ (streptozotocine), les souris seront âgées de 20 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 22 semaines lors de la mise à mort. Pour le modèle d’obésité, les souris seront âgées de 22 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 24 semaines lors de la mise à mort. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.

225 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 200 mâles tués à l'issue et 25 femelles réutilisées pour d'autres projets. Les mâles subissent une chirurgie stéréotaxique ouvrant la boîte crânienne pour injecter un vecteur viral supprimant le récepteur aux androgènes, puis des tests de comportement sexuel, d'anxiété, de locomotion et de fertilité. Les 25 femelles, utilisées comme animaux stimulus, subissent une gonadectomie et des injections de progestérone. Le porteur affirme que l'étude du comportement de reproduction ne peut se faire que sur "l'organisme entier" et signale des risques de douleur post-opératoire, d'hypothermie et d'arrêt cardio-respiratoire liés à la chirurgie et à l'anesthésie.

Objectifs

Ce projet vise à identifer les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction et du comportement de reproduction chez la souris adulte mâle. La survie des espèces dépend de la capacité des individus à se reproduire. Une reproduction réussie requiert la production de gamètes mais également l’expression des comportements de reproduction mâle et femelle afin d’optimiser la fécondation. Chez le mâle, la fonction de reproduction ainsi que le comportement de reproduction sont contrôlées par le cerveau sous l’action des androgènes. Des études précédentes ont démontré un rôle de la signalisation androgénique au sein du cerveau contrôlant la fonction de reproduction ainsi que l’expression du comportement de reproduction mâle. Ces études ont utilisé des souris dont la délétion du récépteur aux androgènes ciblait l’ensemble du tissu neural tout au long de la vie sans distinction du type cellulaire (i.e. cellules gliales versus neurones) ni de la région cérébrale. Ici, nous souhaitons décrypter plus en profondeur les phénotypes cellulaires et les régions cérébrales régulées par les androgènes dans la fonction et le comportement de reproduction mâle à l’âge adulte. Dans ce but, nous déléterons spécifiquement le récepteur aux androgènes au sein d’une région spécifique du cerveau, la region préoptique médiane, dans les cellules gliales ou neuronales à l’âge adulte puis nous étudierons la fonction et le comportement de reproduction suite à ces délétions.

Bénéfices attendus

Les perturbations hormonales au cours de la vie peuvent avoir un impact majeur sur les réponses neuroendocrines et comportementales liées à la reproduction par le biais d’altérations des structures cérébrales impliqués dans ces réponses. Cette étude participera à faire progresser la compréhension des mécanismes d’action sous-tendant cette régulation. Les modèles transgéniques utilisés nous permettront de comparer les mécanismes neuraux des deux voies de signalisation majeures impliquant les récepteurs des oestrogènes et des androgènes chez le mâle.

Procédures

Un nombre de 200 souris mâles subiront une chirurgie sous anéthésie générale avec réveil qui durera entre 30 et 45 minutes maximum. Après 3 semaines de rétablissement, les souris subiront différents tests de comportements sexuels, d’anxiété et de locomotion ainsi que des tests d’étude de leur fertilité. L’ensemble de ces tests n’a pas d’effet indésirable. Un lot de 25 souris femelles subira des gonadectomies sous anesthésie générale avec réveil qui durera entre 15 et 30 minutes maximum. Ces femelles subiront également 2 injections sous-cutanées de progestérone avant les tests de comportement sexuels.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous anesthésie générale à l’isofluorane pendant lesquelles une ouverture de la boîte cranienne est réalisée afin d’injecter dans une région cérébrale donnée un vecteur viral qui nous permettra de déléter le récepteur aux androgènes (AR). Les éventuels nuisances et effets indésirables à court et à long terme liés à cette chirurgie sont : - Une hypothermie - Arrêt cardio-repsiratoire liée à l’anesthésie - Une douleur post-opératoire se traduisant par une apparence, une position et des comportements anormaux - Une perte de poids rapide. La délétion de l’AR dans l’ensemble du système nerveux dès la conception n’entraîne pas d’effets indésirables : nous ne nous attendons donc pas à des nuisances ou des effets indésirables suite à la délétion restreinte de l’AR dans la région préoptique à l’age adulte.

Devenir

Au sein de cette demande d’autorisation de projet 200 animaux seront euthanasiés à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvements et analyses post-mortem nécessaires à l’étude du role du récepteur aux androgènes dans la régulation de la fonction et du comportement de reproduction mâle. Les animaux stimuli nécessaires à l’étude du comportement sexuel mâle (25 femelles) seront réutilisés pour des projets au sein de l’équipe de recherche ou par des collaborateurs afin de respecter la règles des 3Rs.

Remplacement

L’étude des fonctions et comportements de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Dans cette étude, nous souhaitons identifier les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction de reproduction et l’expression du comportement sexuel mâle. Cela nécessite des modèles animaux afin de pouvoir étudier les structures et populations cellulaires contrôlant la reproduction et les méthodes alternatives et/ou substitutives ne peuvent remplacer l’animal entier pour ce projet. La souris est le modèle animal sélectionné afin de tirer profit des techniques récentes (transgénèse conditionnelle et transduction virale) pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau

Réduction

Dans cette demande d’autorisation de projet, nous utiliserons un total de 1125 animaux (225 souris adultes et 900 souriceaux) sur 4 procédures qui nous permettront d’étudier le rôle du récepteur des androgènes dans la régulation de la fonction et du comportement de reproduction mâle. Pour chaque procédure, nous avons eu à cœur de calculer au plus juste le nombre d’animaux dans chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la puissance statistique de l’étude. Pour les études comportementales, 8 à 12 animaux par groupe sont nécessaires pour des résultats fiables et consistants. Un même groupe d’animaux est utilisé pour plusieurs tests. De plus, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses comportementales et immunohistochimiques. Nous péléverons également d’autres organes et les garderons pour de futures études ou nous les proposerons aux collaborateurs de l’équipe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie spécialisée sous la supervision des soigneurs et du vétérinaire-référent. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Au cours des chirurgies, les animaux seront anesthésiés par anésthésie gazeuse. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie, les animaux seront injectés en sous-cutané avec un analgésique en pré-opératoire 30 minutes avant la chirurgie et avec un analgésique anti-inflammatoire en post-opératoire toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Par la suite, un suivi journalier sera réalisé afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être animal. Les critères absolus suivants seront observés : - Apparence et position anormale : poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie - Comportements anormaux : aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation) - Une perte de poids rapide et supérieur à 20 pourcents du poids corporel de l’animal mesuré avant la chirurgie. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie stéréotaxique puis 1 fois par semaine. - Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité - Difficulté respiratoire Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s’assurer que toute souris présentant une perte de poids excessive (-20 pourcents du poids corporel au début de l’étude) ou une détresse seront euthanasiées. Suite à l’observation de ces critères et au diagnostic d’une douleur ou d’un mal-être animal, celui-ci sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d’outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques, vecteurs viraux, …) et de données dans la litérature permettant de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires et ainsi d’implémenter les connaissances sur cette thématique. Les animaux utilisés sont issus d’accouplements réalisés au sein de notre établissement utilisateur et seront utilisés à l’âge adulte lorsque leur maturité sexuelle est atteinte (à partir de 8 semaines). Chaque souris est identifiée soit par tatouage soit par encoche aux oreilles.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés seuls pendant huit à dix-sept jours, reçoivent des repas enrichis en tannins pour simuler une mauvaise assimilation des protéines, passent sept heures en cage métabolique, puis sont tués par ponction cardiaque sous anesthésie pour prélever le contenu de leur tube digestif. L'objectif est de mettre au point un test peu invasif qui pourrait ensuite être adapté à l'être humain, notamment aux enfants souffrant de malabsorption, le porteur renvoyant cette application au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe aucun modèle in vitro capable de reproduire une malabsorption protéique.

Objectifs

La capacité d’assimilation des protéines alimentaires par l’organisme est un des déterminants de la satisfaction du besoin protéique de l’être humain, notamment pour les populations vulnérables. Dans les pays en voie de développement, un apport protéique satisfaisant en quantité et en qualité n’est souvent pas assuré, ce qui entraîne des retards de croissance chez l’enfant. Les affections intestinales liées à l’environnement, dont les affections parasitaires, peuvent détériorer l’assimilation des protéines et donc aggraver l’insuffisance d’apports en protéines. L’objectif global du projet est d’évaluer l’efficacité de suppléments protéiques chez les enfants atteints de ces affections, et pour cela, il faut développer des tests peu ou pas invasifs pour rendre compte d’une amélioration de l’absorption intestinale. Pour cela, nous mettons en œuvre une étude sur rongeurs. Nous faisons varier la digestion des protéines grâce à l’ajout de tannins dans l’aliment. En effet, les tannins, présents dans des produits végétaux, perturbent la digestion des protéines, ce qui permet de mimer une malabsorption protéique. Par ailleurs, nous incorporons des traceurs de la protéine dans le repas, suivis dans l’air expiré et dans les urines. Grâce à ces données ainsi que les analyses effectuées sur les organes et le sang, nous testerons l’hypothèse qu’une baisse de la digestibilité des protéines induite par les tannins va se traduire par une baisse de l’apparition des traceurs dans le sang et l’urine. Si le test s’avère concluant, il pourra être développé chez l’humain, en comparant des individus sains ou atteints de pathologies qui détériorent l’assimilation des protéines.

Bénéfices attendus

Les données obtenues permettront d’évaluer si ce test est sensible à une perte de digestibilité des protéines. Si c’est le cas, il pourrait être adapté chez l’être humain pour révéler des situations de malabsorption protéique liée à des dysfonctions du tube gastrointestinal, dont la dysfonction entérique environnementale qui est susceptible d’altérer l’assimilation protéique.

Procédures

→ Les animaux seront hébergés en cage individuelle en permanence (pendant une durée de 8 à 17 jours selon le jour du test métabolique) . Ils auront un régime alimentaire standard et des petits repas test le matin, dans lequel des tannins sont incorporés (afin de diminuer la digestion des protéines de ce repas). Lors de l’exploration métabolique , ils seront placés dans une cage individuelle cylindrique pour mesurer les échanges respiratoires pendant 7 heures . Le jour de la mise à mort, les rats reçoivent 10 minutes avant le prélèvement sanguin, une injection intra péritonéale de xylazine (10mg/kg), puis ils sont anesthésiés par l’isoflurane (masque) et analgésiés localement par administration sous-cutanée au point d’incision (lidocaïne). Nous réalisons une ponction cardiaque pour prélever du sang. Les rats sont euthanasiés par injection intrapéritonéale d’Exagon (180mg/kg).

Impact sur les animaux

Il sera nécessaire d’héberger les animaux en cages individuelles car nous devons contrôler leur prise alimentaire et les habituer à l’ingestion d’un repas-test. Le jour du test, le rat sera placé dans une cage métabolique individuelle (une cage spécifique pour mesurer les échanges gazeux) différente de sa cage habituelle, ce qui peut générer un stress modéré. L’introduction des repas tests contenant des tannins peut perturber la motivation des rats à consommer leur repas. Bien que peu probable au regard de la dose administrée, les tannins pourraient provoquer des perturbations intestinales, type diarrhée.

Devenir

Les 48 rats seront euthanasiés afin de collecter les contenus des différents segments du tube digestif et mesurer la digestibilité des protéines.

Remplacement

A l’heure actuelle il n’existe pas de modèle in vitro permettant de mimer une malabsorption protéique qui pourrait être détectée dans les produits de dégradation finaux

Réduction

Les résultats pour chaque groupe d’animaux seront comparés entre eux en utilisant une analyse de la variance. A partir des données déjà publiées sur le sujet et dans des conditions expérimentales comparables, le nombre minimum d’animaux requis pour atteindre une puissance statistique suffisante est de 8 par groupe.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles seront enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque ainsi que des billes. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Les animaux seront regroupés lors des pesées et des prises alimentaires pour faciliter leur interaction, dans des cages avec des tunnels suspendus. Si une perte de poids de plus de 20% par rapport au poids de la dernière pesée, sans cause apparente et sans récupération, des diarrhées sans cause apparente ou des difficultés à uriner ou une modification de l’aspect des urines sont détectées grâce au suivi rapproché de chaque animal, il sera sorti du protocole expérimental et euthanasié si son état de santé ne s’améliore pas rapidement. A certaines étapes de la procédure, un traitement peut être envisagé (anti-inflammatoires gastro-intestinaux, etc., en conformité avec la posologie et voie d’administration indiquée par le référent vétérinaire). L e jour de la mise à mort, les rats reçoivent une injection intra péritonéale 10 minutes avant le prélèvement sanguin, puis une analgésie est pratiquée sous la peau au point d’incision. Nous réalisons une ponction cardiaque pour prélever du sang. Les rats sont euthanasiés par injection intrapéritonéale d’un produit léthal.

Choix des espèces

Le régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. De plus, le rat est une espèce de référence pour les études nutritionnelles quel que soit le stade de développement, ici le jeune rat post-pubère.

4080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit un régime obésogène, des mises à jeun, un hébergement individuel de 48 heures, des gavages et des prélèvements de sang répétés à la queue, avant d'être tué pour prélever tissus et organes. Le porteur classe ces actes de léger à modéré tout en reconnaissant que le régime peut gêner les déplacements et que l'isolement génère du stress. Il présente le projet comme une meilleure compréhension des maladies métaboliques liées au vieillissement et à l'obésité, les perspectives médicales restant à venir.

Objectifs

L’inflexibilité métabolique, commune à l'obésité et au vieillissement, est associée à la progression du diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires représentant la première cause de mortalité dans le monde. Ces pathologies résulteraient d’un défaut de gestion des lipides par le tissu adipeux mais les mécanismes impliqués sont encore mal compris. Les travaux de la littérature soutiennent l'hypothèse selon laquelle les cellules endothéliales vasculaires des tissus adipeux jouent un rôle central via leur capacité de gestion des flux lipidiques en fonction de l'état énergétique et que l’altération de cette fonction serait un événement précoce de l’altération de l’homéostasie lipidique systémique. Nous étudierons la contribution de signalisations cellulaires propres aux cellules vasculaires. Notre objectif est d’identifier des mécanismes propres aux cellules endothéliales vasculaires du tissu adipeux et d’évaluer l’impact de la modulation de leur phénotype sur l’expansion, la fonctionnalité du tissu adipeux et sur la progression des pathologies associées au vieillissement naturel et accéléré par l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux définir la contribution des altérations du système vasculaire dans la genèse des maladies métaboliques et cardiovasculaires associées au vieillissement naturel et accéléré par l’obésité et ce, en tenant compte du sexe. En particulier la complétion de ces travaux ouvrira de nouvelles perspectives médicales personnalisées pour diagnostiquer et traiter les individus à risque de développer un diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires associées.

Procédures

Les animaux seront soumis à des interventions de classes légère à modérée. -Prélèvements d’une goutte de sang à la veine caudale : maximum 1 fois 8 prélèvements espacés de 15 à 30 minutes (2 secondes par prélèvement) -Prélèvement de sang à la veine caudale par capillaire : maximum 4 fois sur 24 heures (15-30 secondes par prélèvement) -Gavage : maximum 1 fois par animal (10 secondes) -Mise à jeun : maximum 1 fois pour 12 heures effective (phase active) -Hébergement individuel : maximum 1 fois pendant 48 heures

Impact sur les animaux

Les expérimentations réalisées dans ce projet sont peu invasives indolores (pesée, régime riche en lipides, jeûne) ou de classe légère et modérée (test de tolérance au glucose, gavage, placement en environnement nouveau et seul pendant 48h pour la calorimétrie par exemple, mesure de la composition corporelle). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : - Régime obésogène peut induire une prise de poids pouvant gêner les déplacements - Hébergement individuel de 48h peut générer du stress - L’analyse de la composition corporelle peut générer un stress pendant le maintien immobile dans la cage de lecture (90 secondes) - Gavage peut générer du stress et inconfort durant la procédure (quelques secondes) - Prélèvement à la veine caudale peut générer du stress et une douleur légère - Mise à jeun peut entrainer du stress

Devenir

Les procédures d’études phénotypiques et métaboliques (Calorimétrie indirecte, Composition corporelle, Tolérance au glucose) sont des mesures faites sur l’animal au cours de la procédure de régime obésogène. Les animaux seront alors remis dans leur cage d’origine et seront soit euthanasiés à la fin du temps de régime défini afin de prélever les tissus et organes pour les analyses histologiques et cellulaire des tissus, soit étudiés lors des procédures terminales d’adaptation au jeûne/réalimentation ou challenge lipidique aigue. Au terme de ces procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus et fluides pour des études multi-omiques permettant de répondre aux questions scientifiques énoncées.

Remplacement

L’utilisation du modèle murin nous permettra d’identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant le système vasculaire qui surviennent avec le régime alimentaire, la prise de poids et le vieillissement. Les prélèvements humains représentent un point fixe de l’état individuel et ne permettent pas de contrôler l’historique de perte et/ou gain de poids. Aucun système de culture cellulaire n’a pu reproduire les variations circadiennes des apports en lipides qu’auront à subir les cellules endothéliales chez des souris alternant des phases d’apport nutritif et de repos. Notre objectif est d’identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en place avant l’apparition des désordres métaboliques et cardiovasculaires.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux pour cette étude, nous avons réalisé une veille bibliographique, tenu compte de nos expériences passées et conçu les expériences afin d’obtenir un pouvoir statistique suffisant avec un nombre minimum d’individus. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, plusieurs procédures expérimentales de classe légère puis modérée seront réalisées sur les mêmes groupes d’animaux dès lors que les animaux auront recouvré un bien-être général et dans la mesure où les procédures ne peuvent pas interférer entre elles.

Raffinement

Lors de leur arrivée en zone expérimentale les souris sont placées en salle d’acclimatation et y resteront pendant 1 semaine en présence de ouate pour réduire le stress qui pourrait être causé par le transport. Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge par le personnel de la zootechnie compétent qui vérifiera leur état et bien-être. Les animaux issus de différentes cages de transport ne sont jamais mélangés dans les cages d’hébergement. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance : dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessous, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement par les zootechniciens et par les expérimentateurs du projet. Ce suivi aura pour but de détecter de la douleur, d’évaluer la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, il sera anesthésié puis, après perte de conscience, l’animal sera euthanasié par dislocation cervicale. Observation quotidienne pendant la durée de la procédure. Dans nos connaissances actuelles, les procédures ne doivent pas modifier le comportement général des animaux ni altérer leur bien-être, même si les animaux sont gardés jusqu’à un âge avancé.

Choix des espèces

La souris de fond C57BL6/J est un modèle reconnu dans l’étude du métabolisme et de l’obésité. Nourrie en alimentation riche en gras, elle développe des anomalies similaires à celles associées au syndrome métabolique chez l’Homme. Animaux âgés de 8 semaines et 12 mois en début de protocole. Nous souhaitons utiliser des animaux à maturité et nous affranchir de la phase exponentielle de croissance. L’utilisation de 2 tranches d’âge (8 semaines et 12 mois + 1, 4, 12 semaines) nous permettra d’évaluer si l’adaptation vasculaire peut avoir des effets variables en fonction de l’âge.