Système nerveux

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolées en cage individuelle pendant plus de quatre semaines, elles reçoivent un régime riche en fructose et trois injections intrapéritonéales, puis subissent un test du labyrinthe en croix surélevé et un test de nage forcée pour mesurer anxiété et dépression. Le porteur reconnaît un stress modéré lié à l'isolement, aux injections et à la nature même des tests. Il présente ce projet comme "essentiel" et affirme l'impossibilité de modéliser hors de l'animal le lien entre microbiote, cerveau et comportement.

Objectifs

Pendant des milliers d'années, les humains ont consommé moins de 5 g de fructose par jour. Au 19ieme et 20ieme siècles la baisse du prix du sucre et la conversion industrielle du glucose en sirops de maïs à haute teneur en fructose à l'échelle mondiale a entraîné une augmentation drastique de la consommation de sucre ce qui a multiplié par un facteur 40 la consommation de fructose. Cependant plus de 50% de la population adulte et 80% des enfants de moins de 5 ans ne peuvent pas absorber complètement une charge de 25 g de fructose, alors que l'apport quotidien moyen est de 50-80 g. Ainsi, les changements dans les habitudes alimentaires ont créé des conditions de malabsorption du fructose. Or le fructose apparait de plus en plus comme un facteur de risque pour le développement de troubles fonctionnels cérébraux (apparition de troubles cognitifs, émotionnels et troubles du comportement alimentaire). Cependant les mécanismes liant fructose et troubles de l’humeur demeurent inconnus. Nous avons montré que la consommation excessive de fructose de par la malabsorption à laquelle elle est associée entraîne de profondes modifications du microbiote intestinal et de la production d’une molécule par l’intestin, la cholécystokinine, qui participe à la régulation de l’ingéré alimentaire. Or le microbiote intestinal est de plus en plus reconnu comme étant impliqué dans les troubles de l’humeur et du comportement alimentaire. Nous émettons l’hypothèse que des modifications du métabolisme du microbiote induites par l'ingestion de fructose pourraient donc participer indirectement au développement de troubles de l'humeur et à la modification du comportement alimentaire. Nous émettons également l'hypothèse que ces changements de comportement sont en lien avec l'habilité de ce microbiote à activer la production de cholécystokinine. Ces 2 hypothèses seront testées dans ce projet. Pour cela deux modèles de souris génétiquement modifiées présentant une malabsorption du fructose ainsi que des souris ne présentant pas cette altération seront utilisées. Le projet comprend une procédure permettant d’évaluer l’ingéré alimentaire ainsi que l’état état d’anxiété et de dépression en réponse à une malabsorption du fructose et en présence ou pas d’inhibiteur pharmacologique de la cholécystokinine. Les souris recevront un régime contenant 20% ou pas du tout de fructose pendant 3 semaines et 5 jours.

Bénéfices attendus

L'impact d'une alimentation déséquilibrée sur les fonctions cérébrales est une préoccupation de santé publique. La surconsommation de fructose a été pointée par l'Anses comme potentiellement nocive. Jusqu'à présent, la plupart des études se sont concentrées sur l'impact négatif de la surconsommation de fructose sur le syndrome métabolique. Des études épidémiologiques suggèrent que les régimes enrichis en fructose favorisent le dévelopement de comportements de type anxieux ou dépressif. Récemment le rôle du microbiote dans ce type de comportement a été décrit. Compte tenu de nos données préliminaires il apparait plus que probable que dans le contexte de l'ingestion excessive de fructose (et donc de sa malabsorption), le microbiote participe à ses effets déléteres notamment sur les troubles de l'humeur. Ce projet est essentiel à la compréhension des mécanismes de régulation du stress et de l'anxiété par le fructose.

Procédures

Les animaux recevront un régime riche en fructose susceptible de diminuer leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Les animaux vigiles recevront 3 injections intra péritonéales durant l'ensemble de la procédures (quelques secondes par injection). L'ensemble des animaux seront soumis à 2 tests comportementaux (un test du labyrinthe en croix surélevé de 5 minutes et un test de nage forcée de 6 minutes) afin de mesurer leur niveau d'anxiété et de dépression.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle pendant 4 semaines et 5 jours ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux malabsorbant le fructose réduisent de 5 à 10% leur ingéré alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition à un régime contenant 20% de fructose. Le poids et l'ingéré de ces animaux sera surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. Les animaux soumis aux tests d'anxiété et dépression subiront un stress modéré lié à la nature même des tests. Ce stress durera le temps du test (5 minutes pour le labyrinthe en croix et 6 minutes pour la nage forcée). L'injection IP pratiquée par un expérimentateur expérimenté constitue un stress modéré notamment dû à la contention. Ce stress est cependant très limité dans le temps (quelques secondes seulement). Aucune douleur n'est attendue durant le protocole.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthansié à la fin de la procédure

Remplacement

le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les liens entre composition du microbiote, cerveau et comportement alimentaire/comportement d'anxiété-depression.

Réduction

Afin de réduire de nombre d'animaux nous proposons dans cette étude d'étudier le comportement alimentaire et le comportement d'anxiété et de dépression sur les memes animaux. Un nombre de 20 animaux par groupe a été calculé afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80% ) compte-tenu de la variabilité connue des paramètres.

Raffinement

L’ensemble des animaux bénéficiera d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abris en propylène rouge.Les animaux seront surveillés quotidiennement (surveillance visuelle plus suivi de l'ingéré alimentaire et du gain de poids). Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau excel quotidiennement. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considéré comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours seront également considérés comme des points limite entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont d'une lignée C57Bl6 car on dispose dans cette lignée de souris génétiquement modifiées permettant l'étude des mécanismes de régulation du comportement lié à la malabsorption du fructose (un sucre majeur de notre alimentation). Ce modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies liées à l’alimentation et nous avons une expertise propre sur ces modèles animaux. Des animaux adultes sont utilisés, comme dans nos études préliminaires, car le microbiote est stable à ce stade.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une cécité est provoquée en sept jours par injection de méthylnitrosourée, qui détruit les photorécepteurs, puis les souris subissent deux tests comportementaux visuels dont la nature n'est pas précisée et une électrorétinographie sous anesthésie, pour comparer des animaux sauvages et des animaux dépourvus de la protéine FMRP. En s'appuyant sur la littérature, le porteur affirme que cette perte rapide de la vue n'engendre ni anxiété ni signe de souffrance. Il décrit le modèle animal comme "indispensable" et renvoie une éventuelle thérapie génique chez l'homme au conditionnel.

Objectifs

Parmi les troubles de la vision, les maladies rétiniennes sont une cause importante de morbidité oculaire et de déficiences visuelles. Des études de population ont rapporté une prévalence des troubles rétiniens, en particulier des troubles de la dégénérescence rétinienne (DR), allant de 5,35 % à 21,02 % chez les personnes âgées de 40 ans et plus. La dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie pigmentaire sont les manifestations pathologiques les plus courantes de la DR qui conduisent à une cécité irréversible. Ces pathologies visuelles sont dues à l'apoptose des cellules neurales de la rétine ou des tissus de soutien adjacents, principalement en raison de dommages oxydatifs cumulatifs et prolongés. Bien que les manifestations cliniques de ces maladies aient été entièrement élucidées, il est clair que les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents restent à comprendre. Très récemment, un nouveau régulateur pivot de l'apoptose et de la réponse au stress oxydatif a été mis en évidence dans le tissu cérébral : la protéine FMR (FMRP). Dans la rétine, cette protéine est également connue pour être directement associée à des déficits fonctionnels rétiniens. Notre projet vise donc à mieux étudier le rôle de la FMRP dans les mécanismes de la DR. L'identification de nouveaux acteurs dans le processus de dégénérescence de la rétine nous permettra de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles stratégies de prévention pour une meilleure prise en charge des patients. Actuellement il n’existe aucun traitement curatif de ces pathologies. Sur la base de ces résultats récents et de l'implication bien connue des mécanismes de stress oxydatif et d'apoptose dans la dégénérescence rétinienne, notre projet vise à mieux caractériser le rôle de la FMRP dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne. La question est de mettre en évidence le rôle de FMRP, dans un modèle murin validé de DR, en comparant les résultats de souris sauvages (WT) versus des souris n'exprimant pas FMRP (KO FMR1).

Bénéfices attendus

Notre stratégie expérimentale (utilisation conjointe des souris KO FMR1 et d’un modèle validé de DR) vise à mieux comprendre le rôle de la FMRP dans les mécanismes de la DR, et donc de caractériser si FMRP est une bonne cible thérapeutique dans les DR. Des stratégies ciblées de thérapie génique pourront être envisageables chez l'homme sur la base de ces travaux.

Procédures

1/ Injection i.p (traitement unique), 2/Manipulation pour analyses comportementales (2 tests - 30 minutes) dans le but de caractériser les conséquences de la DR sur des comportements "visuels", et 3/Anesthésie pour l'étude de la fonction rétinienne (ElectroRétinoGraphie ou ERG) (anesthésie unique - 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle « MNU ou MethylNitrosoUrea» de DR utilisé est extrêmement utilisé et validé dans la littérature. Ce modèle va induire une mort spécifique des cellules de la rétine (photorécepteurs), entrainant une perte rapide (7 jours) de la vision chez la souris. Cette perte de la vision est similaire à celle retrouvée chez les patients atteints de DR. Une étude récente utilisant un modèle similaire de DR induite par le MNU a montré l’absence de comportement anxieux ou de souffrance 1 à 2 semaines après injection d et, ceux malgré la perte rapide des paramètres visuels (acuité etc…). Ainsi, dans notre schéma expérimental, la perte rapide de vision n’engendre pas de comportements anxieux ou manifestation comportementale de souffrance (douleur, prostration, hyperactivité etc..).

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort en fin de la procédure, et ce par dislocation cervicale. Ainsi, à chaque temps expérimental (Jour 1, 2, 3, 5 et 7 post-traitement), un lot d’animaux sera mis à mort directement après l'étude de la fonction rétinienne et ce, encore sous anesthésie.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de la DR ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. Dans le cadre de ce projet s’intéressant au rôle de FMRP dans les DR, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires au niveau de la rétine (neurones et cellules gliales). Bien que les expériences in vitro sur cultures cellulaires soient utilisées (lignées cellulaires de cellules rétiniennes : cellules de Müller), aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et la communication cellulaire entre les différents acteurs de la DR.

Réduction

Notre objectif est d’obtenir une bonne robustesse de l’analyse statistique tout en réduisant le nombre d’animaux par lot. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour ce projet in vivo, il y a 5 temps expérimentaux (Jour 1, 2, 3, 5 et 7) avec 8 souris traitées et 8 souris non traitées par génotype (WT et KO FMR1) et par temps soit 32 x 5 = 160 souris au total. A chaque temps expérimental, l’ensemble des animaux seront analysés en comportement et fonction rétinienne (ERG). Puis la moitié des animaux sera mise à mort pour l’étude histologie (prélèvement des yeux) et l’autre moitié sera mise à mort pour les analyses de biologie moléculaire (prélèvement de rétines). Chaque expérience sera répétée trois fois pour une reproductibilité des résultats soit 480 souris au maximum pour 3 ans. Ainsi, nous obtiendrons pour chaque paramètre testé (comportement et ERG) 24 points expérimentaux par temps et par génotype ce qui est un minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats.

Raffinement

Une surveillance et une manipulation quotidiennes des animaux seront effectuées pendant la période d’acclimatation (15 jours) et d’expérimentation. Ces manipulations permettront de limiter le stress de l’animal lors du traitement (injection unique i.p). Par ailleurs, selon les données de la littérature, les animaux traités ne présenteront pas de phénotype autre que la perte de la vision. Les animaux seront hébergés en cage à cap standard au nombre maximum de 5 souris par cage. Nous disposerons dans les cages dès le début de l'expérience, des boules de coton compactées comme enrichissement du milieu. Par ailleurs, l’état général des animaux sera évalué quotidiennement durant toute la durée de l’expérience pour détecter tous signes éventuels de souffrance (3 points limites mis en place). On ne s’attend pas à avoir d’atteinte du point limite dans notre étude. Néanmoins une grille de score quotidienne sera tenue durant le temps d’expérimentation. Les animaux seront mis à mort s’ils présentent des signes de souffrance.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires rétiniennes et leurs conséquences comportementales. Pour notre projet, l’utilisation de la souris est primordiale puis que le couple structure/fonction de sa rétine comme le processus de la DR sont proches de ceux observés chez l’homme. De même, l’existence d’un modèle murin KO FMR1 (disponible au laboratoire) va faciliter l’étude du rôle de FMRP dans la DR.

52 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une démyélinisation focale leur est induite par injection stéréotaxique de lysolécithine, modèle de sclérose en plaques, suivie de jusqu'à cinq anesthésies générales par mois, d'amincissements du crâne et de séances d'imagerie par IRM et ultrasons. Une partie des animaux est étudiée éveillés, avec un cadre fixé en permanence au crâne, et le porteur indique que la démyélinisation reste locale sans déficit moteur, les animaux étant tués pour analyse du cerveau. Il affirme que ni les réseaux de neurones ni les organoïdes ne permettent d'évaluer le retentissement d'une démyélinisation focale.

Objectifs

La démyélinisation focale d’un faisceau de matière blanche cérébrale par une injection in situ de lysolecithine est un modèle animal de la sclérose en plaques humaine largement utilisé depuis plusieurs décennies pour disséquer les mécanismes moléculaires et cellulaires de la démyélinisation et remyélinisation. Cependant l’impact fonctionnel (la connectivité entre différentes aires cérébrales) de cette démyélinisation focale a été quasiment ignoré jusqu’à présent. Ce projet permettra de caractériser cet aspect peu étudié, en mobilisant des approches d’imagerie (IRM, ultrasons) et de comportement.

Bénéfices attendus

Les maladies démyélinisantes du système nerveux central et notamment la sclérose en plaque font parties des maladies invalidantes chez le jeune adulte. Ce projet permettra de mieux comprendre l’impact fonctionnel de la démyélinisation focale par l’utilisation de ce modèle animal. Cet aspect inexploré du modèle animal permettra ensuite de définir de marqueurs fonctionnels qui pourront servir pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à un maximum de 5 anesthésies générales sur une période d’un mois. La première sera réalisée au moment de l’injection de la substance démyélinisante (1h), la seconde pour l’examen IRM (30 min) et dans le cas où l’induction du modèle est confirmée, de l’amincissement du crâne (30 min). Une troisième anesthésie sera réalisée au cours de la première session d’imagerie ultrasonore (1h). La quatrième anesthésie sera afin de réaliser le deuxième amincissement du crâne et la dernière pour la deuxième session d’imagerie ultrasonore.

Impact sur les animaux

L’injection de la substance démyélinisante (lysophosphatidylcholine) s’effectue via une chirurgie stéréotaxique et produit une démyélinisation focale limitée au niveau du site d’injection. Cette démyélinisation locale n’entraîne pas de déficit moteur. L’amincissement du crâne est réalisé avant chacune des sessions d’imagerie fUS, afin de maximiser le signal ultrasonore. Une partie des animaux sera étudiée en condition d’éveil et dans ce cas un cadre permettant supportant la sonde ultrasonore sera fixé de manière permanente sur le crâne des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour prélèvement du cerveau et analyse post-mortem.

Remplacement

Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (IRM, ultrasons) permettant d’étudier la connectivité entre aires cérébrales, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants. Ni les réseaux de neurones, ni les organoïdes cérébraux, ne permettent aujourd’hui d’évaluer le retentissement global (entre aires cérébrales) d’une démyélinisation focale (limitée à un faisceau de matière blanche). De plus, l’utilisation de l’animal vivant permet de relier les données d’imagerie à des performances en tâches comportementales, et ainsi de définir des biomarqueurs fonctionnels qui pourront ensuite être utilisés pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. La sonde ultrasonore est adaptée au rongeur.

Réduction

Chaque animal sera utilisé au cours de plusieurs séances d’imagerie. Ce suivi longitudinal permet de suivre des modifications structurales et fonctionnelle sans avoir à sacrifier les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique. Un nombre minimum de 8 animaux par groupe seront nécessaire afin de permettre une puissance statistique suffisante avec une variabilité de 5 % et obtenir un résultat fiable en procédure 1. Cette estimation est basée sur les travaux les plus récents utilisant cette technique d’imagerie ultrasonore pour sonder la connectivité cérébrale par groupe. Considérant que 20% d’échecs peuvent survenir au moment de l’injection stéréotaxique (nécrose ou démyélinisation trop faible), et 20% au moment de l’amincissement du crâne, un nombre de 12 animaux par groupe, soit un total de 24 animaux sera requis pour la procédure 1. Les procédures 2 et 3 sont conditionnées à la réussite de la procédure 1 et sont envisagées comme des expérimentations pilotes sur un petit nombre d’animaux. Ainsi, pour la procédure 2, qui vise à établir la faisabilité de l’imagerie fUS chez l’animal éveillé, 10 animaux seront nécessaires au maximum. Pour la procédure 3, qui vise à tester d’autres sites d’injections du corps calleux, 6 animaux sont envisagés par site d’injection soit 18 animaux en tout. L’ensemble du projet nécessite 52 rongeurs.

Raffinement

Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés après la chirurgie : perte de poids > 15 % depuis le début de la procédure ; poils très ébouriffés, posture anormale, yeux fermés, immobilité. Les actes chirurgicaux (injection stéréotaxique, amincissement du crâne) seront réalisés sous anesthésie générale avec analgésie adaptée (buprénorphine), thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. La douleur sera réduite au maximum par l’administration répétées d’analgésiques dès l’apparition de signes. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et si nécessaire, l’euthanasie serait effectuée. Les scéances d’imagerie fUS seront réalisé avec une sonde de taille adapté aux crânes des rongueurs. Les expériences chez l’animal éveillé seront précédées par une phase d’habituation afin de minimiser le stress.

Choix des espèces

L’utilisation du rat est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau du rat est proche de celle de l’homme. Le modèle de démyélinisation focale est très bien caractérisé et maîtrisé chez cette espèce. L'imagerie ultrasonore peut être réalisée en condition optimales grâce à une sonde de taille adaptée, et de poids adapté (20g avec le cable) permettant à l'animal éveillé de rester libre de ses mouvements. Rats adultes (6-8 semaines), Crl:CD(SD) Travail sur des animaux adultes ayant un dévéloppement cérébral achevé.

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes dans deux régions profondes du cerveau, puis une restriction alimentaire maintenue à 90 % de leur poids pour les motiver à une tâche de labyrinthe en T récompensée par un granulé de sucre. Le porteur décrit précisément cette tâche de conflit de réponse et indique que la chirurgie et la manipulation quotidienne génèrent stress et douleur, atténués par analgésie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer une tâche comportementale et que l'étude ne peut être menée chez l'humain.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet dans le domaine des Neurosciences Cognitives est de comprendre les mécanismes neuronaux sous-tendant le contrôle de l'action dans le cadre de situations ou des actions impulsives et inappropriées peuvent prendre le pas sur le comportement volontaire d’un sujet, ce qu'on appelle dans le milieu un conflit de réponses. Ce travail repose principalement sur des méthodes électrophysiologiques et comportementales pour comprendre la manière dont les rongeurs peuvent résoudre des tâches de conflit de réponses, et comment différentes régions du striatum participent à ce processus. Le striatum étant une structure profonde du cerveau que l'on sait impliqué de manière importante dans le contrôle de l'action et la motricité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le fonctionnement de deux structures cérébrales, le striatum dorso- médian et le striatum dorso-latéral, ainsi que les processus cognitifs sous-tendant le contrôle de l'action.

Procédures

Les animaux seront soumis à un acte chirurgicale pour implanter des électrodes d'enregistrement intracérébrales. Ils seront également soumis à une tâche comportementale sur un labyrinthe en T, dans laquelle ils apprendront à se diriger vers un des deux bras du T sur la base d'un stimulus instructeur (une lumière indiquant le chemin à suivre), afin d'obtenir une récompense alimentaire (un granulé de sucre). Au total, 20 rats participeront à cette expérience qui devrait durée environ 5 mois.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux découlent principalement de - la restriction alimentaire tout le long du protocole comportementale: l'évolution du poids des animaux sera maintenue à une progression mensuelle de 10% tout au long du protocole à partir d'un poids initial correspondant à 90% du poids de l'animal avant le début de la restriction (pour garantir la motivation des animaux à effectuer la tâche comportementale) - la chirurgie: les animaux subiront une chirurgie pour implanter des électrodes au sein des deux structures visées (le striatum dorso- médian et le striatum dorso-latéral) - La manipulation par l'expérimentateur et la tâche comportementale: Les animaux seront manipulés quotidiennement par l'expérimentateur; le stress que cela pourrait générer sera toutefois minimisé par une habituation longue et adaptée aux besoins de chaque animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, les cerveaux de tous les animaux seront prélevés pour des analyses histologiques. Ces analyses sont en effet indispensables pour confirmer le bon positionnement des électrodes d'enregistrement dans les structures ciblées. Sans cela, il est impossible de s'assurer que l'activité neuronale enregistrée provient bien des deux structures qui nous intéressent.

Remplacement

La nature même des expériences ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elles reposent sur une tâche comportementale que les animaux effectuent et ne peuvent pas être réalisées à partir de modèles in vitro ou in silico. Ce projet ne peut pas non plus être réalisé chez l’humain car les résolutions spatiale et temporelle étudiées nécessite l’implantation d’électrodes dans des structures cérébrales profondes.

Réduction

Le matériel d’enregistrement électrophysiologique que nous utiliserons (microdescendeurs à haute densité) permettra de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet en maximisant le nombre de neurones enregistrés par animal. En effet, ce système permettant de bouger verticalement la position des éléctrodes prévient la formation d'une cicatrice gliale autour de celles-ci qui pourrait empêcher l'enregistrement de l'activiter neuronale assez rapidement après implantation si le système été fixe. On peut ainsi enregistrer plus de neurones, plus longtemps, entraînant le besoin de moins d'animaux. La méthode d’implantation que nous utiliseront (électrodes placées simultanément dans les deux structures visées chez un même rat, au lieu d'utiliser deux groupes différents, un pour chaque structure) permettra également de réduire ce nombre de 50%.

Raffinement

Avant la chirurgie les rats seront hébergés dans des conditions standards avec de la litière foisonnante et un tube en plastique ou une barrette de bois comme enrichissement. L'hébergement standard prévoie également de garder les animaux en binômes permettant ainsi un enrichissement social de leur environnement. Après la chirurgie les rats implantés seront hébergés individuellement dans des cages rehaussées de 13cm pour qu'ils puissent se redresser sans que l'implant ne gêne leurs mouvements. L'enrichissement matériel de l'environnement sera toujours présent. Durant la procédure chirurgicale, l'anesthésie générale profonde sera assurée par l'association d'un agent volatil (isoflurane) et d'un dérivé morphinique (buprénorphine). La buprénorphine agira également comme un analésique puissant pendant 6h après l'injection, couvrant donc la totalité de la durée de la chirugie et sera également associé à un anti-douleur longue durée (carprophène, 24h d'action) et un analgésique local (lidocaïne) assurant ainsi une couverture analgésique optimale pendant la chirurgie. Durant la phase post-chirurgicale, l'animal aura accés à un complément alimentaire riche en eau et en nutriments (hydrogèle) en plus de sa nourriture standard ad libitum pour faciliter sa rémission. Le suivi de l'état de l'animal dans la phase post-chirurgicale sera fait deux fois par jour durant toutes la période de rémission (7 à 10 jours) et visera à évaluer le niveau de douleur et de détresse du rat. Une prise en charge analgésique sera mise en place si nécessaire. Le dégré sera adapté à l'état de l'animal pour faire disparaître toute manifestation de douleur ou de détresse. Egalement, la procédure comportementale sera précédée d'une période d'habituation à l'expérimentateur et au matériel expérimental (labyrinthe en T) visant à faire disparaître tout stress ou détresse de quelque nature que ce soit liés à la manipulation. Cette période d'habituation pourra être de durée variable en fonction des besoins des animaux. Le niveau de stress étant évalué par l'expérimentateur à chaque manipulation. Finalement, afin de maximiser le confort des animaux durant la tâche comportementale, les tests seront fait dans la pénombre.

Choix des espèces

Le rat présente de grandes capacités à la fois d'exploration de l'espace et de contrôle de l'action. Ses performances dans des labyrinthes spatiaux (tels que le labyrinthe en T) et dans des tâches de planification et de contrôle de l'action sont excellentes. De plus, une vaste littérature existe sur ces sujets, ce qui nous permettra de comparer les résultats que nous obtiendrons en utilisant une procédure comportementale innovante avec ceux déjà existants. Egalement, nos travaux antérieurs ont été réalisés chez le rat, ce qui facilite la comparaison des résultats entre eux. Finalement, il s'agira de rats à l'age adulte (3 mois au début de l'expérience). La question scientifique posée ne porte ni sur le développement ni sur le vieillissement des processus cognitifs étudiés. Des animaux jeunes adultes qui devraient avoir des capacités cognitives inchangées tout au long de l'expérience et jusqu'à sa fin sont donc les modèles les plus appropriés.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène cinq jours de suite pour supprimer le gène Pk2 dans les oligodendrocytes, puis sont anesthésiées pour une perfusion terminale du cerveau. Le porteur indique que ces injections répétées sont un facteur de stress douloureux et que la délétion peut entraîner des troubles locomoteurs, voire des crises d'épilepsie. Il relie ce travail fondamental à l'autisme et à la maladie d'Alzheimer chez l'humain, mais affirme qu'aucun modèle in vitro ni informatique ne peut reproduire ces interactions cérébrales.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : (1) créer deux lignées de souris dans lesquelles nous pouvons supprimer spécifiquement le gène Pk2 dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire. (2) étudier l'effet de la délétion de Pk2 sur les cellules de la lignée oligodendrocytaire.

Bénéfices attendus

Ce projet étudiera pour la première fois le rôle du gène de polarité Pk2 spécifiquement dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire. Nos expériences visent à comprendre le rôle de ce gène au niveau cellulaire. Chez l'homme, la déficience de Pk2 a été liée à l'autisme et des altérations de Pk2 ont été observées dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Dans l'autisme, les circuits neuronaux qui sous-tendent certains comportements sont altérés et les oligodendrocytes jouent un rôle dans la stabilisation des circuits neuronaux et la facilitation des connexions neuronales. Notre recherche contribuera donc à évaluer si les oligodendrocytes pourraient être considérés comme une cible putative dans ces pathologies.

Procédures

Les animaux recevront une injection intrapéritonéale de tamoxifène pendant 5 jours consécutifs, après es souris resteront ensuite en vie jusqu'à la fin de la période expérimentale. Pour chaque injection, l’animal sera manipulé par l’expérimentateur entre trente secondes et une minute. L'injection aura lieu pendant ce temps et durera environ 10 à 15 secondes. À la fin de l'expérience, les animaux recevront une injection intrapéritonéale pour induire une anesthésie profonde afin de réaliser une perfusion transcardiaque sous anesthésie. Dans la mesure du possible, les animaux seront anesthésiés par inhalation d'isoflurane à 3 % avant l'injection pour l'anesthésie terminale afin de réduire davantage le stress. L'induction à l'isoflurane prendra environ 3 minutes et l'injection en intrapéritonéal de l’anesthésique prendra 10 secondes. Une anesthésie profonde est obtenue dans les 5 à 10 minutes en fonction de l'induction préalable à l'isoflurane.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale inflige aux animaux des injections intrapéritonéales pendant 5 jours consécutifs. Il s'agit d'un facteur de stress récurrent et d'une procédure qui peut être douloureuse pour les souris. La délétion de Pk2 dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire pourrait avoir un effet négatif sur les souris en entraînant des modifications de l'activité locomotrice et, potentiellement, le knockout pourrait conduire avec une faible probabilité à des crises d'épilepsie.

Devenir

Les souris recevront une injection intrapéritonéale de tamoxifène pour induire une invalidation génique conditionnelle. Les souris resteront ensuite en vie jusqu'à la fin de la période expérimentale. La durée maximale de la période expérimentale est définie comme étant de 8 semaines après la dernière injection (âge maximal de 100 jours ou 14 semaines). Cette période est nécessaire pour s'assurer que la délétion génétique est effective. Après un maximum de 8 semaines, nous serons en mesure d'étudier l'effet cellulaire de l’invalidation génique conditionnelle. À la fin de l'expérience, toutes les souris seront profondément anesthésiées et le cerveau sera préservé par perfusion intracardiaque de fixateur. Une analyse histologique ultérieure sera effectuée au niveau cellulaire. Cette procédure sera effectuée pour tous les animaux afin d'effectuer une analyse biologique et statistique des différentes étapes d'analyse prévues.

Remplacement

Le projet a pour but d'étudier la trajectoire développementale et de signalisation cellulaire de la lignée oligodendrocytaire dans le cerveau murin. La suppression des gènes induite par l'injection de tamoxifène est déterminée par l'âge de développement de l'animal et le stade cellulaire. Cette chronologie complexe ne peut être reproduite in vitro car les voies de signalisation putatives nécessitent des interactions intactes entre les différentes cellules du cerveau. Il n'existe aucun modèle informatique ou "in vitro" capable d'imiter ces processus biologiques tout en respectant la physiologie ; l'utilisation d'animaux est donc nécessaire pour étudier ce mécanisme biologique fondamental.

Réduction

Notre approche expérimentale nous permettra d'aborder les questions expérimentales avec les meilleures expériences possibles. Le nombre d'animaux sera réduit au minimum, tout en permettant des tests statistiques robustes et des expériences contrôle suffisantes. La production de souris sera optimisée en mettant en place un programme d'élevage qui correspond étroitement à la demande et qui est mis à jour tous les 3 mois. Nous élèverons le nombre minimum d'animaux nécessaires pour réaliser les expériences.

Raffinement

L'approche expérimentale est affinée par l'utilisation d'une délétion génétique conditionnelle qui minimise les effets indésirables sur les organes et les cellules non concernés. Ainsi, la délétion du gène Pk2 dans l'oligodendrocyte ne se produit qu'après l'injection d'un modulateur (tamoxifène). Cette injection est effectuée à des moments expérimentaux précis au cours du développement de la souris. Nous mettrons en œuvre les meilleures pratiques pour garantir le bien-être des animaux en ajoutant un enrichissement aux cages, en traitant si nécessaire les douleurs survenues, en limitant tout risque d'infection et en limitant la souffrance des animaux lorsque les objectifs expérimentaux sont atteints.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. Par définition, pour nos études intégrées évaluant l’impact d’une mutation d’un gène sur le cerveau et les troubles du comportement, l'utilisation de techniques in vitro ou d'organismes d'une plus faible sensibilité neurophysiologique (invertébrés par exemple) n'est pas appropriée pour les questions auxquelles nous cherchons à répondre. En outre, la création de modèles animaux est très importante. Par conséquent, nous pensons qu'il n'existe pas de remplacement disponible qui permettrait d'atteindre les objectifs scientifiques du travail proposé. Pour le maintien de l'élevage, nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines ou plus. L’invalidation génique chez les souris expérimentales sera induit à différents moments. Pour supprimer le gène Pk2 dans les cellules précurseurs des oligodendrocytes, des injections de tamoxifène auront lieu entre les jours postnatals 2 et 7 et entre les jours postnatals 28 et 40. Pour le ciblage des oligodendrocytes, les injections de tamoxifène auront lieu entre les jours postnatals 11 et 21 et 28 et 40. Toutes les analyses seront effectuées lorsque les souris seront âgées de 3 semaines à 14,5 semaines. L'analyse à ces différents moments est nécessaire d'un point de vue scientifique car nous analyserons le rôle de la Pk2 dans le développement des cellules de la lignée oligodendrocytaire et dans le maintien des oligodendrocytes chez l'animal adulte.

3 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats spontanément hypertendus servent de modèle du trouble de l'attention avec hyperactivité, testés jeunes entre trois et six semaines pour se rapprocher de l'enfant, placés seuls dans une enceinte pendant 150 minutes après administration d'un composé, puis tués pour prélever sang et cerveau. L'effectif est important et les procédures sont décrites brièvement. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour évaluer le TDAH et que le recours à l'animal de laboratoire est "nécessaire".

Objectifs

Le trouble d'hyperactivité avec déficit de l'attention (TDAH) est un trouble complexe du développement cérébral caractérisé par l'hyperactivité/l'impulsivité et l'inattention. Cette affection touche principalement les enfants et les adolescents, mais elle peut également perdurer à l'âge adulte. Les rats SHR sont des rats spontanément hypertendus présentant une hyperactivité locomotrice et qui sont considérés comme un modèle animal validé du TDAH. Les rats WIstar Kyoto (WKY) servent de souche témoin. L’objectif de la présente étude est d’examiner l’effet d’un composé sur l’hyperactivité des rats SHR dans un test d’activité locomotrice spontanée. Ce modèle animal est un outil précieux pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux ainsi que le développement neuronal mis en jeu dans le TDAH.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif, seul des médicaments modulant les transmissions aminergiques tels ques les psychostimulants (ex :Méthylphénidate) et non psychostimulants (ex : Atomoxétine) sont utilisés actuellement comme pharmacothérapies. Ces médicaments augmentent les transmissions dopaminergiques et noradrénergiques; ces systèmes de neurotransmission sont les cibles privilégiées dans la recherche de nouveaux traitements. De nombreuses recherches sur ce trouble, utilisant des approches génétiques, pharmacologiques et de neuro-imagerie, ont été réalisées. Plusieurs modèles animaux de TDAH tels que : le rat spontanément hypertendu (SHR) ou les souris knock-out DAT, ont également été utilisés. Ces modèles animaux sont donc des outils précieux pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux du TDAH.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

1) L’un des modèles animaux du TDAH les plus utilisés est le rat spontanément hypertendus (SHR) et la souche témoin du rat SHR, le rat Normotendu Wistar Kyoto (WKY). Le rat SHR montre des niveaux élevés d’hyperactivité et d’impulsivité ; ces traits sont présents avant que le rat SHR ne développe une hypertension à l’âge adulte, c’est-à-dire vers l’âge de 7- 8 semaines. Dans ce projet, l’âge des animaux est compris entre 3 à 6 semaines au moment du test ; étant donné que le TDAH affecte principalement les enfants/adolescents, il est plus pertinent d’étudier les psychostimulants/molécules candidats sur des animaux juvéniles. Par conséquent, les animaux de ce projet n’ont pas encore développé l’hypertension spontanée. 2) Le test consiste à placer les animaux individuellement dans une enceinte et à les laisser se déplacer librement pendant une période de 150 minutes comprenant une première période d’habituation de 30 minutes et une deuxième période de test de 120 minutes. 3) Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test à un intervalle de 2 semaines. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant (produit destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou biodisponibilité nécessitant un autre mode d’administration) les voies intrapéritonéales, sous cutanée ou intraveineuse peuvent être choisies L’administration de nouveaux candidats médicaments peut entraîner certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation qui peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer TDAH. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 10 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.

Raffinement

►1) Les animaux sont hébergés selon les normes d’hébergement (annexe II de l’arrêté relatif à l’agrément des EU). Les rats seront hébergés collectivement. Les cages comporteront une litière de sciure, des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger... ► 2) Les animaux seront pesés et leur état général évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans ce projet sont : les rats spontanément hypertendus (SHR) et la souche témoin du rat SHR, le rat Normotendu Wistar Kyoto (WKY). Les rats SHR présentent des déficits d'attention soutenue, d'impulsivité motrice et d'hyperactivité dans un nouvel environnement. De plus, ils présentent une signalisation DA réduite et une expression accrue du transporteur DA (DAT), similaire aux patients atteints de TDAH. De même, le méthylphénidate (MPH) corrige les déficiences attentionnelles et motrices chez les rats SHR, apportant un soutien supplémentaire aux rats SHR en tant que modèle de TDAH humain. 3-6 semaines au moment du test. Etant donné que le TDAH affecte principalement les enfants/adolescents, il est pertinent d’étudier les psychostimulants/molécules candidats sur des animaux juvéniles.

3 912 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dystonie cervicale, l'équivalent d'un torticolis spasmodique, leur est provoquée par micro-injection intracérébrale de DTG dans le noyau rouge après pose d'un guide-canule sous chirurgie stéréotaxique, puis des molécules d'un donneur d'ordre sont testées avant une perfusion au paraformaldéhyde. L'effectif est important pour une étude comportementale, et le projet relève d'une prestation pour un client industriel. Le porteur affirme qu'aucun modèle alternatif de dystonie cervicale n'existe et que la démonstration se fait sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

La dystonie cervicale, également appelée torticolis spasmodique, est un trouble du mouvement neurologique caractérisé par des contractions musculaires continues ou intermittentes qui provoquent des mouvements répétitifs anormaux, souvent douloureux, du cou et de la tête. Les mouvements peuvent entraîner une torsion de la tête et du cou (torticolis) ou une traction vers l'avant (antécollis), vers l'arrière (rétrocollis) ou latéralement (latérocollis). Certains peuvent avoir une combinaison de ces mouvements. En outre, les symptômes peuvent varier dans le temps et selon les individus. Les symptômes commencent généralement progressivement. Ils peuvent s'aggraver et atteindre un plateau. Le stress ou l'excitation peuvent aggraver les symptômes. De plus, certaines positions physiques peuvent activer les symptômes. Des études comportementales et biochimiques ont montré que les récepteurs σ sont impliqués dans la régulation du mouvement et de la posture. Ces récepteurs σ sont concentrés dans des structures cérébrales, telles que le noyau rouge et la substantia nigra. L’objectif de cette étude est de mettre en œuvre le modèle de dystonie cervicale chez le rat et par la suite de tester les molécules du donneur d’ordre pour étudier leur potentiel effet sur les récepteurs σ : soit en induisant, par eux-mêmes, des dystonies cervicales (effet agoniste sur les récepteurs σ2) soit en inhibant les dystonies cervicales induites par l’administration de DTG, un agoniste σ2, (effet antagoniste sur les récepteurs σ2).

Bénéfices attendus

La dystonie cervicale, également appelée torticolis spasmodique, est un trouble du mouvement neurologique caractérisé par des contractions musculaires continues ou intermittentes qui provoquent des mouvements répétitifs anormaux, du cou et de la tête. Les mouvements peuvent entraîner une torsion de la tête et du cou (torticolis) ou une traction vers l'avant (antécollis), vers l'arrière (rétrocollis) ou latéralement (latérocollis). Certains peuvent avoir une combinaison de ces mouvements. En outre, les symptômes peuvent varier dans le temps et selon les individus. Les symptômes commencent généralement progressivement. Ils peuvent s'aggraver et atteindre un plateau. Le stress ou l'excitation peuvent aggraver les symptômes. De plus, certaines positions physiques peuvent activer les symptômes. Ce modèle est utile pour tester le potentiel agoniste ou antagoniste des récepteurs σ2 de molécules induisant des dystonies cervicales.

Procédures

Le but de cette étude est de mettre en œuvre le modèle de dystonie cervicale chez le rat et ainsi permettre le développement de différentes molécules. Une micro-injection intracérébrale dans le noyau rouge de 1,3-di- (2-tolyl) guanidine (DTG), qui est un agoniste des récepteurs σ 1 et σ 2, est réalisée pour induire une dystonie du cou chez le rat. A la fin de l’étude, pour vérifier le site d’injection, les animaux sont perfusés au paraformaldehyde (PFA) et des coupes histologiques sont réalisées par la suite.

Impact sur les animaux

•1- Chirurgie -Les rats sont anesthésiés avec de l’isoflurane et placés dans un appareil stéréotaxique. Un guide canule (tubes en acier inoxydable de calibre 24) est implantée verticalement à 1.00 mm au-dessus du noyau rouge •2- Administration -Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)

Devenir

Pour vérifier le site d’injection au niveau du cerveau, les animaux seront perfusés au paraformaldehyde (PFA) à la fin de l’étude.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucun modèle de dystonie cervicale alternatif à l’animal.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables. • Justification du nombre de groupes: 1) Le groupe témoin est nécessaire à chaque expérience 2) Le groupe DTG est nécessaire pour valider l’expérience et pour comparer l’efficacité du produit testé 3) Il est généralement nécessaire de tester le produit à trois doses pour mesurer la relation dose-effet mais un nombre de doses inférieur ou supérieur peut être justifié en fonction de l’état de connaissance du produit. L’effet attendu du produit testé est une diminution de déviation de torsion de la tête par rapport au plan horizontal. Le DTG est administré en intracérébrale. Selon les études, le produit testé et son placebo sont administrés en intracérébrale ou par voies orale (gavage), intrapéritonéale, sous-cutané, intraveineuse ou intranasale. • Justification du nombre d’animaux par groupe. Compte tenu de la variabilité interindividuelle des variables mesurées dans ce test, ce nombre a été fixé à 12 animaux par groupe. L’utilisation d’un nombre inférieur d’animaux a une probabilité importante d’entraîner la non-validité de l’étude, conduisant à la refaire, et par conséquent à utiliser un nombre d’animaux plus élevé. Les données sont présentées en moyenne et d’erreurs standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux reçoivent trente minutes, avant l’acte chirurgical, une administration en sous-cutanée d’un analgésique (Opiacés ou AINS). Après la chirurgie, les animaux reçoivent 1 ml de solution de lactate Ringer en sous-cutanée et ils sont placés individuellement. Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » (Safe) mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. 24h post-opératoire, les animaux reçoivent une administration en sous-cutanée ou voie orale (per os) d’analgésique (Opiacés ou AINS). Ils sont pesés et leur état général est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. La lignée de rat utilisée est : Wistar 7 semaines au moment de la chirurgie. Les molécules développées sont destinées à des patients adultes.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le tronc cérébral, l'injection étant pratiquée sur des souriceaux de deux jours, puis des médicaments sont administrés avant une mise à mort par dislocation cervicale pour prélever les tumeurs. Le porteur situe le projet face aux tumeurs du tronc cérébral de l'enfant, cancer au taux de survie proche de zéro, l'objectif immédiat restant de valider une nouvelle lignée tumorale et l'association de deux médicaments. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit la complexité observée in vivo et que cette souche de souris immunodéficiente ne peut être remplacée.

Objectifs

Les tumeurs du tronc cérébral sont actuellement les cancers les plus mortels chez l’enfant, avec un taux de survie proche de zéro. La découverte et la validation de nouveaux traitements des tumeurs du tronc cérébral permettront de faire un pas important pour soigner les enfants souffrant de ce cancer, toujours incurable en 2021

Bénéfices attendus

Démontrer que la nouvelle lignée de tumeur du tronc cérébral forme des tumeurs chez la souris NGS et que ces cellules constituent un bon modèle d'étude pour mieux comprendre le développement de la tumeur et pour tester des médicaments. Démontrer que l’association de deux nouveaux médicaments bloque la formation de tumeur chez la souris.

Procédures

Implantation de cellules tumorales en intracrânien dans le tronc cérébral. Administration de médicaments.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certaines conditions du projet, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à cette nouvelle thérapie. La plupart des manipulations sur les animaux seront réalisés sous anesthésie générale.

Devenir

Les 320 souris de ce projet seront euthanasiées par dislocation des vertèbres cervicales afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des arppoches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris immunodéficience. Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Le test statistique utilisé sera le test l’ANOVA (test très généralement utilisé pour ces études). D’après la littérature scientifique, le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 50% d’écart type intra lots est de 10.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll » (Safe, France). En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre (cf. grille jointe en annexe). En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément au paragraphe 3 de l’annexe VIII de la directive 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures (cf. paragraphe 4).

Choix des espèces

1. La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations de l’Animalerie. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.