Système nerveux

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique de la moelle épinière avec lésion de la myéline, pour certaines une castration ou une ovariectomie, puis quatre semaines de surveillance avant le prélèvement de leur moelle épinière. Le porteur étudie le rôle du récepteur CXCR4 dans la réparation de la myéline par la testostérone, en vue de la sclérose en plaques, et affirme que les souris récupèrent vite sans séquelles. Il indique avoir mené des cultures cellulaires mais conclut que la complexité des processus "nécessite l'utilisation d'animaux".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d’identifier le rôle du récepteur de chimiokine CXCR4 dans l’effet de la testostérone et de son récepteur (AR) dans la réparation de la myéline lésée chez la souris. Les résultas obtenus auront une retombée sur la thérapie de la maldei de la sclérose en plaques.

Bénéfices attendus

A terme, ce travail permettra de confirmer ou infirmer l’implication du récepteur CXCR4 dans les effets remyélinisants de la testostérone et son AR. Le gain de fonction du CXCR4, à travers les souris WHIM, nous permettra de déterminer si on pouvait ou non rétablir le phénotype des souris. En effet, nous déterminerons si la surexpression du CXCR4 permet ou non la remyélinisation sans ajout d’implants de testostérone chez des souris castrées. Ce travail permettra de valider l’efficacité des protocoles proposés dans la réparation de la myéline des souris malades et il apportera des informations importantes sur les moyens d’optimiser le traitement de ces pathologies démyélinisantes chez les patients.

Procédures

la chirurgie par stéreotaxie sur la moelle épinière de tous les animaux sera faite une seule fois. Les animaux seront gardés dans l'animalerie pendant 4 semaines, sous surveillance, avant de les euthanasier et de leur prélever la moelle épinère. et leurs états surveillés

Impact sur les animaux

D’après nos expériences précédentes, déjà publiées, les animaux récupèrent vite après la chirurgie. ils ne gardent pas de séquelles.

Devenir

tous les animaux seront euthanasiés pour l'utilisation de leurs moelles épinères afin d'analyser le nombre d'oligodendrocytes et le marquage de la myéline dans les zones lésées.

Remplacement

Des expériences de cultures de cellules ont été réalisées, mais la complexité des processus regardés nécessite l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit à 8 par point expérimental, le minimum requis lors de nos travaux précédents de façon à mettre en évidence des différences statistiques. Nous utiliserons 336 souris en 5 ans. De même, si les résultats obtenus en utilisant les souris CXCR4GFAP/CreLoxp de la procédure N°1 montrent que les astrocytes sont indispensables pour l’effet de la testostérone sur la réparation de la myéline, nous ne réaliserons pas la procédure N°2. Ainsi, les souris CXCR4nestin/CreLoxp ne seront pas utilisées, ce qui réduirait le nombre de souris à seulement 240.

Raffinement

les animaux seront hébergés par groupe de 5 animaux par cage dans des conditions optimales d’hébergement (nourriture et eau disponible à volonté). La méthodologie expérimentale est optimisée pour utiliser le strict nécessaire d’animaux. Pendant la chirurgie, un tapis chauffant sera utilisé pour l’animal, sous anesthésie générale. A la fin de l’opération, l’animal sera traité par antalgiques et la surveillance post-opératoire sera assurée quotidiennement. Si des points-limites, préalablement établis, seront atteints, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Nous utilisons l'animal le plus utilisé par les chercheurs, la souris C57BL/6, pour leur facilité d’hébergement et d’élevage (rapidité de reproduction et nombre de souris par portée). Ces animaux constituent un excellent modèle pour l’étude des pathologies neurodégénératives. Leur génome est très bien connu, ce qui permet de les "modifier génétiquement". Cet avantage nous permet d’utiliser des souris transgéniques et des souris sauvages du même fond génétique dans nos études expérimentales. Nous utiliserons des souris transgéniques, dépourvues du CXCR4 dans toutes leurs cellules neurales (souris CXCR4Nestine-Cre-Loxp) et des souris dépourvues du CXCR4 spécifiquement dans les cellules astrocytaires GFAP (souris CXCR4GFAP-Cre-Loxp). Ces souris seront produites dans notre laboratoire après accouplement des souris CXCR4-Loxp et les souris Nestine-Cre pour les premières et avec les souris GFAP-Cre pour les secondes. Les souris WHIM seront produites et élevées par nos collaborateurs à Clamart, France. Pour les études in vivo, nous appliquerons les conditions publiées par notre équipe, à savoir des souris âgées de 8 semaines (souris jeunes adultes) pour la castration et l’ovariectomie et des souris de 10 à 12 semaines (souris adultes) pour la lésion LPC Bielecki B et al., 2016, PMID: 27930320). Notre projet d’étude de la démyélinisation et la remyélinisation in vivo mimerait les processus pathologiques accompagnant la maladie de la sclérose en plaques chez l’homme adulte.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris transgéniques développent une sclérose latérale amyotrophique évolutive, avec troubles de la démarche, perte de force musculaire et perte de poids, reçoivent une injection tous les deux jours pendant plus de trois mois, et subissent des tests de locomotion ainsi qu'un test d'évitement par choc électrique aux pattes. Le porteur indique avoir d'abord travaillé sur la drosophile puis sur des larves de poissons zèbres avant de recourir à la souris. Il affirme que les modèles murins "ne peuvent pas être remplacés" en vue d'un développement clinique.

Objectifs

notre objectif est de valider une cible thérapeutique pour lutter contre la sclérose latérale amyotrophique. Notre étude permettra d'identifier des molécules capables de réduire les défauts locomoteurs et les atteintes cellulaires liés à cette maladie

Bénéfices attendus

Valider une cible thérapeutique et identifier un/des agents thérapeutiques pour lutter contre la sclérose latérale amyotrophique

Procédures

Tous les animaux (n=768) recoivent une injection intrapéritonéale tous les deux jours. L'impact sur le comportement est évalué du 21ème jour au 124ème jour. Les tissus nerveux des animaux sont analysés post-mortem

Impact sur les animaux

Les souris utilisées présentent un phenotype pathologique avec un décours différent suivant le sexe . Les mâles ont un phénotype plus rapide et prononcé. A 30 jours : apparition des trouble de la démarche et de l'équilibre. A 60 jours : aggravation des défauts de locomotion (diminution de la force musculaire). A 90 jours : début de la perte de poids (mâles). A 120 jours : perte de poids (femelles et mâles).Comme les souris montrent des déficit au niveau intestinal, elles auront accès à de la nourriture en gelée dès le 30ème jour pour limiter la perte de poids. La nuisance liée à l'injection en intrapéritonéale tous les 2 jours est minimisée en alternant le côté d'injection. Les tests de locomotion utilisés provoquent très peu d'effet indésirable. Pour le test d'évitement, les animaux reçoivent un faible choc électrique aversif par les pattes et on note leur réaction. Les chocs sont limités en intensité et en durée de façon à limiter la nuisance aux animaux. Toute variation importante de la sensibilité aux chocs conduit à l'arrêt de la procédure. Ce test ne sera pratiqué qu'une seule fois à la fin du projet

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre l'étude des mécanismes d'action de la thérapie

Remplacement

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie complexe se traduisant par une perte progressive des neurones de la moelle épinière et du cortex moteur. Elle se traduit par une diminution progressive des capacités motrices. Pour minimiser l'utilisation d'animaux vertébrés, nous avons dans un premier temps démontrer chez la drosophile que l'activation d'un récepteur est une cible thérapeutique d'intérêt. Pour identifier 3 nouveaux activateurs de ce récepteur avec un fort potentiel thérapeutique, une série d'activateurs sera d'abord testée sur des larves de poissons zèbres de 5 jours. Ensuite pour valider les 3 meilleurs activateurs candidats, nous avons besoin d'un modèle vertébré proche de la maladie avec une perte de neurones moteurs de la moelle épinière et des déficits progressive de locomotion. Les modèles murins sont les plus adaptés à ce type d'étude et ne peuvent pas être remplacés par d'autres modèles en vue d'un futur développement clinique.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécéssaire, on se base sur les études antérieures utilisant la même stratégie thérapeutique et les mêmes tests comportementaux pour d'autres maladies neurodégénératives. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par un logiciel de statistique.

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance, l'environnement des animaux sera enrichi avec des copeaux de cartons qui permettront aux animaux de se cacher et constituer un abri. Les animaux seront également manipulés toutes les semaines afin de réduire le stress que peut engendrer un expérimentateur lors d'une procédure expérimentale. Afin de réduire la difficulté des souris transgéniques pour s'alimenter, elles auront accès à de la nourriture en gelée dès le 30 ème jour. Afin de contrôler le bien-être des animaux, les souris seront pesées deux fois par semaine dès la naissance. Une feuille de bien-être, avec les points limites sera complétée par l'expérimentateur lorsque tout comportement suspect (plaie, lésions cutanés, agressivité, stéréotypie, apathie, convulsions, ...) sera remarqué. Dès lors une grille d'évaluation sera complétée tous les jours pour le suivi de l'animal. Si une souris présentait un score de souffrance trop élevé sur la grille d'évaluation, elle sera immédiatement euthanasiée par l'expérimentateur qualifié après en avoir averti le chef de projet et le vétérinaire.

Choix des espèces

La lignée de souris transgéniques utilisée a fait l'objet de nombreuses publications et son phénotype est donc bien caractérisé. L'utilisation de ces animaux est indispensable à l'élaboration de thérapies efficaces car ils représentent un des modèles les plus pertinents de la sclérose latérale amyotrophique. Ces souris présentent une altération progressive de leurs performances motrices et mnésiques comme observée dans cette pathologie : A 30 jours : apparition des premiers défauts de locomotion A 90 jours : début de la perte significative des neurones moteurs A 120 jours : aggravation des symptômes

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Citrobacter rodentium pour reproduire un syndrome de l'intestin irritable, reçoivent un gavage de probiotiques, puis subissent un labyrinthe en croix surélevé, un test de nage forcée et une distension colorectale avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur décrit une hypersensibilité colique et un comportement de type anxieux persistant jusqu'à la fin des expériences. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur des animaux et que les modèles cellulaires in vitro ne sont pas envisageables.

Objectifs

L’hypersensibilité colique et les douleurs abdominales sont les principaux symptômes du SII. La prise en charge de ces douleurs en clinique est actuellement limitée. En effet, le manque d’efficacité des traitements disponibles rend le développement de nouveaux outils pharmacologiques nécessaire. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes de ces douleurs afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, puis de tester de nouveaux médicaments agissant sur ces nouvelles cibles. La complexité de cette pathologie faisant intervenir plusieurs organes rend impossible l’utilisation in vitro d’un modèle cellulaire. Ainsi, afin de tester de nouvelles molécules dans des conditions mimant ces pathologies, il est indispensable de développer un modèle animal présentant des origines communes à ce qui est observé chez le patient et permettant donc de reproduire ces pathologies douloureuses. Le protocole s’orientera sur les mécanismes périphériques impliqués dans l’initiation et/ou le développement d’une hypersensibilité viscérale d’origine colique sur des modèles animaux de syndrome de l’intestin irritable post-infectieux. En effet, parmi les différents facteurs étiologiques suspectés dans la physiopathologie de ces atteintes intestinales, il a été observé, chez des patients présentant de sévères douleurs abdominales, des facteurs communs tels qu’un dérèglement du système immunitaire ou des modifications de la composition du microbiote intestinal pouvant être l’origine d’une micro-inflammation locale et/ou d’une hypersensibilité viscérale d’origine colique. L’objectif de ce projet sera donc de clarifier le lien entre un désordre microbien, immunitaire et/ou inflammatoire à bas bruit et le développement d’une HSVC afin de proposer de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement de la douleur viscérale d’origine colique.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes des douleurs associées au syndrôme de l'intestin irritable afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettraient d’envisager une étude clinique grâce à une collaboration avec des services de gastroentérologie . L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au syndrome de l'intestin irritable et, in fine, à soulager les patients douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.

Procédures

Prélèvement de fèces à J3, 7, 10 et 16 post infection sur chaque souris pour évaluer l’état de colonisation du tractus digestif. Suite à cela, les souris recevront un traitement par gavage orale à base de bactéries probiotiques entre J16 et J23. A J21, les souris subiront un premier test comportementale (5 min par souris sur l'ensemble des souris) pour évaluer l'état d'anxiété des souris (Labyrinthe en croix surélevé) puis à J23 un second test comportementale (5 min par souris sur l'ensemble des souris) pour évaluer l'état de dépression des souris (test de la nage forcée). Enfin, à J24, les souris subiront un dernier test (40 min par souris sur l'ensemble des souris), le test de distension colorectale, afin d'évaluer leur sensibilité colique avant d'être mis à mort à la suite de ce test de distension colorectale.

Impact sur les animaux

Une perte de poids (au maximum, 5% du poids initial) peut être observée chez certains animaux durant la phase d’infection et notamment au pic d’infection (7 jours post-infection), mais ce phénomène est temporaire et naturellement résolu avec l’élimination du pathogène (16 jours post-infection). Ensuite, cette infection par C. rodentium induira chez les animaux les symptômes associés au SII-PI à savoir une hypersensibilité colique et un comportement de type anxieux en phase post-infectieuse (16 jours post-infection) et jusqu’à la fin des expérimentations prévues (24 jours post-infection).

Devenir

A l'issu de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort par overdose d'isoflurane suivi par une dislocation cervicale afin de réaliser des prélèvements d'organes.

Remplacement

Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur la sensibilité colique, le comportement et le microbiote intestinal. De plus, une étude comparant des données de métagénomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. D’autre part, nous voulons également évaluer les conséquences physiologiques sur la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale, pour lesquelles il n’existe pas d’autre alternative. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.

Réduction

Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique GraphPad Prim 9.0 et les principales analyses, notamment de suivi du poids seront effectuées grâce à des test ANOVA one-way ou two-way suivi d'un post test adéquat en fonction du résultat.

Raffinement

Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type petite maisonnette ainsi que du coton.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par sa pertinence pour l’étude des pathologies intestinales in vivo ainsi que par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. De plus, la spécificité d’espèce de la souche bactérienne pathogène utilisée rend ce modèle encore plus approprié. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie pour fixer une pièce au crâne, puis une exposition à des ondes 5G une heure par jour pendant quatre semaines, tête immobilisée par contention, suivie de tests comportementaux avant le prélèvement du cerveau. Le porteur qualifie la contention d'une heure de non douloureuse et présente les tests comme non stressants, fondés sur la curiosité des rongeurs. Il affirme qu'un modèle "in vitro ou ex vivo" est "inapproprié" pour observer des effets comportementaux.

Objectifs

Au cours des deux dernières décennies, les recherches relatives aux effets centraux des champs électromagnétiques de la téléphonie mobile ont essentiellement porté sur des signaux utilisés par les standards 2G, 3G ou 4G dont les fréquences porteuses étaient comprise entre 700 MHz et 2,6 GHz. Le spectre qui sera exploité par la 5G comporte, entre autres, des gammes de radiofréquence (RF) comprises entre 450 MHz et 6 GHz (5G sub-6). Ces radiofréquences plus élevées que celles utilisées par les standards 2-4G (≤ 2,6 GHz) assureront des couvertures géographiques beaucoup plus larges et leur pénétration intra tissulaire est compatible avec une absorption directe de l’énergie dans le système nerveux central, absorption dont les conséquences biologiques et fonctionnelles restent largement à déterminer. De plus, l’usage commun d’un téléphone portable entraine une exposition régulière du tissu cérébral aux signaux électromagnétiques vecteurs des télécommunications. A notre connaissance les effets centraux de signaux 5G sub-6GHz n’ont fait l’objet d’aucune étude. Notre programme de recherche porte sur les effets centraux, à des niveaux moléculaires et comportementaux, des signaux électromagnétiques exploités par les standards récents (5G) de la téléphonie mobile. Il comporte des analyses in vivo fondées sur un modèle murin, pour caractériser les effets d’expositions de la tête aux signaux 5G sur des fonctions cognitives.

Bénéfices attendus

Notre projet vise une première caractérisation des effets centraux à des niveaux comportementaux et moléculaires de l'exposition journalière à des signaux 5G-3,5GHz. Etant donné le déploiement extrêmement rapide de la 5G dans de nombreux pays, toutes les études montrant que les animaux ont, ou pas, des déficits comportementaux et des altérations de transcriptome issu du tissu cérébral, est extrêmement important pour le développement des normes d’utilisation de cette nouvelle technologie. Il sera particulièrement important de déterminer le seuil à partir duquel des effets biologiques sont observés, ce qui nécessitera surement d’autres études non incluses dans ce projet.

Procédures

- Procédure chirurgicale (1 par animal) pour la mise en place préalable d’une pièce solidarisée au crâne - Exposition au champ électromagnétique (20h : 1h par jour pendant 4 semaines (5 jours/semaine)) - Tests comportementaux (7 : 1 par jour pendant 7 jours)

Impact sur les animaux

- Présence de douleurs postopératoires. La présence de douleurs est déterminée d’après les indicateurs comportementaux suivant : réduction de la mobilité avec dos voûté et/ou tressautements du corps. Dans ce cas une analgésie supplémentaire et une antibiothérapie est mise en place. L’animal est euthanasié si les douleurs persistent plus de 24h. - Infections postopératoires (écoulements) ou perte de l’implant crânien. Dans ce cas, l’animal est euthanasié. - La perte de poids importante (plus de 20% de son poids). Dans ce cas l’animal est euthanasié.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux prélevés.

Remplacement

Le programme de recherche vise à étudier les effets des signaux électromagnétiques de type 5G sur le système nerveux central dans son ensemble mais surtout sur les effets cognitifs en utilisant des tests comportementaux. L’exposition à ces ondes électromagnétiques est répétée sur plusieurs jours (20 jours), avec une durée quotidienne de 1h, ce qui peut ressembler à l’usage commun d’un téléphone portable chez l’être humain. Ces modèles animaux rendent possibles des analyses de mécanismes cellulaires ou moléculaires associés à toute modification comportementale induite par un agent environnemental. Un modèle in-vitro ou ex-vivo est donc inapproprié pour observer de possibles modifications comportementales ou pour associer des modifications moléculaires et cellulaires au comportement.

Réduction

A notre connaissance les effets centraux de signaux 5G exploitant des radiofréquences plus élevées que celles utilisées par les standards 2-4 G (≤ 2,6 GHz) n’ont fait l’objet d’aucune étude. Notre projet vise ainsi une première caractérisation des effets centraux de signaux 5G-3,5GHz à des niveaux moléculaires et comportementaux. Au niveau comportemental, le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides, y compris pour des études pilotes. Sur la base des études publiées et de notre expérience, un maximum de 15 souris par groupe est nécessaire. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques adaptés aux petits échantillons (

Raffinement

Les animaux d’une même fratrie ou du même âge sont regroupés dans une large cage (Techniplast, 530 cm²). Les souris ont de la nourriture (A04, 18% de protéines, en zone conventionnelle) et de la boisson ad libitum, ainsi que de l’enrichissement (tunnels et maisons en carton). Les 7 jours suivant l'opération chirurgicale, les animaux sont surveillés et pesés tous les jours par l'expérimentateur et/ou les animaliers (avec une fiche post-opératoire pour chaque animaux), et reçoivent si besoin un analgésique par voie orale ou en injection sous-cutanée. Pendant la période de repos, aucune manipulation expérimentale n’est entreprise. La procédure d’exposition au champ électromagnétique et les tests de comportement durent 4 semaines, dont 20h d’exposition. Pour éviter de possibles effets de l’anesthésie sur le système nerveux central et permettre à la souris de réaliser des tâches comportementales à la fin du protocole, il est nécessaire que la souris soit exposée en étant vigile. De plus, il est important que lors de l’exposition aux ondes électromagnétiques d’une antenne 5G, l’animal soit en contention partielle pour recevoir précisément pendant 1h la dose de degré d’absorption spécifique (DAS) qui a été sélectionnée. Pour que la tête de l’animal soit dans une position fixe tout en ayant un environnement qui ne soit pas trop stressant, un dispositif de contention immobilisera la tête de la souris pendant 1h tout en lui permettant de bouger son corps dans un tube en plexiglas. Cette immobilisation pendant 1h, lorsque la souris a compris la tâche n’est aucunement douloureux et le système de contention décrit dans l’annexe 1 est le même que celui qui a été utilisé dans de nombreuses expériences impliquant l’acquisition de réponses calciques en imagerie bi-photonique. Les tests de comportement qui suivront l’exposition ne sont pas stressants et sont basés sur la curiosité naturelle des rongeurs pour la nouveauté.

Choix des espèces

Il est important que lors de l’exposition aux ondes électromagnétiques 5G, la tête de l’animal soit dans une position constante pour recevoir précisément la dose de degré d’absorption spécifique (DAS) sélectionnée pendant 1h. L’espèce utilisée, la souris, a déjà montré une capacité d’habituation à une contention modérée (à savoir ne pas bouger la tête, alors que le corps et les pattes peuvent bouger) lors de nombreuses expériences sur souris éveillée. Les tests comportementaux qui seront réalisés ont déjà été réalisés chez la souris dans de très nombreuses études comportementales, ce qui nous permettra de nous référer à des données connues de la littérature. Les souris auront 2 mois au début de l’expérience. Cette étude s’applique sur l’animal adulte.

25 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour réduire de 30% une population de neurones, elles subissent des tests comportementaux mesurant le sursaut à un souffle d'air et son inhibition par des sons, avant d'être tuées pour analyse du cerveau. Le porteur affirme qu'aucune intervention ni nuisance n'est attendue, alors que la modification génétique et la mise à mort sont au cœur du protocole. Il indique que le "modèle animal reste indispensable" pour étudier ces neurones à l'échelle de "l'organisme entier".

Objectifs

La partie du cerveau appelée néocortex contrôle la perception sensorielle (les organes des cinq sens), les comportements moteurs et la cognition, et repose sur des circuits neuronaux complexes. Les neurones sont des cellules spécialisées qui vont transmettre l'information à d'autres cellules nerveuses, musculaires ou glandulaires. Le rapport entre l'excitation et l'inhibition de ces neurones est essentiel au fonctionnement des circuits. Son déséquilibre est ainsi lié à l'origine de troubles du développement neurologique, notamment les troubles du spectre autistique ou la schizophrénie. La couche superficielle du néocortex constitue en particulier une entrée principale des circuits neuronaux. Malgré son rôle de plus en plus reconnu, nous n'avons encore qu'une compréhension limitée de la façon dont cette couche superficielle du néocortex s'organise au cours du développement. Des études récentes ont mis en évidence les rôles clés d'une population transitoire de neurones nés précocément dans cette zone, appelés cellules de Cajal-Retzius. Cependant, les rôles précis de ces cellules transitoires dans le développement des circuits neuronaux du néocortex, le comportement des souris et l'intégration multisensorielle restent à élucider.

Bénéfices attendus

Ces expériences nous permettront d'établir une corrélation entre la densité des cellules de Cajal-Retzius et les déficits comportementaux potentiels. Ces résultats seront importants car les mutations génétiques liées à ces cellules chez l'homme ont été associées à des troubles du développement neurologique. Ainsi, ce projet permettra des avancées importantes dans la recherche sur le développement neurologique, avec des applications potentielles dans l'étiologie des troubles du développement neurologique et de la santé mentale.

Procédures

Il n'y aura pas d'intervention sur les animaux dans le cadre de cette étude

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu sur les animaux

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des tests.

Remplacement

L’objectif de nos expériences est de définir les rôles des cellules de Cajal-Retzius dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral à l’aide de manipulations génétiques qui réduisent de 30% le nombre de ces cellules. Pour comprendre les rôles de ces neurones particuliers, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l'effet à l'échelle de l'organisme entier, notamment dans le cadre de l'étude du développement du cortex cérébral, les anomalies de ce développement étant liées à des pathologies comme l'autisme ou la schizophrénie.

Réduction

L’amplitude du sursaut en réaction au souffle d’air et l’inhibition de celui-ci par les stimuli sonores seront comparées entre les souris contrôles et les souris mutantes en utilisant le test t de Student ou le test de Mann-Whitney selon la normalité des données. Afin de garder une analyse statistique fiable et reproductible, chaque groupe expérimental sera constitué de 12 animaux au minimum. Par ailleurs, nous nous attendons à avoir le même phénotype chez les mâles et les femelles, d'où des effectifs d'animaux mutants et contrôles combinant les 2 sexes pour arriver à un effectif total de 12 par génotype, et ainsi éviter de doubler les effectifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Après les expériences comportementales, les animaux seront observés pour s'assurer de leur bien-être. Ils seront remis par cagée initiale à la fin des tests. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Le modèle souris est très pertinent et est necessaire pour étudier la modification de notre gène d'intêret à l'échelle de l'organisme entier, notamment dans le cadre d'une étude portant sur le développement du cortex cérébral, les anomalies de ce développement étant liées à des pathologies comme l'autisme ou la schizophrénie. De plus, le modèle souris est très étudié et largement utlisé pour des analyses comportementales. Les tests comportementaux seront réalisés sur la souris adulte, à l'age de 9 mois environ.

66 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit un accident vasculaire cérébral provoqué par un caillot, la pose d'un cathéter, des injections répétées et des examens d'imagerie, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque, pour étudier l'interaction entre deux traitements de l'AVC. Le porteur affirme n'avoir "pas observé de signe de douleur" lors de projets antérieurs similaires. Il indique que les techniques sans animaux "ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information".

Objectifs

Cette étude vise à comprende les intéraction entre l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) et l'antagoniste du recepteur à l'interleukin-1 (IL-1Ra) sur les dommages cérébraux et l'inflammation lors d'un accident vasculaire cérébral ischémique (AVC). Ce projet est une collaboration avec l'Université de Manchester. L'inflammation cérébrale joue un rôle majeur dans le développement les lésions neurologiques à la suite d’un accident vasculaire cérébral, en particulier, la cytokine pro-inflammatoire IL-1 est un médiateur central des processus inflammatoires lors de la phase aigue d’un AVC. Cette cytokine a été ciblé thérapeutiquement par le développement de la forme recombinante de l’antagoniste du récepteur à l’IL-1, IL-1Ra ou Anakinra. Dans un récent essai clinique de phase 2, IL-1Ra a été démontré comme étant efficace pour limiter l’inflammation. Cependant, une analyse secondaire de ces résultats a permis de découvrir un mécanisme alternatif conduisant une détérioration du devenir clinique des patient. Dans cette étude, IL1Ra été administré en combinaison avec l’Actilyse, une forme recombinant de l’activateur tissulaire du plasminogène qui permet la fibrinolyse et ainsi conduire à une recanalisation artérielle. Ces résultats cliniques nous permettent de suggérer la présence d'une interaction négative entre ces deux traitements. Notre projet vise à comprendre les interactions possibles entre le tPA et IL1Ra dans une étude pré-clinique. L’importance de la reperfusion pour l’efficacité d’IL1Ra va être exploré en utilisant un modèle thrombo-embolique d’AVC chez la souris. Dans ce modèle, la thrombolyse par le tPA est efficace pour détruire les caillots sanguins. La compréhension des interactions entre le tPA et IL1Ra est critique afin de progresser sur de futurs essais cliniques pour IL1Ra.

Bénéfices attendus

L’importance de la reperfusion pour l’efficacité d’IL1Ra va être exploré en utilisant un modèle thrombo-embolique d’AVC chez la souris. Dans ce modèle, la thrombolyse par le tPA est efficace pour détruire les caillots sanguins. Le bénéfice du projet est la compréhension des interactions entre le tPA et IL1Ra est critique afin de progresser sur de futurs essais cliniques pour IL1Ra.

Procédures

Procedure 1: 1) Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale (n=66, durée de la procedure :1.5heures) 2) Pose d’un cathéter intraveineux pour injection de tPA (n=66, durée de la procedure :15 minutes) 3) Injection sous-cutanée d'IL-1Ra (6 injections réparties sur 72h, n=66) 4) Evaluation de la perfusion cérébrale par doppler Speckle (n=66, durée de la procedure :15 minutes) 5) Evaluation des lesions cérébrales par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n=66, durée de la procedure :15 minutes) 6) Mise à mort par perfusion intracardique (n=66, sans réveil)

Impact sur les animaux

Afin de limiter toutes douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgesique lors du protocol chirurgical. Lors de projets précédents utilisant des procédures identiques ou similaires, nous n’avons pas observés de signe de douleur ni souffrance des animaux à la suite de la chirurgie. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (un rouleau cartonné + une feuille de papier essuie-tout), et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h).

Devenir

A l'issue de la procédure 1, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 66 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total : 66) a été évalué via un test d’analyse de puissance (α=0.05 ; β=0.8). Les échantillons sont suffisamment importants pour pouvoir utiliser des tests paramétriques : ANOVA à 2 facteurs sur des données mises sur le rang puis test post-hoc de Dunnett. Nous pourrons utiliser également les tests de Mann-Whitney et de Wilcoxon.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence comme d’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la thrombolyse, la neuroprotection et la réponse inflammatoire suite à un AVC ischémique. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour notre étude. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisédans la littérature dans l'étude de la neuroinflammation et des AVC.