Système cardiaque

Une stimulation électrique du cœur qui peut déclencher une fibrillation ventriculaire et tuer l'animal sur la table : 654 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Leurs mères reçoivent du tamoxifène par voie orale juste avant la mise bas, produit qui peut provoquer une fausse route ou déclencher l'accouchement, et les nouveau-nés en reçoivent une injection au deuxième jour, avant un tatouage à dix jours et une biopsie de la queue. Le projet vise à comprendre comment un défaut des fibres de Purkinje, 2 % de la masse du cœur, déclenche les arythmies mortelles chez l'humain. Le porteur retient la souris pour sa petite taille, sa facilité de contention, sa gestation de dix-neuf à vingt et un jours et ses portées de six à quinze petits.

Objectifs

Ce projet se déroule sur 2 établissements EU1 et EU2. La mort subite cardiaque due aux arythmies cardiaques représentent jusqu’à 85 % des cas de mortalité chez des patients atteints d’infarctus ou de maladies cardiaques (cardiomyopathies). Ces arythmies sont souvent déclenchées par des cellules cardiaques spécialisées appelés fibres de Purkinje. Ces fibres forment un réseau de conduction électrique rapide assurant la contraction coordonnée du cœur afin de pomper efficacement le sang. Bien que ces fibres ne représentent qu’une infime partie du cœur (2% de la masse du cœur), plusieurs études suggèrent que des dysfonctionnements au niveau de ces fibres jouent un rôle important dans les arythmies cardiaques et la mort subite chez l’Homme. L’objectif principal de ce projet est d’élucider comment ces dysfonctionnements peuvent provoquer des arythmies cardiaques. Notre hypothèse est que des perturbations de la structure ou de la fonction des fibres de Purkinje dans certaines formes de maladies cardiaques (cardiomyopathies) représentent un facteur de risque élevé de mort subite. Pour cela nous allons étudier la structure et l’activité électrique de fibres de Purkinje des modèles de cardiomyopathies chez la souris. Parmi les modèles de cardiomyopathies, nous travaillerons sur des souris modifiés génétiquement avec une dysfonction des fibres de Purkinje, identifiés chez des patients atteints de malformations cardiaques ou de cardiomyopathies très souvent associées à des arythmies.

Bénéfices attendus

La survenue de mort subite est très souvent liée à une arythmie ventriculaire imprévisible qui dans sa grande majorité provient d’un défaut du réseau de Purkinje. Malheureusement ce réseau ne représente qu’une infime partie du cœur et son étude chez l’Homme est limitée à des mesures invasives et indirectes. L’utilisation de souris transgéniques, chez lesquelles ce réseau est facilement identifiable, est un atout majeur pour comprendre l’origine des arythmies ventriculaires. Ce projet devrait nous permettre d’identifier des facteurs de prédisposition aux arythmies ventriculaires dans plusieurs modèles de cardiomyopathies.

Procédures

La première intervention consiste au traitement des souris gestantes, juste avant la naissance et par voie orale avec une molécule qui induit les cardiomyopathies chez la descendance (durée : moins d’une minute). La descendance issue de ces mères gestantes recevra une injection du même traitement au 2ème jour après la naissance (durée : moins d’une minute), une identification par tatouage digital à 10 jours (durée : moins d’une minute), une biopsie de la queue pour le génotypage (identification de la variation génétique) (durée : moins d’une minute). Ces interventions auront lieu dans l’établissement EU1/2 Ces animaux seront sous anesthésie générale, et leur activité électrique sera analysée au niveau du cœur entier par électrocardiogramme (ECG), au niveau tissulaire par stimulation cardiaque, et au niveau structurel par IRM. Ces interventions auront lieu dans l’établissement EU2/2.

Impact sur les animaux

Les animaux présentant les points limites suivants seront euthanasiés par dislocation cervicale : L’administration par voie orale du tamoxifène peut provoquer un stress à l’animal et provoquer la mise-bas des femelles gestantes. De plus, au moment du traitement par voie orale, le tamoxifène peut également suivre une fausse route. Chez les nouveau-nés, l’injection de tamoxifène peut provoquer un retard de croissance. L’anesthésie générale peut entraîner des difficultés respiratoires se manifestant par des spasmes abdominaux et ne devraient pas engendrer de nuisances ou d’effets indésirables particuliers sur les souris. L’induction d’arythmies ventriculaires par la stimulation cardiaque pourrait entrainer des effets indésirables sévères (fibrillation ventriculaire, tachycardie ventriculaire) et même conduire au décès de certains animaux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasié suite à la fin de fertilité ou bien afin d’effectuer des analyses ex vivo.

Remplacement

Pour le moment, les études sur cellules, organes artificielles ou par modélisation informatique ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de la structure et fonction complexe des fibres de Purkinje. Cependant, les résultats obtenus pourront enrichir de futurs modèles mathématiques des fibres pour la réalisation de simulation virtuelle de la fonction cardiaque et des arythmies.

Réduction

Les animaux subiront le maximum de procédures possibles (sous anesthésie générale) afin d’obtenir le maximum de données sur un minimum de d’animaux. Dès que les résultats auront une puissance statistique minimale pour être exploités, la production de souris sera arrêtée.

Raffinement

Les mesures de raffinement sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adaptés) et seront manipulés par des personnes compétentes et formées. L’état des animaux sera contrôlé quotidiennement afin d’éviter toute souffrance. Les animaux seront anesthésiés quand nécessaire et des points limites sont déterminés afin d’utiliser une méthode analgésique ou bien d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : -animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner -modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), -6 à 15 souriceaux par portée -modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en termes de manipulation génétique. Les stades de développement utilisés dans ce projet sont les suivants : -Souris adultes : des souris génitrices qui permettront le maintien de la lignée de souris transgéniques (à partir 6-8 semaines jusqu’à 24 semaines) et la descendance à partir du 3ème jour jusqu’à 6 semaines.

Pour comprendre pourquoi le cœur diabétique répond mal à l'effort, 90 rats reçoivent pendant six semaines une eau de boisson additionnée d'un composé hypertenseur et une alimentation riche en graisses, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils courent ensuite vingt minutes sur un tapis motorisé, subissent une échocardiographie sous anesthésie pendant laquelle une molécule leur impose un stress cardiaque pouvant déclencher des arythmies, puis un test de tolérance au glucose de deux heures après mise à jeun. Tous sont tués pour prélever leur cœur et en isoler cardiomyocytes et mitochondries. Une grille de score remplie chaque jour tranche, selon un arbre de décision, entre l'administration d'un analgésique et la mise à mort de l'animal.

Objectifs

La réponse combat-fuite, ou fight or flight response, est une réaction permettant à notre organisme de faire face à une situation de danger. Au niveau cardiaque, cela se traduit par une augmentation de la fréquence et de la force de contraction des cellules du cœur. Il est bien établi que cette capacité d’adaptation du cœur à un stress est altérée dans le cadre de la maladie cardiaque associée au diabète de type 2 (DT2) et plus particulièrement dans la cardiopathie diabétique, caractérisée d'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée (HFpEF). Cette altération pourrait contribuer à expliquer l’intolérance à l’effort, les arythmies cardiaques et, potentiellement, le risque accru de mortalité en situation de stress chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque diabétique. L’objectif de ce travail est de mieux comprendre le rôle de l’altération de la fonction mitochondriale — organite clé dans la production d’énergie du cœur — dans la réponse défaillante du cœur diabétique à un stress. Ce projet se concentrera plus particulièrement sur le rôle d’une petite molécule, le monoxyde d’azote (NO), dans la modulation de la réponse des mitochondries cardiaques face à une situation de stress.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre le rôle de cette petite molécule, le monoxyde d’azote (NO), au niveau des centrales énergétiques des cellules du cœur, les mitochondries, dans une pathologie cardiaque encore mal comprise et pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement efficace : l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (HFpEF). Le développement récent de molécules capables de libérer du NO spécifiquement au niveau des mitochondries pourrait ainsi constituer une nouvelle piste thérapeutique prometteuse.

Procédures

Les animaux seront traités quotidiennement pendant six semaines avec avec un composé induisant de l'hypertension (dilué dans l’eau de boisson) et nourris avec un régime riche en graisses. L’association de ces deux traitements induira le développement d’une hypertension artérielle et de troubles métaboliques similaires à ceux observés dans le diabète de type 2. Les animaux seront ensuite soumis à différents évaluations pouvant générer des stress. Un test de course sur tapis motorisé d'une durée d'environ 20 minutes, une échocardiographie de stress sous anesthésie (environ 15 minutes) et enfin une mesure de la glycémie à jeun suivie d'un test de tolérance au glucose à partir de microprélèvements de sang au niveau de la veine de la queue (2h00).

Impact sur les animaux

Le traitement mélangeant régime gras (régime HFD pour high fat diet), afin d'induire des troubles métaboliques, et traitement avec un composé induisant de l'hypertension peut avoir des conséquences sur l’état de bien-être des animaux. Les animaux seront donc surveillés par un personnel habilité et formé pour ce type de procédure expérimentale. Une grille d'évaluation de la souffrance sera utilisée par le personnel qualifié. En cas de souffrance excessive, les animaux seront traités (antalgie ou euthanasie en cas de souffrance trop importante). Le traitement aigu avec un composé permettant de mimer un stress adrénergique, administré lors de l’échocardiographie, peut également affecter le bien-être des animaux. En effet, cette molécule va induire une situation de stress cardiaque (augmentation de la force et de la fréquence de contraction du coeur) pouvant être associé à des arythmies cardiaques. Les animaux seront donc étroitement surveillés et leur rythme cardiaque sera surveillé le temps de l'expérimentation. Un suivi particulier sera réalisé dans les heures suivant le stress, par un personnel formé et qualifié pour ce type d’interventions. Certains animaux seront soumis à un test d'effort sur tapis de course motorisé. Cette procédure peut être stressante pour les animaux mais afin de réduire le stress, une procédure d'habituation à la course ainsi qu'à l'environnement particulier du tapis de course sera mise en place lors des quelques jours précédant les tests. La mise à jeun des animaux pour la mesure de la glycémie se fera pendant la phase diurne (période pendant laquelle les animaux mangent peu) afin de réduire le stress. Le microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale sera précédé d'une anesthésie locale de la zone de prélèvement avec un anesthésique en crème. Les autres expérimentations seront réalisées sur des organes, des cellules et des mitochondries isolées, nécessitant l’euthanasie des animaux avant le prélèvement des tissus.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement du coeur et ainsi permettre l'isolement primaire de cardiomyocytes, de mitochondries ou des analyses biochimiques.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer l’impact du stress métabolique (régime riche en graisse) et hypertensif (inhibition de la synthèse du NO) sur le remodelage pathologique du coeur. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient. Par conséquent l'utilisation de modèles animaux apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.

Réduction

Un grand nombre d'expérimentations sera réalisé sur des cœurs, des cellules ou des mitochondries isolées. Cette approche permet, en contrôlant un grand nombre de paramètres et ainsi en réduisant la variablité d'une expérience à l'autre, de limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus, la taille du cœur du rat permet de collecter une grande quantité de matériel biologique et permettra, à partir d'un même coeur de réaliser différentes évaluations (biochimie, immuno-précipitation, protéomique). Le nombre d'animaux utilisé par groupe a été préalablement determiné à l'aide d'un logiciel de statistique.

Raffinement

Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un animalier formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Ainsi, en se basant sur cette grille, un score sera attributé à chaque animal afin d'évaluer son état de bien être ou de souffrance. Les résultats de cette observation permettront, en se basant sur un arbre décisionnel, d'opter, si necessaire, soit pour une stratégie d'analgésie soit pour la mise de la mort de l'animal. Lors des différentes expérimentations (test de course, echocardiographie de stress, mesure du glucose sanguin) des mesures sont prises pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Ainsi, les animaux seront préalablement familiarisé à l'environnement du tapis de course pendant 3 jours avant le test de course. L'échocardiographie de stress sera réalisée sous anesthésie et les animaux seront surveillés par enregistrement de leurs rythmes cardiaque et respiratoire ainsi que de leur température corporelle. Enfin, le microprélèvement de sang à la queue des animaux sera réalisé après anesthésie locale de la zone de prélèvement.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation des même tissus (coeur) ex vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte (rats de 12-15 semaines) afin de pouvoir travailler sur un système cardiovasculaire mature et sans facteurs de complications

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées avec de la moelle osseuse modifiée, laissées plusieurs mois, avant huit à vingt-quatre semaines de régime enrichi en graisses, en cholestérol et en sucre destiné à provoquer obésité, résistance à l'insuline, maladie du foie et athérosclérose. Suivent des mises à jeun, cinq microprélèvements de sang à la queue par test, des tests de tolérance au glucose et aux lipides sur animal vigile, et pour une partie une échographie cardiaque sous anesthésie. Les retombées annoncées se limitent à envisager un lipide comme marqueur de risque et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, quand l'obésité provoquée, elle, est immédiate. Le porteur affirme que le dialogue entre organes ne peut pas s'étudier en culture cellulaire et que le projet ne s'envisage qu'à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les maladies métaboliques telles que l’obésité sont caractérisées par des désordres touchant le métabolisme énergétique, et notamment des lipides. Elles sont fréquemment associées à des complications cardiaques et vasculaires. L’accumulation de lipides dans la paroi des artères est une conséquence fréquente qui peut conduire à des accidents vasculaires comme la crise cardiaque. Elle est associée à d’autres troubles comme l’obésité, le diabète, le cholestérol ou la maladie du foie gras. Ces maladies touchent plusieurs organes et doivent être étudiées de façon globale afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués. Parmi les mécanismes suggérés dans la littérature scientifique, une modification de certaines cellules immunitaires pourrait avoir un rôle important. Parmi ces éléments, un lipide essentiel pourrait être crucial. Cependant, le mécanisme d’action n’est pas compris pour le moment. Nous souhaitons donc dans ce projet bloquer la production de ce lipide essentiel uniquement dans les cellules immunitaires identifiées comme importantes afin d’identifier les mécanismes que ce lipide contrôle, notamment dans la progression des troubles qui sont associés à l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les mécanismes associés à l’émergence des maladies liées à l’obésité et aux troubles métaboliques qui en découlent tels que l’athérosclérose ou l’insulino-résistance, et plus particulièrement d’identifier un lipide clé des macrophages dans ce processus. Cette étude nous permettra de comprendre l’importance de la dérégulation de l’homéostasie lipidique des macrophages dans le développement des maladies cardiométaboliques et d’explorer les dialogues inter-cellulaire et inter-organes. L’ensemble de ces données permettra d’envisager ce lipide comme un marqueur pertinent, et ainsi d’identifier et de stratifier des populations humaines potentiellement à risque et finalement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux impliqués dans ce projet seront soumis à une greffe de moelle osseuse qui implique une irradiation préalable (moins de 15 min) et une injection de cellules de moelle modifiées, sous anesthésie (5 min). Après plusieurs mois de repos pour que la greffe ait bien prise, les souris seront mises en présence d’un régime riche en graisses et en sucre pour une durée de 8-24 semaines. Avant et après régime, sur les souris vigiles nous évaluerons la masse grasse ce qui nécessite une courte contention (moins de 5 min), et elles seront testées par un faible prélèvement de sang sous anesthésie. A la suite du régime riche en graisse, les souris seront mises à jeun et rapidement évaluées sur le plan métabolique (moins de 2 h). Les réponses des souris à une ingestion de sucre ou de graisse seront alors évaluées grâce à de très faibles prélèvements de sang à la queue (5) sur de courtes périodes (moins de 2h). De même, la réponse des souris à l’insuline, afin d’estimer un potentiel diabète, sera réalisé selon la même procédure (2h). Afin que les évaluations soient fiables, les animaux seront vigiles et libres de leurs mouvements. De même, les évaluations seront distribuées équitablement afin d’éviter toute fatigue. Le comportement des animaux sera mesuré sur plusieurs jours grâce à des cages munies de divers capteurs. Enfin, une partie des animaux sera évaluée sur le fonctionnement du cœur par une échographie et un électrocardiogramme. Ceci sera réalisé sous anesthésie afin de garantir l’immobilité des souris et la qualité des images sans stresser l’animal. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet.

Impact sur les animaux

Les souris seront exposées à des régimes riches en graisses, en cholestérol, et en sucre pendant plusieurs semaines (8 à 24) afin d’induire une obésité et de provoquer les désordres métaboliques qui lui sont associée : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, maladies du foie non alcoolique, troubles du rythme, athérosclérose, troubles du rythme cardiaque…. Ces régimes pourraient induire un inconfort et une difficulté de déplacement dus à l’obésité développée. L’injection de progéniteurs de moelle-osseuse aux souris pourrait induire une douleur de courte durée et un risque d’hématome ou d’hémorragie. De plus, les souris seront soumises à un phénotypage métabolique qui inclus un jeûne non-strict de quelques heures ce qui peut engendrer une sensation de faim chez l’animal. Les injections pour le test de sensibilité à l’insuline et l'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose et un le suivi de glycémie (ou lipides) associé avec des prélèvements sanguins de faible volume pourront induire un stress et une douleur légère de courte durée. L'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose ou de lipide pour le test de tolérance aux lipides pourrait induire des microlésions et des irritations.

Devenir

Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins pour répondre à la question (ou aux objectifs) scientifique de ce projet.

Remplacement

Le dialogue inter-organes (coeur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (macrophages/hépatocytes ou adipocytes) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires. Ainsi l’impact induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, l’altération de la fonction des cellules immunitaires dans un organe peut avoir un écho profond dans des organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués

Réduction

Le projet impliquera 560 animaux au total. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre d’évaluations à réaliser, et donc le nombre d’animaux requis. La composition et la durée du régime riche en graisse utilisé ici sera déterminée par les résultats d’une étude pilote en cours. Cette méthode nous permet ainsi d’assurer avec un faible nombre d’animaux le succès de ce projet et une utilisation rationnée et réduite au strict nécessaire.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel ou à 30 degrés Celsius est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les greffes et les explorations cardiaques seront réalisées sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux. Les animaux seront vérifiés quotidiennement et un suivi régulier du poids sera effectué afin de s'assurer du bien-être des animaux. Pour faciliter l'alimentation, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage en cas de nécessité. Conformément à la réglementation, les actes techniques seront réalisés par du personnel formé et compétent pour respecter le bien-être animal et diminuer leur stress. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris constitue le modèle privilégié pour l’étude des mécanismes impliqués dans la pathophysiologie des maladies métaboliques : la souris est le mammifère le moins évolué qui développe rapidement des maladies métaboliques similaires à l’Homme. L’analyse de l’athérosclérose requiert une modification du métabolisme lipidique et une altération de la communication inter-organes. Nous utiliserons une lignée de souris qui présente un métabolisme lipidique plus proche de ce que l’on peut observer chez l’Homme. Des souris âgées de 10 à 12 semaines, un âge auquel elles sont suffisamment matures pour supporter la transplantation, seront utilisées. Les régimes obésogènes seront mis en place à l'âge de 12 à 16 semaines, afin de laisser le temps aux souris de récupérer de leur transplantation.

Des rats de quatre semaines, pesant une centaine de grammes, reçoivent un traitement qui leur provoque une hypertension des artères pulmonaires. 176 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélèvement des poumons, du cœur, du foie et de la rate. Chacun subit deux échographies cardiaques sous anesthésie et une injection intrapéritonéale par jour pendant deux à trois semaines, certains recevant en plus une minipompe posée chirurgicalement. Le porteur invoque un "besoin médical critique" et des options thérapeutiques limitées, quand le projet consiste à tester chez le rat des inhibiteurs d'une protéine repérée en culture cellulaire.

Objectifs

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie vasculaire rare et progressive caractérisée par un rétrécissement des petites artères pulmonaires, entraînant une augmentation de la pression artérielle dans la circulation pulmonaire. Dans ce projet, nous allons tester de nouveaux médicaments susceptibles de ralentir ou corriger les anomalies à l’origine de cette maladie. Pour cela, nous utiliserons des modèles expérimentaux chez le rat qui reproduisent les principales caractéristiques de l’HTAP humaine. L’objectif est de mieux comprendre comment la maladie se développe et d’identifier les mécanismes biologiques sur lesquels les traitements agissent. Cela permettra d’envisager, à terme, de nouvelles approches pour soigner les patients atteints d’HTAP.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à répondre à un besoin médical critique en explorant de nouvelles approches thérapeutiques pour l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP), une pathologie grave et complexe pour laquelle les options actuelles sont limitées. Avancées thérapeutiques : L’étude permettra d’évaluer si l’intégrine αvβ3 constitue une cible thérapeutique pertinente pour l’HTAP. L’efficacité des inhibiteurs de αvβ3 sera testée afin de déterminer leur impact sur la réduction du remodelage vasculaire pulmonaire et l’amélioration des paramètres hémodynamiques. Compréhension des mécanismes : Les résultats attendus contribueront à une meilleure compréhension des voies de signalisation impliquées dans l’action des inhibiteurs de αvβ3. En particulier, ils permettront d’analyser leur effet sur la prolifération cellulaire, l’inflammation et la dysfonction endothéliale associées à l’HTAP. Impacts translationnels : Ce projet fournira une base scientifique solide pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’intégrine αvβ3 dans le traitement de l’HTAP. Les résultats obtenus pourraient également ouvrir des perspectives pour élargir l’utilisation de ces inhibiteurs à d’autres pathologies impliquant des mécanismes similaires. En se focalisant sur les mécanismes fondamentaux de l’HTAP, ce projet pourrait non seulement améliorer les résultats cliniques des patients, mais aussi contribuer à l’élargissement des connaissances sur cette maladie. Ces bénéfices attendus représentent une avancée importante vers des traitements plus ciblés et efficaces.

Procédures

Dans le cadre de cette étude, les animaux seront soumis à plusieurs interventions expérimentales. Deux échographies cardiaques non invasives seront réalisées sous anesthésie générale légère, chacune durant environ cinq minutes. Ces examens permettront de suivre l’évolution de la maladie et d’évaluer l’effet des traitements. Un sous-groupe d’animaux subira une courte chirurgie (environ 15 minutes) sous anesthésie générale pour l’implantation d’une minipompe osmotique permettant l’administration continue d’un traitement. Les animaux seront surveillés durant la phase de réveil post-opératoire. Chaque animal recevra une injection sous-cutanée unique en début de protocole, puis une injection intrapéritonéale par jour pendant 2 ou 3 semaines selon la procédure suivie (à l’exception des animaux porteurs de minipompe). Chaque injection est réalisée sous anesthésie locale et dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Les traitements administrés ont déjà été testés et présentent un bon profil de sécurité, avec une toxicité minimale. Les effets indésirables attendus dans ce projet concernent les interventions expérimentales ainsi que les manifestations liées aux pathologies induites : • Les injections sous-cutanées peuvent provoquer une douleur modérée et transitoire au point d'injection • La chirurgie abdominale peut entraîner une douleur postopératoire modérée, localisée dans la zone opérée. • Les échographies peuvent générer un stress léger et temporaire dû à la contention et à l’anesthésie. • Les procédures terminales sont réalisées sous anesthésie générale et ne génèrent pas d’effet indésirable postérieur. • Les modèles d’hypertension pulmonaire peuvent provoquer une fatigue progressive et une réduction de la prise de poids.

Devenir

À la fin de l’étude, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie, garantissant l'absence de souffrance. Des prélèvements d'organes (poumons, cœur, foie et rate) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.

Remplacement

Ce projet repose sur des résultats prometteurs obtenus à partir d’études in vitro sur des cultures cellulaires. Ces travaux ont permis de mettre en évidence des altérations dans des voies de signalisation clés impliquées dans le remodelage vasculaire pulmonaire. Le traitement par des inhibiteurs ciblant cette intégrine a montré une réduction significative de la prolifération des cellules musculaires lisses d’artère pulmonaire (CML-AP) induite par le Facteur de von Willebrand (vWF). Ces résultats suggèrent un rôle crucial de l’axe vWF/LRP4/αvβ3 dans la prolifération cellulaire associée à l’HTAP. Toutefois, pour valider l’impact de cette inhibition sur le remodelage vasculaire pulmonaire dans un contexte physiologique intégré, l’utilisation de modèles animaux est nécessaire. Les modèles SuHx et MCT d’hypertension pulmonaire ont été choisis pour leur aptitude à reproduire les altérations pathologiques observées chez l’Homme, notamment le remodelage vasculaire, la prolifération des CML-AP et l’élévation de la pression artérielle pulmonaire. Ces modèles permettent d’induire ces modifications et constitue une approche préclinique pertinente pour tester l’efficacité de traitements. Ces modèles expérimentaux offrent une plateforme robuste pour évaluer les effets des traitements sur la progression de la maladie, mesurer la réduction du remodelage vasculaire et déterminer les implications thérapeutiques potentielles. L’étude des interactions entre les voies de signalisation impliquées dans l’action des inhibiteurs d'intégrine fournira également des informations essentielles sur les mécanismes sous-jacents de cette approche thérapeutique.

Réduction

Les effectifs ont été soigneusement calculés en utilisant des outils statistiques avancés, en tenant compte des données issues de nos études préliminaires et des résultats disponibles dans la littérature sur l’hypertension pulmonaire. Les critères hémodynamiques, tels que la pression artérielle pulmonaire moyenne et l’évaluation du remodelage vasculaire, sont les principaux paramètres retenus pour évaluer l’efficacité des traitements. Cette approche permet de cibler les analyses sur des mesures précises et pertinentes, limitant ainsi la nécessité d’effectuer des évaluations multiples ou prolongées. De plus, les animaux témoins utilisés dans cette étude seront, lorsque cela est possible, réutilisés pour des analyses complémentaires afin d’optimiser leur usage et éviter l’expérimentation supplémentaire sur de nouveaux individus. Egalement, nous avons inclut dans la procédure 1 une étude pilote afin de déterminer le meilleur candidat médicament pour poursuivre le reste de l'étude avec une seule molécule. Cette stratégie vise à maximiser l’exploitation des données obtenues tout en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires au projet. Par ailleurs, les résultats issus de ces expérimentations pourront être valorisés dans le cadre d’autres recherches sur l’HTAP et les mécanismes moléculaires associés, garantissant ainsi une utilisation optimale des ressources animales disponibles

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des matériaux adaptés tels que du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, leur permettant de réaliser des comportements naturels. Ils seront toujours hébergés en groupes pour éviter l’isolement, et une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début des procédures. Pour garantir leur bien-être, un système de surveillance basé sur des points limites sera appliqué afin de détecter rapidement tout signe de souffrance. Une attention particulière est portée à la gestion de la douleur : une analgésie est administrée avant les interventions douloureuses, notamment avant la chirurgie, et toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie adaptée (anesthésie générale pour la chirurgie, anesthésie locale pour les injections). Cela permet de réduire efficacement toute douleur ou stress potentiel. L’ensemble des procédures sera réalisé dans le strict respect des principes éthiques, afin d’assurer des conditions optimales pour les animaux tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les rats sont des modèles standards et bien établis pour l’étude des maladies cardiovasculaires, notamment l’hypertension pulmonaire. Des rats âgés de 4 semaines et pesant environ 100 grammes seront utilisés, conformément aux standards expérimentaux des modèles validés d’hypertension pulmonaire. Cet âge est requis pour assurer l’induction efficace et reproductible de la maladie dans les protocoles utilisés, tout en permettant une comparaison directe avec les données existantes dans la littérature préclinique. Ce choix permet également d’optimiser la transposabilité des résultats vers des approches translationnelles ultérieures.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié soumise à un régime gras pendant dix-huit mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe 48 heures seul en cage de mesure de la dépense énergétique, subit sept pesées, une injection, un gavage et trois prélèvements, puis jusqu'à six tests évaluant l'anxiété, l'activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire et les capacités sensorimotrices. La faim liée à la mise à jeun, la peur pendant les manipulations et l'isolement figurent parmi les nuisances déclarées. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur "l'animal entier" et retient la souris pour la facilité d'y invalider des gènes, les corps servant ensuite aux analyses histologiques.

Objectifs

Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladies du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Il étudie aussi l'impact du vieillissement biologique dans la survenue des pathologies avec l'âge et le déclin des fonctions physiques et cognitives. Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes au cours du vieillissement - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme (vieillissement biologique). Le projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira à une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ Dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques de protéines, notamment mitochondriales impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique, sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes du métabolisme lipidique et glucidique et de régulation de la fonction mitochondriale, et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, - Comprendre l'impact du vieillissement sur le fonctionnement des organes, 2/ Dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l’homme: - Identifier des voies de signalisation et cibles thérapeutiques du métabolisme énergétique et lipidique, visant au développement de futurs médicaments.

Procédures

Dans le premier établissement, la moitié des animaux (souris) seront mis sous régime gras pendant 18 mois. Ils subiront, des pesées (7 fois, 30 sec), une injection (5 sec), un gavage (30 sec) et des prélèvements à 3 reprises (5 sec à 3 min), une mesure de la composition corporelle en matières grasses à 3 reprises (4min) et une mesure de la dépense énergétique où l’animal est hébergé seul (1 fois pendant 48h). Dans le second établissement, ils subiront jusqu’à 6 tests de comportements (durée 6min à 30min) afin d'évaluer l'anxiété, l’activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices, et les capacités physiques de l’animal.

Impact sur les animaux

Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Le changement de régime alimentaire peut induire un stress à l'animal. La faim est une nuisance pouvant survenir lors de la mise à jeun des animaux.La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, à l'occasion des prélèvements ou de leur isolement dans certaines procédures. La peur et le stress peuvent aussi survenir lors la découverte de nouveaux environnements, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant prélèvement. D'autres nuisances sont la douleur à l'injection, lors des prélèvements, ou à l'occasion de certains tests comportementaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort à des fins d’analyse et d’études histologiques.

Remplacement

Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques En parallèle,des tests de culture cellulaire sont à l'étude pour étudier des mécanismes précis et limiter le nombre d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur la base de nos études antérieures ou de la littérature correspondante. Dans ce contexte, le nombre d’animaux utilisé dans chaque groupe étudié sera suffisant pour réaliser les analyses statistiques. De plus, plusieurs données scientifiques pourront être obtenues avec un même animal ce qui réduira le nombre d'animaux dans le projet.

Raffinement

Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre : - les moyens pour limiter le stress aux animaux seront appliqués: avant les expériences, les animaux seront manipulés et habitués à l’expérimentateur afin de favoriser leur coopération dans les actes non invasifs et non douloureux. Ils seront acclimatés aux différentes conditions expérimentales (pièce, hébergement individuel, et différents expérimentateurs). Les expériences seront réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs. - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur. - des anesthésiques et analgésiques seront utilisés dans les procédures en terminal. Un transporteur agréé pour le transport d'animaux sera réquisitionné. La durée du transport entre les établissements utilisateurs n’excèdera pas les 30 minutes. Les animaux seront transportés dans leur cage d'origine (enrichissement compris) afin de limiter le stress lié au transport. Des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis, - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits, - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après les actes quand c'est nécessaire, - la mise en place de procédures de mise à mort quand c'est nécessaire.

Choix des espèces

La finalité du projet est d'identifier les effets de la mutation de protéines, notamment mitochondriales, impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique et le vieillissement. Ainsi, il est indispensable de travailler sur l’animal entier pour comprendre le rôle de ces protéines. Le choix du modèle souris vient du fait que celui-ci offre de larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Il est possible, grâce à ce modèle, d’invalider l’expression des protéines étudiées dans ce projet, et ainsi d'évaluer leur rôle. Nous disposons de lignées murines transgéniques sur ces protéines pour réaliser notre projet. Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides et des glucides sur ce modèle animal. Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'athérosclérose et de la maladie du foie (inflammation et stéatose) sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour démarrer le régime dans les études portant sur l'étude du métabolisme ou de l'athérosclérose. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris et l'impact du régime alimentaire sur l'altération des fonctions au cours du vieillissement de l'animal. Dans les articles scientifiquement, le vieillissement chez la souris, est classiquement étudié chez des souris âgées de 12 à 18 mois.

Une chirurgie cardiaque d'une heure trente, puis une mini-pompe osmotique portée sous la peau pendant trois semaines : 238 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ischémie-reperfusion du cœur, quatre échocardiographies sous anesthésie et une injection guidée par échographie, pour tester un acide ribonucléique messager censé relancer la division des cellules du muscle cardiaque. Le porteur indique que l'insuffisance cardiaque ainsi provoquée est susceptible de causer une souffrance chronique, une perte de poids et un affaiblissement. Seules des femelles servent aux premières procédures, la mortalité opératoire des mâles étant jugée trop élevée, et toutes sont tuées à la fin pour prélever le cœur, les muscles, le foie, les poumons et la rate.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque constitue un problème majeur, tant en termes de prise en charge des patients que de coûts de santé, en raison de la perte massive de cardiomyocytes fonctionnels. Le remplacement de ces cellules perdues par de nouvelles cellules contractiles représente un défi de taille, d’autant plus que, contrairement à certaines espèces non mammifères, le cœur humain adulte ne se régénère pas spontanément. Ce projet vise à stimuler la capacité naturelle du cœur à se réparer en réactivant la division des cellules musculaires cardiaques, un mécanisme qui s'arrête après la naissance. L’objectif est de trouver des solutions pour régénérer le muscle cardiaque endommagé après une crise cardiaque et restaurer sa fonction. Différents modes d’administration d’un traitement expérimental influencent sa répartition dans le cœur, sa capacité à activer la prolifération des cellules cardiaques et l’impact global sur la récupération des fonctions du cœur. Ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles thérapies pour traiter les maladies cardiaques.

Bénéfices attendus

Ce projet explore une thérapie innovante pour réparer le muscle cardiaque endommagé. Il vise à identifier la méthode la plus efficace pour administrer ce traitement, à démontrer qu’il peut stimuler la régénération des cellules cardiaques et à confirmer son potentiel pour améliorer la fonction du cœur. Ces travaux pourraient représenter une avancée majeure dans le développement de nouvelles solutions pour les maladies cardiaques

Procédures

Les animaux modèles d’ischémie-reperfusion subiront une chirurgie cardiaque. Cette intervention est réalisée une seule fois sur chaque souris modèle et dure 1h30. Une partie des animaux subiront un examen d'imagerie non invasive d'une durée de 20 minutes, une échocardiographie (20 minutes), une injection guidée par échocardiographie. Lors d'une seconde expérience, les animaux recevront une injection et subiront quatre échocardiographies (20 minutes). Enfin, les souris porteront une mini pompe osmotique en sous-cutanée dès injection du traitement et jusqu'à la fin de l'expérience soit, pour une durée de trois semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir un stress lié à leur manipulation et une douleur légère et brève au point d'injection. Les procédures nécessitant une anesthésie générale, comme les échocardiographies, la chirurgie cardiaque, les injections myocardiques transcutanées et l'imagerie, peuvent entraîner une baisse transitoire de la température corporelle et un assèchement des yeux. La chirurgie cardiaque, et l’implantation de mini-pompes osmotiques sous-cutanées peuvent provoquer une douleur modérée. De plus, l’insuffisance cardiaque induite par la chirurgie est susceptible de causer une souffrance chronique pour les souris, une perte de poids et un affaiblissement de l’animal.

Devenir

À la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever le cœur, les muscles, le foie, les poumons et la rate. Ces prélèvements permettront d’évaluer la biodistribution à l’échelle microscopique grâce à des analyses ex vivo et de mesurer l’efficacité de l’approche thérapeutique.

Remplacement

Les traitements sont d'abord testés sur des cellules cardiaques humaines pour vérifier leur fonctionnalité avant leur injection dans l’animal. Ce projet a pour objectif d'étudier la distribution et l'efficacité thérapeutique des traitements après injection dans un modèle in vivo. L’évaluation de l’effet thérapeutique repose principalement sur les performances fonctionnelles du cœur, ce qui nécessite l’utilisation d’animaux vivants. Cette étape est essentielle avant l'application de ces approches thérapeutiques chez l’homme.

Réduction

L’évaluation des résultats sera réalisée par une statisticienne indépendante, et les effectifs seront déterminés en fonction des analyses nécessaires pour garantir la validité statistique des conclusions. Les données ont été collectées à partir de la littérature et de notre propre expérience, et les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre de souris, les premières procédures seront effectuées uniquement sur des souris femelles dû à l’importante mortalité observée chez les souris mâles au cours de la chirurgie, ce qui obligerait à une augmentation significative des effectifs contrairement aux femelles protégées notamment par les œstrogènes. Le nombre d'animaux nécessaires tient compte des analyses de biodistribution et de la mortalité attendue, ainsi que de la variabilité des résultats, afin d’assurer des conclusions statistiquement robustes sur l’efficacité des approches thérapeutiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes sociaux dans un environnement enrichi et sont suivis quotidiennement par le personnel de l’animalerie, avec un contrôle régulier par le responsable du projet. Un suivi rigoureux, accompagné de points limites stricts et spécifiques au projet, permettra de détecter toute souffrance ou douleur. Des mesures concrètes seront mises en place pour minimiser ces effets, telles que l’administration d’antalgiques. Si nécessaire, une mise à mort anticipée sera pratiquée, conformément aux régulations en vigueur. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale, avec analgésie avant et après l’intervention. Les méthodes d’imagerie utilisées seront non invasives et non douloureuses.

Choix des espèces

L’évaluation de l’effet thérapeutique, dont le critère principal est l’amélioration des performances fonctionnelles du cœur, nécessite l’utilisation d’animaux vivants. Le choix de l'espèce souris permet d’avoir accès à des modèles génétiquement modifiés, qui offrent un suivi précis du cycle cellulaire. Ce projet constitue une étape préclinique cruciale avant l’application des approches thérapeutiques chez l'homme. Des souris jeunes adultes, âgées de 8 à 10 semaines, chez lesquelles le système cardiovasculaire est pleinement mature seront utilisées. À cet âge, bien que la régénération spontanée du cœur soit limitée, il reste possible de stimuler une régénération partielle, contrairement aux souris plus jeunes où la régénération du cœur est plus complète.