Système cardiaque
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- Système urogénital
Evaluation de traitements susceptibles d’augmenter les taux de facteurs de la coagulation dans des pathologies hémorragiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des souris génétiquement modifiées pour être déficientes en facteurs de coagulation, donc exposées à saigner, elles sont 1 210, dans des procédures allant de l'anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une partie du protocole, biopsie de l'oreille, jusqu'à quatre injections réparties sur cinq semaines, jusqu'à trois prélèvements sanguins. Le test central consiste à sectionner les trois derniers millimètres de leur queue sous anesthésie et à mesurer pendant trente minutes le sang qui s'écoule, avant de les tuer sans les réveiller. Le porteur écrit que toutes sont tuées en fin de procédure en raison du volume de sang prélevé ou perdu, pour une approche destinée aux patients dont la forme de la maladie est jugée trop modérée pour justifier les traitements existants.
Objectifs
La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Ce processus fait intervenir de nombreuses protéines, appelées facteurs de coagulation. Il existe plusieurs maladies hémorragiques congénitales caractérisées par un défaut dans l'un ou l'autre de ces facteurs. Des traitements existent et ont démontré leur efficacité pour les patients atteints des formes graves de ces pathologies. Du fait de la lourdeur de ces traitements, ils ne sont pas administrés aux patients, plus nombreux, qui présentent des formes plus modérées. Ces patients ont en général un défaut partiel en facteur de la coagulation (et non un déficit total comme pour les formes graves). En absence de solution adaptée à leurs besoins bien spécifiques, les patients avec les formes modérées voient leur qualité de vie significativement altérée. L'idée du projet est donc de tester une nouvelle approche thérapeutique dédiée à ces populations de patients, basée sur l'idée d'utiliser leurs facteurs de coagulation résiduels et d'en augmenter la disponibilité.
Bénéfices attendus
Ce projet a vocation à améliorer la prise en charge des patients souffrant de formes modérées de différentes pathologies hémorragiques. Une approche similaire dans une pathologie autre que celles faisant l'objet du projet présenté ici devrait être testée prochainement chez des patients, ouvrant la voie à des essais cliniques à moyen terme pour les patients avec maladies hémorragiques congénitales.
Procédures
Les souris seront soumises à plusieurs interventions pendant la durée des procédures mais chaque souris individuelle ne subira qu'une partie de ces gestes: 1) 1 biopsie à l'oreille. Ce geste dure 2 secondes. 2) 1 ou plusieurs injections. Le nombre maximal est de 4 injections réparties sur 5 semaines. Chaque injection va durer 1-2 secondes. 3) 1 ou plusieurs prélèvements sanguins sous anesthésie. En cas de plusieurs prélèvements, leur nombre maximum sera de 3 dont le dernier qui sera terminal suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires. Ces prélèvements durent entre 5 et 45 secondes. 4) 1 test de saignement sur souris anesthésiées, test consistant à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 30 minutes, suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires sans retour préalable à la conscience
Impact sur les animaux
Lors de la procédure d'élevage, un stress lors de la contention des animaux afin de réaliser le génotypage peut être généré. Les injections peuvent être associées à une légère douleur transitoire, de courte durée. Le prélèvement sanguin peut être associé à une douleur moyenne et une légère hémorragie, nécessitant d'exercer un point de compression. Le test de saignement est réalisé sous anesthésie pendant 30 minutes et les souris sont sous surveillance permanente.
Devenir
En fin de procédure et en raison du volume sanguin prélevé ou perdu, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires et le constat de mort sera établi par des signes évidents de mort.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe et nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être étudié de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de techniques qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Seules 3 associations de molécules seront testés in vivo. Une dizaine de combinaisons sera produite et caractérisée in vitro et seules les combinaisons avec les profils biochimiques les plus prometteurs seront injectés aux animaux. Cela permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. Par ailleurs, une analyse mathématique de puissance a permis d'établir le plus petit nombre d'animaux nécessaires au projet tout en s'assurant d'obtenir des résultats robustes et fiables.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie et d'analgésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux. Les souris seront surveillées pendant toute la durée de la procédure afin de s'assurer qu'elles ne montrent pas de signes de souffrance auquel cas un calcul de score permettra de définir les mesures à mettre en place.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à des modèles murins déjà développés qui ont prouvé leur pertinence dans de nombreuses publications scientifiques. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui sont déficients pour différents facteurs de la coagulation, reproduisant ainsi les pathologies humaines. Pour ce projet, uniquement des animaux adultes des deux sexes seront utilisés, représentant au mieux la population humaine, susceptible de souffrir de ces pathologies.
Étude longitudinale de l’impact de l’hypertension sur le développement des déficits cognitifs dans un modèle de maladie rénale chronique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Cinquante-cinq minutes d'opération pour implanter une sonde de mesure sur la carotide gauche, avec un risque d'hémorragie et de détresse respiratoire, 130 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite pendant 28 jours un régime qui leur provoque une maladie rénale, des injections répétées dans la veine de la queue, deux mesures de filtration rénale de deux heures et des tests d'exploration, d'apprentissage et de mémoire dont aucun n'est nommé. Le porteur annonce des nuisances réduites au maximum, et compose dans le même texte des lots de dix animaux parce qu'il en attend jusqu'à 20 % de morts en cours de route. Toutes finissent exsanguinées sous anesthésie, organes et sang prélevés.
Objectifs
L'insuffisance rénale chronique touche près de 700 millions d'adultes dans le monde, avec des taux plus élevés dans les pays les plus développés. Les complications liées aux maladies rénales chroniques incluent notamment l’hypertension artérielle, qui est la cause principale des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Les patients atteints de maladie rénale chronique souffrent également de nombreuses complications neurologiques, notamment d'anxiété, de dépression, d'anomalies motrices, de troubles du sommeil et de troubles cognitifs. Le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique est un mécanisme clé dans le développement des troubles cognitifs au cours de la maladie rénale chronique. Notre projet vise à évaluer l’influence de l’hypertension sur les troubles cognitifs dans un modèle animal de maladie rénale chronique. Nous utiliserons notamment une approche pharmacologique afin d’évaluer l’impact de la modulation de la pression sanguine sur l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique et la fonction cognitive.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le lien les atteintes cérébrales et l’hypertension au cours des maladies rénales chroniques, et de développer des stratégies de prévention de ces atteintes cérébrales via des approches pharmacologiques. La possibilité d’améliorer la prise en charge et le pronostic neurologique des patients atteints de maladie rénale chronique présente un bénéfice en santé humaine. Les troubles cognitifs pouvant être associés aux maladies rénales chroniques entraînent des répercussions négatives sur la qualité de vie du patient et représentent un impact médicosocial considérable pour la société. Il est essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de réduire ces troubles cognitifs.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie pour placer un implant afin de pouvoir mesurer leurs constantes cardio-vasculaires (55 min). Les animaux seront soumis à un régime alimentaire spécifique induisant le modèle de maladie rénale (28j). Les animaux seront soumis à l’administration de substances pharmacologiques (schéma d'administration dépendant des molécules). Les animaux seront soumis à deux reprises à une injection sous courte anesthésie de molécules fluorescentes, puis mesure pendant 2 heures de la décroissance de la fluorescence avec une caméra miniature afin de mesurer la filtration glomérulaire. Les animaux seront soumis à des imageries qui seront espacées d’au moins 24h pour une durée maximale de 30min. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux de l’exploration, de l'apprentissage et de la mémoire afin d'évaluer les troubles cognitifs (moins d'une heure pour l'ensemble des tests). Enfin un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie à la fin de l’étude.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut provoquer un stress de la manipulation, un risque de déshydratation et de détresse respiratoire lié à l’anesthésie, de la douleur et un risque d’hémorragie . L’induction d’une maladie rénale par un régime spécifique provoque une altération de l’état général et un stress de l’animal qui peut se manifester par une perte de poids. L’imagerie et l’injection de molécules fluorescentes nécessiteront une anesthésie halogénée et pourront engendrer un stress, ainsi qu’une hypothermie. Les tests comportementaux pourront induire un stress par des manipulations quotidiennes. L’administration de substances pharmacologiques pourra engendrer un stress. Plusieurs injections intraveineuses dans les veines caudales seront réalisées pouvant entrainer une douleur et un stress chez l'animal. L'exsanguination, pratiquée sous anesthésie et analgésie, provoquera la mort des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure. Les organes et le sang seront prélevés pour réaliser des analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
La pose d’implants au niveau de la carotide gauche chez la souris ne peut se faire que sur animaux vivants. C’est une méthode validée et utilisée chez la souris. Il n’y a pas d’alternative non animale. En partant de nos résultats observés chez la souris montrant une altération de la barrière hématoencéphalique en contexte de modélisation de maladie rénale chronique, nous étudions une communication entre des organes : le rein et le cerveau, qu'il est impossible de modéliser in vitro et il n’existe actuellement pas de modèle de substitution in vitro pour étudier l’impact d'une substance sur la survenue de troubles cognitifs à la suite d’une insuffisance rénale. De plus, pour caractériser les atteintes neurologiques fonctionnelles après une maladie rénale chronique, nous réalisons des évaluations neurocomportementales des animaux, qui n'est pas modélisable in vitro.
Réduction
Comme évalué dans des expériences précédentes notamment concernant l’implantation des sondes télémétriques, des lots de 8 animaux sont nécessaires afin d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats. Nous utiliserons des tests statistiques spécifiques pour comparer deux lots entre eux ou pour comparer plusieurs (>2) lots. La mortalité est estimée
Raffinement
Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement dans toutes les cages. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et s'accompagneront d'une prise en charge peri-opératoire de la douleur avant, pendant et après la chirurgie. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne, par du personnel qualifié et formé, de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée quotidienne pendant toute la durée du protocole. Toute atteinte de points limites amènera à la mise en place d'actions décrites dans cette annexe. Les critères d’arrêt sont la prostration, la présence de plaies ne cicatrisant pas, ou une perte de poids trop importante.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle souris car ce modèle est largement décrit dans la littérature concernant l’implantation de sondes télémétriques et la modélisation d’insuffisance rénale. Ces espèces permettent également le recours à des techniques validées d’évaluation neurocomportementales, d’imagerie cérébrale et d’immunohistochimie cérébrale, permettant de répondre à nos hypothèses. Un stade de développement adulte est souhaité car cohérent avec le développement de cette pathologie chez l'être humain.
Vectorisation d’acides ribonucléiques circulaires à visée thérapeutique EU1/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des souris femelles de cinq semaines, choisies parce que le projet porte sur le lymphœdème qui suit la chirurgie du cancer du sein, elles sont 370, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Une opération d'une vingtaine de minutes sous anesthésie leur provoque un lymphœdème, puis trois injections dans le derme leur administrent des vecteurs à ARN circulaires censés faire repousser les vaisseaux lymphatiques. Le porteur reconnaît que la chirurgie et le lymphœdème provoquent des douleurs modérées. Les souris sont ensuite transportées vers un second établissement où on les tue pour prélever les tissus, une modification que le porteur présente comme se faisant sans ajout d'animaux.
Objectifs
Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué́ dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphœdème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphœdème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude récente menée au laboratoire , notre équipe a montré que l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques permettant la production de facteurs lymphangiogéniques permettait d’améliorer la résolution du lymphoedème sur une durée courte. Dans cette étude, nous nous appuierons sur les résultats déjà obtenus par notre équipe et testerons l’efficacité d’une nouvelle génération de vecteurs à acides ribonucléiques développés au laboratoire. Ces nouveaux vecteurs produiront les mêmes facteurs lymphangiogéniques mais basés sur une nouvelle technologie qui permet de produire des lentivecteurs contenant des acides ribonucléiques thérapeutiques circulaires. La particularité des acides ribonucléiques circulaires est d’être beaucoup plus stable que les acides ribonucléiques linéaires utilisés dans nos études précédantes et devraient ainsi permettre une expression prolongée des molécules thérapeutiques. Le bénéfice attendu sera une meilleure efficacité et un effet renforcé par rapport aux résultats obtenus précédemment. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs. La réalisation de la dernière étape des procédures dans un 2eme établissement utilisateur nécessite la modification d’un projet initial autorisé sans ajout d’animaux
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques circulaires pour la première fois in-vivo et de faire la preuve du concept de leur utilisation. Les données obtenues au cours de ce projet et comparées à celles obtenues dans nos études précédantes visent à démontrer que cette nouvelle génération de vecteurs possède un avantage thérapeutique en permettant une expression prolongée du vecteur et des molécules thérapeutiques produites.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie sous anestésie générale d'une durée d'envion 20 minutes, 3 injections intradermiques lors d'une même anesthésie générale soit une durée d'envion 5 minutes. Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subissent des injections intradermiques et une procédure chirurgicale (15 min par animal) . Dans le second établissement utilisateur, les procédures terminales sont réalisées
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de lymphœdème vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiée à l'issue de chaque procédure afin de collecter les échantillons nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les données relatives à l’expression du vecteur ont été évaluées in-vitro (culture de cellules) mais ne sont pas suffisantes pour évaluer le niveau d’expression et la durée d’expression dans un contexte intégré in-vivo (implication de la réponse immunitaire en particulier). Par ailleurs, Le développement du lymphœdème fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche intégrée permettant de comprendre les interactions complexes entre le vecteur et l’hôte (souris). Par ailleurs l’approche in-vivo seule permet d’évaluer le bénéfice thérapeutique des molécules exprimées dans le cadre du lymphoedème et la restauration de la fonction endothéliale lymphatique. Le lymphœdème fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux…) ; il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permette de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre de l’étude et du traitement du lymphœdème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport)
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris afin de pouvoir obtenir des résultats comparables et à mettre en perspective par rapport à ceux obtenus dans nos études précédentes dans lequel le même modèle de souris a été utilisé. L’utilisation d’une autre espèce ferait perdre tout le bénéfice des données précédemment obtenues et ne permettrait pas d’évaluer le bénéfice attendu produit par les nouveaux vecteurs à ARN circulaires Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.
Participation des prostaglandines PGE2 et PGD2 dans la physiopathologie cardiaque secondaire au stress métabolique et au vieillissement chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Nourries pendant dix semaines d'un régime riche en gras et en sucre qui les rend obèses et peut les rendre diabétiques, 480 souris enchaînent trois séries d'examens aux semaines 1, 8 et 10, échographie cardiaque sous anesthésie, mesure de composition corporelle et test de tolérance au glucose de deux heures quinze. Sept injections dans l'abdomen s'y ajoutent pendant les deux dernières semaines, après des jeûnes de six heures. L'ensemble est rangé dans le niveau de souffrance le plus faible, alors que le porteur décrit des animaux qui se déplacent difficilement, boivent et urinent plus que la normale et ont le pelage graissé. Une partie de ces souris a 20 à 22 mois. Toutes sont tuées à l'issue, le cœur et les vaisseaux prélevés pour y chercher la fibrose.
Objectifs
Les études épidémiologiques montrent une forte augmentation des maladies cardiovasculaires associée au vieillissement de la population mondiale. Le vieillissement du tissu cardiaque s'accompagne d'une diminution progressive de la compliance du ventricule gauche, empêchant un remplissage passif correct. Le coeur est affecté par une perte significative de cardiomyocytes par nécrose et/ou apoptose, tandis que la prolifération des fibroblastes cardiaques augmente et la matrice extracellulaire s'accumule. Outre les caractéristiques de la fibrose, les coeurs des personnes âgées sont plus enclins à développer un dysfonctionnement cardiaque et une fibrose après une lésion de l'organe. D'autre part, le syndrome métabolique observé chez les patients diabétiques ou obèses génère également un remodelage cardiovasculaire et augmente fortement la prévalence de l'insuffisance cardiaque dans ces populations, surtout lorsqu'elles sont âgées. Un phénotype pro-inflammatoire chronique de bas grade apparaît dans le tissu cardiaque vieillissant et diabétique. Ce phénomène s'explique, en partie, par une perte de capacité à résoudre l'inflammation, créant un déséquilibre entre les mécanismes pro- et anti-inflammatoires, et est corrélé à un risque accru de développer des complications cardiovasculaires. Nos études préliminaires ont montré une augmentation importante de la signalisation de la prostaglandine E2 dans le coeur des souris âgées, mais également chez les souris âgées soumises à un régime riche en gras et en sucre. En ce qui concerne la prostaglandine D2, sa fonction n'est pas clairement définie, bien qu'elle soit fortement représentée dans le coeur murin et humain, des effets protecteurs et délétères ont été rapportés sur le coeur et les cardiomyocytes. Néanmoins, la prostaglandine D2, est décrite comme régulatrice du métabolisme et de la sensibilité à l'insuline. La biosynthèse de plusieurs oxylipines apparaît dans les cellules sénescentes et renforce l'arrêt prolifératif des cellules. Sachant qu'il existe une corrélation entre la présence de cellules sénescentes et le développement de l'insuffisance cardiaque, il est pertinent de déterminer le rôle de cette molécule dans le vieillissement cardiaque. A ce jour, le modèle murin est, à nos yeux, indispensable et doit faire suite à nos résultats préliminaires in vitro afin d'asseoir nos hypothèses. Valider notre concept in vivo nous semble obligatoire avant d'envisager toute application chez l'homme.
Bénéfices attendus
Le projet s'inscrit dans les recherches expérimentales pour l'amélioration future de la prise en charge et du traitement de pathologies humaines et le maintien en bonne santé. Il s'intéresse à une cause majeure de la morbimortalité dans les pays dits développés, les maladies cardiovasculaires. La prévalence des maladies cardiaques dans les populations vieillissantes augmente fortement dans nos sociétés, malgré les progrès de la prise en charge. A long terme chez l'Homme, la description de ces atteintes et la compréhension des mécanismes pathologiques nouveaux lors de traitement. Le projet déploie les dernières avancées technologiques pour une meilleure description moléculaire des altérations, une évaluation fonctionnelle approfondie et des essais précliniques de test d'interventions thérapeutiques.
Procédures
Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie, l'animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Pour les échographies, l'anesthésie est d'une durée de dix minutes et est répétée 2 à 3 fois selon les groupes ; à la semaine 1, à la semaine semaine 8 et à la semaine 10. Pour les mesures de la composition corporelle, l'acte d'une durée de 2 minutes est répété 2 à 3 fois, en vigile selon les groupes, à la semaine 1, à la semaine 8 et à la semaine 10. Pour le test de tolérance au glucose, l'acte d'une durée totale de 2 heures 15 est répété 2 à 3 fois, en vigile selon les groupes; à la semaine 1, à la semaine 8 et à la semaine 10. Pour le traitement en intrapéritonéal, l'acte d'une durée totale de 10 secondes est répété tous les 2 jours pendant les semaines 9 et 10, soit un total de 7 injections pour les groupes concernés.
Impact sur les animaux
Le régime riche en gras et en sucre induit un phénotype obèse et peut entrainer des difficultés de déplacement des animaux, l'apparition d'un diabète, le graissage du pelage des animaux, une polyurie/polydipsie. Par conséquent, les animaux soumis à un régime riche auront un suivi plus précis avec des remplissages de biberon et des changements de litières plus fréquents si nécessaire. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie, l'animal peut mettre quelques minutes à récupérer.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort. Les tissus/organes et le sang seront prélevés et analysés par différentes approches (histomorphologie, marquages immunohistologiques, expression de gènes et western blot) pour déterminer les processus physiopathologiques intervenant dans le remodelage tissulaire et l'apparition de la fibrose.
Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n'existe à l'heure actuelle pas de méthode alternative validée permettant de s'affranchir du modèle animal pour les études de la fonction cardiaque en conditions physiopathologiques.
Réduction
Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n'existe à l'heure actuelle pas de méthode alternative validée permettant de s'affranchir du modèle animal pour les études physiopathologiques cardiaques. Les effets du régime seront évalués par différents tests statistiques, soit pour comparer les souris au sein d'un même groupe, soit entre deux groupes, soit entre plusieurs groupes.
Raffinement
Les doublons expérimentaux seront évités, et des mesures strictes seront appliquées afin de réduire la douleur pendant les procédures expérimentales : anesthésie, tapis chauffant, monitoring global de l'animal. Un suivi journalier est mis en place par un zootechnicien qualifié afin de détecter le plus précocement possible la souffrance éventuelle de l'animal, selon une grille de score établie. Les signes de douleur spécifiques de la souris seront surveillés, comme la prostration, la perte de poids, l'absence de toilettage. Le franchissement de ces points limites précoces conduira à la mise à mort de l'animal. Les animaux sont hébergés dans une zootechnie agréée et sous surveillance quotidienne de zootechniciens qualifiés, avec un suivi régulier par notre responsable du bien-être animal.
Choix des espèces
Le remodelage cardiaque murin est bien décrit dans la littératur . Tout comme chez l'homme, la plupart des souris développent un coeur fibrotique et dysfonctionnel en vieillissant, aggravé lors d'un stress métabolique. Les mécanismes gouvernant le remodelage ventriculaire semblent proches de ceux proposés chez l'homme. Les animaux seront utilisés au stade adulte, une partie d'entre eux de 5 à 7 mois et l'autre partie de 20 à 22 mois.
Étude du potentiel thérapeutique de l’inhibition d’un transporteur de glucose (SGLT2) dans l’insuffisance ventriculaire droite chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
200 rats vont être utilisés, 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour analyser leur cœur et leurs poumons. Une chirurgie de 25 minutes installe une insuffisance cardiaque droite chronique, suivie d'une échocardiographie sous anesthésie chaque semaine pendant quatre ou huit semaines. Le porteur décrit des douleurs thoraciques, une forte fatigue, une mobilité réduite, de l'inconfort respiratoire et un essoufflement à l'effort, tout en affirmant que les conditions d'entretien sont contrôlées pour que les animaux ne subissent aucun stress. Il conclut qu'aucune simulation in vitro ou in silico ne reproduit la mise en place de cette insuffisance et que l'étude ne peut se faire sans ce modèle de cerclage chez le rat.
Objectifs
L'hypertension pulmonaire (HTP) est un groupe de maladies rares et sévères qui touchent environ 1% de la population mondiale et dont la survie à long terme est très limitée. En effet progressivement les patients atteints d'HTP développent une insuffisance ventirculaire droite (IVD). Cette insuffisance ventriculaire droite correspond à un mauvais fonctionnement du ventricule droit, qui va amener à un mauvais fonctionnement du ventricule gauche et donc de tout le cœur, qui à terme entraine le décès des patients. Actuellement l'IVD n'est ciblée par aucun médicament. L'objectif du projet est donc d'améliorer la compréhension de l’insuffisance ventriculaire droite et de déterminer si l’inhibition in vivo, d'un transporteur de glucose, serait bénéfique pour réduire le développement l'IVD, ce qui permettrait d'ouvrir le champ à des nouveaux candidats thérapeutiques pour cette maladie.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de confirmer l’implication d'un transporteur de glucose (SGLT2) dans le développement de l’insuffisance ventriculaire droite, et permettra de déterminer s’il est possible de repositionner les inhibiteurs de SGLT2 dpour réduire l'insuffisance ventriculaire droite. Au vu de l'absence de thérapeutique curative pour lutter contre le développement de l’insuffisance ventriculaire droite, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades.
Procédures
Le début de protocole commence par l'induction de l'insuffisance ventriculaire droite, qui sera réalisée par chirurgie sous anesthésie générale et analgésie (25 min par animal). Tous les animaux subiront des échocardiographies, une fois par semaine (pendant 4 ou 8 semaines selon le protocole) réalisées sous anesthésie générale (15 min par animal). A la fin des procédures, tous les animaux subiront un prélèvement sanguin à la veine caudale ainsi qu'un dernier bilan de ses fonctions cardiaques sous anesthésie générale (25 min par animal, J28 ou J56).
Impact sur les animaux
Comme décris précédemment, les procédures chirurgicales conduiront au développement d'une insuffisance cardiaque droite chez tous les animaux opérés. Celle-ci va dans un premier temps engendrer des douleurs au niveau thoracique pour l’animal. Puis à une forte fatigue conduisant à une mobilité réduite de l'animal, surtout dans les premiers jours post-chirurgies. Enfin, cela conduira également à des effets secondaires important tels que de l'inconfort respiratoire ou encore de l'essoufflement à l'effort. En effet, une maladie dite « chronique » va alors se mettre en place comme chez l’humain. Les réveils des anesthésies réalisées pour les échographies peuvent également être une source de stress pour l'animal. Tout comme le gavage ainsi que la contention pour réaliser les traitements. Les animaux auront également une prise de sang en fin de protocole sous anesthésie peuvent également être source de nuisance pour l’animal.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux pour analyses post-mortem sur le coeur et les poumons.
Remplacement
L’objectif de recherche est d’étudier et de comprendre le rôle du transporteur SGLT2 dans le développement de l'insuffisance ventriculaire droite et de déterminer si ce transporteur peut être une nouvelle cible thérapeutique dans l'hypertension pulmonaire en ciblant directement le ventricule droit. Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte dit normal ou sain (physiologique) et un contexte ou l'animal est malade (physiopathologique). Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo, que ce soit in vitro ou in silico, la mise en place de cette insuffisance ventriculaire droite qui est un processus complexe. L'obtention des nouvelles connaissances, nécessaires à une meilleure compréhension de la maladie et de futures thérapies, recherchées par cette étude ne peuvent donc pas avoir lieu sans l'utilisation de ce modèle de banding et donc de rats.
Réduction
Les fonctions cardiovasculaires seront étudiées par des méthodes non invasives chaque semaine (échocardiographie) permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Un dernier bilan de leur fonction cardiaque est réallisé à la fin de l'expérimentation afin de collecter un maximum de données. Le nombre total de rats utilisés sera de 200 sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales sur le même animal. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront également effectuées. Le test statistique adéquat (test Wilcoxon-Mann-Whitney avec une valeur alpha de 0,05 et une valeur Beta de 0,1) permet de bien définir le nombre d’animaux nécessaires à cette étude.
Raffinement
Une semaine d’acclimatation sont prévues à l’arrivée des animaux. Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques par voie gazeuse (Isoflurane®) et des analgésiques (Buprecare®) afin de minimiser le stress des animaux. L'eau ainsi que la nourriture sera en illimité pour les animaux. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages des animaux. La procédure conduira à une insuffisance cardiaque droite, les animaux seront donc surveillés quotidiennement (évaluation de la présence de points limites précoces, notamment la perte de poids, qualité de la fourrure et posture des animaux en post-chirurgie) et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celle de l’homme. De plus notre équipe travaille en routine avec des modèles expérimentaux utilisant les rats pour l’étude de maladies vasculaires pulmonaires et cardiaque. Jeune adulte (8 semaines, 200g à 250g). A ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’insuffisance ventriculaire droite est plus rapide. De plus, chez l'Homme l'hypertension pulmonaire et l'insuffisance ventriculaire droite se développe chez les jeunes adultes.
Modification du projet : Impact de l’hypoxie intermittente sur l’activation du système sympathique et ses répercussions sur le métabolisme et la fonction cardiaque 1/3
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Quand l'injection d'insuline fait tomber leur glycémie sous 40 mg/dL, les souris reçoivent du glucose pour les remonter. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après seize semaines d'exposition à une privation intermittente d'oxygène pour prélever leurs organes. Elles sont habituées progressivement au tube de contention servant aux mesures de pression artérielle, transportées entre trois établissements distincts, et certaines portent un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Le porteur écrit que dix animaux par groupe suffisent pour ses analyses métaboliques et que cinq suffisent pour la télémétrie, sans détailler comment ces effectifs aboutissent aux 390 souris déclarées pour ce volet.
Objectifs
Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.
Bénéfices attendus
L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.
Procédures
Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).
Impact sur les animaux
Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.
Remplacement
Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.
Réduction
Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).
Raffinement
Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.
Modification du projet : Impact de l’hypoxie intermittente sur l’activation du système sympathique et ses répercussions sur le métabolisme et la fonction cardiaque 3/3
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines : 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles subissent trois séries de tests de stimulation à l'insuline, au glucagon, à l'adrénaline ou à la dexaméthasone, trois électrocardiogrammes et trois échographies sous anesthésie, quarante-huit heures en cage de mesure des échanges gazeux, et des mesures de pression artérielle en tube de contention. Le protocole, réparti sur trois établissements voisins entre lesquels les animaux sont transportés, prévoit aussi soixante-dix chirurgies de trente minutes pour implanter un émetteur de télémétrie, suivies de quatorze jours de surveillance. La thérapie espérée contre les dérèglements métaboliques de l'apnée du sommeil reste énoncée au conditionnel, quand la privation d'oxygène, elle, court sur quatre mois.
Objectifs
Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.
Bénéfices attendus
L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.
Procédures
Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).
Impact sur les animaux
Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.
Remplacement
Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.
Réduction
Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).
Raffinement
Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.
Caractérisation de souris exprimant un facteur de la coagulation muté
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une biopsie de l'oreille d'une à deux secondes pour le génotypage, une piqûre pour endormir, puis une procédure de trente à quarante-cinq minutes dont elles ne se réveilleront pas : 460 souris vont être utilisées dans des procédures classées sans réveil ou légères. Le projet porte sur l'interaction entre les plaquettes sanguines et un facteur de la coagulation muté, dans la perspective de mieux caractériser des patients atteints d'une maladie hémorragique. Le porteur affirme que la coagulation "nécessite absolument un organisme vivant entier" et qu'aucun test adapté n'éviterait aujourd'hui le recours aux animaux non-humains. Il justifie la mise à mort sans réveil par le volume de sang à prélever, trop important pour que l'animal survive, et par des tests in vivo trop invasifs ou trop hémorragiques.
Objectifs
La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Ce processus fait intervenir de nombreuses protéines appelées facteurs de coagulation. Il existe plusieurs maladies hémorragiques congénitales caractérisées par un défaut dans l'un ou l'autre de ces facteurs. Il est important de bien comprendre comment ces facteurs de la coagulation interagissent avec d'autres protéines pour remplir leur fonction. Dans ce projet, nous allons étudier l'interaction d'un facteur de la coagulation avec les plaquettes sanguines qui sont des cellules vitales dans l'arrêt du saignement.
Bénéfices attendus
A court-terme, cette étude va nous aider à comprendre le rôle de l'interaction entre les plaquettes sanguines et le facteur de la coagulation étudié dans l'arrêt du saignement et dans les processus de thrombose. A plus long terme, ce projet permettra de mieux caractériser certains patients souffrant d'une maladie hémorragique due à un dysfonctionnement du facteur de la coagulation étudié.
Procédures
Les souris vigiles seront soumises aux gestes suivants: 1) 1 biopsie au niveau de l'oreille. Ce geste prend 1-2 secondes 2) 1 piqûre pour induire une anesthésie générale. Cette piqûre se fait en une seconde. Tous les autres gestes se feront sous anesthésie générale et à la fin de chaque procédure d'une durée allant de 30 à 45 minutes, les animaux seront euthanasiés sans retour au préalable à la conscience.
Impact sur les animaux
Lors du génotypage, un stress peut être généré lors de la contention des animaux afin de réaliser génotypage. Lors de la biopsie pour le génotypage une douleur transitoire peut intervenir.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés. En effet, pour les tests ex vivo, les prélèvements sanguins nécessaires sont d'un volume trop important pour que l'animal puisse rester en vie. En ce qui concerne les tests in vivo, ceux-ci sont soit trop invasifs soit accompagnés d'une perte sanguine trop importante, justifiant leur classification "sans réveil".
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, et nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Une partie des tests sera fait sur du sang prélevé chez les souris d'intérêt. Ces tests in vitro nécessitent moins d'animaux car ils sont plus reproductibles que les tests in vivo. D'autre part, nous avons au fil des années acquis une expérience importante sur le type de tests qui seront mis en oeuvre dans ce projet. Nous pouvons donc anticiper avec une certaine confiance le nombre minimum d'animaux qui sera nécessaire à l'obtention de résultats interprétables et robustes d'un point de vue statistique. Si les résultats des premières expériences s'avèrent encore plus discriminants que nous avions anticipé, alors nous n'utiliserons pas toutes les souris prévues et nous arrêterons les expériences plus prématurément qu'anticipé.
Raffinement
Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximun l'inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, traitement analgésiques...). Les animaux seront observés régulièrement afin de s'assurer de leur bien-être. Pour limiter le stress des souris, les animaux seront sortis de la zone d'hébergement de l'animalerie juste avant la procédure expérimentale. Les souris sont anesthésiées pendant l'intégralité des procédures expérimentales et analgésiées pour certaines procédures.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d'ordres scientifiques, pratiques et éthiques. Sa génétique bien connue facilite la création de modèles transgéniques. La souris est l'animal de laboratoire le plus utilisé en hémostase par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer les résultats obtenus. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce. Des souris âgées entre 8 semaines et 1 an seront utilisées pour le projet
Physiopathologie du nœud sino-atrial cardiaque : implication de la protéine kinase AMPc-dépendante
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Toutes tuées pour que leur cœur soit prélevé et étudié hors du corps, 652 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère pour 604 d'entre elles et modéré pour 48. Ces 48 souris reçoivent un capteur télémétrique implanté sous la peau au cours d'une chirurgie de dix minutes, quatre-vingts autres passent un électrocardiogramme mensuel sous anesthésie d'une heure, et aucune procédure n'est décrite pour les plus de cinq cents restantes. Trois gavages et une injection d'agents pharmacologiques complètent le protocole, destiné à comprendre comment l'adrénaline accélère le cœur et pourquoi le nœud sinusal se dérègle avec l'âge. Le porteur écrit vouloir des conditions telles que les souris "ne subissent aucun stress", et présente la mise à mort comme un moyen d'éviter "toute souffrance inutile à l'animal".
Objectifs
Au cours d'une vie humaine, le cœur bat en moyenne plus de 2,5 milliards de fois. L’origine du battement cardiaque est un évènement électrique, provenant d’une petite région du cœur aux propriétés particulières, appelée le nœud sinusal. Chez les personnes âgées, ou dans le contexte d’une maladie cardiaque, il est fréquent que le cœur batte trop lentement et de façon irrégulière : c’est la dysfonction sinusale. Cette maladie entraîne de la fatigue, des essoufflements et des syncopes et dans les cas les plus graves, elle peut conduire à une mort subite. Les mécanismes qui mènent à ces dysfonctions ne sont pas bien compris et les patients qui en souffrent nécessitent le plus souvent l’implantation d’un stimulateur cardiaque, impliquant des contraintes et limitations (durée de vie limitée de l’appareil, coût financier important et complications suite à l’implantation). La dysfonction sinusale représente donc un enjeu de santé publique et le projet présenté se propose de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie. Pour cela, nous auront recours à des modèles de souris génétiquement modifiées qui permettront de comprendre pour la première fois la fonction d’un gène présumé important dans l’activité électrique du nœud sinusal et dans le développement de la dysfonction sinusale. Une meilleure compréhension de ces mécanismes est importante afin d’être en mesure d’offrir de nouvelles perspectives thérapeutiques alternatives au stimulateur cardiaque.
Bénéfices attendus
L’ensemble de cette étude permettra de clarifier un mécanisme important par lequel l’adrénaline accélère le cœur, et les conséquences physiopathologiques de leur dérégulation sur la fonction du nœud sino-atrial cardiaque. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait être particulièrement bénéfique pour l’homme car la dysfonction sinusale représente un des principaux troubles du rythme cardiaque chez le sujet âgé mais elle est aussi fréquente dans plusieurs pathologies communes comme le diabète de type II et l’insuffisance cardiaque. La dysfonction sinusale entraîne de la fatigue, des palpitations mais également des vertiges, voire des syncopes et dans les cas les plus graves, des morts subites. A ce jour, la seule thérapie disponible est l’implantation d’un pacemaker cardiaque artificiel. Environ 60% des implantations de pacemakers (plus d’1 million par an dans le monde) sont liées à la dysfonction sinusale. Ainsi, ce projet présente des bénéfices à court terme pour la recherche fondamentale pour améliorer notre compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’automatisme cardiaque. A plus long terme, il revêt un intérêt majeur pour la santé humaine car il pourrait en effet permettre de développer de nouvelles pistes thérapeutiques pour le contrôle de la fréquence cardiaque dans les maladies cardiovasculaires et le vieillissement.
Procédures
3 gavages d’une durée de 1 min par gavage sur animaux conscients et 1 injection sous anesthésie générale d’une durée de 3 secondes par injection. 48 animaux : Une chirurgie sous anesthésie générale et d’une durée de 10 minute pour une implantation d’un capteur télémétrique en sous cutanée. On évaluera le rythme cardiaque sur animaux vigiles sur la période jour/nuit puis en réponse à l’administration d’agents pharmacologiques par injection. 80 animaux : Pour un suivi du rythme cardiaque, chaque souris aura un électrocardiogramme de surface tous les mois. Cette intervention dure une heure maximum et les souris sont anesthésiées sur cette période
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette étude, certaines manipulations seront réalisées sur des souris. Par exemple, on leur administrera des substances par voie orale ou par injection dans l’abdomen. Ces gestes peuvent provoquer une légère douleur, gêne et un stress ponctuel chez l’animal lié à sa manipulation. Aucun produit n’est administré à des doses entraînant des effets délétères pour l’animal. Des capteurs seront implantés sous la peau pour enregistrer l’activité cardiaque. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie. Une douleur légère peut apparaître lors du réveil et la gêne liée à cette opération est estimée à deux semaines, incluant une phase de récupération et une phase expérimentale. Les animaux seront surveillés quotidiennement et durant les 72h post-opération ils seront sous antidouleur. L’enregistrement du rythme cardiaque pourra entraîner un stress lié à une injection unique et à un bruit de courte durée. L’examen en lui-même est réalisé sous anesthésie et ne cause pas de douleur. Au cours de l’anesthésie l’animal sera placé sur un tapis chauffant et de la crème oculaire sera appliquée afin d’éviter l’assèchement des yeux. Les aiguilles des capteurs seront insérées en sous la peau au niveau des pattes. Cela peut occasionner une douleur légère après le réveil. La durée de cette nuisance est d’une heure. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Pour l’ensemble des animaux, des critères précis d'observation sont définis. Si un animal présente des signes critiques, il sera euthanasié sans douleur selon les procédures en vigueur.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés afin de permettre le prélèvement du cœur, qui est ensuite étudié en dehors du corps. Cette approche est essentielle car certaines analyses précises du fonctionnement cardiaque, notamment sur le rythme spontané et les mécanismes régulant l’activité du cœur, ne peuvent être réalisées que sur un organe isolé, dans des conditions contrôlées impossibles à obtenir chez un animal vivant. Travailler sur le cœur après la mise à mort permet donc d’approfondir la compréhension des mécanismes physiologiques et pathologiques du rythme cardiaque, tout en évitant toute souffrance inutile à l’animal.
Remplacement
Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier l’implication d’un acteur majeur dans l’automatisme cardiaque dans un contexte physiologique et physiopathologique. De plus, il se justifie par l’impossibilité d’obtenir des lignées de cellules cardiaques automatiques du cœur adultes fonctionnelles. Des résultats préliminaires obtenus ex vivo dans le cadre du projet montrent l’implication de cet acteur dans la régulation de la fréquence cardiaque.
Réduction
Des souris des deux sexes seront utilisées dans ce projet et ceci permettra de réduire le nombre d'animaux produits. Une planification minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et en conservant une puissance statistique suffisante pour observer un effet. Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés, notre étude réalise un suivie de la fréquence cardiaque sur animaux anesthésié. Dans la mesure du possible, les cellules et les tissus sont partagés afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer qu’ils ne subissent aucun stress. En cas de douleur, même potentielle post-opératoire, les animaux seront sous antidouleur. Les procédures pouvant générer de la douleur ou un stress seront réalisées sous anésthésie. Au quotidien, l’aspect des souris sera examiné (poids, comportement, état du pelage, prostration éventuelle) et selon le problème l’animal sera pris en charge de façon adaptée (nourriture supplémentaire, changement de groupe social, ajout d’enrichissement). Si un animal souffre trop, il sera euthanasié par une technique qui ne procure aucune douleur. Afin d’améliorer leurs conditions d’hébergement de l’enrichissement sera ajouté dans leurs cages et des groupes compatibles seront formés.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée dans la recherche car le développement de la génétique de la souris en fait un modèle unique pour déterminer l’implication d’un gène d’intérêt dans un processus physiologique ou pathologique. Notre modèle d’invalidité étant inductible et tissu spécifique nous pouvons travailler sur un gène normalement létal à l'état embryonnaire. Cela permet à la souris de se développer dans les mêmes conditions qu’une souris sauvage. Des souris adultes âgées de 8 semaines à 24 mois seront utilisées lors de ce projet. Cela se justifie car la dysfonction sinusale est une pathologie qui se déclenche essentiellement à l’âge adulte mais peut être asymptomatique jusqu’à l’âge senior de 65 ans chez l’Homme.
Prélèvement de tissus pour génotypage de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un morceau d'oreille de 2 mm est découpé sur des souriceaux de 21 à 28 jours, sous anesthésie, au moment du sevrage. 2 500 souris génétiquement modifiées vont être utilisées de cette façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, et aucune n'est tuée dans le cadre de ce projet. L'établissement décrit le prélèvement de poils, non invasif, comme sa méthode courante et la biopsie d'oreille comme un recours quand le résultat n'est pas concluant, tout en en programmant 2 500. Les souris porteuses du génotype recherché partent vers les projets de recherche du laboratoire ou vers des prélèvements post-mortem, les autres pouvant être réutilisées pour "la formation du personnel".
Objectifs
Les souris génétiquement modifiées génotypées lors de ce projet seront utilisées dans les différents projets autorisés de notre établissement portant principalement sur la production de plaquettes et les fonctions plaquettaires. Les souris génétiquement modifiées doivent être identifiées individuellement pour faire correspondre chaque animal à un génotype spécifique. L’identification est réalisée par tatouage à l’encre aux doigts des souris. Le génotypage se fait de manière générale par prélèvement de poils (non invasif), cependant pour certaines lignées, il peut arriver que le génotypage poils donne des résultats non concluant. Il est alors nécessaire de réaliser une biopsie à l’oreille pour obtenir un génotypage fiable. L’objectif de ce projet est de prélever un bout d’oreille nécessaire à la bonne caractérisation génétique des animaux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir fournir des animaux du génotype souhaité pour les projets autorisés et les prélèvements post-mortem. De plus, ce projet permet de caractériser génétiquement les animaux servant au maintien et à l’optimisation de la gestion d’élevage.
Procédures
Les souris anesthésiées sont soumises à un prélèvement de tissus à l’oreille (2 mm) qui dure 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont un stress pour les animaux. Une douleur légère et de courte durée peut être ressentie après le prélèvement prélèvement.
Devenir
Les animaux génotypés présentant le génotype souhaité iront en utilisation continue dans les projets de recherche autorisés dans notre laboratoire, pour des prélèvements de tissus post-mortem et pour le maintien de l’élevage. Les animaux ne présentant pas le génotype souhaité pourront être réutilisés pour le formation du personnel.
Remplacement
Les souris de ce projet seront utilisées dans des projets autorisés de notre laboratoire lorsqu’elles ont le génotype attendu. Les alternatives non animales et l’impossibilité de les utiliser sont détaillées dans les projets concernés. Il est indispensable de connaitre le génotype des animaux afin de les utiliser dans les projets autorisés. Il n’est donc pas possible de remplacer les animaux ici.
Réduction
Le nombre d’animaux génétiquement modifiés pour lesquels un prélèvement à l’oreille pour le génotypage sera fait est calculé en fonction des besoins expérimentaux. Les élevages sont optimisés pour produire un maximum d’animaux ayant le génotype d’intérêt pour les projets autorisés. Les animaux surnuméraires ou ne possédant pas le génotype d’intérêt peuvent être utilisés pour la formation du personnel. Le nombre d’animaux concernés par ce prélèvement de tissu invasif est réduit au maximum par la mise en place dans notre établissement de prélèvement de poils (méthode non invasive) pour la réalisation des génotypages. Cependant, cette méthode peut parfois conduire à un génotype non concluant et nécessiter un génotypage invasif par prélèvement à l’oreille.
Raffinement
Pour réduire le nombre de manipulations, la biopsie à l’oreille est réalisé au même moment que le sevrage des souriceaux. La biopsie est réalisée sous anesthésie par un personnel expérimenté et n’excède pas 5 minutes par animal. Les animaux sont surveillés sur 3 jours après le prélèvement.
Choix des espèces
Les modifications génétiques des souris produites et élevées dans notre établissement permettent de réaliser des projets de recherche autorisés et de répondre à des questions scientifiques concernant la production de plaquettes et les fonctions plaquettaires. La souris est un modèle largement connu d’un point de vu génétique, permettant de générer différentes modifications génétiques. Ses mécanismes physiologiques proches de ceux de l’Homme en font un très bon modèle d’étude pour les différents projets de notre laboratoire. Les souris seront prélevées à l’oreille entre 21 et 28 jours. La procédure de génotypage est réalisée à ce stade car elles doivent être utilisées dès l’âge adulte dans les projets autorisés ou pour des prélèvements de tissus post-mortem. Cela permet également de connaitre le génotype des animaux suffisamment tôt pour effectuer le maintien de l’élevage.
Etude du rôle des cellules immunitaires dans la circulation sanguine embryonnaire par échographie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
533 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie profonde, les animaux étant tués avant tout réveil. Les femelles gestantes reçoivent une alimentation modifiée pendant neuf jours et une injection sous la peau, puis subissent une chirurgie de quatre-vingt-dix minutes qui les conduit à la mort, le temps d'une échographie de la circulation cérébrale de leurs embryons. Le porteur annonce comme effets indésirables un stress léger lié au changement de nourriture et une douleur brève à l'injection, sans mentionner la mise à mort des embryons. Il revendique une recherche fondamentale sur la microglie, dont les résultats "pourront aider" à mieux comprendre des maladies neuro-développementales.
Objectifs
Les microglies sont des cellules immunitaires du cerveau, mais en plus de ce rôle, elles jouent plusieurs fonctions dans le développement embryonnaire. Dans ce projet, nous étudierons le rôle de ces cellules dans la formation de vaisseaux du sang chez la souris. Pour analyser leur architecture et le flux du sang, nous utiliserons l’échographie in utero. Les résultats de ce projet nous permettrons de comprendre le rôle de la microglie dans le développement.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de comprendre comment l'absence de microglie influence la formation et la morphologie des vaisseaux sanguin du cerveau en développement. Les résultats obtenus pourront aider à mieux comprendre des maladies neuro-développementales, notamment celles liées à des inflammations virales maternelles (e.g. Zika) lors de la gestation.
Procédures
Nourriture modifiée pendant 9 jours. Une injection sous la peau. Chirurgie sans réveil sous anesthésie profonde (90 minutes)
Impact sur les animaux
Stress léger dû au changement de nouriture. Douleur légère et de courte durée lors de l'injection sous la peau.
Devenir
La mise à mort des mères gestantes va permettre l'extraction des embryons et l'analyse postmortem de leur cerveau.
Remplacement
L'établissement du cerveau implique l’interaction coordonnée de plusieurs types cellulaires et se fait de façon progressive et régulée dans l'espace et dans le temps. Cette complexité ne peut pas être reproduite dans des modèles in vitro et requiert l’expérimentation dans des modèles animaux in vivo.
Réduction
Le nombre de souris requis a été estimé sur la base de nos travaux précédents et d’études comparable pour avoir des résultats statistiquement valides après analyse avec des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les souris seront élevées dans des cages comprenant du matériel de nidification et dans des groupes sociaux. Un personnel formé au bien-être animal surveille les animaux tous les jours. Les souris gestantes seront pesées régulièrement afin de suivre leur gestation. Une anesthésie profonde et des analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur des animaux pendant la chirurgie qui est sans réveil. La température du corps sera maintenue grâce à une plaque chauffante lors de la chirurgie et de l’imagerie. Des points limites spécifiques ont été etablis.
Choix des espèces
L'établissement de vaisseaux sanguins requiert un environnement complexe et l'interaction de plusieurs cellules cérébrales ; c'est un processus très contrôlé au niveau spatio-temporel et qui n'est pas encore récapitulé par des modèles in vitro. Le modèle génétique de déplétion de microglie est établi chez la souris. L'échographie fonctionnelle qui permet de visualiser la totalité du cerveau est établie chez la souris et est un modèle de référence dans ce champ d'étude L'utilisation de femelles gestantes requiert des femelles adultes et fertiles. Elles seront utilisées à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à 4 mois. Le stade de développement des embryons est compris entre 14.5 et 18.5 jours.
Etude longitudinale des mécanismes physiopathologiques de l’hypertension pulmonaire associée à la dysplasie broncho-pulmonaire par exposition à l’hyperoxie chez le rat et la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Rats : 3250
5 450 nouveau-nés, 3 250 ratons et 2 200 souriceaux, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun passant ses quatorze premiers jours de vie enfermé dans une enceinte en hyperoxie pour lui provoquer une hypertension pulmonaire. Leurs mères sont échangées toutes les vingt-quatre heures pour leur éviter l'effet toxique de l'oxygène. Suivent des échographies cardiaques, des mesures de pression cardiaque et une pléthysmographie invasive, sur des animaux gardés jusqu'à un an afin de suivre les séquelles à l'âge adulte. Tous sont tués pour l'extraction du bloc cœur-poumon, le porteur affirmant qu'il est "indispensable" de comprendre les mécanismes de cette maladie et que "seul l'animal entier" permet les interactions entre organes.
Objectifs
La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP) est la principale complication liée à la grande prématurité. La DBP peut se compliquer d’une hypertension pulmonaire (HTP-DBP) responsable d’une mortalité importante dans les 2 ans suivant le diagnostic, par défaillance cardiaque droite. Par ailleurs, les altérations pathophysiologiques présentes pendant la période néonatale persistent dans le temps chez les grands prématurés survivants, augmentant leur risque de développer des maladies respiratoires et cardiovasculaires sévères à l’adolescence et à l’âge adulte. Les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HTP-DBP sont encore méconnus et il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement préventif ni curatif de cette maladie. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. Ainsi, dans ce projet, nous utiliserons des modèles animaux (rats et souris) d’HTP-DBP expérimentale induite par hyperoxie, classiquement décrits dans la littérature et utilisés au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Ces modèles animaux sont les modèles qui reproduisent le mieux la pathologie humaine. Dans ces modèles, nous étudierons de manière longitudinale, l’évolution des altérations pathophysiologiques de l’HTP-DBP à différents âges (jour (J)15, J60, J180 et J365 chez les animaux, ce qui correspond chez l’humain à la période de l’enfance (
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’HTP-DBP et leur évolution dans le temps. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs sera comparée ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients.
Procédures
Un groupe sera exposé à l’air ambiant (normoxique – groupe contrôle) et un 2ème groupe sera maintenu en hyperoxie chronique dans les 24h suivant la naissance, pour une durée de 14 jours (J). Un échange des mères entre les groupes sera effectué toutes les 24h, afin d’éviter l’effet toxique lié à l’oxygène chez ces mères. La méthode et la fréquence d’injection pendant la mise en place des modèles pathologiques seront ajustées en fonction de la substance considérée. Le protocole préventif sera appliqué dès le début du protocole (au jour 2 de vie des ratons ou souriceaux) et le protocole curatif sera appliqué à la fin des 14 jours d’hyperoxie jusqu’à la fin du protocole J60 (adolescence, 12-18 ans), J180 (jeune adulte, 25-30 ans) et J365 (adulte, 40-50 ans) chez le rat et la souris. Après 14 jours, une partie des ratons/souriceaux sera anesthésiée afin de réaliser des échographies cardiaques (10 minutes/animal), des mesures de pressions cardiaques (10-15 minutes/animal) et des mesures de la fonction respiratoire par pléthysmographie invasive (5-10 minutes/animal) pour diagnostiquer la présence d’une HTP-DBP et en évaluer la sévérité. Tous les animaux auront ces différentes mesures avant l’extraction du bloc-cœur-poumon. Les animaux seront euthanasiés pour l’extraction du bloc cœur-poumon. Des prélèvements de sang pourront être effectués sur certains animaux juste après l’euthanasie et avant de récupérer le bloc cœur-poumon. L’échographie, les mesures hémodynamiques et les mesures de fonction respiratoire permettront également d’évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques. L’autre partie des animaux sera placée en normoxie seule, en présence d’une mère allaitante jusqu’au sevrage puis en condition d’hébergement classique jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours pour le rat et la souris. Durant cette période de « vieillissement », les animaux seront pesés 2 fois/semaine et tous les animaux auront une échocardiographie sous anesthésie générale aux différents temps d’évaluation, y compris ceux qui poursuivent le protocole de « vieillissement » à J60, 180 ou 365. Ainsi, les animaux explorés à J60, J180 et J365 auront au total, respectivement 2, 3 et 4 échographies cardiaques durant le protocole. A l’issue de chaque période de « vieillissement », les animaux seront anesthésiés afin de réaliser des échographies cardiaques, des mesures de pressions cardiaques, des mesures de la fonction respiratoire et des prélèvements de sang et extraction du bloc cœur-poumons.
Impact sur les animaux
L’HTP-DBP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Nous avons une grande expérience du suivi notamment respiratoire des animaux sous des atmosphères en oxygène variées au laboratoire et nous serons particulièrement attentifs aux points limites qui constitueront un arrêt des protocoles. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP-DBP chez les animaux. Les points d’injection des substances et/ou solvants à tester peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés. Le risque de douleur est le principal effet indésirable des expérimentations in vivo. De ce fait, nous réaliserons systématiquement une analgésie-sédation. Avant de débuter les expérimentations in vivo, la surveillance de la profondeur de l’analgésie-sédation sera réalisée en s’assurant de l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte en réponse au pincement des orteils des membres postérieurs. Le rythme cardiaque et la fréquence respiratoire seront surveillés pour s’assurer également de la profondeur de l’anesthésie. Le changement de mère toutes les 24h peut être source de stress pour les petits.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.
Remplacement
Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’HTP-DBP mais des études pourront être réalisées sur des cellules de poumons humains fœtaux en culture, exposées ou non à l’hyperoxie. Ce remplacement du modèle animal par un modèle in vitro permettra d’élucider certains mécanismes intracellulaires sans utiliser d’animaux. Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in/ex vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. Par ailleurs, cette pathologie implique plusieurs organes et plusieurs types cellulaires pulmonaires qui interagissent entre eux et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes et cellules.
Réduction
Pour limiter le nombre d'animaux : (1) une partie des utilisateurs utilisera le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche, (2) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (3) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines fœtales exposées à l’hyperoxie in vitro pour simuler l’HTP-DBP. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée en concertation avec tous les utilisateurs lors de nos réunions d’équipe hebdomadaires. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (randomisation, travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. Le nombre d’animaux sera également réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs avant la fin de la totalité des séries prévues.
Raffinement
Selon la condition, 12-13 ratons ou 10 souriceaux et 1 mère allaitante seront placés soit dans l’enceinte à hyperoxie soit dans une cage classique. L’enceinte à hyperoxie et la cage classique contiendront une couche de litière suffisante pour absorber l’humidité, des éléments de nidification (coton, papier kraft) et du matériel d’enrichissement (un tunnel rouge et buchettes de bois). L’accès à l’eau et la nourriture sera ad libitum. Les paramètres ambiants (hygrométrie, température) seront contrôlés quotidiennement et conserver sur un registre. Un cycle jour/nuit de 12h sera également appliqué. L’échange quotidien des mères sera réalisé par le même opérateur en utilisant le tunnel mis à disposition dans la cage ou l’enceinte. Les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement. L’enceinte d’hyperoxie sera ouverte tous les jours pour l’échange des mères. A cette occasion, les animaux seront observés et pesés. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà d’une période de 2 h post-administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre. Une grille de scoring pour le suivi des animaux sera mise en place pour chaque animal L’ensemble des expérimentations in vivo sera réalisé sous anesthésie générale. Pour les mesures hémodynamiques un tapis chauffant sera utilisé pour préserver la température corporelle constante durant toute la procédure. Le degré d’anesthésie sera vérifié par l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte au pincement. Des modifications des paramètres physiologiques et notamment la fréquence cardiaque indiquant une souffrance ou une détresse de l’animal conduirait à une procédure d’euthanasie.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP-DBP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. L’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont quasiment absents chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. De plus, le rat et la souris sont particulièrement adaptés pour modéliser la DBP car au moment de la naissance leurs poumons sont au stade de développement pulmonaire qui correspond au stade de maturation des poumons de nouveau-nés grands prématurés humains et les expérimentations pourront être menées chez des rats/souriceaux nés à terme et ne nécessiteront pas d’induire une naissance prématurée de ces animaux. La première partie de l’étude vise à reproduire une pathologie concernant uniquement les nouveau-nés grands prématurés, les expérimentations concerneront des rats/souris nouveau-nés pendant leurs 14 premiers jours de vie. La deuxième partie du projet portant sur l’évolution longitudinale des anciens nouveau-nés grands prématurés ayant eu une dysplasie broncho-pulmonaire, les expérimentations porteront sur des ratons/souriceaux ayant été exposés pendant 14 jours à l’hyperoxie ou à la normoxie en période néonatale puis laissés en normoxie seule jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours (adolescent, jeune adulte et adulte chez l’homme respectivement).