Système nerveux

358 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue dont 144 perfusés à cœur battant sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après implantation d'un capteur de température, ils sont exposés aux radiofréquences 5G pendant six semaines puis soumis à dix tests comportementaux évaluant mémoire, anxiété, dépression et seuil douloureux, une lignée sélectionnée pour son phénotype dépressif étant comparée à une lignée saine. Le porteur cherche à comprendre l'électrohypersensibilité, qu'il qualifie lui-même de "syndrome médicalement inexpliqué", et rappelle que les études antérieures n'ont pas montré que l'humain perçoit consciemment les radiofréquences. Le bénéfice annoncé, mieux reconnaître ces patients, reste une hypothèse à explorer.

Objectifs

L’objet de ce projet est la recherche fondamentale pris au sens du 1er article R. 214-105 du Code rural et de la pêche maritime. Le contexte général est celui de l’augmentation exponentielle de l’utilisation de la téléphonie mobile et des techniques de communication et du déploiement de la 5G. Il pose la question de l’augmentation de notre exposition environnementale et de ses conséquences possibles sur notre santé physique et mentale. De plus, certaines personnes souffrent d’hypersensibilité électromagnétique (EHS) et à ce jour, aucune évidence biologique ou clinique n’explique ces symptômes, et les causes de l’EHS restent inconnues. L’implication d’un niveau d’inquiétude élevé, d’un mal-être et /ou d’états anxieux ou dépressifs est suggéré mais pas établie. L’objectif du projet est de tenter de répondre aux questions suivantes : le sujet dépressif perçoit-il les radiofréquences différemment d’un sujet sain? la dépression est-elle la cause ou la conséquence de l’EHS ? Quelles différences hommes-femmes, considérant que l’EHS concerne plutôt les femmes, comme c’est le cas pour la dépression ou l’anxiété (ratio : 2 femmes/1 homme)? Le projet propose d’étudier les effets d’une exposition chronique aux radiofréquences de la 5G (2 gammes de fréquences, 900 MHz et 26 GHz) sur le comportement et la plasticité cérébrale de rats adultes mâles et femelles, sains ou dépressifs (souche Flinders Sensitive Line ou FSL) en ciblant la sphère cognitive (mémoire à court et à long terme, flexibilité) et la sphère affective (anxiété, dépression, sensibilité à la douleur).

Bénéfices attendus

Ce projet qui vise à mieux comprendre les déterminants de l'électrohypersensibilité, doit faire progresser les connaissances sur ce syndrome encore médicalement inexpliqué dans le but notamment d'améliorer la reconnaissance et la prise en charge de ces patients.

Procédures

Les rats seront soumis à : i) une intervention chirugicale courte (10-15 min, anesthésie gazeuse, implant d'un logger température intra-abdominal), 2) une exposition aux radiofréquences de la 5G en chambre réverbérante dans une cage d'élevage pendant 6 semaines (5j/semaines, 4h/j) et 3) 10 tests comportementaux répartis sur une période de 2 mois pour évaluer la mémoire (2 tests), l'activité (2 tests), l'anxiété (3 tests), la dépression (1 test) et le seuil douloureux (2 tests), chaque session durant de 1 min à 10 min maximum avec 1 session/jour et chaque test d'une durée de 1 à 7 jours (voir détails Procédure expérimentale 1, figure 3 annexe).

Impact sur les animaux

Il n'est pas attendu de nuisances ou effets indésirables importants ou durables pouvant altérer leur bien-être, l'essentiel des interventions proposées nous sont très familières. De plus, les rats dédiés aux expériences préliminaires permettront d'affiner les protocoles pour certains tests et d'en ajuster si besoin les paramètres, il en est de même pour le protocole chirurgical (pose des 'capteurs' de température) et la période post-opératoire. Pour ce qui est de leur environnement au quotidien et la prise en charge de leur bien-être tout au long des expériences, nous avons une grande expérience de ce type de projet, une cellule SBEA présente et disponible ainsi qu'une vétérinaire pour le suivi médical. De plus, le projet scientifique a pour thème la dépression et l'anxiété et l'impact d'un facteur environnemental: nous serons donc particulièrement vigilants et réactifs sur leur bien-être car tous les résultats des tests comportementaux en dépendent.

Devenir

Procédure 1: 214 rats seront mis à mort et le cerveau récupéré pour 144 d'entre aux pour les études de la plasticité cérebrale (coloration de Golgi) et 144 rats seront gardés en vie et entreront dans la Procédure 2. Procédure 2 (sans réveil) : 144 rats perfusés en intracardiaque pour récupération du cerveau et études immunohistochimiques nécessitant une préservation uniforme et rapide de tissu cérébral.

Remplacement

L’approche chez l’animal, en particulier le Rat, est la seule permettant d’aborder la question de de l’impact des radiofréquences sur la sphère cognitive et affective/émotionnelle et les mécanismes cérébraux sous-jacent afin de comprendre un syndrome inexpliqué, l’électrohypersensibilité ou EHS. Ce projet est une première tentative de modélisation chez le rat pour tester une hypothèse originale : l’impact de troubles de l’humeur (dépression) à l’origine de l’EHS? Ce projet devrait permettre aussi de répondre à la question du rôle des radiofréquences sur l'apparition de ce syndrome: les études précédentes n’ayant pu montrer que l’humain est capable de percevoir consciemment les radiofréquences et un effet nocebo a été proposé pour expliquer l’EHS. Enfin, l'arrivée des nouveaux signaux de la téléphonie mobile 5G nécessite des études chez l'animal pour en comprendre les effets biologiques, physiologiques voire pathologiques.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé au plus juste en fonction des prérequis statistiques à l'aide tests paramétriques. Nous avons une grande expériences de ce type de projets et de nombreuses publications scientifiques.

Raffinement

Dès leur arrivée au laboratoire, les rats sont hébergés dans de grandes cages à 3 individus et 3 bâtons à ronger pour enrissement dans une animalerie agrée avec températire, humidité et cycle jour/nuit adaptés. L'évaluation de leur bien-être se fera au quotidien à l'aide de la grille de l'Afstal, une attention particulière sera portée à la chirurgie et la période juste après. De plus avant toute procédure, les rats seront habitués à l'expérimentateur, la salle de test et le test lui-même. L'objectif est de les amener à coopérer en réduisant le stress et l'anxiété. De plus, le thème du projet vise justement à évaluer l'impact de l'environnement (les radiofréquences) sur divers paramètres incluant l'anxiété, la dépression,et la cognition. Nous serons donc particulièrement vigilant dans le raffinement de nos procédures, essentiel pour le bien-être mais aussi la qualité de nos données scientifiques. Pour plus de détails voir Procédure 1

Choix des espèces

Le choix du Rat s’impose par l’existence de très nombreuses données anatomiques, électrophysiologiques et comportementales solides sur la cognition, mémoire, mais aussi l’anxiété, la dépression ainsi que sur les effets des radiofréquences. En effet, les bases neurobiologiques de la mémoire, de l’anxiété ou de la dépression étudiées chez le rongeur, et notamment chez le Rat, ont permis de grandes avancées dans la compréhension de ces phénomènes physiologiques et pathologiques chez l’homme. Le rat possède des capacités cognitives élaborée et un répertoire comportemental complexe. Il s’adapte bien à la vie au laboratoire et coopère facilement dans les tâches comportementales. De plus, le rat est un modèle pré-clinique validé pour la dépression ou les troubles anxieux et plusieurs souches ont été développées : le rat FSL utilisé dans ce projet en est un bon modèle depuis plus de 30 ans (241 publications 1986-2020). Ce projet propose d'étudier les effets des radiofréquences sur la sphère cognitive et affective dans 2 souches de rats, dont l’une présente un trouble de l’humeur (dépression). Ceci dans le but de montrer si ce phénotype dépressif est capable d’induire des effets biologiques et comportementaux spécifiques des radiofréquences qui ne seraient pas observés chez des sujets sains. En effet, les sujets EHS présentent tout un panel de symptômes (troubles de la mémoire, de l’attention, du sommeil, anxiété, douleurs…) qu’ils attribuent aux ondes électromagnétiques et notamment aux radiofréquences. Ce syndrome, à ce jour inexpliqué à la fois au plan scientifique et médical, est rapporté dans la très grande majorité des cas chez les adultes, très rarement chez l’enfant ou le sujet très âgé. Ceci justifie le choix du rat jeune adulte âgés de 2 à 5 mois au moment des expériences.

768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tuées comme donneuses de moelle osseuse et 720 transférées vers un autre protocole de tests comportementaux. Rendues obèses par un régime gras pendant 18 semaines, elles reçoivent du busulfan induisant une myélodysplasie, une greffe de moelle et des prélèvements sanguins répétés, pour étudier le rôle de la protéine DNase1L3 dans le syndrome métabolique et la dépression liés à l'obésité. Le porteur décrit la perte de poids et l'anémie post-busulfan comme "transitoires". Les 720 survivantes prolongeront l'expérimentation dans une animalerie dédiée aux tests d'anxiété et de dépression, sous une autre autorisation.

Objectifs

Nous avons observé que la déficience en DNase1L3 rend les souris plus susceptibles au développement du syndrome métabolique induit par l’obésité. Un de nos objectif courant est de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires de la DNase1L3 dans le contexte de l’obésité. De plus, l’obésité induit des troubles neuropsychiatriques comme la dépression. Un deuxième objectif de notre travail est d’évaluer l’impact de la déficience en DNase1L3 sur la survenue des syndromes neuropsychiatrique induits pas l’obésité. Tous les concepts, incluant l’état de l’art, le rationnel de notre étude ainsi que sa méthodologie sont décrits dans la section suivante.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mettre en évidence le rôle de la DNase1L3 dans la régulation de l’inflammation chronique induite par l’obésité ainsi que ces mécanismes d’actions. De plus, il nous permettra de déterminer si une dérégulation de la DNase1L3 peut contribuer aux troubles neuropsychiatriques induits par l’obésité. Ainsi notre projet pourra conduire aux développements de nouvelles approches thérapeutique basées sur la supplémentation en DNase1L3 afin de limiter l’inflammation chronique induite par l’obésité qui est à l’origine du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques.

Procédures

Les souris sont soumises à un régime riche normal et riche en graisse durant 18 semaines. Une myélodysplasie est induite par le Busulfan durant 4 jours. Une reconstitution des souris myélodysplasique est faite par transfer de cellules de moelle osseuses . La reconstitution se fait par une seule injection et a lieu en 1 mois. Des prises de sang retroorbitaires sont effectué toutes les six semaines. Un test de tolérance au glucose par injection i.p de glucose et prise de sang a la base de la queue est effectué toutes les 6 semaines aussi.

Impact sur les animaux

1. Placer les animaux sur un régime riche dans le temps imparti pour l’expérimentation augmente leur poids d’une manière considérable sans causer une altération significative de l’état général de l’animal. 2. La génération de souris chimérique nécessite l’induction d’une myélodysplasie par un traitement aux Busulfan. Ce traitement induit une perte de poids

Devenir

Procédure 1 : 288 animaux sont inclus dans cette procédure. 48 animaux sont utilisés en tant que donneur de moelle osseuse et sont euthanasiés par dislocation cervicale a l’issue de cette procédure. Le prélèvement de la moelle osseuse ne peut être effectue que sur des animaux morts. Le reste des animaux (240), constituent les animaux chimériques receveur de moelle osseuse qui seront gardés en vie et donc inclus dans les procédures qui suivent. Procédure 2. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un régime normal (360) et un régime riche en graisse (360). Tous les animaux de cette procédure sont gardés en vie en passent dans la procédure 3. Procédure 3. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à des prises de sang. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie en passent dans la procédure 4. Procédure 4. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un test de tolérance au glucose. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie et transférés dans l’animalerie NutriNeuro ou ils seront soumis à des tests comportementaux. Une autre DAP a été soumise pour cela.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologiques observés chez l'homme, peut apporter la preuve du rôle de la DNase1L3 dans le développements d’un syndrome métabolique et dans la régulation des troubles neuropsychiatriques qui découlent de l’inflammation induite par l’obésité. De plus les études comportementales afin d’évaluer le développent de l’anxiété et des états dépressifs ne peuvent être réalisé que sur des animaux vivants. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro ou ex vivo, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité de la régulation des états mentaux par les processus inflammatoires.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Afin de réduire le nombre d’animaux nous avons également optimisé leur utilisation. En effet sur les mêmes animaux nous allons à la fois évaluer la survenue du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques. Cela nous permet de réduire l’utilisation des animaux d’un facteur deux.

Raffinement

1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bienêtre (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang retro-orbitaires sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort de cette procédure. De plus, les prises de sang réalisées à l’extrémité de la queue incluent une anesthésie locale pour réduire la douleur qui peut être induite par cette procédure.

Choix des espèces

Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Les souris déficientes pour la DNase1L3, DNase1, TLR9 et IFNAR sont uniquement disponibles dans cette espèce et sur ce fond génétique. De plus, elles sont très sensibles aux régimes alimentaires pour l'induction de l’obésité (Surwit et al., Diabetes, 1988). Comme l’Homme, elles développent une obésité, un diabète de type II, une stéatose hépatique et des troubles neuropsychiatriques (dépression et anxiété) un fois exposées à un régime riche en graisse, alors qu’avec une alimentation standard, elles restent minces et ne développent pas de problèmes métaboliques ni de troubles neuropsychiatriques. En plus des souris congénique B6/SJL (pep boy, CD45.1) seront utilisées pour réaliser des chimères de moelle osseuse. Leur utilisation est necessaire afin d'évaluer l'efficacité de nos greffes qui est rendu possible par l'analyse de l'expression du variant de la molécule CD45. Les souris seront nourries dès l’âge de 12 semaines par HFD. L’exposition des souris C57BL/6 de cet age à un régime HFD ad libidum conduit à une obésité et au développent du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques assez proche de ceux se développant chez l’homme. Les premières manifestations apparaissent environ 6 semaines après l’introduction du régime HFD mais l’hyperglycémie, l’insulino-résistance, la stéatose hépatique ainsi que les troubles neuropsychiatriques sont observées vers 18 semaines post régime HFD (Surwit et al. ; Diabetes, 1988).

14 562 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des candidats médicaments, le plus souvent par gavage, puis passent des tests comportementaux avant un prélèvement de sang et de cerveau, dans des modèles d'autisme obtenus par lignées mutantes ou par activation immunitaire des mères. Le porteur indique que les effets attendus se limitent à des crampes abdominales ou une sédation, et justifie l'effectif par ce qui est "classiquement utilisé en expérimentation animale". Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de modéliser ces troubles et que le recours à la souris est "nécessaire".

Objectifs

Les troubles du spectre autistique (TSA) sont des troubles neurodéveloppementaux caractérisés par des déficits dans trois domaines: 1) des troubles dans les interactions sociales ; 2) des déficits du langage et de la communication et 3) des comportements limités ou répétitifs. Il devient de plus en plus évident que les causes des troubles du spectre autistique (TSA) sont dues à la fois à des facteurs génétiques et environnementaux. Les études animales fournissent des modèles translationnels importants pour élucider des facteurs génétiques ou environnementaux spécifiques qui contribuent aux déficits comportementaux liés aux TSA. Par exemple, de nombreux modèles murins d'activation immunitaire maternelle ont démontré que l'infection virale et bactérienne maternelle modifie le comportement de la progéniture, entraînant des phénotypes de type TSA. D’autre part, des souris mutantes transgéniques (BTBR T+ Itpr3 tf /J) et des souches consanguines (BALB/cByJ) ont été utilisées pour étudier les contributions génétiques possibles aux comportements de type TSA. Ces comportements comprennent des niveaux réduits d'interactions sociales réciproques, un manque de sociabilité typique de l'espèce et des niveaux significativement plus élevés d'auto entretien répétitif. L’objectif de ce projet consiste : 1) d'étudier l'effet de nouveaux candidats médicaments dans un modèle murin d'autisme (soit BTBR soit BALB/cByJ) et 2) la mise en place d’un modèle d’autisme par activation du système immunitaire innée (injection de Poly I:C) chez la souris et étude de l’effet de nouveaux candidats médicaments dans ce modèle.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux pour les TSA. Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ces modèles animaux peuvent être utiles pour identifier d’une part les contributions génétiques possibles aux comportements de type TSA et d’autre part le lien entre l’inflammation et l’autisme afin de tester de nouveaux candidats médicaments.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes régulières dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués sous anesthésie générale, à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les administrations (molécule de référence, candidats médicaments...) sont réalisées une seule fois avant le test. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant (produit destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou biodisponibilité nécessitant un autre mode d’administration) les voies intrapéritonéales, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies L’administration de nouveaux candidats médicaments peut entraîner certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation qui peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Devenir

A la suite des administrations des produits (molécule de référence, candidats médicaments et véhicule), l’ensemble des animaux passent en tests. Ensuite, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang et de cerveau (sous anesthésie générale), juste avant la mise à mort. Ces prélèvements permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour modéliser les TSA. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour l’étude de la physiopathologie et l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées sont : C57Bl/6 J, BALB/cByJ, BTBR T+ Itpr3 tf /J (BTBR) 1- Effet de nouveaux candidats médicaments dans le modèle murin d’autisme chez les souris BTBR et BALB/cByJ 4-10 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes. 2- Mise en place d’un modèle d’autisme par activation du système immunitaire innée (injection de Poly I:C) chez la souris et étude de l’effet de nouveaux candidats médicaments dans ce modèle 6-12 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.

18 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent un test de mémoire en labyrinthe en Y après administration de candidats médicaments ou de molécules mimant la maladie d'Alzheimer (scopolamine) ou la schizophrénie (MK-801), avant un prélèvement de sang et de cerveau. Le porteur indique que les effets attendus se limitent à l'inconfort des injections et à une possible sédation, et justifie l'effectif par ce qui est "classiquement utilisé en expérimentation animale". Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer les fonctions cognitives et que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Le test d’alternance spontanée en labyrinthe en Y est utilisé pour évaluer l'état des fonctions cognitives des rats et des souris dans des modèles expérimentaux. Le comportement normal d’un animal se caractérise par des alternances de visites des bras. Une alternance est définie comme une visite consécutive des 3 branches. Un animal avec une mémoire de travail intacte (donc des fonctions corticales préfrontales intactes), se souviendra du bras précédemment visité et montrera une tendance à entrer dans un bras moins récemment visité. Un déficit mnésique se caractérisera par un pourcentage d’alternance proche de 50% (visites au hasard). Le projet présenté ici a pour objectif la mise en place d’un test de mémoire « le test d’alternance spontanée en labyrinthe Y » chez le rongeur (rat/souris) pour : 1) étudier les effets potentiels induits par un médicament candidat sur les fonctions cognitives ; 2) tester l’efficacité de médicament candidat sur les déficits cognitifs induits soit par une molécule amnésiante tel que la scopolamine (l’administration de scopolamine induit des changements de connectivité cérébrale observés dans la maladie d’Alzheimer, elle est donc utilisée comme modèle pharmacologique de la maladie d’Alzheimer chez le rongeur) soit par un antagoniste non compétitif du récepteur du N-méthyl-D-aspartate tel que le MK-801 (le dysfonctionnement des récepteurs NMDA est maintenant bien connu dans la schizophrénie, le MK-801 est donc utilisé comme modèle pharmacologique de la schizophrénie chez le rongeur).

Bénéfices attendus

La compréhension des déficiences fonctionnelles et des processus pathologiques est d'une importance vitale afin de développer des thérapies efficaces. En utilisant le comportement exploratoire naturel des rongeurs, le labyrinthe d’alternance spontanée en labyrinthe Y permet d’évaluer la mémoire de travail spatiale à court terme. Le protocole de test du labyrinthe en Y est simple et nécessite des ressources minimales. Il peut également être appliqué pour étudier la mémoire à court terme dans des modèles de rongeurs âgés.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d’évaluer les fonctions cognitives. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne et d’erreurs standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J ou SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées (C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2, BTBR.....) Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar et Sprague-Dawley. D'autres lignées de rats peuvent également être utilisées (SHR) 5 -52 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes et personnes âgées.

600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier des syndromes d'hypercroissance liés au gène PIK3CA. Une partie est gavée pendant deux mois avec un inhibiteur, d'autres reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules mutées, plusieurs lignées génétiquement modifiées étant entretenues en parallèle. Le porteur indique que les souris de maintien de lignée restent en vie, celles des procédures étant tuées pour exploration anatomique et histologique. Il affirme que ces syndromes ne peuvent pas s'étudier in vitro, hors de leur environnement, et que la souris est le seul animal chez qui la protéine PIK3CA a été mutée.

Objectifs

Meilleur compréhension de la physiopathologie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieux. Nous souhaitons maintenant : 1-Étudier l’effet de la mutation PIK3CA dans chaque tissu de l’organisme (graisse, muscle, os, vaisseaux lymphatiques, vaisseaux artériels, vaisseaux veineux et les nerfs) en utilisant des modèles génétiques appropriés. 2- Tester l’efficacité d'un inhibiteur dans chacune des conditions. 3- Comprendre la physiopathologie de ces syndromes.

Bénéfices attendus

Meilleur compréhension de la physiopathologie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieux. Identification des tissus sensibles à une inhibition pharmacologique.

Procédures

Au cours de la procédure 2, un gavage sera effectué par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul). Le gavage débutera à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par l'inhibiteur de PIK3CA. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souples et non traumatisante pour l’animal. Au cours de la procédure 3, des cellules de différents types de tissus portant une mutation PI3KCA seront injectées en sous cutanée chez des souris immunodéficientes. Cette injection sera réalisée par un technicien expérimenté, chez des souris anesthesiées et un injectant le plus petit volume possible.

Impact sur les animaux

1-Le gavage quotidien qui débutera à la semaine 6 de vie et sera effectué pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par l'inhibiteur de PIK3CA. 2- Injection sous cutanée de cellules mutées PIK3CA chez des souris immunodéficientes (une injection unique).Nous n'attendons aucun effet indésirable lié au gavage ou à l'injection sous cutanée.

Devenir

Procédure 1: maintien de lignée, donc souris maintenues en vie Prodédures 2 et 3: animaux sacrifiés pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur lces syndromes d'hypercroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus avec des modèles murins peuvent tout au mieux être complétés par des expériences in vitro.

Réduction

La taille des groupes utilisés (n-25), minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Ce protocole est peu invasif puisque le gavage sera réalisé sur des souris mises dans des conditons de calme, par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul). Le gavage débutera à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par du BYL719. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Aucun prélevement ne sera effectué chez les souris. A priori l'inhibiteur de PIK3CA devrait améliorer le phénotype des souris. Nous injecterons également 1 million de cellules en sous cutanée chez des souris. Ces injections seront réalisées chez des souris anesthésiées (injection intrapéritonéale de Kétamine (128 mg/kg)/Xylazine (6,4 mg/kg)), par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul).

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et que de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). La souris est le seul animal pour lequel la protéine PIK3CA a été mutée Jeunes souris de 6 semaines car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.

4200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une administration unique d'un candidat médicament, le plus souvent par gavage, avant un test d'activité locomotrice, puis un prélèvement de sang et de cerveau. Le porteur reconnaît des effets indésirables possibles comme des crampes abdominales ou une sédation, et justifie l'effectif par ce qui est "classiquement utilisé en expérimentation animale". Il décrit le recours à l'animal comme "nécessaire", faute de méthode alternative pour ces mesures sur le système nerveux.

Objectifs

Lors du développement d’un candidat médicament, il peut être pertinent d’évaluer si celui-ci peut induire des effets sur le niveau d’activité générale, l’activité locomotrice globale ainsi que les habitudes d’exploration chez la souris. La modification de l’activité locomotrice peut entraîner des biais pour l’évaluation correcte du candidat médicament dans certaines thématiques. Pour exemple, une diminution de l’activité locomotrice peut entraîner un comportement de type anxiolytique (une diminution de nombre de billes enfouies dans le test d’enfouissement de billes). Il est donc important de vérifier avant toute caractérisation des effets d’un candidat médicament dans ce type de modèle. L’objectif de ce projet sera d’étudier, chez la souris, l’effet d’un candidat médicament dans le test de mesure de l’activité locomotrice spontanée.

Bénéfices attendus

Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ce modèle animal peut être utile pour identifier les potentiels effets indésirables de nouveaux candidats médicaments sur l’activité locomotrice afin d’éviter de biaiser son développement.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaitre. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant, par exemple si le produit administré est destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou si sa biodisponibilité nécessite un autre mode d’administration, les voies intrapéritonéale, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour étudier les effets potentiels induits (fonction motrice, l'exploration, l'anxiété, l'hyperactivité ou la sédation) par des médicaments candidats sur le SNC. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne et d'erreur standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Les lignées utilisées sont : la souris Swiss et la C57Bl/6J De 5 à 10 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection virale et l'implantation d'une fibre optique dans le cerveau sous anesthésie, puis des séances de stimulation magnétique transcrânienne et d'inhibition optogénétique, dans un modèle de dépression, pour identifier les circuits impliqués dans l'effet du traitement. Le porteur affirme à plusieurs reprises un "impact faible" voire nul sur le bien-être des animaux non-humains, malgré la chirurgie cérébrale et le modèle de dépression. Les souris sont tuées par perfusion dans le cœur pour vérifier le placement des fibres.

Objectifs

Les troubles dépressifs sont la principale cause d’invalidité dans le monde. Cependant l’efficacité des antidépresseurs est insuffisante chez un grand nombre de patients, ce qui nécessite une meilleure caractérisation des mécanismes neurobiologiques de la maladie ainsi que l’investigation de thérapies alternatives. La stimulation cérébrale magnétique transcrânienne répétée (rTMS) permet de modifier durablement l’activité cérébrale d’une région corticale ciblée via l’application d’une série d’impulsions magnétiques. Ses mécanismes d’action restent peu connus. L’objectif du projet est dans un premier temps de caractériser les effets de la rTMS par photométrie de fibre dans le cerveau de la souris (technique expliquée dans le déroulé du projet). Cette technique permet de suivre en direct l’activité d’une population neuronale à l’échelle d’une région cérébrale. La région d’intérêt à stimuler est le cortex préfrontal médian (mPFC), car il a été montré dans notre équipe que la rTMS du mPFC permet l’amélioration de certains phénotypes dépressifs dans un modèle murin de dépression. Cependant, le rayon d’action de la sonde que nous utilisons pour la rTMS n’a pas été décrit systématiquement in vivo, d’où la nécessité de caractériser la rTMS avec une technique permettant de suivre en direct les modifications de l’activité neuronale. Dans un second temps, l’objectif sera de caractériser plus en détail l’effet thérapeutique des stimulations. Une fois que nous aurons mieux caractérisé la stimulation et ciblé avec plus de précision le mPFC par rTMS, nous allons investiguer quelle projection du mPFC est impliquée dans l’amélioration des phénotypes dépressifs après rTMS. En particulier, le mPFC projette directement vers l’amygdale et le striatum ventral, et indirectement vers l’hippocampe. Ces trois régions et le mPFC étant dérégulées dans la dépression, il est important de déterminer le rôle de chacune de ces projections dans la réponse thérapeutique à la rTMS. Pour cela, nous allons d’abord caractériser la connectivité fonctionnelle au repos 3 jours après la fin d’un traitement de 5 jours consécutifs de rTMS du mPFC. En s’appuyant sur ces résultats, nous allons ensuite étudier l’impact d’une inhibition optogénétique des projections du mPFC vers l’amygdale, l’hippocampe, et le striatum ventral. L’inhibition de ces projections une à une pendant le traitement par rTMS nous permettra d’identifier quelle(s) projection(s) est impliquée dans la réponse thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra permettre une meilleure utilisation de la stimulation magnétique dans les modèles précliniques de maladies neuropsychiatriques murins grâce à une caractérisation plus détaillée de la seule sonde disponible pour les rongeurs (initialement mise au point pour le modèle rat). En se basant sur ce meilleur contrôle de la stimulation, cette étude pourra permettre d’identifier la (ou les) projection du mPFC ayant un effet dans le rétablissement des phénotypes anxieux et/ou dépressifs. Cela est important pour mieux comprendre les effets de la rTMS chez l’homme et l’animal, mais aussi pour développer de potentielles approches thérapeutiques plus spécifiques dans une approche translationnelle.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des injections virales et à l’implantation de fibre optique sous anesthésie générale (isoflurane), l’intervention durant environ 90 min. Une seconde intevention sous anesthésie générale est la rTMS, qui n’est pas invasive et consiste à placer la sonde magnétique à proximité du crâne de l’animal. 640 animaux au total suivront cette procédure, qui dure environ 10 min et est répétée sur 5 jours consécutifs. Une dernièree intervention sous anesthésie générale également est l’inhibition de l’activité neuronale par optogénétique, qui se fera pendant la rTMS (sur la même durée, 10min) via la fibre optique préalablement implantée et connetée à générateur délivrant des pulses de lumière (10Hz, 10ms) sur une durée de 500ms pendant 20s.

Impact sur les animaux

Peu d’effets indésirables sont à prévoir dans le projet. Le modèle de dépression que nous envisageons d’utiliser a un impact faible sur le bienêtre des animaux. La rTMS n’a pas d’impact sur le bien-être. La chirurgie permettant l’injection du vecteur viral puis l’implantation de la fibre optique pour la photométrie et l’optogénétique a un impact léger sur le bienêtre animal, les animaux récupérant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) étant faibles : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sans encombre sur l’animal mobile et éveillé sans gêne majeure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à morts lors de la perfusion intracardiaque . Cette procédure est nécessaire pour la caractérisation histologique de l’expression des vecteurs viraux et du placement des fibres optiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la rTMS nécessite également l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les effectifs sont optimisés, les analyses tissulaires nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=20 sujets par groupe expérimental en tenant compte du taux de succès des chirurgies évalué à ~70%). De plus, la rationalisation des procédures permet d’optimiser l’utilisation des échantillons cérébraux prélevés. Les phases de mise au point des chirurgies (étapes 1) et 2) dans la description du projet) font partie de cette optimisation afin de réduire le nombre d’animaux dans les étapes ultérieures, et seront arrêtées une fois la technique mise au point.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux recevront un traitement analgésique avant, juste après et 24 à 48h suivant l’intervention, puis si nécessaire un traitement antibiotique. Chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation d’un modèle de dépression et de neurostimulation, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les animaux seront adultes (âgés d’environ 8 semaines ou plus) au début de l’étude. Justification : il s’agit de comprendre ces phénomènes dans un cerveau adulte (8 semaines correspondant au début de l’âge adulte chez la souris.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer une maladie d'Alzheimer, elles reçoivent cinq injections intraveineuses espacées de deux semaines et subissent quatre tests comportementaux dont la nature n'est pas précisée, pour étudier le rôle des lymphocytes B. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable puisque les animaux sont tués avant six mois, âge où la forme grave apparaît. Il présente au conditionnel de futures stratégies thérapeutiques et justifie le recours à un "organisme vertébré" par les explorations comportementales.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle des lymphocytes B dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections par voie intraveineuse (5 injections espacées de deux semaines) et des tests comportementaux (au nombre de 4).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucun effets indésirables sur les animaux car les animaux développeront une maladie modérée. Dans ce modèle bien caractérisé, les souris développent une maladie grave à l'age de 12 mois et donc bien après la période de leur utilisation dans notre étude. Tous les animaux seront euthanasiés à l'age de six mois maximum. En revanche, les animaux pourront développer des effets indésirables au cours des injections et des contraintes liées aux test comportementaux. Nous avons alors établi des points limites afin de limiter au maximum ces éffets indésirables.

Devenir

Les animaux que nous utilisons développent spontanément une maladie grave à l'age de 12 mois. Tous les animaux seront donc utilisés et euthanasiés au plus tard à l'age de 6 mois. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale profonde préalable (mélange de Kétamine 180 mg/kg et de Xylazine 10 mg/kg en injection intrapéritonéale sous un volume de 0,01ml/g du poids de la souris). Cette méthode d'euthanasie respecte la réglementation européenne.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle des cellules B dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.

Choix des espèces

Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de six semaines seront utilisées.