Système cardiaque

Chaque souris peut recevoir jusqu'à 26 injections, dont 21 quotidiennes d'affilée, avant 21 jours d'hébergement continu en hypoxie, une instillation nasale, une gonadectomie de trente minutes et deux poses de pellet sous-cutané. Viennent ensuite les échocardiographies sous anesthésie, cinq prises de tension en boîte de contention d'un quart d'heure chacune, deux contentions pour récolte d'urine, et une mesure de tension invasive qui achève l'animal. 6 915 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour décrire le remodelage des vaisseaux au cours de l'hypertension pulmonaire et systémique. Toutes sont tuées pour prélever les organes utiles à l'étude et, écrit le porteur, ceux "susceptibles d'un usage ultérieur".

Objectifs

Le remodelage vasculaire, c’est-à-dire le changement de structure (cellules et matrice) et de réactivités (vasoconstriction et vasodilatation) des vaisseaux sanguins apparait lors de développement d’hypertension (primaire, secondaire ou pulmonaire). Ce remodelage est une composante importante du développement de l’hypertension. L’hypertension artérielle pulmonaire est une maladie rare (avec une prévalence de 15 a 55 cas par millions) et très grave qui entraine une insuffisance cardiaque droite nécessitant à terme une transplantation cœur-poumon. Cette pathologie est caractérisée en particulier par une multiplication des cellules formant la paroi des vaisseaux (cellules endothéliales et cellules musculaires lisses vasculaires) ce qui diminue leur diamêtre et a amplifie l’hypertension artérielle pulmonaire. L’hypertension systémique induit à long terme des altérations de la fonction des organes, en particulier cœur, cerveau et rein, et c’est un facteur de risque d’évènements cardiovasculaires majeurs (accident vasculaire cérébral, infarctus…). Les mécanismes cellulaires impliqués dans ces remodelages artériels ne sont pas pleinement élucidés. Nous étudions le rôle de cellules souches vasculaires ou périvasculaires impliquées dans le développement du remodelage vasculaire associé à l’hypertension.

Bénéfices attendus

Nous espérons que cette étude nous permettra de comprendre les mécanismes de remodelage artériel suite à une hypertension (pulmonaire ou systémique), de la phase de déclenchement à celle de stabilisation. Nous espérons décrypter le rôle des hormones sexuelles dans le déclenchement du remodelage artériel associé à la voie d'intérêt, précédemment mesuré par l’équipe et y corréler ou pas une éventuelle dysfonction rénale. Connaissant les mécanismes de remodelage artérielle menant à une hypertension, ainsi que les cofacteurs, favorisera le diagnostic (biomarqueur) et la précocité de la prise en charge. De plus nous pourrons espérer stabiliser le remodelage pour prévenir des formes plus grave. De même nous espérons améliorer la compréhension général de l'hypertension, et contribuer à comprendre pourquoi prés de 40 pourcent des patients traités pour, sont mal répondants aux traitements existant.

Procédures

Certains animaux subiront de 5 à 26 injections (vigile, 21 fois quotidiennement en continu au maximum, durée de la manipulation de 30 secondes). Ainsi qu’une une mise en hypoxie (animal vigile, 21 jours maximum en continu). Nous leur pratiquerons une instillation nasale (anesthésie gazeuse, dépôt de goutte immédiat). Et il y aura aussi une mesure de tension invasive (anesthésie, analgésie, procédure terminale, 10 minutes). D’autre animaux subiront une chirurgie (anesthésie, analgésie, gonadéctomie une fois, 30 minutes, et une pose de pellet sous-cutanée 5 minutes, deux fois). Puis une échocardiographie (anesthésie gazeuse). Ensuite il y aura une contention pour récolte d’urine (vigile, 2 fois, une minute). Ainsi que des prises de tension (vigile, 15 minutes en boite de contention, 5 fois). Et il y aura une mesure de tension invasive (anesthésie, analgésie, procédure terminale, 10 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection d’une molécule pour induire le modèle expérimentale peut provoquer une inflammation péritonéale chronique et des dépôts, du côté du diaphragme ou du péritoine. Les injections peuvent provoquer une douleur légère de courte durée et une inflamation peritonéal. L'hébergement en hypoxie peut générer un stress passager pour les animaux. L'hypertension pulmonaire induite pourrait induire dans de rare cas un arrêt cadio-respiratoire. Les anesthésies pour chirurgie ou pour des analyses peuvent induire des effets tels que l’hypothermie, des difficultés respiratoires ou dans les cas les plus critiques un arrêt cardio-respiratoire. La chirurgie peut conduire à des risques hémorragique ou à de douleurs post-opératoires ou encore à un risque infectieux jusqu'a une semaine. Un stress des animaux est possible lors de l’acclimatation à la prise de pression systémique vigile. Les mesures de pression systolique et les prélèvements de sang peuvent provoquer des hématomes ou dans de rares cas une hémorragie. Les instillations intranasales peuvent provoquer un arrêt momentané de la respiration et un éternuement. La castration/ovariectomie n'entraine pas de nuisances particulière, l'effet principal étant une augmentation de l'appétit.

Devenir

Toutes les souris en procédures sont euthanasiés pour prélever les organes d’intérêts direct necessaires (biochimie, histologie, culture cellulaires) et ceux susceptibles d’un usage ultérieur.

Remplacement

L'objectif du projet est d’une part de mettre en évidence les mécanismes du remodelage artériel lors d'une hypertension pulmonaire. D’autre part de déterminer l’importance des hormones sexuelles et d’une dysfonction rénale dans l’installation de l’hypertension artérielle suite à un remodelage artériel médié par la voie d'intéret. Pour cela, il est nécessaire de conserver l’ensemble des phénomènes intervenants dans la régulation des vaisseaux pulmonaires et systémique : inflammatoires (interactions cellules immunes et cellules vasculaires), vasculaires (interactions des cellules vasculaires entre elles), cardiaques (retentissement éventuel d’altérations de la fonction cardiaque gauche et droite), respiratoires (hypoxie), dus système renine-angiotensine et éventuellement nerveux. Cela ne peut être réalisé que par une étude sur organisme entier, nous avons donc choisi un modèle de souris, pour leurs susceptibilités à l’hypoxie et du fait de l’existence des lignée transgéniques d’intérêt. Si nous caractérisons les voies biochimiques, leurs mécanismes seront prioritairement étudiés ou sur lignée cellulaires.

Réduction

Au total, 6915 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre d’animaux par lot a été adapté à ces calculs. De multiples organes seront prélevés, comme le mésentère et le rein, pour une étude annexe sur le remodelage vasculaire systémique.

Raffinement

Les animaux seront stabulés avec leurs congénères (2 à 6 par cage), par fratrie pour les mâles, avec du matériel d'enrichissement : lanières de papier, morceau de bois, maison en carton. Ils seront observés quotidiennement par du personnel compétent et informé des paramètres à contrôler et de façon hebdomadaire par les membres de l’équipe de recherche. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12heure par jour (6heure-18heure). La profondeur de l'anesthésie sera vérifiée en testant l'absence de réflexe de retrait de la patte (après pincement). Les animaux sous anesthésie sont toujours placé sur un tapis chauffant a 37 dégré, avec de l'ocrigel sur les yeux pour éviter qu'ils ne deviennent trop sec. Un suivi La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémique en péri-opératoire puis en post-opératoire et pourra être renouvelée en cas de souffrance de l’animal. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème desinfectante et antiseptique. Après chirurgie cardiaque, la 1ère semaine, les animaux seront nourris avec de la bouillie et l'apport d'eau sera facilité. Des points limites suffisament prédictif ont été définis et seront quotidiennement évalués avec des annotations sur les etiquettes de suivi post-opératoires.

Choix des espèces

Les souris (Mus Musculus) sont un modèle classique à la fois pour l'étude du développement de l'hypertension artérielle pulmonaire et systémique. Les lignées choisies nous permettront d'étudier nos modéles avec une suractivation de la protéine ou une absence de celle-ci ainsi que le devenir des cellules progéntrice d'intérêt avec le modéle de tracking fluorescent. De plus les lignées nécessaires n'existent pas dans d'autres espèces animales, à notre connaissance. Les animaux seront impliqués dans le projet a 6-12 semaines, soit le début de l’âge adulte, l'étude ne portant ni sur le développement, ni sur les ages avancées.

4 500 souris vont être utilisées, chacune soumise jusqu'à trente-deux semaines de régime gras associé à un composé qui élève la pression artérielle, quarante heures en cage individuelle sans enrichissement et vingt-quatre heures en cage métabolique sur grille. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent une à deux administrations par jour, des pompes implantées sous la peau au cours d'une chirurgie de dix à quinze minutes, trois prises de sang, des mises à jeun de six heures et des courses sur tapis roulant. Le porteur attend de ce modèle qu'il permette d'évaluer de futurs médicaments contre l'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée, et précise que les animaux seront traités avec les molécules de ses clients, aux doses que ceux-ci auront fixées.

Objectifs

Les désordres métaboliques (diabètes, obésité, ...) et le vieillissement augmentent le risque de maladies cardiovasculaires dont l’insuffisance cardiaque, qui touche 1 à 1,5 millions de Français. On distingue deux types d’insuffisance cardiaque. D’un point de vue étiologique et physiopathologique, les 2 formes d'insuffisance cardiaque sont très différentes. La forme à fraction d’éjection préservée (50 % des cas) est une maladie qui se manifeste de plusieurs façons et présente une physiopathologie complexe. À l’heure actuelle, le traitement de cette forme d’insuffisance cardiaque ne repose sur aucune recommandation solide. Jusqu’à il y a peu, il était d’usage d’appliquer aux patients les mêmes stratégies thérapeutiques que celles utilisées pour les patients souffrants d’une de l’autre forme d’insuffisance cardiaque. Parmi les facteurs de risque identifiés figurent : l’âge, le sexe féminin, les maladies métaboliques (diabète et obésité), l’hypertension, … Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie, il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie de cette maladie, en incluant une ou plusieurs comorbidités. Le développement de modèles prédictifs et robustes ainsi que leur utilisation en recherche pré-clinique permettront d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels.

Bénéfices attendus

Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie humaine, donc présentant plusieurs comorbidités afin d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels. L’ensemble des expériences effectuées ont pour but de valider ou non l’efficacité de nouvelles cibles ou futurs médicaments. Les animaux seront traités avec les molécules de nos clients aux doses qu’ils auront déterminées.

Procédures

Pour induire une insuffisance cardiaque chez la souris, des régimes gras associés à un composé chimique augmentant la pression artérielle seront mis à disposition dans les cages d'hébergement (jusqu’à 32 semaines de procédure). Les composés à tester seront administrés une à deux fois par jour par voie : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié ou vigile. L'administration dure 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Des pompes permettant une diffusion du composé en continu pourront être implantées sous la peau des animaux (chirurgie de 10 à 15 minutes sous couverture analgésique). Des prélèvements de sang (uniques ou répétés) seront réalisés (à 3 reprises pendant les 32 semaines). Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Pour les mesures de paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose pourront être effectués (des mesures répétées du taux de sucre dans le sang après administration de sucre). Les animaux seront soumis à des suivis longitudinaux de la fonction cardiaque et vasculaire sous anesthésie gazeuse (20 minutes maximum). L’exploration de la fonction métabolique se fera sur animaux vigiles. Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement. Pour la fonction rénale, la mise en place d’un patch, nécessitera une courte anesthésie (moins de 10 minutes) puis sera effectuée sur animaux vigiles. La mesure des paramètres urinaires se fera en cage métabolique (24 heures). Au maximum, ces examens seront effectués à la fin de l’induction, au milieu et à la fin des traitements. Bien que non invasifs, ils requièrent pour la plupart une anesthésie gazeuse qui pourrait impacter les mesures. Ainsi, il aura 3 examens par semaine maximum. Au-delà, ils devront être distribués sur plusieurs semaines. Pour faire les échographies et fixer les patchs, nous devrons au préalable dépiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. En fin de procédure, les animaux seront soumis à un test d’effort réalisé sur un tapis de course. Les mesures terminales nécessiteront la mise en place d’un cathéter dans la carotide au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et sans réveil.

Impact sur les animaux

Le modèle induit progressivement une dysfonction cardiaque associée à d’autres comorbidités. Chez le rongeur, les effets indésirables se manifesteront sous différentes formes : comportementale (hyper ou hypoactivité, isolement, agressivité, hygiène), prises hydriques et alimentaires (poids et hydratation), aspect général (aspect du pelage, manque d’hygiène) ... Ces altérations du comportement seront détectées lors des visites quotidiennes. Les animaux seront nourris, au plus tôt à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet avec un régime enrichi en graisse pour une durée de 32 semaines. Cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer un inconfort. Les administrations (jusqu’à 12 semaines, 1 à 2 fois par jour) et les prélèvements de sang répétés peuvent engendrer un stress léger à modéré et une douleur légère (piqûre). Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques, bien que non invasives, nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires en cages métaboliques, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h générant un stress et un inconfort. Lors des tests de course sur tapis roulant, les animaux seront soumis à un stress et une douleur légère.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin des procédures afin de procéder à la collecte des organes et du sang pour l'évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans les organes cibles, paramètres métaboliques et de fonction rénale et cardiaque dans le sang...)

Remplacement

Les nouveaux médicaments doivent avoir validé leur efficacité pré-clinique (chez l’animal) avant de passer en phase clinique (chez l’homme). L’utilisation des animaux permet de réaliser ces tests dans un système intégré et donc d’augmenter la prédictibilité des effets chez l’homme. Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions cardiaques associées aux complications métaboliques, vasculaires et rénales ne peuvent être pleinement reproduites que dans un système in vivo pour le moment. Le remplacement par un animal d'une autre classe (comme le poisson zèbre) ne permettra pas une analyse aussi précise des mécanismes pathologiques à cause sa très petite taille et contrairement aux rongeurs il n’appartient pas aux espèces réglementaires pour le développement de nouveaux médicaments.

Réduction

Le projet a été organisé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux tout en prenant en compte la mortalité (environ 10%) et la variabilité interindividuelle lors du développement de la dysfonction (10% des animaux exclus après randomisation à la fin de l’induction). Ces estimations sont basées sur notre expérience, au sein de la société, des modèles induits par régime, des données bibliographiques et d’échanges avec d’autres chercheurs. La possibilité de réaliser des mesures non invasives permettra un suivi longitudinal sur les paramètres cardiovasculaires, métaboliques et rénaux pour chaque animal, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Par ailleurs, chaque animal est utilisé pour mesurer plusieurs caractéristiques (physiologiques, anatomiques, histologiques, biochimiques et moléculaires) du développement de la pathologie.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance. Si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids, défaut de toilettage, agressivité, …), une grille de score spécifique est mise en place. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas, l’animal concerné sera mis à mort. Des mesures de la fonction cardiaque, vasculaire, rénale et métabolique peuvent être répétées sur un même animal (suivi longitudinal) en ayant recours à des techniques non invasives. Pour les mesures effectuées sur animaux vigiles (tapis de course/cage métabolique), une habituation au dispositif sera réalisée. Pour les procédures qui peuvent induire de la douleur chez l’animal une analgésie pré et per-opératoire est mise en place pour la prévenir et la réduire.

Choix des espèces

Les souris sont largement utilisées et caractérisées par la communauté scientifique afin d’évaluer les effets de molécules sur les fonctions cardiovasculaires dans des modèles de maladies cardiovasculaires et cardio-métaboliques. Il est possible d’induire chez ces espèces des atteintes similaires à celles observées chez l’Homme et d’en suivre l’évolution avec les mêmes outils qu’en médecine humaine (échographe,, …). L’ensemble des procédures décrites dans le projet concerne des animaux sevrés (minimum 4 semaines). Si l’étude le requiert, les expérimentations pourront être réalisées sur des animaux plus âgés afin de considérer le vieillissement (comorbidité connue) comme les facteurs aggravants de la pathologie.

Trois souris par groupe vont être utilisées en surnombre pour compenser un taux d'échec de 20 % à l'injection dans la veine de la queue, celles dont l'injection rate étant écartées et tuées aussitôt. Elles sont 70 en tout, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de mélanome puis sont gardées quatorze jours pendant que les métastases se développent, avec une perte de poids, une cachexie et des difficultés respiratoires parmi les effets attendus. Le porteur indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le développement des métastases et l'intégrité des vaisseaux sanguins, et conclut que le projet "nécessite" d'observer l'"organisme entier".

Objectifs

Les micro-ARN (mir) sont des petits acides ribonucléiques produits par la cellule qui ne sont pas traduits en protéines. Leur rôle est de réguler l’expression de gènes en bloquant la traduction des ARN messagers en protéines. Des études chez l’humain ont révélé la présence de plus de 500 mir différents pouvant cibler potentiellement près de 30 % des ARNm humains. Le projet est la suite d’un projet qui nous a permis de démontrer que le miR-155 est un nouveau facteur stimulant la croissance des vaisseaux sanguins mais qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. En particulier, nous avons établi qu’une exposition au miR-155 entraine une altération de la forme et de la structure des vaisseaux sanguins, notamment en fragilisant la paroi des vaisseaux et ayant pour conséquence de faciliter la formation de nouvelles ramifications vasculaires. Ces ramifications se font par bourgeonnement des cellules endothéliales qui tapissent la face interne des vaisseaux. Le miR-155 est classé comme un biomarqueur du cancer en raison de sa surproduction dans le microenvironnement tumoral de cancers solides (sein, poumon, foie). Dans notre projet nous émettons l’hypothèse qu’un excès de miR-155 d’origine tumorale conduirait à une perte d’intégrité et d’étanchéité des vaisseaux sanguins qui pourrait favoriser la dissémination des cellules tumorales et donc la formation de foyers métastatiques. Dans ce contexte nous souhaiterions déterminer la contribution du miR-155, synthétisé naturellement par des cellules de mélanome, au processus métastatique in vivo. Nous prévoyons d’utiliser un modèle de métastases chez la souris en réalisant une analyse macroscopique des foyers tumoraux pulmonaires complétée par des approches d’immunofluorescence afin d’évaluer l’intégrité des vaisseaux sanguins. En fonction des résultats obtenus, nous tenterons, dans un second temps, de préciser la spécificité et d’élucider le mécanisme de transfert du miR-155 produit par les cellules tumorales pour une action sur les cellules vasculaires.

Bénéfices attendus

Nous avons montré dans une étude précédente que le miR-155 favorise la formation de vaisseux sanguins mais il génère des vaisseaux anormaux et perméables ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Nous souhaiterions confirmer ces observations dans des souris adultes quand le réseau vasculaire est établi et mature. En particulier, nous souhaiterions déterminer si le miR-155 produit par les cellules tumorales circulantes induit des dommages vasculaires. Cette fragilisation de la paroi des vaisseaux par le miR-155, aurait pour conséquences de faciliter l’échappement des cellules tumorales circulantes et de favoriser le développement de foyers métastatiques. Ainsi, nous pourrions envisager des stratégies pour le cibler (cible thérapeutique) afin de préserver l’intégrité vasculaire et limiter l’apparition de métastases.

Procédures

Une injection de cellules tumorales par souris sera effectuée. Les analyses seront réalisées après 14 jours. Tous les animaux sont concernés par les procédures.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette étude, les sources de douleur et de stress pourraient provenir des conséquences de l’injection de cellules tumorales et tout particulièrement au cours du développement des métastases durant 14 jours. Les effets indésirables et nuisances attendus dans ce modèle et qui seront particulièrement observés afin de déceler un mal-être chez ces animaux sont les suivants : - Perte de poids - Cachexie - Gêne/douleur - Difficulté respiratoires (métastases pulmonaires)

Devenir

14 jours après l’injection (procédure1) ou si un point limite est atteint, les animaux seront directement sacrifiés par du personnel formé et qualifié. Différents tissus seront prélevés pour analyses (ex. : poumons, foie, reins, aorte, yeux,... ) puis fixés pour des analyses macroscopiques et en histologie. En fonction des résultats obtenus sur les premiers animaux, la méthode de mise à mort prévue pourrait évoluer vers une méthode alternative (procédure 2) permettant de fixer profondément les tissus et ainsi faciliter nos analyses. Cette procédure sera elle aussi réalisée par un personnel qualifié.

Remplacement

Certains aspects du projet vont être réalisés in vitro sur des cellules vasculaires d’origine commerciale. En particulier, des co-cultures avec les lignées de cellules tumorales seront réalisées. Cependant, à l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro permettant d’étudier le développement des métastases et l’intégrité des vaisseaux sanguins dans un environnement complexe (cultures comprenant les cellules du sang, les péricytes (autres composants cellulaires des vaisseaux sanguins), la matrice extracellulaire, le flux sanguin.....). Dans ce contexte, la réalisation du projet nécessite d’avoir recours à l’animal afin d’étudier des effets sur l'organisme entier qui ne sont pas approchables in vitro (ex. : formation de métastases, relations avec le système immunitaire à grande échelle, ...).

Réduction

Basé sur notre expérience et sur la littérature existante, nous devons prendre en compte que le taux d’échec pour les injections par la veine caudale chez la souris est de 20% en moyenne (causes d’échec : résistance à l’injection, bulles et qu’il existe une certaine variabilité intrinsèque au développement des métastases. Afin d'obtenir des études statistiques fiables, nous avons réalisé des analyses de puissance statistique. Suite à ces analyses, nous avons calculé que nous aurions besoin au minimum de 11 animaux utilisables par groupe d'étude lorsque nous utilisons le test statistique adéquat. De plus, pour pallier ce taux d’échec d’injection de 20%, nous tablons donc sur 14 animaux par groupe d'étude, soit 3 souris pouvant être écartées de l’étude en cas de problème d'injection. Par conséquent, 11 animaux par condition seront analysables statistiquement et ceci pour chacun des 5 groupes expérimentaux. Afin de limiter le nombre d'animaux, les expériences en place sont étudiées afin de recueillir le maximum de données et d'échantillons biologiques. C'est la raison pour laquelle nous recueillerons les poumons (site privilégié pour la formation de métastases dans le cas du mélanome) et d’autres d'organes d’intérêt (ex. : foie, reins, aorte, yeux... ), lors du sacrifice des animaux. Ceux-ci seront utilisés aussi bien pour des études à l'échelle macroscopique (dénombrement des foyers métastatiques) que microscopique (histologie). Des morceaux de tissus seront aussi congelés pour des analyses transcriptomiques et protéiques, a posteriori.

Raffinement

L’élevage est supervisé par le personnel compétent de l’animalerie. L’hébergement des animaux sera enrichi par des tunnels en polycarbonate ou polysulfone. Afin de réduire le stress des animaux, une phase d'habituation sera mise en place en cinq séances sur deux semaines avant le début de la procédure. Cette période permettra de les familiariser progressivement au déplacement vers la salle d'expérimentation ainsi qu'à la manipulation. Concernant les problèmes inhérents aux injections, tous les animaux dont l’injection n’aura pas été maitrisée seront écartés de l’étude et immédiatement sacrifiés par du personnel qualifié pour ne prendre aucun risque. Les injections seront réalisées sous anesthésie, induisant une analgésie modérée.

Choix des espèces

Dans la recherche en oncologie, la souris constitue un modèle pertinent qui présente l’avantage d’être très documenté d’un point de vue des protocoles développés par la communauté scientifique étudiant la croissance tumorale et le processus métastatique. L'étude de la formation de métastases pulmonaires dans les modèles de cancer peut s'effectuer par la formation de métastases provenant de la tumeur primaire et nécessite donc une implantation de cellules dans un organe. Cependant, en se basant sur la bibliographie dans le domaine, il apparait qu’une injection de cellules tumorales chez la souris constitue un procédé plus rapide, plus efficace en termes de formation de métastases, et moins sévère du point de vue chirurgical, en vue d'étudier ce processus. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 7-8 semaines minimum. En dessous de cet âge, les animaux ne sont pas assez matures. En particulier, les poumons et le système vasculaire ne sont pas complétement développés, ce qui pourrait interférer avec nos résultats car nous souhaitons étudier l’effet du miR-155 sur les vaisseaux matures.

Pour documenter les effets cardiovasculaires des immunothérapies anticancéreuses chez des individus déjà hypertendus, 450 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'hypertension leur est imposée par une mini-pompe implantée sous la peau, qui diffuse une molécule pendant vingt-huit jours. Viennent ensuite des anticorps deux fois par semaine pendant deux semaines, trois prélèvements de sang de dix minutes, des échographies du cœur et des carotides, une imagerie de l'œil, une imagerie du mésentère et des mesures de pression à la queue. Le porteur écrit avoir "soigneusement optimisé" le nombre de rats par groupe, sans donner de calcul de puissance, et arrive à un effectif d'environ 450 à partir d'un minimum de dix rats par groupe.

Objectifs

Documenter les potentielles toxicités cardio-vasculaires liés aux traitements par inhibiteurs des points de contrôles immunitaires utilisés dans le traitement des pathologies malignes. Comprendre les mécanismes de toxicités cardio-vasculaires liés aux traitements par inhibiteurs des points de contrôles immunitaires. Identifier les pistes de travail pour prévenir cette toxicité cardio-vasculaire.

Bénéfices attendus

La compréhension des conséquences cardio-vasculaires liés aux traitement par inhibiteurs des points de contrôles immunitaires, traitement des pathologies malignes, nous permettra d'appréhender au mieux ces complications. La compréhension des mécanismes physiopathologiques de ces complications et l'identification des cibles pour l'initialement d'une potentielle prévention avant l'apparition des complications cardio-vasculaires sont les enjeux de ce travail. L'incidence des pathologies malignes dans le monde augmente, de part notamment le vieillissement de la population. Aujourd'hui l'utilisation d’inhibiteurs de points de contrôles immunitaires est une pierre angulaire dans le traitement des pathologies malignes et l’amélioration des connaissances sur les effets indésirables potentiels de ces traitements est indispensable.

Procédures

Les rats seront soumis à la mise de place de mini-pompes sous la peau ( temps du geste 10 minutes) pour diffuser une molécule qui les rend hypertendus pendant une période de 28 jours. De plus, des traitements par anticorps qui modulent le système immunitaire seront administrés deux fois par semaine pendant 2 semaines afin d'évaluer la toxicité de ces traitements. Les rats bénéficieront de prélèvements sanguins à J1, J15, J28 jours soit 3 au total pour réaliser des analyses diverses (10 mn par prélèvement). Les rats bénéficieront de plusieurs examens in vivo : - Echographie trans-thoracique et carotidienne à J1 et J28 (temps d’intervention estimé à 10-20 min à J1 et à J28) – une imagerie oculaire à J28 (temps d’intervention estimé à 10 min à J28) – une imagerie du mésentère à J28 (temps d’intervention estimé à 5 min à J28) – la mesure de la pression artérielle au niveau de la queue du rat à J1 et J28 (temps d’intervention estimé à 10 min à J1 et à J28)

Impact sur les animaux

Pose de la mini-pompe sur un animal anesthésié : cette intervention entraîne une douleur post-chirurgicale ainsi qu’une gêne liée à la présence du capteur sous la peau. Injections : elles génèrent du stress lors de la contention de l’animal éveillé et peuvent également entraîner une gêne au niveau du point d’injection. Pléthysmographie sur un animal vigile : cette procédure induit un stress chez l’animal.

Devenir

A l'issu de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes pour des études biomoléculaires et histologiques. Ces tissus sont nécessaires pour valider les effets des traitements sur l'organisme.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les effets cardiovasculaires des traitements par inhibiteurs des points de contrôle immunitaire dans des conditions de physiopathologie intégrées, autrement dit, chez des animaux présentant déjà un facteur de risque cardio-vasculaire, comme l'hypertension artérielle. De ce fait, l'utilisation de modèles cellulaires ou ex vivo n'est pas adapté pour répondre de façon pertinente aux questionnement scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été soigneusement optimisé afin de limiter l'utilisation d'animaux au strict nécessaire. Une stratégie spécifique a été mise en place pour réduire au maximum les prélèvements, que ce soit lors des analyses pharmacocinétiques ou au moment de la mise à mort. Cela permet de limiter à la fois le nombre d’animaux utilisés et les volumes prélevés sur chacun. Quelle que soit la conception des études exploratoires, nous nous engageons à utiliser le moins d’animaux possible. Pour garantir la robustesse des résultats, un minimum de 10 rats par groupe est requis. Au total, en incluant l’ensemble des procédures prévues dans ce projet, environ 450 rats seront utilisés.

Raffinement

Dans la mesure du possible, l'hébergement social est choisi afin de réduire le stress et l'angoisse, avec un enrichissement adapté à chaque espèce. Un suivi quotidien de l'état clinique des animaux est réalisé pendant toute la durée du projet. Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 3 à 4 par cage avec de l’enrichissement adapté à l’espèce. Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C, hydrométrie à 55% et luminosité à 100lux avec un cycle de lumière 12h/12h). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des animaux sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal est utilisée quand un animal présente un état de mal-être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et avis du responsable bien-être animal. L’anesthésie et l’analgésie sont rigoureusement respectées pour toutes les interventions effectuées sur les animaux tout au long de l’étude. À l’issue de chaque procédure, les rats seront euthanasiés conformément aux protocoles en vigueur.

Choix des espèces

Le choix d’espèces rongeurs est justifié par : - Les objectifs du projet : disponibilité d’un modèle de maladie déjà existant (hypertension artérielle par injection de traitement dans les mini-pompes sous cutanés) permettant d'étudier l'injection des traitements par inhibiteurs de points de contrôles immunitaires chez des animaux avec un facteur de risque cardio-vasculaire. - La comparaison possible avec d’autres études menées chez ces modèles animaux au laboratoire - Aspects pratiques de manipulation Des rats âgés de 12 à 18 semaines seront utilisés, car le protocole requiert des animaux adultes. Le choix de rats adultes permet d'établir un parallèle avec la situation humaine, dans laquelle les traitements sont généralement administrés à l'âge adulte. De plus, les individus adultes présentent un risque accru de développer des pathologies vasculaires, ce qui justifie l'utilisation de cette tranche d'âge dans notre modèle expérimental.

Les ovaires de 1 200 souris leur sont retirés en dix à vingt minutes, avant la pose sous la peau d'une capsule diffusant des hormones. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tuées pour prélever leurs tissus. L'objet est de comprendre pourquoi les plaques d'athérome évoluent différemment selon le sexe et de mesurer l'effet des œstrogènes sur ce processus, y compris chez des souris privées du récepteur qui les reconnaît. La liste des procédures ne mentionne que la chirurgie et la capsule, alors que les effets attendus décrivent aussi un régime obésogène capable de faire dépasser 40 grammes aux animaux et de gêner leurs déplacements.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité en France chez les femmes, pourtant, elles restent encore sous-estimées. Les femmes présentent souvent des symptômes atypiques, un diagnostic et une prise en charge plus tardive et des différences dans l'évolution clinique des pathologies cardiovasculaires par rapport aux hommes. Les hormones sexuelles peuvent expliquer en partie ces différences, notamment les œstrogènes chez les femmes. En effet, au-delà de leur rôle majeur dans les fonctions de reproduction, leurs actions s’étendent également aux tissus non reproducteurs et en particulier aux artères. Chez la femme en période d’activité génitale, le 17β-estradiol (E2), produit par les ovaires, est l’œstrogène majoritaire. Durant cette période, ces hormones confèrent une protection artérielle à l’origine du moindre risque cardiovasculaire de femmes par rapport aux hommes. Au moment de la ménopause, qui correspond à l’arrêt de la production d’œstrogènes et qui survient en moyenne entre 49 et 52 ans chez la femme, la protection diminue considérablement ce qui entraine une augmentation significative du risque cardiovasculaire à partir de cette période. Le but de ce projet est de comprendre le dimorphisme sexuel dans l’évolution des plaques d’athérome (à l’origine de la plupart des maladies cardiovasculaires) et d’étudier l’impact des œstrogènes dans ce processus. Enfin nous évaluerons les mécanismes d’actions des œstrogènes en utilisant des souris déficientes pour leur récepteur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet portent sur la santé humaine et plus particulièrement la santé féminine. Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle des hormones féminines dans les pathologies cardiovasculaires, en particulier chez la femme au moment de la ménopause. En effet les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité chez la femme.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Ovariectomie (10 à 20min) 1200 animaux 2-Pose de capsule à libération prolongée (5min) 1200 animaux

Impact sur les animaux

Les chirurgies sur la souris telles que l’ovariectomie ou la pose de pellet peuvent engendrer une douleur, une légère perte de poids et un stress en post-opératoire durant les premières 24 à 48h. Le régime obésogène provoque une prise de poids qui peut engendrer une gêne de mobilité chez la souris (si le poids de la souris dépasse 40g de poids corporel).

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés.

Remplacement

L’évaluation des plaques d’athérome dans la paroi des vaisseaux est un phénomène complexe qui ne peut pas être mimé in vitro. De plus, aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire des variations hormonales et ceci d’autant plus que l’ensemble des lignées cellulaires présentent dans le vaisseau « perdent » l’expression du récepteur des œstrogènes.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi il ressort que 10 animaux/groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle d’euthanasie, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à un dépôt de plaque dans les artères. Ces souris sont un modèle reconnu dans l’étude des maladies cardiovasculaires. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines d’âge (après pic de croissance et puberté).

Pour relier la stéatose du foie aux troubles cardiaques, 960 souris sont rendues obèses et diabétiques par un régime suivi pendant 16 à 24 semaines. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélever leur foie, leur cœur et leur tissu adipeux. S'y ajoutent une injection quotidienne pendant 12 à 24 semaines, deux injections par jour deux fois par semaine pour induire une fibrose du foie, des mises à jeun, des gavages avec risque de lésion de l'œsophage, six prises de sang en deux heures et des explorations cardiaques sous anesthésie. Le porteur indique qu'un traitement agissant sur la voie étudiée est déjà commercialisé contre des maladies auto-immunes et pourrait voir son indication étendue.

Objectifs

La prévalence des maladies métaboliques du foie (MASLD) est en constante augmentation et touche environ un tiers de la population mondiale. Les études de cohortes chez l’Homme ont révélé son lien complexe avec les maladies cardiovasculaires. La MASLD a été associée à un risque accru de cardiopathie métabolique (CM) incluant arythmie, cardiopathie ischémique et insuffisance cardiaque. L'impact de la MASLD sur la CM va au-delà des facteurs de risque traditionnels et prédit de manière indépendante le risque de mortalité cardiovasculaire. Ces observations soulignent la nécessité d'étudier les liens entre la MASLD et la CM pour comprendre comment les troubles métaboliques hépatiques peuvent influencer la pathogénèse de la cardiopathie métabolique.

Bénéfices attendus

Les stéatopathies métaboliques (MASLD) sont en pleine expansion car elles sont très associées au développement de l’obésité et du diabète de type 2. Elles affectent environ 40 pourcent de la population mondiale. La morbi-mortalité cardiovasculaire représente la première cause de décès chez ces patients atteints de MASLD. Ce projet a pour but de comprendre le rôle d'un lipide particulier d’origine hépatique et de ses récepteurs cardiaques dans la physiopathologie de la cardiopathie métabolique. En effet, cet axe pourrait être une cible thérapeutique dans le traitement de ces maladies étant donné que des agonistes de cette voie existent actuellement sur le marché et sont utilisés dans le cadre de maladies auto-immunes et inflammatoire. Ce traitement déjà sur le marché pourrait avoir une extension de son indication pour les patients avec MASLD présentant une cardiopathie métabolique.

Procédures

Les animaux sont soumis à une injection pour l'administration d'un agent viral (sous anesthésie, une fois, quelques minutes) et seront nourris avec des régimes spéciaux (régime induisant une obésité, un foie gras, une inflammation hépatique (animal vigil, en continu pendant 16 à 24 semaines ) ou un traitement injectable pour induire une fibrose hépatique (animal vigil, 2 fois par semaine pendant 12 semaines, 1 minute). Pour les animaux recevant le traitement ou un placebo, une injection par jour sera réalisée pendant 12 à 24 semaines sur animal vigil, 1 min. Pour les souris sous traitement induisant une fibrose hépatique, le nombre d'injections est porté à 2 par jour 2 fois par semaine. Des explorations métaboliques seront réalisées pour explorer la sévérité du diabète (animal vigil, 2 fois car un pour le test de tolérance à l'insuline et un pour le test de tolérance au glucose), 6 prélèvements de sang de faible volume au total sur une période de 2h) ainsi que des analyses cardiaques (sous anesthésie, 2 fois car un pour l'enregistrement du rythme cardiaque à l'électrocardiogramme et un pour l'échographie cardiaque), 10 minutes). En fin de projet, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (électrocardiogramme, échocardiographie) 2) les conséquences de la maladie hépatique (insulinorésistance, diabète, obésité) et les conséquences sur le coeur (arythmie, insuffisance cardiaque) 3) le stress et la douleur légère lié à la manipulation et la contention durant les tests métaboliques (tests de tolérance à l'insuline et test de tolérance au glucose), mise à jeun avec la sensation de faim, risque de lésion/irritation oesophagienne lors du gavage 4) le stress et la douleur légère de courte durée liée au prélévement de sang lors des tests métaboliques 5) la douleur ponctuelle liée à l'injection 6) risque de saignement ou d'hématome lors des injections.

Devenir

Une fois les explorations cardiaques réalisées au terme du régime et du traitement, les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les tissus d’intérêt (tissus adipeux, foie et coeur) en vue d’analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de comprendre l’influence du métabolisme hépatique en cas de MASLD sur l’activité cardiaque. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, des biopsies de tissu provenant d'études antérieures seront utilisées pour ne pas reproduire les expériences

Réduction

Le nombre total d’animaux sera de 960 souris. Ce nombre a été calculé grace à un test de puissance afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau (Changement de la litière, jusqu'à deux fois par semaine si nécessaire, en cas de souillure par les urines liée à l'apparition d'un diabète induit par les différents régimes/traitement Nourriture hydratée en fond de cage pour les animaux obèses ou qui perdent du poids). Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés (anesthésie) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Les souris sous régime ou traitement fibrotique seront surveillées quotidiennement. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Les points limites sont évalués par un personnel compétent. Lors des anesthésies, application d'un gel olphtalmique pour la protection oculaire, utilisation tapis chauffant (37 degrés celcius) pour limiter l’hypothermie durant l'anesthésie

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques d’obésité et de diabète ont été validés chez la souris. Sa physiologie est connue et il est bien décrit qu'un régime obésogène et ou diabétogène est capable d'induire une insulinorésistance quelques semaines après le régime. Les animaux seront étudiés à partir de 6-8 semaines de vie car atteinte de la maturité sexuelle et les souris sont métaboliquement stables (arrêt de la croissance), et pour la reproductibilité et standardisation des résultats internationaux (les études déjà publiées travaillant sur l'obésité et le diabète utilisent ces souris à partir de ces âges)

Chacune des 960 souris de ce projet finit le crâne incisé sous anesthésie profonde, sans réveil, pour une observation au microscope pouvant durer trois heures. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et aucune souris ne reste en vie. Avant cette chirurgie terminale, certaines reçoivent chaque semaine pendant trois semaines un agent qui provoque une fibrose de la moelle osseuse, ou une chimiothérapie, ou dix injections quotidiennes destinées à inactiver un gène. Le porteur situe le bénéfice immédiat du côté de la connaissance de ces vaisseaux et renvoie les retombées pour les patients, meilleure prise de greffe ou freinage des métastases, à un horizon lointain.

Objectifs

Nous nous intéressons à la barrière sang-moelle osseuse formée par les vaisseaux sanguins dans la moelle osseuse. Ces vaisseaux sont le site unique d’entrée dans la circulation de toutes les cellules sanguines et le site d'entrée dans la moelle lors des greffes de cellules souches. Comment les cellules de ces vaisseaux maintiennent leur fonction de barrière tout en étant perpétuellement sujettes aux cellules qui les traversent est peu étudié. Il est particulièrement important d’entreprendre ces études car différentes maladies modifient les propriétés de la moelle et sont susceptibles de modifier la fonction de barrière de ces vaisseaux. Nous avons déjà mis en évidence que dans des modèles de maladies de moelle osseuse, mimant les cancers de la moelle (myélofibrose) ou la chimiothérapie, ces vaisseaux sont modifiés, avec modifications de l’expression de différentes protéines. Les objectifs globaux du projet sont d’évaluer si et comment ces conditions pathologiques que l'on retrouve chez l'homme (myélofibrose, chimiothérapie) impactent la fonction de perméabilité des vaisseaux aux molécules et aux cellules. Nous étudierons cet aspect chez la souris à l’état de base et après avoir induit la myélofibrose ou la chimiothérapie. La perméabilité aux molécules sera évaluée par la mise en place de modèles d’injection de colorant puis observation par microscopie intravitale . Pour étudier le rôle des protéines d'intérêt, nous disposons de souris génétiquement modifiées pour ces protéines et chercherons à évaluer la perméabilité de leurs vaisseaux par comparaison avec les souris contrôles appropriées.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, très peu de choses sont connues sur la biologie des vaisseaux de moelle osseuse, du fait de leur rareté et de la difficulté de les isoler et de les cultiver. Ce projet permettra de mettre en lumière le comportement de ces vaisseaux, comprendre comment ils tolèrent le passage incessant des cellules sanguines matures dans la circulation tout en maintenant leur rôle de barrière sanguine. Les bénéfices à court terme sont de comprendre les mécanismes qui régulent cette barrière. Les bénéfices à long terme visent 1) les patients développant une myélofibrose ou traités par chimiothérapie, avec la possibilité de pouvoir favoriser ou freiner l'entrée des cellules sanguines dans la circulation; 2) l’extravasation de cellules dans la moelle: en comprenant le comportement de cette barrière, on pourra envisager de la moduler pour par ex. accélérer/améliorer la prise de greffe de cellules souches hématopoiétiques, ou à l’inverse freiner l’entrée de cellules tumorales circulantes qui provoquent des métastases dans la moelle osseuse.

Procédures

Induction de la myélofibrose: injections d'un agent stimulant la production de plaquette, 1 fois par semaine pendant 3 semaines, sur animaux vigiles (3 secondes). Traitement chimiothérapeutique: injection unique sur souris vigile (3 secondes). Inactivation d'un gène: injections sur souris vigile (temps d'injection 5 secondes), une fois par jour pendant 10 jours consécutifs. Anesthésie profonde pour chirurgie terminale et observation de la fluorescence : analgésique: injection unique sur souris vigile (sc 3 secondes), anesthésiant: injection unique sur souris vigile ( 3 secondes), pas de réveil jusqu'à la fin de la procédure chirurgicale et de l'observation. La chirurgie par elle-même dure 15 minutes. L'observation par microscopie se fait en température thermostatée à 37°C, pendant 3h au maximum.

Impact sur les animaux

Injection des médicaments sur souris vigile: nécessite la contention de l'animal, ce qui entraine un stress et une douleur légère de courte durée au point d'injection. Chirurgie: déshydratation liée à l'anesthésie

Devenir

L'imagerie intravitale nécessite une chirurgie et l'incision de la peau du crâne, ainsi que l'injection systémique de colorants et marqueurs vasculaires. Nous optons pour une procédure terminale 1) pour éviter toute souffrance au réveil liée à la suture des tissus; 2) les souris ne sont pas réutilisables dans d'autres expériences du fait de possibles interférences/artéfacts liés aux injections des produits.

Remplacement

Ce projet repose sur un mécanisme complexe faisant intervenir non seulement les cellules endothéliales en tant que telles mais également le contexte physiologique ou pathologique (propriétés biochimiques et mécaniques du tissu médullaire, flux sanguin , réseau microvasculaire extrêmement dense, myélofibrose, myélosuppression,…), et sur animal vivant. De ce fait, ces expériences sont irremplaçables, il n'existe pas encore de modèle au point permettant de recréer toutes cette complexité. En outre, nous utilisons des modèles de souris inactivées pour des gènes ou mimant une mutation humaine.

Réduction

Les méthodes pour visualiser la perméabilité vasculaire sont bien décrites dans la littérature et nous nous y réfèrerons concernant les doses à injecter, donc nous ne prévoyons pas d'étude pilote. Le nombre d’animaux sera réduit au minimum par l’emploi de méthodes statistiques adaptées et d'après notre expérience passée utilisant cette technique, et par la possibilité de pouvoir observer sous le microscopes différents champs pour une même souris.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet sont pris en compte et sera minimisé : - Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes sociaux. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 3 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Après chaque injection, on leur apportera à leur réveil de la nourriture apétente en gel, comme forme de "récompense". - - Par l'utilisation de dispositifs de contention non stressant pour l'animal. -Par une anesthésie et une analgésie de l’animal avant l’injection de certains traitements. - Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant tous les gestes sur animaux anesthésiés. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites, s'ils sont atteints, permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance.

Choix des espèces

La moelle osseuse de la souris reproduit la complexité de celle de l'homme. L'os du crâne de la souris est très fin et donc translucide, ce qui nous permet de visualiser les vaisseaux sanguins de la moelle par fluorescence directement à travers l'os intact, sans avoir recours à une chirurgie lourde. Nous disposons de souris génétiquement modifiées pour nos gènes d'intérêt. Les souris seront observée au stade jeune adulte (8-18 semaines) car la vascularisation de la moelle se modifie avec le vieillissement.

Une vingtaine de prises de sang à la queue, des injections dans le sinus situé derrière l'œil, un gavage de glucose et trois injections dans l'abdomen attendent chacune des 96 souris de ce protocole. Génétiquement modifiées pour accumuler le cholestérol, elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées. Le porteur qualifie ce phénotype de "silencieux, sans altération du bien-être de l'animal" et précise que les plaques restent stables chez la souris, sans infarctus ni accident vasculaire cérébral, ce qui ne l'empêche pas de présenter le projet comme une étude des conséquences cardiovasculaires. Les aortes sont prélevées après la mise à mort, l'échographie ne donnant rien chez la souris.

Objectifs

Notre projet évaluera l'importance d'un gène du foie (PGS1) sur le développement de l'athérosclérose et des maladies cardiovasculaires chez la souris.

Bénéfices attendus

Sur la base des données génétiques humaines ainsi qu’aux connaissances préliminaires générées, le projet fera la lumière sur les effets de Pgs1 sur les lipides sanguins et les conséquences métaboliques (athérosclérose et maladies cardiovasculaires). Le projet permettra de faire avancer les connaissances scientifiques sur l’implication de Pgs1 dans la régulation de mécanismes physiologiques impliqués. De plus, si, comme nous le prévoyons, l'inhibition de Pgs1 conduit à des bénéfices globaux sur maladies cardiovasculaires, ce travail représentera une pierre angulaire dans la valeur de PGS1 en tant que candidat prioritaire pour l'intervention pharmaceutique chez les patients ayant des besoins médicaux non satisfaits contre les maladies cardiovasculaires liées aux lipides.

Procédures

Au maximum, une vingtaine de prélèvements de sang d'une durée inférieure à 30 secondes (sur animaux vigiles après anesthésie cutanée locale) seront au maximum réalisé par souris sur la durée du protocole. Les souris subiront au cours du protocole également une injection intraveineuse (10 secondes par injection IV), un gavage oral (5 secondes par gavage) et trois injections intrapéritonéales (5 secondes par injection IP).

Impact sur les animaux

Les procédures de ce protocole sont de classe modérée. Les souris Ldlr-/-sont hypercholestérolémiques et prédisposées à l’athérosclérose mais ce phénotype est silencieux, sans altération du bien-être de l’animal. De plus contrairement à l’homme, les plaques d’athérosclérose sont stables chez la souris et n’entrainent pas de maladies cardiovasculaires telles que l’infarctus du myocarde, l’accident vasculaire cérébral ou l’artérite du membre inférieur (postérieur). De plus, les expériences précédemment réalisées n’ont pas identifié d’effets indésirables suite à l’inhibition hépatique de PGS1. Les principaux effets indésirables prévus pour les animaux, concernent le stress et les douleurs induits par les prélèvements sanguins à la queue, les injections ainsi que l’administration d’un bolus de glucose par gavage. Les injections seront réalisées par une personne expérimentée dans le sinus rétro-orbital (seringue à insuline) sous anesthésie (isoflurane). Cette zone d’injection est préférée aux autres (veine péniennes ou caudale) pour des raisons de comparaisons intersexe ainsi qu’une meilleure expérience sur la distribution des virus. Afin de limiter la souffrance liée à la répétition des injections, nous utiliserons des seringues microfines, ferons varier variation les points d’injection et les volumes injectés (d’insuline et de tyloxapol) seront faibles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issu du protocole. L’objectif principal est de mesurer les conséquences de notre traitement sur le développement de la plaque d’athérosclérose au niveau de l’aorte. Les méthodes non invasives type échographie n’étant pas applicable avec succès sur le modèle murin, il nous est nécessaire de collecter chirurgicalement les aortes pour mesurer l’étendue des lésions par explorations histologiques.

Remplacement

Les données déjà obtenues par analyse génétique semblent valider notre hypothèse sur l’effet fonctionnel de PGS1 et nous pousse à explorer son action dans un système complexe. En effet, les pathologies cardiométaboliques résultent de processus intégrés et de communications inter-organes, impossibles à modéliser in-vitro avec les méthodes actuelles. Ainsi, l’utilisation de modèles animaux intégrés reste indispensable.

Réduction

Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude.

Raffinement

Nous avons pris en compte le bien-être animal, une visite quotidienne des animaux par les zootechniciens formés permettra de prévenir les risques de stress et de souffrance. De plus un examen clinique hebdomadaire sera réalisé par les responsables du protocole de recherche. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant des procédures adaptées, notamment anesthésiques pour les injections virales et avant la mise à mort des animaux et analgésiques pour les prélèvements sanguins. Des signes cliniques définissant les points limites, au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal mis à mort, ont été fixés et résumés en Annexe. Nous utilisons des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et un igloo ou un tube tunnel, en polycarbonate) et les animaux sont hébergés et maintenus en groupes sociaux.

Choix des espèces

Le modèle intégré animal est nécessaire pour tester les effets systémiques cardiovasculaires de l’inhibition de Pgs1. De plus, le modèle murin Ldlr-/- est un modèle de choix d’athérosclérose disponible au sein de l’équipe de recherche. En effet, le métabolisme lipidique murin protège les souris sauvages de l’accumulation de cholestérol dans le système vasculaire ne permettant pas l’observation de plaque d’athérosclérose. Les animaux débuteront le protocole de recherche à 8 semaines d’âge de façon à travailler sur des animaux adultes. Le but de ce travail n’étant pas de déterminer l’effet de l’inhibition de Pgs1 au cours du développement.