Système nerveux
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Evaluation thérapeutique de l’électrostimulation du nerf splénique sur un modèle expérimentale de la maladie de Parkinson induit par une neurotoxine
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Choisies mâles, à dix semaines et 20 à 25 grammes pour permettre "une chirurgie aisée", 528 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Parmi elles, 480 reçoivent pendant cinq jours une neurotoxine qui détruit leurs neurones dopaminergiques et provoque un déficit moteur, et 288 se font implanter une électrode sur le nerf de la rate, les connecteurs étant fixés au crâne. L'électrostimulation impose ensuite trente jours d'isolement, chaque souris étant séparée des autres à cause du fil qui la relie au stimulateur. Toutes sont tuées à l'issue, une mise à mort que le porteur présente comme un moyen de limiter les souffrances liées à l'évolution de la maladie qu'il a lui-même provoquée.
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer, sur un modèle murin induit par une neurotoxine, l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique sur la maladie de Parkinson. L'injection de la neurotoxine provoque les symptômes de la maladie de Parkinson en détruisant certains neurones du cerveau. Ce modèle de Parkinson est caractérisé par une réponse neuroinflammatoire médiée en partie par le système immunitaire. Il a pour finalité éventuelle d'appliquer ce traitement par électrostimulation en clinique. La maladie de Parkinson est une maladie du cerveau qui entraîne de la neuroinflammation, des problèmes moteurs,des troubles de la santé mentale et du sommeil, ainsi que des douleurs et d’autres problèmes de santé. L'efficacité des traitements actuels est malheureusement inconstante, et épuisable, obligeant à changer souvent de molécules. Il n’y a pas de traitements curatifs. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante et pourrait apporter une nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels. Nous avons ainsi récemment démontré que la stimulation du nerf de la rate (splénique) réduisait significativement la neuroinflammation dans un modèle murin de la sclérose en plaque. On sait que la stimulation de certains nerfs périphériques agit également directement sur les cellules du système immunitaire en inhibant leur activité inflammatoire. Toutefois, l’impact d’une stimulation chronique du nerf splénique sur l’évolution de la maladie de Parkinson n’a jamais été évalué. Le projet consiste à :1- implanter chez une souris une électrode de stimulation au niveau du nerf de la rate (nerf splénique);2- puis induire la maladie de Parkinson par injection d’une neurotoxine s; 3- puis réaliser ou non des sessions d'électrostimulation du nerf de la rate. La comparaison des scores cliniques entre les animaux ayant subi une électrostimulation du nerf splénique et ceux n'ayant pas subi cette électrostimulation nous permettra de déterminer l'effet de l'électrostimulation sur le développement de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante, présentant une toxicité potentielle moindre comparée aux molécules de type stéroïdien par exemple. Déterminer si l’électrostimulation inhibe les principales cellules immunitaires pathogéniques impliquées dans la maladie de Parkinson pourrait conforter l’utilisation de cette nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
Induction de la maladie de Parkinson: 480 animaux Les animaux subiront une anesthésie générale gazeuse et recevront une injection de neurotoxine, tous les jours pendant 5 jours consécutifs afin d’induire la pathologie. Implantation électrode : 288 animaux Les animaux recevront un analgésique 20 minutes avant l’opération puis subiront une anesthésie générale gazeuse pendant 20 minutes. Une électrode sera implantée au niveau du nerf splénique et les connecteurs seront fixés au niveau du crâne. La durée prévue de l’opération est de 20 minutes. Le lendemain del'opération, les animaux opérés recevront un traitement anti-inflammatoire non stéroïdien ( maintenu pendant les 3 jours suivants. Mesure de la coordination motrice: 384 animaux la coordination motrice est mesurée avec un appareil automatisé à tige tournante (rotarod). Les souris sont testées séquentiellement sur la tige tournante à huit vitesses incrémentales pendant 150 s maximum par vitesse. Une période de repos de 5 minutes a été prévue entre les vitesses successives afin d'atténuer le stress et la fatigue des animaux. Pas de prélèvement sur animaux vigiles, pas de prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
1- Nuisances associés à l’induction de la maladie de Parkinson par injection de neurotoxine : Dans ce modèle, la maladie de Parkinson est induite par injections sous-cutanée d'une neurotoxine. La neurotoxine appelé MPTP induit la perte des neurones dopaminergiques de la substance noire, ainsi qu’une diminution des quantités de dopamine dès le 3ème jour. La perte des neurones dopaminergiques est en partie due à l’induction de neuroinflammation par le MPTP. A partir du 15ème jour après la première injection de MPTP, un déficit moteur modéré apparaît qui se traduit par une diminution progressive de la coordinatation motrice. 2- Nuisances associées à l’électrostimulation : Il n’y a pas de douleurs associées à l’électrostimulation du nerf splénique car ce nerf n’est pas constitué de fibres nerveuses sensitives. La procédure d'implantation d'une électrode sur le nerf de la rate et l'électrostimulation chronique de ce nerf est réalisée de manière récurrente au sein de notre équipe depuis 2017. Une douleur d’une durée estimée à 48 heures est par contre engendrée par la procédure chirurgicale permettant l’implantation de l’électrode de stimulation sur le nerf splenique du fait de l’incision de la peau et du péritoine. Lors de l'électrostimulation les animaux seront séparés les uns des autres car la stimulation électrique requiert une connexion à un stimulateur électrique externe par un fil incompatible avec une stabulation en groupe pendant 30 jours (risques de rognage de fils).
Devenir
Afin de limiter au maximum les souffrances potentielles associées à l'évolution de la pathologie, l'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure
Remplacement
Ce type d’étude ne peut être envisagés que sur des organismes entiers préservant l’intégrité des interactions entre les systèmes immunitaires et nerveux dans un contexte pathologique et non pathologique.
Réduction
Les estimations du nombre d'animaux par condition expérimentale a été determiné par une approche statistique afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaire au bon déroulé de l’expérimentation et donc de limiter le nombre d’animaux.
Raffinement
Des mesures de raffinements seront mises en place afin de limiter au maximum les contraintes imposées aux animaux dans le contexte de cette étude : les interventions chirurgicales seront menées suivant un protocole d’anesthésie et d’analgésie en prenant soin de maintenir la température corporelle des animaux en les plaçant sur une couverture chauffante. Le suivi postopératoire inclura un traitement antalgique. Des grilles d’observation préétablies pour le suivi postopératoire et le suivi de l'évolution de la pathologie prévoient des mesures correctives et la mise en œuvre le cas échéant de points limites précoces et adaptés.
Choix des espèces
Ce type d’étude ne peut être envisagés que sur des organismes entiers préservant l’intégrité des interactions entre les systèmes immunitaires et nerveux dans un contexte pathologique et non pathologique. Le modèle souris a été choisi car c’est l’espèce animale de référence en Immunologie chez laquelle l’induction de la maladie de Parkinson par injection de MPTP a été bien caractérisée. Le projet portera sur des souris mâles C57Bl/6 âgées de 10 semaines permettant une chirurgie aisée (poids entre 20et 25 gr).
Mécanismes impliqués dans la plasticité des réseaux neuronaux de la corne dorsale : role des neuromédiateurs
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Sous anesthésie générale, 360 souris reçoivent une inflammation de la patte ou une opération témoin et 360 autres une lésion nerveuse, 100 recevant en plus quatre injections de tamoxifène. Au total, 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes anesthésiées puis tuées pour prélever leur moelle épinière. Le but est de comprendre comment le toucher devient douleur, en suivant l'activité des neurones de la corne dorsale chez des souris génétiquement modifiées porteuses d'un capteur calcique. Le porteur annonce deux jours de tests comportementaux avant l'induction du modèle puis trois semaines de tests après, sans préciser lesquels, et écrit qu'aucune procédure du projet n'entraîne d'effet indésirable majeur en dehors de la douleur qu'il provoque.
Objectifs
Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les autres neurones ? Comment l’information tactile se propage-t-elle à travers ce circuit ? En combinant des techniques de pointe – imagerie calcique en microscopie multiphotonique, enregistrements électrophysiologiques ciblés – chez des souris exprimant génétiquement un marqueur d’activité neuronale, nous visualiserons en temps réel la dynamique de l’activation de ce circuit et identifierons les neurones impliqués. Nous étudierons le rôle de neurotransmeteurs dans ces mécanismes de plasticité, notamment la sérotonine et l'ocytocine.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de comprendre le rôle des neuromodulateurs dans la plasticité des réseaux neuronaux spinaux en conditions physiologiques et pathologiques.
Procédures
Les animaux subiront entre 4 et 5 interventions au total (cf description annexe schématique du projet). Le groupe de souris CFA est composé de 180 Sham + 180 CFA = 360 animaux. Le groupe de souris neuropathiques est composé de 360 animaux. L'ensemble de ces animaux seront testés pendant 2 jours pour étudier leur comportement avant tout modèle de douleur, puis pendant 3 semaines une fois le modèle établi. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
Aucune des pocédures décrites dans ce projet, en dehors de la douleur induite dans les modèles de douleur, n'induit d'effets indésirables majeures. Les données de la littérature indiquent néanmoins une comorbidité anxio-dépressive dans les modèles de douleurs utilisés dans ce projet, comme décrit par les patients atteints de douleurs persistentes.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin d'analyser l'excitabilité neuronale de la corne dorsale. L'objectif du projet est d'étudier l'activité neuronale de la moelle épinière et les contraintes techniques de cette approche nécessitent de réaliser l'étude ex vivo.
Remplacement
Pour ce projet, l'utilisation de souris transgéniques permettant la visualisation de l'activité neuronale de la moëlle épinière est nécessaire. Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique.
Réduction
Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement, en accord avec le décret n° 2011-1177 du 23 septembre 2011 relatif à l'utilisation confinée d'organismes génétiquement modifiés. Les animaux sont stabulés dans des cages individuelles contenant au maximum 4 males ou 5 femelles et situés dans des portoirs ventilés, thermorégulés (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois toutes les 2 semaines. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé (lumière de 19h à 7h). Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal. Les procédures expérimentales impliquant une anesthésie et une analgésie se feront à l'aide de mélanges de Kétamine et de Xylasine. Les animaux seront suivis quotidiennement par les membres utilisateurs du projet, et seront euthanasiés en cas de points limites atteints, après consultation de la SBEA et selon le fascicule « la douleur de l’animal au cours d’une expérimentation », élaborée par le service communication de l’école Vétérinaire de Lyon.
Choix des espèces
Les souris transgéniques GCamp sont les seules espéces animales dotées d'un senseur calcique exprimé au sein de leurs cellules neuronales. L'utilisation d'autres marqueurs calciques exogènes est toxique pour les neurones qui y sont exposés et est donc peu recommendé pour l'étude de réseaux neuronaux physiologiques et physiopathologiques. Par ailleurs, seules les souris permettent à l'heure actuelle de cibler l'expression du senseur calciques dans des populations spécifiques de neurones spinaux. Adultes (P21-35) pour comparaison avec les autres données de la littérature
Rôle des vésicules extracellulaires dérivées du microbiote intestinal d’individus avec des troubles du spectre de l’autisme sur l’axe intestin-cerveau dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Vingt-cinq souris dites "inconnues", utilisées comme partenaires sociales dans un test de sociabilité, sont gardées vivantes et remises en circulation dans l'animalerie. Les 264 autres sont tuées, dans un projet où 289 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Gavées trois fois par semaine de vésicules issues du microbiote intestinal de personnes autistes, elles passent trois jours de tests de locomotion, d'interactions sociales, de gestes répétés et d'anxiété, puis une sonde introduite dans le rectum mesure leur sensibilité colique. Le porteur affirme que le lien entre intestin et cerveau ne peut s'étudier aujourd'hui que sur un modèle animal, alors qu'il décrit par ailleurs des travaux préalables menés sur cultures de neurones intestinaux et sur intestins isolés.
Objectifs
L’autisme regroupe un ensemble de troubles neurodéveloppementaux caractérisés par des déficits dans les interactions sociales et des centres d’intérêts restreints et répétitifs. Outre ces symptômes comportementaux, une grande majorité de personnes autistes (environ 70%) souffrent de symptômes digestifs, diarrhée, constipation, ballonnement, douleur abdominale. La corrélation entre la sévérite des symptômes digestifs et des troubles comportementaux souligne l'importance de l'intestin dans l’autisme. Ceci suggère également des mécanismes communs dans les dysfonctions des neurones de l'intestin (système nerveux entérique) qui régulent les fonctions digestives et ceux du cerveau. Un cofacteur important dans l’autisme est le microbiote intestinal. En effet, des modifications de la composition du microbiote intestinal ont été décrites chez les patients autistes par rapport à des sujets témoins. Des études fonctionnelles visant à déterminer l’impact de ces modifications ont montré que le transfert de microbiote humain provenant de sujets autistes chez la souris induisait des symptômes digestifs et comportementaux de l’autisme. Cependant, les mécanismes sous-jacents à ces effets sont encore inconnus, mais pourraient impliquer des vésicules extracellulaires. Les vésicules extracellulaires sont produites et libérées par tous types cellulaires, incluant les bactéries, et transportent des molécules signalétiques pouvant agir à la fois sur l’intestin et le cerveau. L’hypothèse du projet est que les vésicules extracellulaires produites par le microbiote intestinal altéré des autistes contribuent aux dysfonctions digestives et cérébrales. Le premier objectif est donc d’étudier la capacité des vésicules extracellulaires produites par le microbiote à induire chez la souris des symptômes digestifs et comportementaux pertinents de l’autisme. Nos données préliminaires obtenues in vitro montrent que les vésicules extracellulaires isolées à partir de selles de patients autistes augmentent l'expression d’une enzyme neuronale responsable de la libération du nitric oxide, un neurotransmetteur clé du système nerveux entérique et du cerveau, dont les voies de signalisation sont perturbées dans l’autisme. Ainsi, le 2e objectif sera d'explorer la contribution de cette voie de signalisation dans les effets induits chez la souris par les vésicules extracellulaires. Ce projet apportera des éléments novateurs dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’autisme.
Bénéfices attendus
L’autisme touchent environ 1% de la population mondiale et est en constante augmentation. Un frein pour le développement d’approche thérapeutique résulte d’un manque de connaissances des mécanismes physiopathologiques impliqués dans les troubles digestifs dans l’autisme. Bien que plusieurs éléments récents indiquent que des altérations du microbiote intestinal représentent un facteur important pouvant contribuer à l’autisme, les médiateurs impliqués dans les interactions entre le microbiote intestinal et les organes cibles de l’autisme, l’intestin et le cerveau, sont encore largement inconnus. En ciblant les vésicules extracellulaires, ce projet vise à mieux comprendre dans l’autisme les mécanismes d’interaction entre le microbiote intestinal d’une part, et l’intestin et le cerveau d’autre part. De plus, ce projet permettra d’identifier la voie nitrergique (neurotransmetteur nitric oxide) de l’hôte comme une cible potentielle des vésicules extracellulaires dérivées du microbiote de patients autiste. La voie nitrergique ayant été précédemment identifiée comme altérée dans l’autisme, ce projet permettra de proposer un mécanisme reliant l’altération du microbiote intestinal de patients autiste avec les dysfonctions digestives et cérébrales. Cette étude présente un intérêt non seulement pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’autisme, mais également dans la perspective d’un traitement thérapeutique basé sur l’utilisation de vésicules extracellulaires comme postbiotiques.
Procédures
Pour chaque procédure, lors des études comportementales et fonctionnelles digestives, nous réaliserons : - Un gavage sera réalisé 3 fois par semaine (un jour sur deux) avec une solution de vésicules extracellulaires (2min). - Injection d'un traitement visant à inhiber la signalisation nitrergique, une fois par jours pendant 7 jours (2min). - Des tests comportementaux sur 3 jours seront effectués sur les souris : Jour 1: un test mesurant la locomotion des souris de 15min et un test mesurant les interactions sociales de 35min. Jour 2: un test mesurant les gestes répétés de 15min et un test mesurant l’anxiété de 15min. Jour 3: un prélèvement d’un échantillon de sang à la base de la queue - un prélèvement des selles tous les ¼ d’heure sur 2 heures. - un test permettant de mesurer la sensibilité colique par une petite sonde introduite dans le rectum (30min).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendues sur les souris sont faibles. Cependant, du stress et de la douleur peuvent être générés par les différentes procédures expérimentales (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux). Par ailleurs, l’administration de vésicules extracellulaires et de métabolites bactériens de patients avec troubles digestifs sont susceptibles d’induire chez la souris des douleurs abdominales et des troubles gastro-intestinaux. Tous ces signes seront observés quotidiennement au cours du traitement.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort, sauf les 25 souris dites « inconnues » utilisées pour le test des 3 chambres seront gardées en vie et réutilisées au sein de l'animalerie. Pour les souris mise à mort, les intestins et le cerveau seront prélevés et des mesures ex vivo de motricité colique et de perméabilité colique seront effectuées ainsi que des analyses supplémentaires de biochimie (protéines, tissus et ADN pour mesurer des marqueurs de neurones) et des marquages immunohistochimiques
Remplacement
L’étude du lien entre les systèmes nerveux central et entérique, dans un contexte de neurodéveloppement physiopathologique, nécessite une étude comportementale qui ne peut, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, notre étude sur l’autisme mettant en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, microbiote intestinal...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée seulement par une approche in vitro, justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer la complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.
Réduction
Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin et ex vivo sur des intestins isolés nous ont permis de mettre en évidence que les vésicules extracellulaires provenant de selles humaines ont une bioactivité sur les neurones entériques et de réduire significativement le nombre d’animaux qu’il aurait fallu pour examiner les effets potentiellement sur le système nerveux entérique. Parallèlement, des expérimentations similaires menés chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80%.
Raffinement
Le bien-être animal sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Nous recevrons les souriceaux une semaine avant le début du traitement. Les animaux seront hébergés collectivement (max 5) dans des cages avec frisottis et tunnels ou dômes plastiques transparents rouges. L’évaluation des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique (pelage, posture), activité, comportement, fréquence respiratoire). Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés 3 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, des points limites sont mis en place
Choix des espèces
Une de nos études préliminaires a montré que l’administration du microbiote intestinal des patients autistes de cette même cohorte induisait des troubles gastro-intestinaux chez la souris. Le but ici est de déterminer si les effets observés impliquent les vésicules extracellulaires du microbiote intestinal dans ce même modèle. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie juste après le sevrage (21/22 jours) et gardées une semaine en acclimatation avant le début des gavages. Ce stade correspond à un stage enfant/adolescent cohérant avec le fait que l’autisme est une pathologie du neurodéveloppement. Par ailleurs, le système nerveux entérique étant encore plastique pendant la période de l’enfance et adolescence, étudier l’impact des vésicules extracellulaires sur le remodelage du système nerveux entérique est plus pertinent à ce stade du développement.
Rôle d’une protéine du système nerveux central dans les traumatismes de la moelle épinière
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une grille de score fixe le seuil de souffrance à partir duquel les souris sont tuées avant terme. Au total, 176 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la moitié et sévère pour l'autre, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Parmi elles, 88 subissent une hémisection de la moelle épinière sous anesthésie, avec paralysie d'une patte arrière, perte du contrôle urinaire et risque d'escarres, et 80 reçoivent des injections quotidiennes pendant les sept jours qui suivent. L'objectif est de voir si l'absence d'une protéine de la cicatrice médullaire améliore la récupération, et le porteur justifie l'emploi d'animaux adultes par le fait que les jeunes récupèrent trop spontanément pour permettre des statistiques fiables.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière (LME) touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs chroniques. Bien que les LME touchent des personnes relativement jeunes (moyenne d’âge à 40 ans), le nombre de patients plus âgés est en nette croissance dans les pays industrialisés. L’étude de cette pathologie représente un enjeu majeur. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une LME. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une LME. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle à la transmission des informations depuis le cerveau au reste du corps ainsi que du corps vers le cerveau. Nous voulons étudier si l’absence d’expression de l’un des facteurs associé a cette cicatrice favorise une meilleure récupération après une lésion de la moelle épinière.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière (LME) induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement permettant de soigner les patients. Développer des travaux visant à favoriser la récupération après lésion de la moelle épinière représente donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Les lésions de la moelle épinière étant d’origines variées chez l’homme (section par arme blanche, choc et écrasement…) nous utilisons des modèles similaires chez l’animal car ils représentent actuellement l’approche expérimentale la plus pertinente pour comparer à la pathologie humaine. Nous cherchons à caractériser les conséquences de l’absence d’expression d’une protéine du système nerveux au niveau de la moelle épinière dans un contexte physiologique et pathologique tant sur le plan cellulaire et tissulaire que comportemental. Nous obtiendrons des informations sur le rôle de cette protéine qui reste méconnu à ce jour et l’étude à différents temps après lésion permettra de déterminer précisément son importance à la fois juste après lésion moelle épinière mais également longtemps après chez les deux sexes et d’envisager des stratégies appropriés pour une approche visant à développer des thérapies adaptées.
Procédures
Tout ou partie des animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale et analgésie (30 min ; n=88) . Les animaux seront évalués au niveau comportemental (n=96) pour déterminer les fonctions motrices et évaluer l’anxiété avant et après lésion de la moelle épinière. L’évaluation comportementale analysera l’activité motrice spontanée durant 8 minutes, la marche et la coordination des animaux durant 10 minutes et la force d’agrippement des animaux (2 minutes par animal par session). Les manipulations peuvent engendrer un stress léger. Les tests seront faits 7 jours et 24 heures avant la lésion, puis à J3, J5, J7, J10 et J14 postopératoire puis 1 fois par semaine jusque 6 semaines post-opératoires. Les comportements de type anxieux seront évalués par des tests qui évalue la qualité du nid fait par un animal durant 24 heures, le temps de toilettage durant 5 minutes, et le temps que met l’animal à aller au contact de la nourriture durant 5 minutes. Ces tests seront effectués deux fois, au début et à la fin de la procédure. Une partie des animaux (n=80) recevra des injections quotidiennes (moins d’1 minute) en intra-péritonéal durant 7 jours juste après la lésion, ou à un âge équivalent pour les animaux non lésés. Tous les animaux recevront une injection en sous cutanée d'anesthésique local (moins de 1min) puis une injection en intra-péritonéal d’anesthésique (moins d'1 minute) afin de procéder aux prélèvements de tissus post-mortem.
Impact sur les animaux
Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée. Les injections quotidiennes en intra-péritonéal peuvent induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion de la moelle épinière (hémisection). Une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré après une hémisection, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Suite à la chirurgie les animaux sont observés quant au développement de signes légers relatifs à la détérioration de l’état de santé de l’animal. 24-48hrs suivant la lésion, les animaux peuvent présenter des signes de douleurs. Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de dominance peuvent être observés. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Devenir
A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques et cellulaires.
Remplacement
Pour éviter l'expérimentation animale, on encourage l'utilisation de cultures de cellules nerveuses. Cependant, ces cultures ne peuvent pas reproduire entièrement la complexité des organismes vivants. Les modèles animaux de traumatisme de la moelle épinière sont actuellement considérés comme la méthode la plus adaptée pour étudier cette pathologie, car ils reproduisent de manière fidèle les différents aspects pertinents chez l'humain. Ces modèles permettront d'explorer les changements provoqués par l'absence d’expression d’une protéine du système nerveux et faciliteront l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. L'utilisation d'animaux est nécessaire à cette étape préclinique et demeure cruciale pour envisager des applications cliniques.
Réduction
Les animaux sont utilisés pour plusieurs analyses, les deux sexes sont utilisés. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire. Nous avons également calculé le nombre d'animaux avec un logiciel de biostatistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant des effectifs pertinents pour répondre à notre hypothèse biologique
Raffinement
Les croisements sont effectués de manière à éviter d’effectuer du génotypage qui est une source de stress pour les animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont croisés entre eux et les animaux sauvages également . Les deux souches sont sous le même fond génétique. Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants et d'analgésiques adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées. Afin de réduire la souffrance : soins quotidiens spécifiques. L'absence de signes anormaux sera vérifié 2 fois par jour après la lésion. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les LME, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Ces souris génétiquement modifiées n’expriment pas une protéine du système nerveux central. Cela en fait donc un modèle de choix pour déterminer les conséquences de l’absence de cette protéine dans un contexte physiologique et après une lésion médullaire. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 1, 2 ou 6 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée non seulement plus importants mais surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique.
Mécanismes régulant la migration neuronale chez la souris: rôle du cil primaire et cas du Syndrome de l’X Fragile
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Endormis par le froid, injectés dans le cerveau pendant cinq minutes, réchauffés sur un tapis à 37 degrés puis rendus à leur mère, des souriceaux nouveau-nés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent en parallèle une opération sous anesthésie générale, jusqu'à une heure, pour introduire du matériel génétique dans le cerveau de leurs embryons. Le projet compte 504 souris, toutes tuées quelques jours après l'intervention, mères gestantes et embryons compris. Ces mises à mort permettent de filmer la migration des neurones sur tranches de cerveau vivant, le porteur indiquant que les analyses ne sont réalisables que post mortem.
Objectifs
La migration neuronale est une étape fondamentale du développement du système nerveux qui permet la mise en place de circuits neuronaux fonctionnels. Des défauts de migration neuronale conduisent à des malformations cérébrales et sont impliquées dans des maladies psychiatriques. Il est donc crucial de comprendre les mécanismes qui régulent la migration neuronale aussi bien d’un point de vue fondamental qu’appliqué. Nous avons découvert récemment un mécanisme entièrement nouveau de régulation de la migration neuronale. Nos objectifs sont à présent de disséquer dans son intégralité la voie de signalisation impliquée, son lien avec le cytosquelette des neurones migrants ainsi que son existence chez l’embryon. Nous nous intéressons également aux défauts de cette voie dans le cadre du Syndrome de l’X Fragile, 1ère cause héréditaire de déficit intellectuelle. Dans ce syndrome, l’absence de la protéine FMRP (Fragile X Messenger Ribonucleoprotein) entraine une série de défauts neurodéveloppementaux associées à des déficits de plasticité neurale adulte. Les défauts de migration neuronale dans cette pathologie restent peu connus jusqu’alors. Ces études mettront donc en évidence des mécanismes fondamentaux jusqu’alors inconnus de régulation de la migration neuronale, ce qui est essentiel pour comprendre le développement du cerveau en conditions physiologiques et pathologiques, y compris dans le cadre du syndrome de l’X Fragile.
Bénéfices attendus
Ces études mettront donc en évidence des mécanismes fondamentaux jusqu’alors inconnus de régulation de la migration neuronale, ce qui est essentiel pour comprendre le développement du cerveau en conditions physiologiques et pathologiques, y compris dans le cadre de l’X Fragile. Ce type d’analyse de la migration neuronale sur coupes de tissu vivant est extrêmement informatif, apportant des informations uniques qui reste inaccessibles par d’autres types de techniques.
Procédures
Des souris post-natales seront soumises à une procédure visant à l’introduction de matériel génétique dans leurs cerveaux. Pour ce faire, elles seront temporairement endormies par le froid, ce qui sera suivi de la procédure principale qui durera environ 5 minutes. Les souris reprendront conscience sur un tapis chauffant à 37°C avant de retourner dans leur cage auprès de leur mère. Ces souris seront euthanasiées quelques jours après pour pouvoir filmer la migration des cellules modifiées par différentes techniques comme le film sur tissu vivant ou le marquage de protéines sur tissu fixé. Parallèlement, des souris gestantes seront impliquées dans une procédure spécifique permettant l’introduction de matériel génétique dans le cerveau de leurs embryons. Pendant cette intervention, elles seront sous anesthésie générale induite par un gaz inodore et analgésie. Un maintien de la chaleur sera assuré tout au long de la procédure, qui ne devrait pas dépasser une heure. Ces souris se réveilleront rapidement après l'arrêt de l'anesthésie. Les embryons seront euthanasiés (en même temps que la mère gestante) quelques jours après afin d’analyser la migration de leurs neurones sur tissu vivant ou fixé. Les procédures d’euthanasie respecteront des normes éthiques rigoureuses.
Impact sur les animaux
Le projet peut impacter, de manière limitée, les 5 libertés fondamentales de l’animal, notamment induire des éléments de stress physique et thermique lors des expérimentations. La méthode d’introduction des mutations chez les nouveau-nés implique l’anesthésie par le froid. L’introduction de mutation chez l’animal postnatal et l’embryon impliquent une chirurgie. Les procédures de chirurgie peuvent provoquer une douleur pendant 24/48h malgré l’utilisation d’analgésiques. Néanmoins, elles sont indispensables à notre projet car seules cette technique permet d’introduire les multiples mutations dont nous avons besoin pour analyser notre système de migration.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés car les analyses expérimentales envisagées ne peuvent être réalisées que post-mortem.
Remplacement
Nous souhaitons explorer le déplacement des neurones dans le cerveau des souris à différents stades de leur vie, que ce soit après la naissance ou pendant la période embryonnaire. Notre objectif est de comprendre comment ces cellules se déplacent dans un environnement complexe, avec des influences provenant d'autres cellules du cerveau. Cette étude nécessite une approche spéciale d'imagerie sur tranche de cerveau pour préserver les conditions naturelles dans lesquelles ces cellules se déplacent. Bien que nous utilisions parfois des cultures d'explants dans du matrigel pour certaines expériences in vitro afin d'analyser le déplacement des cellules, il est important de noter que ces cultures ne peuvent pas reproduire la complexité totale de l'environnement naturel des cellules dans le cerveau. Dans le cadre de nos expériences, nous introduisons des modifications génétiques chez les animaux avant d'utiliser un système in vitro pour analyser leur migration. L'objectif ultime est de mieux comprendre le développement cérébral dans des conditions aussi proches que possible de la réalité.
Réduction
Le projet impliquera un total de 504 souris. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de nid végétal. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive en respectant des points limites et des soins adaptés en terme d'anesthésie et d'analgésie.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix, reconnu comme tel sur la scène internationale, pour étudier la migration neuronale chez l’animal postnatal et chez l’embryon. De plus, les techniques de manipulation génétique que nous utilisons chez la souris sont robustes et reproductibles. Pour étudier la migration postnatale, nous utilisons des souris post-natales Pour étudier la migration embryonnaire, nous utilisons des souris embryonnaires. Ce sont des modes de migration qui se ressemblent mais qui peuvent présenter des différences qu'il est important de comprendre pour mieux comprendre le développement du cerveau dans des conditions physiologiques ou pathologiques.
Shadow imaging in vivo pour l’étude du milieu extracellulaire et la perfusion intracardiaque
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chacune des 2 718 souris de ce projet subit l'ouverture du crâne et la pose d'une fenêtre d'imagerie de trois millimètres sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Pour 420 d'entre elles s'ajoutent un traumatisme crânien ou l'implantation de cellules tumorales et jusqu'à deux injections dans l'arrière de l'œil, afin d'observer comment se déforme l'espace situé entre les cellules du cerveau. Les souris sont tuées pour prélever le cerveau entier, à l'exception de celles qui portent un dispositif d'injection implanté, que le texte annonce maintenues en vie. La réduction du nombre d'animaux repose, selon le porteur, sur l'emploi des mâles comme des femelles et sur "des années d'expérience", sans qu'aucun calcul ne vienne justifier ces 2 718 souris.
Objectifs
Environ 25% du volume cérébral est occupé par l'espace extracellulaire (ECS) qui correspond à l’espace se trouvant entre les cellules et qui sert d’environnement à l’échelle microscopique pour le cerveau et forme un chemin de communication chimique entre les cellules. Il a été montré que la structure et la diffusion de l'ECS sont composés d’éléments de nature différentes et qu'elles dépendent de conditions internes et externes, telles que le système de sommeil/éveil ou d’un œdème cellulaire provoqué par un traumatisme cérébral. De plus, l’ECS fournit un réservoir pour les ions impliqués dans l'activité électrique des neurones et joue un rôle clé dans la transmission de substances entre les cellules. Ainsi, l’ECS n'est pas seulement le siège de toutes sortes d'interactions cellule-cellule, mais peut également jouer un rôle important dans des fonctions neuronales cruciales, telles que la mémorisation ou la formation de circuits neuronaux. Afin de visualiser la structure de l'ECS à très petite échelle (nanomètre), nous utiliserons une nouvelle approche d'imagerie, à savoir la technique de Shadow imaging (SUSHI). C'est une méthode de marquage où un produit fluorescent est injecté localement dans le cerveau afin de visualiser l’ECS avec une très haute résolution. En outre, comme le produit fluorescenr ne pénètre pas les cellules saines, toutes les cellules apparaissent en noires, ce qui permet d'imager également la structure anatomique des cellules non marquées. Cette méthode présente de grands avantages puisqu’elle n’est pas sensible à la perte de fluorescence de la molécule (la diffusion du produit fluorescent permet de maintenir un signal constant) ni à la toxicité (puisque le produit fluorescent reste en dehors des cellules). Dans ce projet, nous comptons tester plusieurs produits fluorescents qui présentent tous une gamme de longueur d’onde proche de celui de la GFP (Protéine fluorescente verte) et ne pénètrent pas les membranes cellulaires.
Bénéfices attendus
Cette technique sera utilisée pour imager l’ECS au travers d’un dispositif d'imagerie posée soit sur le cortex soit sur l’hippocampe (petite partie du cerveau qui sert pour la mémoire, le comportement et certaines émotions). Partant de là, nous nous proposons d'effectuer des séances d'imagerie répétées d’un même animal pour cartographier, sur animal vivant et avec une résolution spatiale inédite, la morphologie de l’ECS et caractériser la dynamique (quelques minutes à quelques semaines) des structures fines de l’ECS afin de voir les interactions cellule/cellule à l'échelle des circuits intégrés.
Procédures
Toutes les souris auront la pose d'un dispositif d'imagerie (2718 souris). Pour avoir ce dispositif il faut procéder à une chirugie sur animal endormi qui dure environ 1h avec utilisation de produits anti douleur. Un dispositif d'imagerie de 3mm de diamètre sera fait dans le crâne de la souris et une lamelle sera posée dessus afin de protéger le cerveau de l'extérieur. 1770 souris auront une injection directe dans le cerveau pendant qu'elles seront endormies. L'injection prendra environ 15 minutes et sera faite qu'une seule fois sur ces souris. 948 souris auront une pose d'un dispositif implantatoire dans le cerveau permettant d'injecter plusieurs fois le produit fluorescent. Ce dispositif implantatoire sera posée pendant la chirugie pour le dispositif d'imagerie. Chaque souris de ce groupe aura un dispositif implantatoire et plusieurs injections dans le temps d'une durée de 15 minutes environ chacune. Une injection rétro-orbitales sera faite sur 420 souris. Une injection par oeil et 2 injections par animal au maximum. L’induction d’un traumatisme cranien (impact fait en une fraction de secondes) et l’induction de cellules tumorales (une dizaine de minutes) sera faite sur un total de 420 souris. Toutes les souris auront une préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires après une ou plusieurs injections injection (si la souris a un dispositif d'injection ou non). Cette préparation des tissus se fera sur animal endormi avec utilisation d'anti douleur. L'animal sera ensuite euthanasié et le cerveau sera récupéré.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et l'induction du traumatisme cranien et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies, injection retro-orbitale et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. Le risque de rejet des animaux non sevrés et le stress de la séparation peuvent également entrainer une nuisance ou un effet indésirable.
Devenir
Les souris subissant la préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires seront euthanasiées à la fin de l'expérimentation afin de prélever le cerveau entier. Les souris ayant subi une chirurgie pour l'implantation d'un dispositif d'imagerie seront utilisées pour la microscopie puis euthanasiées à la fin de l'expérimentation si elles ne sont pas utilisées pour la préparation des tissus. Les souris ayant un dispositif implantatoire seront maintenues en vie.
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. L’objectif de ce projet étant de caractériser l’ECS dans les conditions les plus naturelles possibles, cette étude ne peut être réalisée de manière pertinente avec des modèles sur ordinateurs (in silico) ou sur micro-organismes, organes ou cellules en dehors de leur contexte naturel (in vitro). Le microscope sera, dans un premier temps, validé en imageant de toutes petites particules (nanoparticules) fluorescentes. Toutefois, ces échantillons ne permettent pas réellement de reproduire l’ensemble des paramètres optiques observés dans les échantillons biologiques. C’est pourquoi une seconde étape de validation dans des tranches organotypiques (tranches de partie de cerveau sur une lamelle) apparait cruciale pour optimiser les conditions d’imagerie qui seront utilisées à terme pour l’imagerie sur animal vivant (in vivo).
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode de production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'Homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'Homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'Homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 1 et 21 jours. Puis sur ces mêmes animaux de 2 à 6 mois, période qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une meilleure reproductibilité des résultats.
Mise en place d’un modèle de stress infantile chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Aspergées d'urine de mâle, séparées de leurs petits dix minutes par jour ou livrées six jours de suite à des mâles agressifs, des souris mères vont être utilisées pour provoquer un traumatisme précoce chez leurs souriceaux. Au total, 964 souris sont engagées dans ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 510 d'entre elles et sévère pour 454. Les souriceaux passent ensuite des tests d'anxiété, d'anhédonie et de résignation, à l'adolescence puis à l'âge adulte, avant que 454 souris soient tuées, les mères, les petits et trente mâles agressifs rejoignant l'élevage ou d'autres expériences. Le porteur écrit que l'analgésie et le renforcement positif ne peuvent être envisagés, puisque la douleur psychique visée forme la base même du modèle.
Objectifs
Les expériences de vie précoce pendant l’enfance, qu’elles soient positives ou négatives, peuvent laisser des traces indélibiles sur le cerveau et le développement psychologique. En effet l’exposition précoce à des traumatismes psychosociaux, incluant entre autres la maltraitance infantile, est indiscutablement l’un des plus importants facteurs prédicteurs de pathologies psychiatriques à l’adolescence et à l’âge adulte, notamment de la dépression et du suicide. Différents modèles animaux chez la souris ont été mis en place pour étudier les conséquences du stress précoce sur le développement cérébral et psychologique, mais ces modèles se concentrent principalement sur des périodes tardives du développement (après le sevrage), et nos connaissances des effets à long terme sur le cerveau du stress infantile sont extremement limitées. Nos connaissances des mécanismes cellulaires participant à la formation et à la persistance des mémoires traumatiques précoces sont aussi très lacunaires. Afin d’étudier ces mécanismes, nous nous proposons ici de mettre en place et de tester la validité d’une procédure de stress indirect (l'expositition indirecte de souriceaux à l'agression physique de leur mère) basée sur l’experience sensorielle et la contagion émotionnelle, pouvant mimer chez la souris un traumatisme psychologique infantile avant le sevrage des animaux. Nous testerons finalement comment cette expérience peut precipiter la survenue de comportements de type anxieux et dépressifs à l’adolescence et l’age adulte.
Bénéfices attendus
Il n’existe actuellement aucun modèle animal permettant d’étudier les conséquences du trauma infantile sur le cerveau. Pour autant, l’adversité précoce est sans conteste le premier facteur de vulnérabilité pour les maladies psychiatriques telles que la dépression, les troubles anxieux, le syndrome de stress-posttraumatique, et pour le suicide. Outre la souffrance morale induite par ces pathologies, elles constituent un enjeu majeur de sante publique compte tenu du fardeau socio-économique engendré. Ces pathologies sont difficiles à prendre en charge, avec des traitements qui sont actuellement peu satisfaisants en termes de cout et d’efficacité. La mise en place d’un modèle pertinent de trauma psychosocial infantile permettrait dans ce cadre de mieux comprendre, d’un point de vue fondamental, comment le stress précoce affecte le cerveau et son développement. Cela permettrait également de disposer d’un outil pertinent pour étudier les mécanismes cellulaires mis en jeu dans la formation et la persistance des mémoires traumatiques précoces, et comment elles influent notre comportement. Si l’objectif à court terme de cette recherche fondamentale n’est pas la mise au point d’un outil thérapeutique visant à améliorer la prise en charge de populations cliniques victimes de trauma psychosocial pendant l’enfance, il est certain qu’une étape indispensable vers cet objectif est la compréhension des mécanismes neurobiologiques mis en jeu.
Procédures
- 8 mères ne subiront aucune manipulation (groupe contrôle) - 16 mères subiront une aspersion d'urine de mâle. - 16 mères subiront une séparation de leurs petits de 10 min pendant 6 jours. - 16 mères seront exposées à des comportements antagonistes (défaite sociale) durant 10 min et répétés sur 6 jours - 16 mères seront aspergées d'urine de mâle et isolées 10 min de leur petit, et cela, à un rythme d'une fois par jour sur 6 jours. - 60 mâles seront utilisés pour sélectionner des individus agressifs. - 40 souris sentinelles seront utilisées pour sélectionner des individus agressifs. - 360 petits seront pesés soit entre 3 et 8 jours postnatal soit entre 14 et 21 jours apres la naissance. - 160 petits seront utilisés dans des tests comportementaux, deux fois par test (une fois pendant l'adolescence, l'autre fois à l'age adulte). Ces tests sont effectués au cours de sessions uniques, allant de 3 à 10 minutes, et visent à mesurer les comportements sociaux, les conflits motivationnels et l'anxieté, l'anhédonie et la résignation des animaux.
Impact sur les animaux
Le modèle de défaite sociale (DS), qui consiste à être exposé à des comportements antagonistes de facon répetée induira de la douleur physique chez les mères sujettes directement au modèle. Il induira également de la douleur psychique, un état de stress aigu pendant la procédure mais aussi durable, en induisant possiblement un phénotype anxiodépressif chez les souris exposées au modèle. Cette douleur psychique est la base du modèle, l’objectif étant d’étudier comment ces changements comportementaux sont transmis aux souriceaux des mères exposées ou modifient leur comportement. L’exposition indirecte à la défaite sociale des souriceaux n’aura aucune incidence d’un point de vue physique, puisqu’elle n’est effectuée que sur les mères. Il est possible cependant que dans l’éventualité où la DS perturberait le comportement maternel, cela induise une détresse physiologique et sensorielle des souriceaux en diminuant la qualité des soins fondamentaux promulgués par leur mère. C’est pour cette raison qu'une attention particulière sera donnée au monitoring des souriceaux et du comportement maternel tout au long du protocole. Par ailleurs si notre hypothèse est validée, il est possible que le modèle induise chez les souriceaux une détresse psychique liée au stress, ce qui est notre objectif, afin d’étudier les substrats neurobiologiques et conséquences comportementales de ce stress. Etant donné que les tests de comportement sont basés sur des mesures quantitatives ou qualitatives d’exploration dans des dispositifs nouveaux et donc possiblement anxiogènes, il est possible que les tests utilisés puissent induire un stress léger chez les animaux. Ces tests sont cependant de courtes durées (10 minutes maximum), et ne sont pas basés sur des situations hautement aversives. Ces tests ne sont d’ailleurs pas connus pour induire de changements physiologiques ou comportementaux durables chez les animaux.
Devenir
Pour la validation du modèle, tous les animaux experimentaux (400 souriceaux et 80 femelles) seront réaffectés à notre élevage de souris (à condition que nos résultats ne montrent aucune atteinte au comportement maternel), afin de permettre la génération de nouveaux souriceaux. Les souris agressives utilisees pour la defaite sociale (nous estimons à la moitié le nombre de souris qui rempliront les critères d'agressivité, soient 30 souris) seront par ailleurs maintenues en vie pour de futures experiences de défaite sociale. Les souris sentinelles servant à selectionner les souris agressives, les souris non agressives, et toutes les souris utilisées pour etudier les effets du modèle sur le comportement seront mises à mort à la fin des expériences.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des zones cérébrales impliquées dans la réponse au stress et les émotions.
Réduction
Nous souhaitons ici pouvoir évaluer une taille d’effet forte et être confiants dans les effets que nous observons, garantissant ainsi la fiabilité de nos conclusions et la reproductibilité future du modèle. Nos effectifs intègrent donc le fait de pouvoir comparer statistiquement les groupes expérimentaux pour les différentes variables comportementales (témoins, DS susceptibles : c’est-à-dire qui ont un comportement altéré à la suite du modèle de DS, DS résilients : qui ne présentent pas de modification comportementale à la suite du modèle). Basé sur la literature des effets comportementaux du stress et des changements neurobiologiques qui y sont associés, un dimorphisme sexuel est suspecté. C’est pourquoi nous utiliserons à la fois des males et des femelles en considerant ici le sexe comme une variable d’analyse. Seuls les mâles agressifs sélectionnés pourront être réutilisés pour la suite des expériences. Les effets du modèle sur le comportement des souriceaux sera testé à la fois à 22 jours et à l’âge adulte (63 jours) sur les mêmes souris, plutôt que d’utiliser des cohortes différentes pour ces différents temps de mesure, diminuant ainsi le nombre d’animaux utilisés. En l’absence d’effet délétère sur le comportement maternel et la survie des souriceaux, les animaux utilisés pour la validation du modèle pourront réintégrer l’élevage. Les tests statistiques seront adaptés à de petits effectifs expérimentaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimisées avec la mise à disposition de plusieurs supports pour la construction des nids (carton, coton, papier) et de bâtons de bois pour favoriser le comportement de ronger qui est important pour cette espèce (Raffinement hébergement). Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure seront réalisées avant les tests comportementaux. Les mères seront habituées à la manipulation au moins une semaine avant la naissance des petits. Les jeunes seront manipulés avec douceur et par des personnes habituées à manipuler des jeunes souriceaux. Nous incluons ici une procédure pilote en trois étapes pouvant chacune donner lieu à un arrêt total des expériences. La phase du projet étudiant l’impact de la DS indirecte sur les jeunes sera uniquement lancée si nous n’observons aucune surmortalité des petits par rapport aux mères contrôles au cours de cette procédure pilote (Raffinement des procédures). Des grilles d’évaluation de la douleur physique et de la qualité des soins maternels ont été créées pour définir précisément les points limites. Ce modèle visant à induire des atteintes psychiques, l’analgésie et le renforcement positif, ou tout traitement pouvant interférer avec l’étude ne peuvent être envisagés (réduction des douleurs physiques et psychiques associées aux procédures).
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris et la possibilité d’utiliser des animaux transgéniques permettant l’utilisation d’outils de neurosciences intégratives font de la souris le modèle animal le plus pertinent. Des souris OGM (phénotype non-dommageable) seront utilisées permettant d’induire l’expression permanente d’un rapporteur fluorescent dans les neurones activés pendant une fenêtre temporelle précise. Le choix de cette lignée est donc motivé par le fait que si notre modèle induit un phénotype robuste chez la descendance des souris exposées à la défaite sociale, elle nous permettra de visualiser les neurones activés pendant la défaite sociale, et d’étudier plus en avant la formation, la consolidation et le rappel de cette trace mnésique, ce qui est un objectif à long terme de ce projet. Par ailleurs des souris non-OGM classiquement etudiées seront utilisées afin de s'assurer que le modèle est viable sur une lignée bien caracterisée, avant la mise en place du modele sur les souris transgeniques. Les mâles agressifs seront d’anciens reproducteurs adultes, car c’est à cet âge que le comportement agressif est le plus marqué. Les souris femelles « sentinelles » seront âgées de 8 semaines (même âge que les mères qui seront utilisées pour la validation du modèle et la mesure de ses effets comportementaux). Mères expérimentales: jeunes adultes (8 semaines) ce qui est nécessaire pour la mise à la reproduction. Progéniture des mères expérimentales : de 3 jours après la naissance à l’âge adulte, car le modèle vise à induire un stress postnatal très précoce, pendant la période infantile. Les effets comportementaux du modèle seront testés après sevrage (à 21 jours) et à l’âge adulte (à 63 jours), puisque nous souhaitons connaitre les conséquences comportementales à long terme du modèle.
Conception d’un berceau IRM innovant et mise au point d’un protocole d’entraînement adapté pour l’acquisition IRM sur rongeurs éveillés.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 64
Deux heures de chirurgie pour fixer un support sur le crâne, jusqu'à quarante séances d'IRM en contention sur six à huit mois, une prise de sang par semaine pendant deux mois : 64 souris et 64 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certains reçoivent en plus une injection de virus fluorescent dans le cerveau pendant l'opération. Le projet est présenté comme une amélioration du bien-être des animaux non-humains, puisqu'il vise un berceau d'IRM plus confortable que les barres d'oreilles habituelles, et les prises de sang hebdomadaires dosent l'hormone du stress. Tous les rongeurs sont tués à la fin pour chercher dans leur cerveau les marqueurs moléculaires de ce même stress.
Objectifs
L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technologie très courante. Une de ces applications, appelée IRM fonctionnelle (IRMf), permet d’obtenir des évaluations non invasives de l’activation cérébrale rendant ainsi possible un suivi à long-terme. Le développement de cette technique chez le rongeur, avec le but d’établir une cartographie fonctionnelle de leurs fonctions cognitives, permettra d’établir un lien avec la recherche humaine. Pour cela, il est nécessaire d’effectuer les mêmes modalités d’imagerie et dans les mêmes conditions physiologiques chez les rongeurs et dans l’espèce humaine. Jusqu’à présent, les contraintes liées à l’IRMf notamment en terme d’immobilité, ont conduit essentiellement à la réalisation de protocoles sur rongeurs anesthésiés. Cependant, l'utilisation d'anesthésiques pendant l'IRMf empêche toute investigation sur les modalités de traitement des informations par le cerveau de façon consciente . La réalisation d'études chez des animaux non anesthésiés présente donc un intérêt majeur. Nous souhaitons construire un tout nouveau berceau IRM qui sera utilisé dans un protocole d’habituation pour l'adaptation des rongeurs à l'environnement du scanner, améliorant ainsi le bien-être animal et permettant d’obtenir des résultats non biaisés par un état de stress et limitant le nombre de rongeurs nécessaires par étude car induisant une diminution des variabilités inter individus. Ce nouveau berceau sera jugé sur l’amélioration du confort des animaux lors des acquisitions IRMf et la diminution de leur niveau de stress. Les animaux seront maintenus à l’intérieur du berceau à l’aide d’un système de fixation implanté sur le dessus du crâne et évitant donc l’utilisation de la contention par des barres d’oreilles. De plus, l’innovation majeure de notre berceau sera la présence d’un tapis roulant placé dans le berceau qui permettra aux rongeurs de marcher à l’intérieur de l’IRM lors des sessions, ce qui aura pour effet de limiter leur niveau de stress. Une fois l’animal mis en confiance avec son environnement, il augmentera alors ses périodes d’inactivité pendant lesquelles les acquisitions IRM pourront avoir lieu.
Bénéfices attendus
L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technologie d’imagerie médicale aujourd’hui très développée et répandue. Une de ces applications, appelée IRM fonctionnelle (IRMf), permet de visualiser, de manière indirecte, l’activité cérébrale. L’IRMf est un outil performant pouvant être utilisée sur un grand nombre d’animaux, ce qui en fait un pont majeur vers la recherche humaine. Le développement de cette technique chez le rongeur afin de pouvoir dresser une cartographie fonctionnelle des fonctions cognitives complexes et donc essentiel pour ensuite établir un lien translationnel entre la recherche animal et humaine. Cela nécessite que les acquisitions se déroulent dans les mêmes conditions à la fois chez l’homme et chez l’animal pour qu’une comparaison puisse se faire. Les acquisitions IRMf chez l’homme se font chez des patients éveillés c’est pourquoi la réalisation d'études chez des animaux non anesthésiés présente un intérêt majeur. De plus, les quelques exemples d’IRMf de rongeurs éveillés sont réalisés dans des conditions stressantes pour l’animal (fixés par des barres d’oreilles, maintenus immobiles…). L’intérêt de notre projet est donc de pouvoir réaliser des enregistrements en IRMf tout en améliorant le bien-être animal afin de réaliser des expériences plus fiables.
Procédures
Ce projet consiste à développer une technique fiable et appropriée d’IRM fonctionnelle chez le rongeur éveillé à l’aide d’un berceau innovant et d’un protocole d’habituation adapté. Pour pallier aux contraintes liées à l’IRMf en terme d’immobilité, les rongeurs devront être soumis à une procédure chirurgicale de courte durée (2h) afin de positionner un système de fixation. Lors de cette intervention, certains animaux recevront une injection (5min) de virus fluorescent au niveau des structures cérébrales. Cela permettra de mesurer lors des acquisitions IRM l’activité neuronale au niveau des structures ciblées. Ces acquisitions IRM auront une durée maximum de 2h en fonction du comportement de l’animal, avec un maximum de 2 séances par semaine (une période d’une semaine entière sera laissée à l’animal pour récupérer entre deux séances consécutives). L’objectif sera de pouvoir acquérir des données sur une période de 6 à 8 mois avec un maximum de 40 sessions sur cette période. En début de procédure, pendant une période de 2 mois, en plus des phases d’étude IRMf, les animaux auront des prélèvements sanguins réguliers (5min, 1 fois par semaine) afin de contrôler leur taux de corticostérone dans le sang (également appelée l’hormone du stress), et des tests de comportements visant à évaluer l’anxiété et la socialisation des animaux seront également réalisés chaque semaine (2 tests de 10min) pour compléter les résultats obtenus avec l’ensemble des données physiologiques.
Impact sur les animaux
Les chirurgies de mise en place des systèmes de fixation et d’injection de virus pourront entraîner des douleurs et/ou une perte de poids dans les jours suivants l’expérimentation. La présence d’un dispositif chirurgical intracérébrale pérenne pourra induire une gêne chez l’animal. Les premières sessions d’habituation pourront stresser les animaux induisant une modification du comportement. L’immobilisation par contention des animaux pourra induire un stress chez les animaux. Les prélèvements sanguins effectués chaque semaine pourront induire un stress chez les animaux.
Devenir
La suite du projet prévoit des analyses histologiques du cerveau afin d’étudier certains marqueurs moléculaires pouvant être lié à l’état de stress des animaux. Les animaux seront donc euthanasiés afin de conserver le cerveau dans un état le plus proche possible de son état physiologique.
Remplacement
L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technologie d’imagerie médicale aujourd’hui très développée et répandue. Une de ces applications, appelée IRM fonctionnelle (IRMf), permet de visualiser, de manière indirecte, l’activité cérébrale. L’IRMf est un outil performant pouvant être utilisée sur un grand nombre d’animaux, ce qui en fait un pont majeur vers la recherche humaine. Le développement de cette technique chez le rongeur afin de pouvoir dresser une cartographie des fonctions cognitives complexes est donc essentiel pour ensuite établir un lien direct entre la recherche animale et humaine. Cela nécessite que les acquisitions se déroulent dans les mêmes conditions à la fois chez l’homme et chez l’animal pour qu’une comparaison puisse se faire. Les acquisitions IRMf chez l’homme se font chez des patients éveillés, et c’est pourquoi la réalisation d'études chez des animaux non anesthésiés présente un intérêt majeur pour la comparaison des données. De plus, les quelques exemples d’IRMf de rongeurs éveillés sont réalisés dans des conditions très stressantes pour l’animal (fixés par des barres d’oreilles, maintenus immobiles…), l’intérêt de notre projet est donc d’accéder à ces données tout en améliorant le bien-être animal afin d’obtenir des expériences fiables.
Réduction
Nous avons calculé le nombre de rongeurs à utiliser dans chaque groupe avec un logiciel de statistique et en s’appuyant sur des expériences antérieures similaires d’évaluation du niveau de stress lors d’acquisitions IRM sur rongeurs éveillés. Nous arrivons à 49 rongeurs par groupe. D’après notre expérience, nous savons que chaque rongeur a besoin d’un calendrier différent pour l’entraînement et que certains ne seront jamais en mesure de réaliser des acquisitions IRM éveillés dans de bonne condition, sans stress. Cette proportion d’animaux non entraînables est estimée à 30%. Nous souhaitons pouvoir mettre au point ce protocole à la fois chez la souris et chez le rat. De plus, le but étant de développer un protocole général qui sera utilisé par tout projet ultérieur, il va donc être nécessaire de faire des tests avec les deux sexes. Nous arrivons donc à un total de 128 animaux pour ce projet. Ce nombre pourra être diminué en analysant en continu les données enregistrées. Chaque rongeur étant acheté au fur et à mesure, il n’y aura donc pas d’animaux inutilisés.
Raffinement
Les critères qui seront les plus importants pour cette étude seront l’amélioration du confort des animaux lors des acquisitions IRMf et la diminution de leur niveau de stress. Tous les animaux seront surveillés tout au long de la procédure. Pendant les interventions chirurgicales les animaux sont anesthésiés et recevront un analgésique ainsi que des injections d’anesthétique locales afin d’éviter toutes douleurs. Pour le suivi post chirurgie d’implantation des posts de fixation, nous utiliserons une grille de score dans laquelle des points limites sont déterminés afin de s’assurer que l’état de santé des animaux ne se dégrade pas. Si une souffrance est observée, l'animal sera pris en charge, et des soins adaptés seront mis en place en fonction de son état avec administration d’analgésique pour pallier à cette souffrance. Si un des points limites est atteint alors l’animal sera sortie d'expérimentation.
Choix des espèces
Les résultats précliniques de l'IRMf sur les rongeurs (que ce soit les souris ou les rats) ont été vérifiés à plusieurs reprises chez l'homme, ce qui en fait un bon modèle pour tester des médicaments ou étudier des hypothèses sur le fonctionnement du cerveau. En outre, les scanners IRM précliniques ont de petites cavités, ce qui permet d'utiliser uniquement de petits animaux, et conviennent à l'IRMf sur les rongeurs. Enfin, nous utiliserons des rongeurs adultes mâles et femelles, car l'étude que nous voulons réaliser ne nécessite pas de rongeurs jeunes ou très jeunes. Nous n'utiliserons donc, que des rongeurs entre 2 mois et un an et demi.
Mécanismes moléculaires et physiologiques de la synchronisation photique des rythmes circadiens dans des modèles de rongeurs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour savoir comment la lumière recale les horloges biologiques, 600 souris privées de certains photorécepteurs vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles passent quinze à vingt jours en obscurité constante, isolées en cage individuelle, sous un capteur infrarouge qui enregistre leur activité. Vient ensuite une injection dans l'œil sous anesthésie, un réveil d'une heure, trente minutes de stimulation lumineuse, puis la mise à mort une heure plus tard pour prélever les tissus. Le porteur annonce que les points limites "spécifiques au projet" seront appliqués, sans dire lesquels.
Objectifs
Le fonctionnement autonome des horloges circadiennes repose sur des mécanismes impliquant des gènes d’horloges et leurs protéines, dont certains forment une boucle de rétroaction autorégulée, avec une rythmicité de 24 heures. L'horloge centrale du noyau suprachiasmatique, dont l'activité est synchronisée par la lumière via les photorécepteurs rétiniens, contrôle par des voies de sortie directes et indirectes, les rythmes de sécrétions hormonales, d'activité locomotrice, de température, de vigilance et le cycle veille/sommeil. En plus de son rôle synchronisateur de l’horloge centrale, la rétine contient également un oscillateur circadien autonome à l’origine de nombreux processus cellulaires, biochimiques, et physiologiques. Dans ce projet, nous évaluerons chez l’adulte et au cours du développement 1) les conséquences de l'absence spécifique d'un type de photorécepteurs sur le fonctionnement endogène des horloges (rétine et horloge centrale) et leur réponse à la lumière, 2) le rôle respectif des différents photorécepteurs sur la réponse à la lumière de ces horloges et 3) les voies de signalisation mise en jeu dans la transmission de l'information photique par les bâtonnets dans la rétine.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer les conséquences de l'absence spécifique d'un type de photorécepteurs sur le fonctionnement des horloges circadiennes (rétine et noyau suprachiasmatique) et leur réponse à la lumière en utilisant des modèles murins transgéniques, déficients en photorécepteurs. L'altération de la réception de l'information lumineuse chez ces modèles devrait se traduire par des dysfonctionnements de nombreuses fonctions physiologiques des horloges. De plus, l'approche pharmacologique in vivo d'activation/inhibition des voies de signalisation des bâtonnets au sein de la rétine devrait nous permettre de décortiquer de manière précise les mécanismes par lesquels la lumière agit sur nos rythmes circadiens.
Procédures
Les interventions, d'une durée d'environ 3h30, sont listées ci-dessous : 1) Tout d'abord, les animaux adultes seront isolés dans des cages individuelles du début et jusqu’à la fin de l’expérimentation. 2) Les animaux adulte subiront, sous anesthésie générale et locale, une injection intravitréenne de molécules pharmacologiques avec réveil (1h). Après injection et réveil (1h), les animaux seront exposés à une stimulation lumineuse (30 min) et mise à mort 1h après la stimulation.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances : 1) Tout d'abord, les animaux seront placés individuellement dans des cages munies d’un capteur infrarouge permettant de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. 2) Afin d’évaluer les paramètres de leur système circadien (période endogène, décalage de phase comportemental), les animaux seront placés pendant 15-20 jours à l’obscurité constante. Le placement de l’animal en condition constante (obscurité constante) est le protocole standard utilisé afin d’évaluer le fonctionnement endogène et la réponse à la lumière du système circadien. 3) Les animaux subiront une chirurgie avec ou sans réveil.
Devenir
Mise à mort pour prélevements de tissus et fin d'expérimentation.
Remplacement
Le but de ce projet est de déterminer 1) les conséquences de l'absence spécifique d'un type de photorécepteurs sur le fonctionnement endogène des horloges et leur réponse à la lumière, 2) le rôle respectif de ces différents photorécepteurs sur la réponse à la lumière des horloges circadiennes. Compte tenu de la complexité de l’environnement tissulaire et le réseau complexe constituant les horloges circadiennes, ne pouvant être reproduits in vitro, ce projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal. De plus, ce projet fait appel à des modèles murins non transgéniques et transgéniques sélectionnés car ils permettent d'aborder différents aspects scientifiques de notre projet.
Réduction
Pour réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons des approches non invasives (comportement) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. -Ceratains animaux utilisés lors des approches noninvasives pourront être utilisés dans des approches ex-vivo. - Plusieurs prélèvements de tissus et certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. - Enfin, dans certains cas, chaque animal pourra être son propre contrôle. Le nombre d'animaux requis a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la limitation du stress, au moyen notamment d’un enrichissement varié. Un suivi régulier des animaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort ou de douleurs. Les soins et les expérimentations seront réalisées par du personnel qualifié. Les points limites spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
Ce projet fait appel principalement à des modèles murins non transgéniques ou modifiés génétiquement. Cette espèce a été sélectionnée car elle présente une grande similitude avec les photorécepteurs chez l’homme et représente donc un modèle expérimental privilégié pour l’étude des mécanismes moléculaires des horloges circadiennes et leur régulation par la lumière. De plus, elle permet d'avoir accès à plusieurs lignées dont le phénotype est bien établi. Les différentes souches sélectionnées sont pertinentes pour évaluer le rôle respectif des différents photorécepteurs, de l’horloge et des connexines dans le fonctionnement endogène et la réponse à la lumière des horloges rétinienne et centrale. Ces souris sont déficientes en : a) photorécepteurs : mélanopsine, opsine des cônes MW, ou bâtonnets. b) connexine 36 : invalidée dans les bâtonnets ou les cônes. c) Horloge dans les bâtonnets ou présentent une mutation conduisant à la dégénérescence des bâtonnets couplée à l’absence d’une horloge fonctionnelle dans les bâtonnets. Afin de mieux comprendre le fonctionnement moléculaire endogène et la réponse à la lumière des horloges circadiennes, des expérimentations chez l'adulte (2-5 mois) et le nouveau né sont indispensables. En effet, les horloges se mettent en place progressivement chez la souris durant la période post-natale. De plus, les différents photorécepteurs réceptionnant l'information lumineuse maturent progressivement et à des stades différents au cours du développement. Nous utiliserons différents stades postnataux : 8, 15 ou 30 jours après la naissance.
Shadow imaging in vivo pour l’étude du milieu extracellulaire et la perfusion intracardiaque
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une fenêtre d'imagerie de trois millimètres percée dans le crâne sous anesthésie, puis pour 1 770 d'entre elles une injection directe dans le cerveau : 2 718 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Pour 948 autres, un dispositif implanté permet des injections répétées, et 420 subissent des injections dans l'arrière de l'œil, un traumatisme crânien ou l'implantation de cellules tumorales. L'objectif est de cartographier l'espace entre les cellules du cerveau à l'échelle du nanomètre, sur des souris vivantes maintenues tête fixée. Le champ officiel du devenir ne mentionne aucun animal gardé vivant, alors que le texte annonce que les souris porteuses du dispositif implanté seront maintenues en vie, les autres étant tuées pour prélever le cerveau entier.
Objectifs
Environ 25% du volume cérébral est occupé par l'espace extracellulaire (ECS) qui correspond à l’espace se trouvant entre les cellules et qui sert d’environnement à l’échelle microscopique pour le cerveau et forme un chemin de communication chimique entre les cellules. Il a été montré que la structure et la diffusion de l'ECS sont composés d’éléments de nature différentes et qu'elles dépendent de conditions internes et externes, telles que le système de sommeil/éveil ou d’un œdème cellulaire provoqué par un traumatisme cérébral. De plus, l’ECS fournit un réservoir pour les ions impliqués dans l'activité électrique des neurones et joue un rôle clé dans la transmission de substances entre les cellules. Ainsi, l’ECS n'est pas seulement le siège de toutes sortes d'interactions cellule-cellule, mais peut également jouer un rôle important dans des fonctions neuronales cruciales, telles que la mémorisation ou la formation de circuits neuronaux. Afin de visualiser la structure de l'ECS à très petite échelle (nanomètre), nous utiliserons une nouvelle approche d'imagerie, à savoir la technique de Shadow imaging (SUSHI). C'est une méthode de marquage où un produit fluorescent est injecté localement dans le cerveau afin de visualiser l’ECS avec une très haute résolution. En outre, comme le produit fluorescenr ne pénètre pas les cellules saines, toutes les cellules apparaissent en noires, ce qui permet d'imager également la structure anatomique des cellules non marquées. Cette méthode présente de grands avantages puisqu’elle n’est pas sensible à la perte de fluorescence de la molécule (la diffusion du produit fluorescent permet de maintenir un signal constant) ni à la toxicité (puisque le produit fluorescent reste en dehors des cellules). Dans ce projet, nous comptons tester plusieurs produits fluorescents qui présentent tous une gamme de longueur d’onde proche de celui de la GFP (Protéine fluorescente verte) et ne pénètrent pas les membranes cellulaires.
Bénéfices attendus
Cette technique sera utilisée pour imager l’ECS au travers d’un dispositif d'imagerie posée soit sur le cortex soit sur l’hippocampe (petite partie du cerveau qui sert pour la mémoire, le comportement et certaines émotions). Partant de là, nous nous proposons d'effectuer des séances d'imagerie répétées d’un même animal pour cartographier, sur animal vivant et avec une résolution spatiale inédite, la morphologie de l’ECS et caractériser la dynamique (quelques minutes à quelques semaines) des structures fines de l’ECS afin de voir les interactions cellule/cellule à l'échelle des circuits intégrés.
Procédures
Toutes les souris auront la pose d'un dispositif d'imagerie (2718 souris). Pour avoir ce dispositif il faut procéder à une chirugie sur animal endormi qui dure environ 1h avec utilisation de produits anti douleur. Un dispositif d'imagerie de 3mm de diamètre sera fait dans le crâne de la souris et une lamelle sera posée dessus afin de protéger le cerveau de l'extérieur. 1770 souris auront une injection directe dans le cerveau pendant qu'elles seront endormies. L'injection prendra environ 15 minutes et sera faite qu'une seule fois sur ces souris. 948 souris auront une pose d'un dispositif implantatoire dans le cerveau permettant d'injecter plusieurs fois le produit fluorescent. Ce dispositif implantatoire sera posée pendant la chirugie pour le dispositif d'imagerie. Chaque souris de ce groupe aura un dispositif implantatoire et plusieurs injections dans le temps d'une durée de 15 minutes environ chacune. Une injection rétro-orbitales sera faite sur 420 souris. Une injection par oeil et 2 injections par animal au maximum. L’induction d’un traumatisme cranien (impact fait en une fraction de secondes) et l’induction de cellules tumorales (une dizaine de minutes) sera faite sur un total de 420 souris. Toutes les souris auront une préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires après une ou plusieurs injections injection (si la souris a un dispositif d'injection ou non). Cette préparation des tissus se fera sur animal endormi avec utilisation d'anti douleur. L'animal sera ensuite euthanasié et le cerveau sera récupéré.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et l'induction du traumatisme cranien et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies, injection retro-orbitale et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. Le risque de rejet des animaux non sevrés et le stress de la séparation peuvent également entrainer une nuisance ou un effet indésirable.
Devenir
Les souris subissant la préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires seront euthanasiées à la fin de l'expérimentation afin de prélever le cerveau entier. Les souris ayant subi une chirurgie pour l'implantation d'un dispositif d'imagerie seront utilisées pour la microscopie puis euthanasiées à la fin de l'expérimentation si elles ne sont pas utilisées pour la préparation des tissus. Les souris ayant un dispositif implantatoire seront maintenues en vie.
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. L’objectif de ce projet étant de caractériser l’ECS dans les conditions les plus naturelles possibles, cette étude ne peut être réalisée de manière pertinente avec des modèles sur ordinateurs (in silico) ou sur micro-organismes, organes ou cellules en dehors de leur contexte naturel (in vitro). Le microscope sera, dans un premier temps, validé en imageant de toutes petites particules (nanoparticules) fluorescentes. Toutefois, ces échantillons ne permettent pas réellement de reproduire l’ensemble des paramètres optiques observés dans les échantillons biologiques. C’est pourquoi une seconde étape de validation dans des tranches organotypiques (tranches de partie de cerveau sur une lamelle) apparait cruciale pour optimiser les conditions d’imagerie qui seront utilisées à terme pour l’imagerie sur animal vivant (in vivo).
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode de production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'Homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'Homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'Homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 1 et 21 jours. Puis sur ces mêmes animaux de 2 à 6 mois, période qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une meilleure reproductibilité des résultats.
Enregistrement de neurones spinaux pour le criblage de candidats médicaments antalgiques
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 390
390 rats et 360 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs leur provoquent des douleurs chroniques par chirurgie, par injection d'adjuvant complet de Freund, par un agent de chimiothérapie ou par induction d'un diabète, avant 5 436 sessions de tests comportementaux de von Frey et d'immersion de la patte. Chaque animal finit par une chirurgie sous anesthésie terminale de deux à quatre heures, pendant laquelle des laboratoires pharmaceutiques font tester leurs candidats antalgiques sur des neurones de la moelle épinière. Le porteur décrit cette approche comme un raffinement permettant de tester des stimulations très nociceptives "sans aucune souffrance pour l'animal", dans un projet qu'il classe lui-même en gravité sévère.
Objectifs
Le projet consiste à mesurer l’effet de candidats médicaments de l'industrie pharmaceutique sur l'activité de neurones à l’origine de la sensation douloureuse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'obtenir de meilleures connaissances des mécanismes conduisant aux douleurs chroniques et contribura à l'etablissement de nouveaux traitements des douleurs chroniques.
Procédures
Chirurgie sous anesthésie avec réveil (10 min): 312. Injection d'une substance inflammatoire sous anesthesie (5 min) : 111. Prélèvement d'une goutte de sang sur la queue chez l'animale vigile (30 s) : 468. Injection d’un agent utilisé en chimiothérapie ou d'une substance induisant le diabete chez l'animal vigile (15 s) : 252. Tests comportementaux (30 min) : 5436. Chirurgie sous anesthésie terminale (2-4 h) : 750.
Impact sur les animaux
Les modèles mis en œuvre induisent un état de douleur chronique. Cela est nécessaire pour la mise au point de traitements analgésiques efficaces contre les douleurs chroniques.L’injection d’adjuvant complet de Freund et les interventions chirurgicales induisent une douleur localisée au niveau de la patte, après le stress induit par l’induction de l’anesthésie à l’isoflurane. La douleur est modérée à sévère dans les heures qui suivent l’intervention, puis légère à modérée par la suite. Les injections chez l’animal vigile induisent un stress et une douleur légère de brève durée due à la contention et l'injection. Il en est de même pour le prélèvement d'une goutte de sang sur la queue. Le diabète peut induire des dysfonctions physiologiques prononcées (dyspepsie, cachéxie) et donc un stress sévère chez certains animaux. Les tests comportementaux de Von Frey et d’immersion de la patte induisent un stress léger dû à l’isolement et à la contention, respectivement. La stimulation induit une douleur légère puisque l’animal est en mesure d’éviter la stimulation.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés avec une overdose d’anesthésique à la fin de chaque expérience, car les mesures physiologiques pratiquées ici chez l'animal anesthesié sont trop invasives pour permettre la survie de l'animale.
Remplacement
L’utilisation d’animaux pour les tests d'efficacité de candidats médicaments analgésiques est rendue nécessaire par le fait que les mécanismes d'action de ces molécules sont des processus complexes impliquant la totalité du système nerveux (de manière imagée, des communications réciproques entre le cerveau, la moelle épinière, et les tissus périphériques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit par 3 actions conjointes : 1) le soin apporté à chaque expérience (une spécialisation extrême est indispensable pour obtenir un taux de succès élevé dans ces expériences délicates) ; 2) le ciblage d’une population de neurones essentielle dans la génération de la sensation douloureuse ; 3) une approche par étape, avec des lectures intermédiaires des résultats, afin d’arrêter rapidement les expériences inutiles.
Raffinement
Les approches physiologiques chez l’animal anesthésié permettent un certain nombre de raffinements. Premièrement, il est possible de pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments sur la réponse à des stimuli très nociceptifs sans aucune souffrance pour l'animal (impossible chez un animal vigile). Deuxièmement, plusieurs doses de candidat médicaments peuvent être testées chez un même animal dans la même expérience. Troisièmement, chaque animal est son propre contrôle lors du test de candidats médicaments (principe des mesures répétées avant/après).
Choix des espèces
Les rongeurs, rats et souris, sont des espèces appropriées pour l’étude et le développement de médicaments analgésiques et antalgiques, et sur lesquels nous disposons de beaucoup de connaissances. Le rat a l’avantage sur la souris d’être plus robuste du point de vue physiologique, et donc de mieux supporter de longues anesthésies. La souris permet de profiter des manipulations génétiques plus facilement. Les animaux sont utilisés au stade adulte, car ce projet ne s'intéresse ni au développement, ni à l'animal âgé.
Evaluation de la sécrétion pancréato-biliaire chez les souris Knock-out CD36 lingual
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Six heures de jeûne, une laparotomie, une ligature de l'œsophage et la pose d'un cathéter dans le canal biliaire : 60 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées sous anesthésie à la fin de l'intervention pour prélever leurs organes. L'opération mesure les sécrétions du pancréas et de la bile chez des souris privées du récepteur CD36 dans les papilles gustatives, pour préciser le rôle du "goût du gras" dans la préparation de la digestion. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à la description de cette nouvelle lignée, qui pourra ensuite servir de modèle pour d'autres questions. Le choix de l'espèce tient à la lignée elle-même, le porteur écrivant que ce modèle génétiquement modifié n'existe que chez la souris, ce qui le rend selon lui "indispensable".
Objectifs
Il a été rapporté que le goût du gras représente une sixième modalité gustative aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. C’est plus précisément les récepteurs gustatifs, exprimés par les cellules des bourgeons du goût (de type 1, 2, et 3) qui permettent la détection des saveurs. Les récepteurs de lipides (CD36, GPR120) exprimés dans les papilles gustatives sont responsables non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. Le signal gustatif est transmis au cerveau par les nerfs gustatifs, conduisant à une augmentation des sécrétions digestives préparant le corps à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue – cerveau – intestin. Les études réalisées chez les souris n’exprimant pas CD36 ont démontré qu’elles perdent la perception du goût du gras, due à une altération de l’axe langue – cerveau – intestin, avec notamment une diminution des sécrétions digestives déclenchées lors d’une application linguale de lipides. Comme CD36 est exprimé dans plusieurs tissus et organes, il a été difficile de déterminer chez ces souris, le rôle oral dans les effets observés. Ainsi, des souris génétiquement modifiées qui n’expriment pas CD36 uniquement dans les papilles gustatives ont été générées. Le but de ce projet est d’étudier le rôle de CD36 lingual dans l’activation des sécrétions digestives chez les souris qui n’expriment pas CD36 dans les papilles gustatives.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra la description d’une nouvelle souche de souris génétiquement modifiées qui n’exprime pas le récepteur CD36 dans les papilles gustatives et qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur l’expression de CD36 et le « gout du gras ».
Procédures
L’ensemble des souris sera nourri avec un régime standard et sera pesé de façon hebdomadaire. Six heures avant la manipulation, les souris seront mises à jeun (de nourriture seulement). Lors de la manipulation, une injection sous-cutanée d’analgésiant puis une injection intrapéritonéale d’anesthésiant seront effectuées. Un anesthésique local sera également appliqué. Les souris endormies seront tondues au niveau de l’abdomen. Une laparotomie, une ligature de l’œsophage et cathétérisation du canal biliaire seront réalisés sous anesthésie générale. Un prélèvement sanguin intracardiaque (sous anesthésie toujours) sera réalisé puis les souris seront mises à mort (toujours anesthésiées). Après euthanasie, les organes d’intérêt seront prélevés.
Impact sur les animaux
Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale ce qui peut engendrer un stress pour les animaux, ils auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaire pour les injections sous-cutanées (analgésiques) et intrapéritonéales (anesthésiques). Une douleur est également à prévoir lors de cette injection sous-cutanée et lors de cette injection intrapéritonéale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.
Remplacement
La sécrétion pancréato-biliaire est une étude faisant intervenir une communication inter-organes ainsi qu’une sécrétion pancréatique in vivo. C’est un paramètre métabolique qui ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de toute la partie expérimentation in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux
Réduction
L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable . Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur, la désinfection des surfaces, l’utilisation d'un champ stérile, la stérilisation des outils de dissection, la tonte de la zone d’incision et la désinfection de la peau.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la phase post-ingestive et le comportement alimentaire. Bien que techniquement plus difficile que l’utilisation du rat, notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction de la modification génétique étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude.