Système cardiaque

Pour tester des inhibiteurs d'une protéine mitochondriale sur le cancer colorectal et sur les muscles, 62 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour dix d'entre eux et modéré pour les 52 autres. Ces rats sont génétiquement modifiés et portent une mutation qui déclenche des tumeurs intestinales. Ils reçoivent un traitement anticancéreux dans l'abdomen deux fois par semaine pendant neuf semaines, sont pesés jusqu'à une fois par jour, subissent deux mesures de pression artérielle et une échographie cardiaque sous anesthésie. Le porteur indique que la cachexie cancéreuse leur fait perdre poids, appétit et mobilité, que 52 d'entre eux seront tués pour prélever le bloc cœur-poumons, et que les dix n'ayant subi qu'une échographie partiront vers un autre projet.

Objectifs

L’ion calcium est impliqué dans différents processus favorisant le développement du cancer. A l’échelle cellulaire, les variations de calcium intra-mitochondrial sont essentielles à la production d’énergie pour la cellule. Or, dans les cellules cancéreuses, les mitochondries présentent divers degrés de dysfonctionnement. Ainsi, le développement de nouveaux agents visant spécifiquement ces organites suscite un intérêt croissant dans la lutte contre le cancer. La sortie de calcium de la mitochondrie dépend d'une protéine mitochondriale. Dans le cancer colorectal, cette protéine joue un rôle ambivalent : une diminution de son expression et de son activité entraine une réduction significative de la croissance tumorale, mais semble ensuite favoriser l’apparition de métastases ainsi qu’une résistance à la chimiothérapie. Toutefois, ces résultats proviennent d’expériences in vitro, réalisées sur des cellules probablement adaptées à l’absence de cette protéine. L’utilisation d’approches pharmacologiques ciblant spécifiquement cette protéine apparaît donc indispensable pour mieux comprendre son rôle dans la progression du cancer colorectal. Le calcium mitochondrial joue également un rôle crucial dans la régulation des cellules musculaires. Chez les patients atteints de cancer, le fonctionnement de ces cellules peut être altéré par la maladie elle-même et/ou par les traitements anti-cancéreux, entraînant des complications qui détériorent fortement la qualité de vie des patients. Les effets de stratégies pharmacologiques ciblant la protéine mitochondriale étudiée n’ont pas encore été étudiés sur les organes comportant des cellules musculaires. Ce projet a donc pour objectif d’étudier l’impact systémique du développement du cancer colorectal et des traitements ciblant la protéine d'intérêt, à l’aide d’un modèle de rat génétiquement modifié. Ce modèle est porteur d'une mutation fréquemment retrouvée dans les cancers colorectaux humains et constitue un modèle pertinent pour reproduire fidèlement la tumorigenèse intestinale.

Bénéfices attendus

À court terme (pendant et juste après le projet) : - Meilleure compréhension du rôle de la protéine d'intérêt dans la progression du cancer colorectal. - Acquisition de données sur les effets du cancer colorectal et des inhibiteurs de la protéine d'intérêt sur la physiologie cardiovasculaire, musculaire et intestinale dans un organisme entier. Comparaison entre la chimiothérapie conventionnelle et l’approche innovante (inhibition de la protéine d'intérêt). - Identification de signatures biologiques associées à la modulation de la protéine d'intérêt et au développement tumoral, en tenant compte non seulement de la tumeur mais aussi des organes périphériques (muscles cardiaques et squelettiques, intestin, foie, tissu adipeux). - Meilleure gestion des effets secondaires : compréhension des impacts métaboliques des approches pharmacologiques ciblant la protéine d'intérêt pour mieux anticiper et limiter les complications cliniques chez les patients. - Production de données essentielles pour justifier le passage à des essais cliniques précoces d’inhibiteurs de la protéine d'intérêt. À long terme (5-10 ans et au-delà) : - Développement de nouvelles classes de médicaments ciblant la protéine d'intérêt, pouvant compléter ou remplacer certains traitements classiques du cancer colorectal. - Intégration des connaissances dans les stratégies personnalisées de traitement du cancer colorectal, en tenant compte du profil tumoral et des comorbidités du patient. - Amélioration de la qualité de vie : réduction des complications cardiovasculaires et musculaires liées aux cancers digestifs et à leurs traitements, grâce à des thérapies mieux tolérées. - Extension à d’autres pathologies : les connaissances acquises pourraient bénéficier à la recherche sur d’autres cancers, mais aussi sur des maladies cardiovasculaires et métaboliques.

Procédures

Injection sur animal vigile de traitement anticancéreux par voie intrapéritonéale 2 fois par semaine pendant 9 semaines (< 5 minutes à chaque fois). Pesée des animaux vigiles : 3 fois/semaine pendant 6 semaines puis 1 fois/jour pendant 3 semaines (< 1 minutes à chaque fois). Mesure de la pression artérielle chez le rat vigile, 2 fois par animal (< 10 minutes à chaque fois). Injection par voie intrapéritonéale d’un anesthésique sur animal vigile (1minute) puis échographie cardiaque (5 minutes). Prélèvement du bloc coeur-poumons sous anesthésie générale profonde 1 fois/animal pendant moins d’1 minute.

Impact sur les animaux

Stress durant le transport des animaux. Stress ponctuel lié à la manipulation/contention des animaux lors des pesées, de la mesure de la pression artérielle et des injections intrapéritonéales. Douleur au niveau des sites d’injection du traitement ou du solvant. Le cancer et le développement tumoral peuvent entrainer des symptômes d'intensité limitée : une perte de poids, une perte d’appétit et une réduction de la mobilité à cause de la cachexie cancéreuse.

Devenir

Les rats ayant subis une échographie uniquement seront réutilisés dans un autre projet. Pour les groupes d’animaux témoins et traités, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs ainsi que plusieurs organes pour caractériser l'effet biologique des traitements. Nous devons pour cela procéder au prélèvement du bloc cœur-poumons, ce qui entraine la fin de vie de l’animal.

Remplacement

L’un des principaux défis de la recherche sur les effets systémiques de la tumeur sur l’hôte réside dans les défaillances multi-organiques qui en résultent. Cette complexité rend le développement de modèles expérimentaux particulièrement difficile. À ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro capable de reproduire fidèlement ces interactions. Les altérations métaboliques étendues et les atteintes de plusieurs organes compliquent fortement la conception d’approches pertinentes. La recherche dans ce domaine s’appuie notamment sur l’utilisation de biopsies humaines, exploitées directement ou utilisées pour établir des lignées cellulaires et des organoïdes. Cependant, ces approches présentent des limites : quantité et qualité variables des échantillons, accès restreint à certains organes (cœur, intestin, foie) et contraintes éthiques. De plus, les lignées cellulaires immortalisées ne reflètent pas la complexité fonctionnelle des tissus dans leur contexte physiologique. Ces limites nous conduisent à recourir à des modèles animaux et à des expérimentations in vivo, seules approches permettant d’étudier de manière intégrée l’impact de la tumeur sur l’organisme entier.

Réduction

L’étude comporte une étape préliminaire comportant au maximum 10 animaux ainsi que quatre groupes expérimentaux de rats comprenant chacun 13 animaux, soit un total de 62 rats. Ce nombre a été défini pour maintenir un équilibre éthique et scientifique, en garantissant une puissance suffisante pour détecter des effets modérés à forts à l'aide d'outils statistiques tout en limitant l’usage d’animaux.

Raffinement

Une phase d’habituation sera mise en place pour limiter le stress des animaux. Tous les animaux seront hébergés dans un milieu enrichi. Après chaque mesure expérimentale et chaque administration, l’animal recevra une récompense alimentaire. Les animaux seront étroitement surveillés pendant toute la durée du traitement avec, le cas échéant, l'utilisation d'un analgésique et des points limites adaptés.

Choix des espèces

Notre modèle de rat génétiquement modifié, porteur d'une mutation fréquemment retrouvée dans les cancers colorectaux humains, permet de reproduire fidèlement la tumorigenèse intestinale. Ce modèle ne se limite pas à l’étude du développement tumoral : il offre également la possibilité d’analyser les conséquences systémiques du cancer sur l’organisme entier. Ainsi, il permettra d’évaluer à la fois la charge tumorale et l’impact de la maladie sur des fonctions clés telles que la motilité intestinale, la fonction cardiovasculaire et la physiologie musculaire squelettique. Grâce à cette approche intégrative, ce modèle est idéal pour générer des données essentielles à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques et pour justifier, le cas échéant, le passage à des essais cliniques précoces. Les animaux utilisés dans ce projet seront à un stade adulte et âgés de 12 semaines au début du traitement. Ce choix repose sur des considérations physiologiques et méthodologiques. En effet, il s’agit d’une période où l’organisme a atteint sa maturité fonctionnelle et présente une stabilité métabolique, cardiovasculaire et musculaire, conditions indispensables pour obtenir des données fiables et interprétables.

12 720 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 7 020 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un infarctus est provoqué chirurgicalement sur le cœur, suivi de biopsies et de six prises d'image par animal sous anesthésie, le porteur annonçant une baisse d'activité ou d'appétit après l'opération. L'espoir de stratégies pour régénérer les tissus humains est renvoyé au long terme, l'objet immédiat étant d'identifier les séquences d'ADN qui activent la régénération du cœur du poisson, une partie des animaux étant aussi utilisée pour la formation de personnels. Le porteur affirme que les cultures de cellules et les modèles informatiques ne reproduisent pas ce qui se passe dans un cœur vivant, et justifie l'effectif par des stratégies d'accouplement calculées d'après des expériences antérieures, sans donner de chiffre.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment certains tissus peuvent se régénérer après une lésion chez le poisson zèbre. Ce petit poisson est utilisé comme modèle scientifique car il possède une capacité naturelle à reconstruire des organes endommagés, comme la nageoire ou le cœur. Pour atteindre cet objectif, les approches suivantes seront adaptées : 1. Identifier les séquences d'ADN responsables de l'activation des programmes de régénération cardiaque. 2. Évaluer l’impact de l’inhibition pharmacologique ou de la délétion génique de ces éléments sur la régénération cardiaque. En étudiant ces mécanismes, nous espérons identifier des processus biologiques communs qui pourraient, à long terme, aider la recherche médicale à développer de nouvelles stratégies pour favoriser la régénération des tissus chez l’être humain, par exemple après un accident ou une maladie.

Bénéfices attendus

Le poisson zèbre permet d’étudier comment le cœur peut se réparer après un infarctus. En comprenant comment les gènes s’activent pour régénérer le cœur chez le poisson, nous pourrons mieux comprendre pourquoi le cœur humain a plus de difficultés à se réparer. Ces connaissances pourraient ensuite aider à développer de nouvelles stratégies pour améliorer la récupération du cœur après une attaque cardiaque.

Procédures

Biopsie: réalisée une seule fois sous anesthésie générale et analgésie, durée

Impact sur les animaux

LLes effets indésirables prévus sur les animaux : • Biopsie: sous anesthésie générale et analgésique peut induire une gêne très brève de quelques secondes. • Chirurgie cardiaque : sous anesthésie générale et analgésique peut induire une douleur modérée de courte durée après l’infarctus expérimental, pouvant s’accompagner d’une baisse d’activité ou d’appétit. •Imagerie : réalisée sur animaux anesthésiés, 6 photos par animal, chaque photo prenant environ 1 minute.

Devenir

L'ensemble des poissons de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été́ réalisées soit au court des procédures soit seront réalisées en post mortem.

Remplacement

Dans ce projet, l'utilisation d'animaux est nécessaire pour comprendre comment le cœur peut se réparer naturellement après une blessure. Ce phénomène de régénération implique des mécanismes très complexes qui concernent l’ensemble du corps, comme la circulation du sang, les réactions du système immunitaire ou encore les échanges entre différents types de tissus. Aujourd’hui, les expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ou des modèles informatiques ne permettent pas de reproduire avec précision ce qui se passe dans un cœur vivant. Le poisson zèbre, un petit poisson dont le cœur a une grande capacité naturelle de régénération, est utilisé dans ce projet. Il constitue un modèle reconnu et précieux pour mieux comprendre les mécanismes qui pourraient un jour aider à réparer un cœur humain malade.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien ce projet et effectuer les tests statistiques nécessaires à l'analyses des données.

Raffinement

Les poissons utilisés dans ce projet sont élevés dans de bonnes conditions (eau propre, température adaptée, éclairage approprié) et leur comportement est observé chaque jour. Toutes les interventions sont réalisées avec le plus grand soin et sous anesthésie, avec des traitements pour limiter la douleur. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués afin de réduire au maximum tout inconfort pour les animaux. Après chaque intervention, les poissons sont surveillés et, si leur état se dégrade, une mise à mort sans douleur est pratiquée immédiatement.

Choix des espèces

Le poisson zèbre (zebrafish) est un animal largement utilisé en recherche biomédicale car il partage environ 70 % de son génome avec l’être humain, et son système cardiovasculaire fonctionne de manière très similaire au nôtre. Pendant le développement, ses embryons se forment à l’extérieur de la mère et sont transparents, ce qui permet d’observer en détail la formation du cœur et des vaisseaux, sans chirurgie ni extraction. Notre étude se fera chez l’adulte, ce poisson possède une capacité remarquable de régénération : il peut réparer entièrement une partie de son cœur après une blessure. Cette aptitude exceptionnelle en fait un modèle idéal pour étudier la régénération des organes et mieux comprendre les mécanismes qui pourraient un jour inspirer la médecine humaine.

660 000 souris et rats sont élevés pour être livrés aux laboratoires porteurs de la mutation voulue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 535 000 d'entre eux et modéré pour 125 000. Chacun peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue pour vérifier son génotype, jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour et une injection d'hormone destinée à activer sa mutation. Une partie part vers d'autres établissements, le reste est mis à mort, ces animaux appartenant au scientifique et ne pouvant, selon le porteur, être replacés. Il annonce une hausse d'environ 10 % des effectifs et indique que les scientifiques s'engagent par écrit à l'absence de solution de remplacement, l'objectif affiché étant de leur livrer le "modèle parfaitement adapté" à leurs expérimentations.

Objectifs

Ce projet consiste à maintenir des lignées de rongeurs dont certains gènes ont été modifiés. Ces modifications peuvent provoquer chez les animaux des changements visibles ou des symptômes particuliers, appelés phénotypes. L’objectif est d’observer ces animaux, de comprendre si la mutation génétique a un impact sur leur santé et leur bienêtre, et d’ajuster la manière dont ils sont suivis et soignés en fonction de ces observations. Ces animaux sont utilisés comme modèles dans la recherche scientifique, par exemple pour mieux comprendre des maladies génétiques comme la mucoviscidose, l’hémophilie ou certaines myopathies, et contribuer au développement de nouveaux médicaments. Pour savoir si un animal porte réellement la mutation recherchée, on effectue une biopsie, généralement en prélevant un morceau d’oreille. Ce prélèvement sert à extraire l’ADN et à vérifier si la mutation est présente. Cela est indispensable, car dans une même portée, tous les animaux ne sont pas forcément porteurs, et il faut pouvoir identifier précisément ceux qui seront utiles pour les recherches et garantir la fiabilité des résultats. Lorsqu’une nouvelle lignée génétiquement modifiée arrive ou est créée, et que l’on ne connaît pas encore les effets de la mutation, une phase d’observation détaillée est mise en place pour comprendre comment celleci influence l’animal et s’assurer que son bienêtre est préservé. Lorsque les effets de la mutation sont déjà connus, le suivi et les soins sont adaptés directement, en surveillant les éventuels signes cliniques et en mettant en place des mesures de prévention ou de traitement si nécessaire. Pour certaines lignées, la mutation ne s’exprime que lorsque l’animal reçoit une substance déclenchante, par exemple une hormone, ce que l’on appelle un ligand. Une administration peut donc être réalisée afin d’activer la mutation et de permettre à l’animal de manifester les caractéristiques liées à cette modification génétique. Dans l’ensemble du projet, environ 660 000 animaux sont concernés, avec une augmentation d’environ 10 % liée à une utilisation croissante de ces modèles. Ils sont répartis dans 500 à 600 projets de recherche différents. Parmi ces projets, environ 35 % portent sur des lignées génétiquement modifiées, pour lesquelles les animaux font l’objet d’une attention particulière en matière de suivi et d’évaluation des phénotypes, afin d’anticiper et de limiter au maximum l’impact potentiel de la mutation sur leur bienêtre. 

Bénéfices attendus

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait dû être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptées à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le modèle parfaitement adapté pour leurs expérimentations.

Procédures

Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis (par animal) : à 1 à 2 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique : un prélèvement par animal à la queue maximum) (maximum 4 biopsies sur validation par l’équipe vétérinaire), acte d’une durée maximale de 2sec par biopsie. à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale de max 3sec. à une injection d’un ligand, acte d’une durée maximale de 10sec par injection. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite).

Impact sur les animaux

Expression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité innatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dus à l'injection d’un produit.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).

Remplacement

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.

Réduction

Le nombre d’animaux hébergés et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur génétiquement altéré quand il est accouplé avec des animaux non génétiquement altéréesafin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, n’est utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypage. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européennes (au moins 7 animaux de chaque sexe et génotype, sur 2 générations).

Raffinement

En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés au suivi vétérinaire des animaux. Pour les lignées à phénotype dommageable, des observations cliniques plus fréquentes et spécifiques, avec des points limites, peuvent être mises en place. Pour limiter la douleur, une euthanasie pourrait être demandée à un point limite ou âge précis pour éviter l’expression du phénotype. Cela est évalué lors de la caractérisation du phénotype, en lien avec le scientifique et les vétérinaires. Les observations sont facilitées par des outils internes comme des grilles de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype, des points d’intervention sont adoptés pour un suivi précis et des soins adaptés (soutien nutritionnel…). Si des signes cliniques peuvent être atténués ou guéris par traitement, avec accord du scientifique, le traitement est mis en place. Les animaux présentant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final pour assurer leur réception et utilisation selon les normes éthiques et de bien-être animal.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement altérés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5 jours après la fécondation.

Vingt-six semaines de régime gras et enrichi en cholestérol, puis cinq injections quotidiennes pour déclencher un diabète, avant d'être tuées sous anesthésie sans réveil pour le prélèvement de leur aorte ou d'un rein : c'est le parcours des souris donneuses de greffon. Les receveuses sont opérées de quarante-cinq à soixante minutes pour recevoir ce greffon, subissent une néphrectomie, jusqu'à soixante injections d'inhibiteurs et des prélèvements sanguins hebdomadaires à la lancette dans la joue, puis vivent seules en cage pour qu'elles ne rongent pas leurs sutures. 5 742 souris vont être utilisées au total dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, le porteur retenant surtout des mâles, "plus faciles à opérer du fait de leur grande taille", et comptant 10 % de mortalité périopératoire. Toutes sont tuées, les donneuses pour livrer leur organe, les receveuses pour l'analyse du greffon, du sang et des cellules immunitaires.

Objectifs

La transplantation d’organes est le traitement de référence en cas de défaillance chronique terminale d’un organe vital (rein, cœur, poumon, foie). Malgré le recours aux traitements immunosuppresseurs, la dysfonction chronique du greffon, se manifestant à partir d’un an après transplantation, demeure un problème médical majeur, limitant la longévité du greffon ainsi que la qualité et l’espérance de vie des patients transplantés. La vasculopathie de transplantation (VT) est une lésion fréquemment observée après la greffe, qui se traduit par une sténose des vaisseaux sanguins du greffon, entraînant un défaut d'approvisionnement en sang. Les signatures histologiques de la VT se retrouvent particulièrement dans le coeur et le rein greffés : dans 10-50 % des cas plus d’un an après la greffe rénale et avec une prévalence de 40 % 8 ans après transplantation cardiaque. La sévérité de la VT est notamment associée aux facteurs de risque cardiovasculaires classiques, dont le diabète. Ainsi plusieurs larges études récentes réalisées entre 1995 et 2019 et regroupant les données de plus de 200 000 patients, démontrent que les greffons rénaux provenant de donneurs diabétiques présentent une survie diminuée par rapport aux donneurs non diabétiques. Sachant qu’en 2045, 46 % de la population, donc des donneurs potentiels, sera diabétique, il est primordial de comprendre les mécanismes sous-jacents à la dysfonction des organes greffés issus de donneurs diabétiques. Ceci permettra d’augmenter le taux d’acceptation de ce type de greffons, ce qui élargira le pool de greffons disponibles et permettra de mieux prendre en charge les patients greffés avec des organes de diabétiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier des nouvelles cibles thérapeutiques pertinentes et efficaces pour prévenir le développement de la vasculopathie de transplantation, notamment lorsque les patients reçoivent un organe issu de donneur diabétique. Ceci permettra de rendre l’utilisation d’organes donneurs diabétiques plus sûre, et donc à la fois de diminuer le temps passé sur liste d’attente pour un greffon, et d’augmenter la qualité et la durée de vie des patients transplantés avec des greffons diabétiques.

Procédures

Tout ou partie des animaux enrolés dans les procédures seront soumis: 1/un régime enrichis en gras et cholestérol pendant 26 semaines 2/une chirurgie sans réveil : prélèvement du greffon aortique (30 min) 3/ une chirurgie avec réveil : implantation du greffon aortique (45 min) 4/ une chirurgie sans réveil : prélèvement du greffon rénal (45 min) 5/ une chirurgie avec réveil : implantation du greffon rénal (60 min) 6/des injections tous les jours pour induire un diabète (5 jours, 5 injections, durée: 30 sec) 7/ des injections tous les jours pour induire un diabète (2 jours, 2 injections, durée: 30 sec) 8/ des injections d'inhibiteurs de cibles thérapeutiques (15 jours, 15 injections, durée : 30 sec ou 1 mois, 30 injections, durée : 30 sec ou 2 mois, 60 injections, durée : 30 sec) 9/ des prélèvements sanguins sur le donneur de greffon (7 fois en 26 semaines, ou 6 fois en 6 semaines, durée : 5 sec) 10/ des prélèvements sanguins sur l'animal greffé (6 fois en 2 mois, durée : 30 sec) 10/un prélèvement sanguin le jour de la mise à mort sur animal anesthésié (durée: 1 min).

Impact sur les animaux

L’implantation du greffon aortique ou rénal (durées de la chirurgie : respectivement 45 et 60 min) ou la néphrectomie (15 min) sont des procédures de gravité modérée qui doivent être exécutées avec une technicité sans faille et dans le temps imparti afin d’éviter des complications, dont le décès périopératoire ou la douleur et le mal-être postopératoires. Les chirurgies peuvent entraîner une hypothermie (max. 12h) et une douleur post-opératoire (en général moins de 24h et max. 5 jours). Une perte de poids légère peut survenir après la chirurgie. La chirurgie peut causer un stress (max. 3 jours), et les points de suture sont un danger potentiel en cas de contact avec les pairs. Le prélèvement sanguin à la veine mandibulaire à l’aide d’une lancette de 5mm effectué de manière hebdomadaire pour les souris transplantées rénales entraîne une douleur légère et de courte durée.

Devenir

Les animaux donneurs de greffon sont mis à mort pour le prélèvement de leur greffon aortique ou rénal, utilisé pour être implanté aux animaux receveurs. Les animaux receveurs de greffon sont mis à mort pour analyse de la vasculopathie de transplantation sous l'impact du diabète du receveur, en combinaison ou non avec différents traitements ou modifications génétiques. Seront analysés les greffons ainsi que le sang et les cellules immunitaires des souris receveuses de greffon.

Remplacement

Notre équipe développe des modèles 2D et 3D de vaisseaux sanguins afin d’analyser et de modéliser les structures des artères, afin d’éviter d’avoir recours à des animaux quand cela est possible. Cependant, la vasculopathie de transplantation est un contexte pathologique complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires de la paroi vasculaire, le microenvironnement rénal, ainsi que des facteurs circulants, en particulier les cellules immunitaires. De ce fait, les mécanismes étudiés ne sont pas toujours modélisables in vitro, le recours aux modèles animaux est donc nécessaire et indispensable. De plus, dans notre contexte d’étude, une transplantation d’organes in vivo est la seule approche expérimentale permettant de mimer la transplantation d’organes chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum, en respectant les exigences des publications, sans nuire aux objectifs du projet et en garantissant des analyses statistiques de qualité . Par ailleurs, les expérimentations ont été optimisées de manière à regrouper les analyses sur un même animal chaque fois que cela est possible. Des groupes de 11 animaux sont requis pour obtenir une distribution normale, compenser la variabilité entre individus et tenir compte de la mortalité périopératoire (10%). La plupart des manipulations seront réalisées sur des souris mâles, plus faciles à opérer du fait de leur grande taille, et seuls les résultats les plus porteurs (espoir d’une nouvelle thérapie etc) seront validés sur des groupes de souris femelles. La transplantation rénale, plus lourde que la transplantation aortique, ne sera utilisée que pour la preuve de concept des résultats obtenus avec les transplantations aortiques. Le choix du groupe contrôle a été réfléchi afin de pouvoir le comparer à plusieurs groupes expérimentaux. Enfin, les tissus non prélevés chez l’animal pourront être récupérés par d’autres membres de l’équipe ou de l’institut pour optimiser la nécessité d’une mise à mort d’un animal.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes aux normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement approprié (igloo, bâtonnets de bois, coton, sizzle nest) et un statut sanitaire sans pathogène fixe, contrôlé tous les trimestres. Les souris receveuses ayant reçu une greffe d’organe sont hébergées de manière individuelle afin d’éviter les accidents potentiels (grignotage des points de suture, compétition pour la nourriture). Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont mises en place. Les protocoles d’anesthésie utilisés lors des chirurgies sont éprouvés par notre équipe et ont été réfléchis en concertation étroite avec le vétérinaire. Ils garantissent la narcose, la myorelaxation et l’analgésie de manière stable. En particulier, un anti-douleur fort (opioïde de palier 3), agit au niveau de la moelle épinière et du cerveau, ce qui permet d’interférer à plusieurs niveaux du trajet de la nociception. Le cocktail anesthésique est antagonisé chez la souris receveuse à la fin de la chirurgie afin d’éviter le développement de l’hypothermie ou autres effets indésirables dus à une anesthésie trop longue (dépression respiratoire, cardiaque). A ce moment-là, une administration d'anti-douleur avec un temps d'action long prend le relais. Le personnel de zootechnie suit les animaux au quotidien et utilise une grille de scoring validé par la structure chargée du bien-être des animaux. Si un animal présente des signes cliniques comme la perte de poids, la prostration ou des blessures, l’état général pourra être évalué par la structure chargée du bien-être des animaux et le vétérinaire désigné pour décider des soins à mettre en place pour réduire le stress, la douleur, l’incofort de l’animal. Si l’état est jugé négatif, l’animal sera sorti de l’étude et mis à mort. Les procédures de mise à mort sont réalisées sous anesthésie et analgésie afin de diminuer au maximum la douleur des animaux. Des molécules analgésiques sont administrées en post-opératoire suite à la chirurgie et sont étendues jusqu’à 5 jours, jusqu’à rétablissement complet de l’animal. Des suppléments nutritionnels sont donnés aux animaux post-chirurgie pour faciliter l’accès à la nourriture et éviter une perte de poids. Si l’hyperglycémie des souris donneuses induit une diurèse plus fréquente, les litières seront changées plus fréquemment pour que les animaux aient un environnement propice au bien-être.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle expérimental pour lequel il existe des animaux génétiquement modifiés pour lesdifférentes cibles thérapeutiques étudiées dans ce projet. Du fait de sa petite taille et de son cycle de reproduction rapide, la production de générations successives facilite la mise en œuvre des protocoles expérimentaux. La souris possède également des paramètres physiologiques similaires à ceux de l'Homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude des pathologies chroniques, en particulier consécutives à la transplantation d’organes. Les animaux enrôlés dans les procédures seront âgés de 7 à 35 semaines. Il est nécessaire d’utiliser des animaux adultes avec un système vasculaire mature, donc des animaux de plus de 7 semaines. Dans la plupart des cas, les animaux utilisés auront entre 7 et 12 semaines, donc des jeunes adultes, ce qui permet de ne pas tenir compte du vieillissement. Lorsque les animaux donneurs de greffons seront soumis au protocole d’induction du diabète impliquant une mise sous régime spécial, ils seront utilisés à 33-35 semaines car leur régime alimentaire de type western diet dure 26 semaines.