Système nerveux

186 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chocs électriques pour induire un état de stress post-traumatique, sont hébergées seules pendant toute la procédure puis reçoivent des stimulations ultrasonores transcrâniennes évaluées par des tests comportementaux, avant une perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur reconnaît que l'isolement, reproduit pour coller à un modèle existant, "risque d'induire un stress supplémentaire prolongé", et que ses résultats précédents n'avaient pas reproduit un vrai modèle de stress post-traumatique. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est disponible, le modèle reposant sur l'observation du comportement de l'animal vivant.

Objectifs

Ce projet a été évalué sous le numéro L'État de Stress Post-Traumatique (ESPT ou PTSD, pour Post-Traumatic Stress Disorder, APA 1994) est une pathologie psychiatrique qui touche 8 à 12% de la population générale qui survient après l'expérience d'un événement traumatique pouvant être létal, causer une blessure grave ou menacer l'intégrité physique. Les bases neuroanatomiques et physiopathologiques sont bien établies. Elles font état d'une altération du système limbique (qui comprend notamment hippocampe et amygdale) avec une suractivation de l'amygdale et une sous-activation du cortex préfrontal. Cet état dysfonctionnel entraîne des troubles cognitifs et émotionnels (notamment un déficit dans l'extinction du conditionnement de peur) caractéristiques des symptômes du PTSD. La symptomatologie du PTSD se définit alors par un syndrome de reviviscence traumatique, un évitement et émoussement affectif et une activation neurovégétative. L’efficacité des thérapies pharmacologiques (antidépresseurs) ou psycho-cognitive utilisée pour le traitement de la pathologie est cependant relative et limitée. L'amélioration de l'arsenal thérapeutique représente donc un enjeu de santé publique majeur. Ces dernières années, les techniques de neurostimulation sont en train d’émerger. Au laboratoire, nous avons mis au point le traitement par Stimulation Transcrânienne Ultrasonore répétée (rTUS) du cortex infralimbique dans le traitement de la dépression. C’est une technique qui offre l’avantage d’être non-invasive. Employé dans le cadre du traitement du PTSD, cette option thérapeutique n'en est qu'à ses prémices. Le but de cette étude porte sur les effets de la rTUS sur la physiopathologie du PTSD et de comparer ces effets à ceux d’un traitement chronique avec un antidépresseur. Avenant : Le premier objectif sera donc d’obtenir un modèle murin de PTSD robuste et montrant différents aspects de la symptomatologie du PTSD. Après obtention du modèle murin de PTSD, l’efficacité thérapeutique de la rTUS sur le comportement des animaux sera évaluée. Les cerveaux seront prélevés pour d’ultérieures études mécanistiques.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, nous allons raffiner le modèle de Trouble de Stress Post-Traumatique. Il est impératif, pour des études sur des maladies psychiatriques en préclinique, d’avoir un modèle robuste reproductible et permettant de représenter différents symptômes de la maladie. Dans un second temps, nous reproduirons des résultats déjà démontré au laboratoire : l’activation neuronale induite par la stimulation ultrasonore. Cette approche à l’avantage d’être non invasive, plus focale et permettant d’aller stimuler des régions plus profondes que d’autres méthodes de neurostimulation. Cependant, cette technique n’a pas encore été testée en tant qu’approche thérapeutique dans un modèle préclinique de PTSD. Notre étude permettrait donc de mettre en évidence l’efficacité de l’activation répétée du cortex infralimbique dans notre modèle. A l’aide des différents tests comportementaux, nous pourront confirmer les effets thérapeutiques à long terme de la stimulation transcrânienne ultrasonore répétée ainsi que l’absence d’effets délétères sur le cerveau lié à la répétition de la stimulation.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux seront soumis à des chocs électriques d’intensité modérée et de durée variable puis l’effet de ces chocs sera évalué par des tests comportementaux. Puis avec l'appui ce ces premiers résultats obtenus, nous réaliserons l’étude proprement dite impliquant la génération d’un stress, l’application d’ondes ultrasonores, des tests comportementaux pour évaluer les effets du stress et du traitement par stimulation ultrasonore. L’étude se poursuivra par une analyse immunohistochimique des cerveaux, une perfusion intracardiaque nous permettra de prélever les cerveaux pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Le PTSD est caractérisé selon les critères du DSM-5 par une persistance de différents symptômes envahissants sur une durée de plus d’un mois. Lors de la mise au point du modèle, nous serons donc tenus de montrer la persistance de différents symptômes sur le long terme. Il a de plus été montré à plusieurs reprises, au laboratoire comme dans d’autres études, que la mobilité des souris ayant subis le traumatisme était réduite lors de l’exploration dans différents contexte comparé à des souris n’ayant pas subis de traumatisme et ce plusieurs jours à plusieurs semaines après. De plus le souris montrerons des comportements de peur associé au contexte traumatique encore un mois après le conditionnement. Toutefois, les souris ne devraient pas montrer de perte de poids importante lié à l’induction du PTSD ni des signes de mal-être dans la cage d’hébergement. Enfin le modèle de PTSD a montré son efficacité chez la souris C57BL6N dans plusieurs études ultérieures. Dans ces études, les souris étaient hébergées seules au moins 14 jours avant le début des expérimentations. Nous hébergerons donc les souris en cages isolées afin de reproduire le modèle de PTSD et d’obtenir la même symptomatologie mais ceci risque d’induire un stress supplémentaire prolongé.

Devenir

Les animaux destinée à la mise au point du projet seront euthanasiés soit par injection léthale soit par asphyxie au CO2. Les souris étant isolées pour l’ensemble de la procédure afin de reproduire un modèle de PTSD existant et ayant été validée dans différentes études, il ne sera pas possible de les regrouper à la suite de cette procédure. En effet des souris regroupées après isolement deviennent agressives et tendent à se battre violemment. Les animaux ayant terminé l’expérimentation finale seront ensuite sacrifié pour prélever les cerveaux afin de réaliser l’étude immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le PTSD chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.

Réduction

Avenant : Afin de pouvoir étudier les effets d’une stimulation transcrânienne ultrasonore répétée et de se demander si cela peut être utilisée comme traitement contre le syndrome de Stress post-traumatique (PTSD), il est nécessaire d’avoir un modèle animal stable, reproductible et permettant de représenter différents symptômes de la maladie. Nos derniers résultats ont montré une ré-expérience de la peur lors de la réexposition au contexte, phénomène aussi visible lors d’un apprentissage de peur non traumatique, mais n’ont pas permis de reproduire les résultats obtenus dans d’autres études et permettant de parler de modèle de PTSD (l’évitement, la généralisation et sensibilisation de la peur, l’anxiété…). Nous avions pourtant un nombre d’animaux plus important que celui prévu pour les expériences finales. Il nous parait donc nécessaire de refaire des tests préliminaires pour valider le modèle avant de poursuivre l’étude. Nous serions de plus assurés d’avoir un protocole modélisant au mieux le PTSD. Enfin, les effectifs sont optimisés, les observations comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisant compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=15 sujets par groupe). Les souris seront uniquement mâles, afin d’éviter les variations comportementales provoquées par le cycle menstruel de la femelle et ainsi réduire le nombre total d’animaux.

Raffinement

Le stress traumatique appliqué aux animaux, deux chocs électriques de 2sec à 1.5 mA dans un contexte inconnu, peut être qualifié de moyen, en raison de sa brièveté. Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur. Tous les animaux seront hébergés ensemble, stressés et non stressés, avec enrichissement du milieu (cabanes, smarthome® et tubes). Les expérimentateurs sont experts dans la préhension/contention des souris et sont soucieux d’éviter tout stress lors de la réalisation des procédures. Les injections quotidiennes d’antidépresseur ont été remplacées par un traitement dans l’eau de boisson. Pendant la stimulation rTUS, les animaux sont sous anesthésie gazeuse, ils sont placés sur une couverture chauffante pour éviter toute hypothermie et leurs cornées sont protégées de la déshydratation par un gel.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, par l’obtention de résultats pertinents avec cette même approche méthodologique ainsi que par l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs. En effet, la zone ciblée dans cette étude (cortex infralimbique) existe chez l’Homme (pour ce qui est du cortex moteur) ou alors sont des équivalents fonctionnels de zones existant chez l’Homme (le cortex infralimbique est un équivalent fonctionnel du cortex cingulaire antérieur subgénual BA 25 chez l’Homme). Les souris C57/BL6 seront adultes (âgées de 9 semaines) à J0 de l'expérimentation afin de comparer les effets chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

35 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont maintenus par restriction alimentaire à 90 % de leur poids pour les inciter à rapporter de la nourriture à leur nid pendant un mois d'apprentissage, avant mise à mort et prélèvement du cerveau pour un marquage du gène c-fos, afin d'identifier les régions cérébrales de l'intégration des trajets. Le porteur héberge individuellement une partie des rats et prévoit un retour à l'alimentation libre au-delà de 15 % de perte de poids. Il présente ce projet fondamental comme une remise en question possible de l'hypothèse de la carte cognitive dans la navigation.

Objectifs

La navigation spatiale chez les mammifères repose sur la perception et le traitement de multiples informations sensorielles dont la source peut être environnementale (informations allothétiques : visuelles, olfactives, auditives) ou interne à l'animal (informations idiothétiques générées par le déplacement: vestibulaires, tactiles, proprioceptives, etc.). La conjonction de ces informations va permettre à l’animal de mettre en œuvre des stratégies spatiales variées lui procurant une flexibilité comportementale. L'importance des informations idiothétiques et le rôle des régions cérébrales dans le traitement de ces informations ont longtemps été sous-estimés et restent méconnus. Des travaux comportementaux ont montré que les mammifères sont capables au cours de leur déplacement de revenir à un lieu de référence, par exemple leur "nid", en n'utilisant que des informations idiothétiques. Cette capacité est appelée intégration des trajets car elle repose sur l'intégration par le système vestibulaire des accélérations linéaires et angulaires lors du mouvement ce qui aboutit au calcul et à la mise à jour d'un vecteur pointant sur le lieu de retour. Dans une série d’études lésionnelles, nous avons montré que l'intégration des trajets implique plusieurs régions du cerveau, comme le cortex pariétal et le cortex entorhinal. Dans le cortex entorhinal, une population neuronale (les "cellules-grilles") pourrait être le centre de l’intégration des trajets du cerveau. Cette hypothèse est séduisante mais le cortex entorhinal n'est certainement pas la seule région du cerveau impliquée. Le traitement des informations idiothétiques dans le cerveau implique un réseau nerveux étendu mais notre connaissance des contours de ce réseau reste très lacunaire. L'objectif du projet est d'identifier l'ensemble des régions impliquées dans ce réseau en faisant un marquage de l'expression du gène d'expression précoce c-fos au cours d'une tâche d'intégration des trajets. Nous faisons l’hypothèse que la tâche implique une activation rapide du gène c-fos et donc une synthèse de proteines c-fos en particulier dans les structures sollicitées par le processus d’intégration des trajets.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront d'identifier les structures cérébrales impliquées spécifiquement dans la mise en œuvre de l'intégration de trajet. Ces résultats nous permettront également de tester l'hypothèse selon laquelle l'intégration de trajet peut se faire à partir d'un autre point de l'environnement que celui à partir duquel l'animal initie son trajet. Ce dernier résultat, s'il est confirmé, nous permettrait de remettre en question le recours quasi-systématique à une hypothèse alternative (existence d'une carte cognitive) pour expliquer les comportements de navigation complexes observés chez les animaux (humains compris).

Procédures

Procédure comportementale : Apprentissage d'une tâche d'integration des trajets. Procédure se déroulant sur un mois environ à raison de 2 essais de durée variable (mais n'excédant pas 5 minutes chacun) par jour et par animal.

Impact sur les animaux

Afin d'assurer un contrôle individuel de la prise alimentaire, les animaux des groupes 1, 2 et 4 seront hébergés individuellement. Cette mesure particulière d'hébergement sera maintenue durant une période la plus courte possible et les rats ainsi isolés pourront avoir des contacts visuels, auditifs et olfactifs avec leurs congénères. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort (n=35) par injection d'euthanasiant (Pentobarbital sodique, 200 mg/kg, IP, soit 0.5 mL/kg d'EUTHASOL VET. SOLUTION INJECTABLE) après sédation profonde (Médétomidine, 500 μg/kg, IP, soit 0.5 mL/kg pour le DOMITOR). La mise à mort permet le prélèvement des cerveaux afin de réaliser le marquage de l'expression du gène d'expression c-fos par immunohistochimie. La quantification de ce marquage est l'objectif de l'étude car il permettra d'identifier les structures nerveuses impliquées dans l'intégration des trajets.

Remplacement

La nature même des expériences proposées dans ce projet ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, ces expériences reposent sur l'exploration de l'environnement effectuée par les animaux en réponse à diverses manipulations environnementales et ne peuvent être réalisées à partir de modèles in vitro, in silico ou ex vivo. Ces expériences, du fait du caractère invasif des procédures de collecte des données (prélèvement du cerveau afin de révéler le marquage de certaines structures nerveuses), ne peuvent pas non plus être conduites chez le sujet humain.

Réduction

Cette étude nécessitera un total de 35 rats. Deux groupes expérimentaux et deux groupes contrôles sont indispensables pour permettre de conclure sur l'implication des structures dans les processus ciblés : Un groupe expérimental (n=8) entraîné dans la tâche d'intégration des trajets, un groupe contrôle (n=8) entraîné dans une tâche spatiale ne nécessitant pas l'intégration des trajets, un groupe contrôle (n=6) ne réalisant aucune tâche (explorant librement l'environnement pendant 3 mn) et un deuxième groupe expérimental (n=8) entraîné dans une tâche alternative d'intégration de trajet. Enfin, 5 animaux sont ajoutés au total pour pallier d'éventuels problèmes de marquage immunohistochimique (aux alentours de 15%). Le nombre d'animaux dans ces groupes permet de tenir compte de la variabilité individuelle inhérente aux études comportementales et d'obtenir des résultats fiables. L'analyse des résultats comportementaux reposera essentiellement sur l'utilisation de tests statistiques de proportion (type Chi 2). En ce qui concerne l'analyse des résultats issus des marquages immunohistochimiques, plusieurs scenari sont envisagés. Si la normalité des distributions n'est pas avérée, nous utiliserons des tests statistiques non-paramétriques tels que le test de Kruskal-Wallis. Si la normalité des distributions est avérée mais pas l'homogénéité des variances, nous utiliserons l'ANOVA à un facteur de Welch (associé au test post-hoc de Games-Howell). Si la normalité et l'homogénéité sont avérées, nous aurons recours à un test ANOVA à un facteur (associé au test post-hoc de Tukey). Ce plan d'analyse statistique nous permettra d'exploiter les données quelque soit l'ampleur de la variabilité inter-individuelle tout en conservant des effectifs d'animaux réduits.

Raffinement

La tâche comportementale repose essentiellement sur le comportement spontané des rongeurs à explorer un environnement et à récupérer un morceau de nourriture pour le ramener dans son nid et le consommer. L'animal apprend à faire cette tâche sans contrainte externe ce qui réduit considérablement son état de stress. L'hébergement des animaux s'effectue dans le respect des protocoles d'enrichissement validés par la Structure de Bien-Etre Animal de notre établissement d'expérimentation. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle animal privilégié pour les études sur la navigation spatiale du fait de ses excellentes capacités d'orientation spatiale. Nous avons montré que ces animaux sont capables de réaliser la tâche d'intégration des trajets dans sa version classique (Groupe 1). L'étude de l'activation des réseaux de structures nerveuses au cours d'un comportement de déplacement dans l'environnement ne peut pas être réalisé en utilisant des procédures in vitro, ex vivo ou in silico. Les animaux seront des rats adultes agés de 4 mois. Les capacités d'apprentissage chez ces animaux de cet âge sont optimales.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes dans le cerveau avec injection d'un vecteur viral, puis sont soumis à une restriction alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids pour les pousser à explorer un dispositif en quête de nourriture, l'objet étant de cartographier l'activité du cortex rétrosplénial pendant la navigation spatiale. Le porteur les héberge individuellement et prévoit un retour à l'alimentation libre si la perte de poids dépasse 15 %. Il présente les retombées pour les maladies neurodégénératives comme une simple piste de réflexion issue de cette recherche fondamentale.

Objectifs

Les capacités d'orientation et de mémoire sont déficitaires chez les sujets vieillissant et les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Le cortex rétrosplénial est impliqué dans ces processus mnésiques et de navigation. et semble être une structure fondamentale pour s'orienter dans des environnements complexes. Ce projet permet de comprendre quelles informations de l'espace sont nécessaires aux activités neuronales du cortex rétrosplénial et également d'étudier l'influence de cette structure sur les autres aires cérébrales impliquées dans la navigation, notamment le cortex entorhinal médian. Ce projet, de nature fondamentale, ouvre des pistes de réflexions sur la nature des déficits de navigation inhérents aux maladies neurodégénératives qui affectent la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet, de nature fondamentale, ouvre des pistes de réflexions sur la nature des déficits de navigation inhérents aux maladies neurodégénératives qui affectent la mémoire.

Procédures

Procédure comportementales : exploration libre à la recherche de nourriture suite à une privation contrôlée de nourriture; et procédures chirurgicales : implantation d'un système d'électrode avec l'injection d'un vecteur viral pour utiliser les outils d'inactivation neuronale pharmacogénétique. Tous les animaux subiront la procédure comportementale. 1 groupe de 20 animaux sera soumis à la procédure chirurgicale d'implantation des électrodes seule, et un 2ème groupe d'animaux sera soumis à la chirurgies d'implantation d'électrode et d'injection du vecteur viral.

Impact sur les animaux

Afin d'assurer un contrôle individuel de la prise alimentaire, les animaux seront hébergés individuellement. Cette mesure particulière d'hébergement sera maintenue durant une période la plus courte possible et les rats ainsi isolés pourront avoir des contacts visuels, auditifs et olfactifs avec leurs congénères. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Devenir

La mise à mort permet le prélèvement des cerveaux afin de réaliser le marquage des neurones par cresyl violet ou thionine et d’identifier la position des électrodes d’enregistrement dans les structures d’intérêts. L'identification de la position des électrodes est cruciale car elle permet d'affirmer que les activités neuronales mises en évidence proviennent bien de la structure cérébrale ciblée dans le projet.

Remplacement

Ce projet repose sur les méthodes invasives d'enregistrement des neurones isolés ainsi que de l'inactivation de l'activité cérébrale chez le rat jeune adulte Long Evans, qui ne sont pas compatibles avec une approche chez le sujet humain, ni adaptables aux études in vitro ou de modélisation.

Réduction

Le projet comporte deux expériences qui utiliseront chacune 20 animaux. Ce nombre est indispensable pour deux raisons : 1-éviter statistiquement une variabilité inter-individuelle et 2-enregistrer un nombre suffisant d’activité neuronale pour effectuer des tests statistiques. L'analyse des résultats reposera essentiellement sur l'utilisation de tests statistiques paramétriques. Cependant, si la normalité des distributions n'est pas avérée, nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques. Ce plan d'analyse statistique permettra d'exploiter les données si une variabilité inter-individuelle est toutefois présente tout en conservant des effectifs d'animaux réduits.

Raffinement

La tâche comportementale repose essentiellement sur le comportement spontané des rongeurs à explorer un environnement pour aller manger des granulés de nourriture. L'hébergement des animaux s'effectue dans le respect des protocoles d'enrichissement validés par la Structure de Bien-Etre Animal de notre établissement d'expérimentation. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%) ou en dessous de 90% de leur poids initial (points limites), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré. Une grille de score approuvée par la SBEA permet de s’assurer du bien-être animal pendant et en dehors des temps d’expérience. Cette grille permet d’évaluer si l’animal est dans un état normal ou en souffrance. L’arrêt des souffrances est prévu dans cette grille de score par des mesures d’observation attentive, des méthodes de soulagement, l’arrêt complet de l’expérience ou la mise à mort de l’animal. Les méthodes d’arrêt des souffrances se font de concert avec les zootechniciens de l’animalerie et sont reportées pour chaque animale sur une feuille de soins disponibles à l’animalerie.

Choix des espèces

Le rat représente le modèle de choix pour les études du comportement spatial qui est à la base des protocoles comportementaux qui seront utilisés. Il présente d'excellentes performances dans les tâches de navigation spatiale. Enfin, 90% des études portant sur les bases neurales de la navigation réalisées chez le rongeur reposent sur l'utilisation du rat, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Par ailleurs, j'ai réalisé la seule étude qui a mis en évidence les cellules bidirectionnelles du cortex rétrosplénial chez le rat. Utiliser le rat me permet de comparer les résultats issus de ce projet avec ceux précédemment obtenus. Le projet vise à établir le rôle de certaines structures cérébrales chez le rat jeune adulte. Afin de pouvoir comparer les résultats avec les travaux antérieurs, nous utiliserons des animaux qui auront 3 mois au début de l'expérience.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent sous anesthésie une chirurgie stéréotaxique d'injection de virus dans le cerveau, puis passent une série de tests comportementaux (labyrinthe surélevé, open field, reconnaissance d'objet et reconnaissance sociale, enfouissement de billes, nidification), pour tester une thérapie génique contre le syndrome de l'X fragile sur une lignée de souris Fmr1-KO. Le porteur revendique une preuve de concept déjà obtenue in vitro et affirme que ces mécanismes comportementaux ne peuvent être étudiés que dans un "organisme complexe" comme la souris. Les bénéfices annoncés pour les patients restent au stade de la preuve de concept, l'objectif immédiat étant de mesurer une correction du comportement avant prélèvement du cerveau.

Objectifs

Le syndrome de l’X fragile (FXS) représente la première cause héréditaire de déficience intellectuelle et d’autisme pour lequel il n'existe à ce jour aucune thérapie. Nous avons récemment découvert un mécanisme moléculaire qui serait à l’origine du FXS. Nous proposons maintenant de tester une approche par thérapie génique afin de corriger le mécanisme moléculaire défaillant pour traiter le FXS. Pour mettre en œuvre cette approche expérimentale, nous utiliserons un modèle animal FXS qui a été développé chez la souris. La souris FXS récapitule une grande partie des phénotypes observés chez l’homme et constitue un excellent modèle animal de la maladie. Ainsi ce projet vise à déterminer : 1. Est-ce que la thérapie génique permet de restaurer le mécanisme moléculaire défaillant pour traiter le FXS ? 2. Est-ce que la thérapie génique permet de restaurer le comportement du modèle de souris FXS ?

Bénéfices attendus

Notre étude a pour but de fournir la preuve de concept que le mécanismes moléculaire que nous avons identifié précédemment contribue à la pathologie du FXS. Nous proposons des nouveaux outils de thérapie génique pour corriger ce mécanisme moléculaire défaillant et le comportement du modèle de souris FXS. Jusqu'à présent, toutes les stratégies thérapeutiques envisagées pour traiter le FXS ont échoué cliniquement. Notre projet s'appuie sur des connaissances nouvelles acquises au laboratoire, et qui pour la première fois, lient le FXS à un nouveau mécanisme moléculaire. Notre approche repose ainsi sur des données préliminaires publiées et solides pour fournir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter le FXS.

Procédures

480 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Après l'injection de virus, ils seront soumis à des tests comportementaux : semaine 1. Analyse du rythme circadian (36H) + Labyrinthe surelevé (5min). semaine 2.Open field (15min), toilettage (15min). semaine 3. nidification (24h) + reconnaissance d’objet (2x10min) + enfouissement de billes (15 min) semaine 4. Reconnaissance sociale (3x10min).

Impact sur les animaux

La chirurgie stereotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou de récepteurs particulier dans des populations neuronales spécifiques. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post- chirurgicale.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

Toutes les validations experimentales in vitro ont été réalisées et publiées. Nous avons ainsi apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Il convient maintenant de valider in vivo nos données. Etant donné que le phénotype comportemental est l'un des traits les plus importants du FXS, ces mécanismes complexes ne peuvent être étudiés que dans des organismes complexes tels que la souris

Réduction

Nous utiliserons un total de 480 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris. Pour toutes ces raisons, le nombre d'animaux a éte déterminé en prennant en compte les contraintes experimentales.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. Aucune douleur ou souffrance n'est attendu dans la plupart des procédures expérimentales utilisées mais l'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les procédures expérimentales potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience et les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formée spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

L’utilisation des souris se justifie par l’existence d'une lignée génétiquement dans laquelle la protéine Fmr1 est invalidé. La souris Fmr1-KO récapitule une grande partie des phénotypes observés chez l’homme (altération de la mémoire, perte d’interaction sociale, hyperactivité, macro-orchidisme, anomalie des épines dendritiques) et constitue un excellent modèle animal de la maladie. Les chirurgies stéréotaxiques concernant l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux chez les nouveau nés à P0 pour prévenir le phénotype du FXS. Chez des souris âgées de 8 semaines (jeune adulte), stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées et chez des anuimaux adultes de 20 semaines afin de corriger le FXS Les animaux seront injectés dès l'âge de 8 semaines pour la première partie du projet (PE1).

2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent le test de la barre, qui mesure la catalepsie par l'incapacité de l'animal à quitter une position imposée, pour vérifier qu'un candidat médicament ne provoque pas cet effet indésirable. Le porteur indique que toute souris atteignant un point limite est aussitôt mise à mort, et que les prélèvements sanguins se font par ponction cardiaque ou par décapitation à la guillotine sous anesthésie. Le cerveau est ensuite prélevé pour analyse.

Objectifs

La catalepsie se caractérise par une rigidité musculaire et par une perte des mouvements volontaires. C'est un des effets indésirables que peuvent provoquer certains médicaments psychotropes. L'objectif de ce projet est de vérifier qu'un médicament candidat n'induit pas de catalepsie. Celle-ci est mesurée par le test de la barre. Le principe de ce test repose sur l’incapacité d’un animal à se libérer d’une position imposée par l’expérimentateur. Le temps mis par l’animal pour quitter cette position est alors utilisé pour évaluer l’intensité de la catalepsie. Plus le temps mis par la souris pour revenir à une position « normale » est important et plus la catalepsie est sévère.

Bénéfices attendus

Les antipsychotiques, tel que l’halopéridol, utilisé dans le traitement de la schizophrénie et d’autres troubles psychiques, engendrent des effets secondaires extrapyramidaux tel que la catalepsie. La catalepsie induite par l'halopéridol est due au blocage des récepteurs dopaminergiques et à une réduction de la transmission dopaminergique.C'est pourquoi, la mesure des effets cataleptiques potentiels est importante dans la recherche de nouveaux médicaments antipsychotiques, afin de limiter les effets secondaires de ces derniers.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre les prélèvements de sang sont réalisés : 1) soit en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris entre 0.5 ml à 1 ml maximum ; 2) soit par décapitation, sous anesthésie générale, avec une guillotine dans le cas d’une nécessité de prélèvement sanguin important (supérieur à 1 ml). A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.

Impact sur les animaux

Au moment du test, l’état général des animaux est également évalué selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Une grille de score, comprenant les points limites prédictifs, est remplie chaque jour de test et 24h après. Des paramètres supplémentaires ont été rajoutés, ils concernent les effets indésirables potentiels qu’un traitement pourrait provoquer. L’expérimentateur doit alors noter l’intensité de chacun de ces paramètres.

Devenir

A la fin du test de la catalepsie, les animaux seront soumis: 1) à un prélèvement de sang en intracardiaque sous anesthésie générale ou par décapitation, sous anesthésie générale, avec une guillotine dans le cas d'une nécessité de prélèvement sanguin important et 2) à un prélèvement de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d’évaluer les effets cataleptiques potentiels des médicaments. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 10 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans ce projet : - Les lignées de souris utilisées sont : C57Bl/6 J (consanguine) et SWISS (non consanguine). - Une lignée de souris transgénique-KO est également utilisée : GPR88-KO (pas de phénotype dommageable) Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.

3 888 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Maintenues à 85 % de leur poids par restriction alimentaire et isolées en cage individuelle, elles passent un test d'impulsivité dans un labyrinthe en T, avec administration de candidats médicaments par gavage, pour modéliser un trouble de l'attention avec hyperactivité. Le porteur indique que toute souris atteignant un point limite est mise à mort immédiatement, et que les prélèvements de sang se font par ponction cardiaque ou par décapitation à la guillotine sous anesthésie. Il précise qu'aucun traitement curatif du trouble n'existe à ce jour.

Objectifs

Le trouble d'hyperactivité avec déficit de l'attention (TDAH) est un trouble complexe du développement cérébral caractérisé par l'hyperactivité/l'impulsivité et l'inattention. Les médicaments les plus couramment prescrits pour le traitement du TDAH modulent les systèmes dopaminergiques et noradrénergique. Deux grandes classes pharmacologiques de médicaments sont utilisées : les psychostimulants (ex : Méthylphénidate, d-amphétamine) et les inhibiteurs non stimulants du recaptage de la noradrénaline (ex : Atomoxétine) Dans ce projet, seul un des symptômes centraux du TDAH sera étudié : l'impulsivité. Le test du labyrinthe en T, qui sollicite la capacité à attendre, permet d’étudier l’impulsivité (incapacité à attendre) et de mesurer les effets d’agents pharmacologiques sur ce comportement. Il permet de mettre en évidence des améliorations de l’impulsivité par des traitements destinés au TDAH. Ce test constitue donc un modèle préclinique pour l’étude de substances destinées au traitement du TDAH. L’objectif de ce projet sera dans un premier temps la mise en place de ce modèle chez la souris puis d’étudier une potentielle efficacité de plusieurs candidats médicaments sur l’impulsivité.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif, seul des médicaments modulant les transmissions aminergiques tels que les psychostimulants (ex : Méthylphénidate, d-amphétamine) et non psychostimulants (ex : Atomoxétine) sont utilisés actuellement comme pharmacothérapies. Ces médicaments augmentent les transmissions dopaminergiques et noradrénergiques; ces systèmes de neurotransmission sont les cibles privilégiées dans la recherche de nouveaux traitements. Ce modèle animal est donc un outil précieux pour étudier les mécanismes comportementaux du TDAH et pour étudier une potentielle efficacité de plusieurs candidats médicaments sur l’impulsivité.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre les prélèvements de sang sont réalisés : 1) soit en intracardiaque, sous anesthésie générale, pour un prélèvement sanguin compris entre 0.5 ml à 1 ml maximum ; 2) soit par décapitation, sous anesthésie générale, avec une guillotine dans le cas d’une nécessité de prélèvement sanguin important (supérieur à 1 ml). A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.

Impact sur les animaux

1- Le régime alimentaire et la mise en cage individuelle : Dans ce modèle, les animaux seront soumis à une restriction alimentaire tout au long de l’expérience afin que leur poids corporel soit maintenu à environ 85 % de leur poids corporel en alimentation libre. Cette restriction alimentaire est nécessaire pour maintenir un niveau de motivation constant tout au long de l'expérience. Ainsi, pour éviter tout risque d’agressivité des souris les unes envers les autres et pour contrôler l’évolution de leur poids; lors de leur arrivée, les souris sont placées en cage individuelle dans un environnement régulé (température, 22±1°C, cycle lumière/obscurité de 12:12 heures, lumière allumée à 7 heures) avec de l'eau en libre accès. Durant la période d’acclimatation qui dure entre 6 et 10 jours, les animaux sont manipulés tous les jours afin de limiter le stress dû à l’isolement. Par ailleurs, les animaux sont pesés chaque jour pour suivre l’évolution de leur poids et leur état sanitaire est évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. 2- Administrations : Les administrations sont réalisées une seule fois par jour avant le test et chaque jour de test à partir de la « phase de test ». Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant (produit destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou biodisponibilité nécessitant un autre mode d’administration) les voies intrapéritonéales, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies. L’administration de nouveaux candidats médicaments peut entraîner certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation qui peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin du test comportemental à un prélèvement de sang et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer TDAH. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées sont : la souris C57Bl/6J, BTBR 3-7 semaines au moment du test. Etant donné que le TDAH affecte principalement les enfants/adolescents, il est pertinent d’étudier les psychostimulants/molécules candidats sur des animaux juvéniles.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une modification génétique, elles sont soumises à des tests comportementaux d'anxiété, de dépression et d'activité motrice, dont le test de la nage forcée où l'animal est placé dans un bécher d'eau. Le porteur indique que si une souris met la tête sous l'eau elle est aussitôt retirée, et qu'une souris atteignant un point limite est mise à mort immédiatement. Le projet cherche des effets comportementaux d'une modification génétique dont ce n'était pas la cible, le cerveau des souris étant prélevé en fin d'étude.

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier les changements comportementaux induits par une modification génétique sur l’anxiété, la dépression et l’activité motrice des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de mettre en évidence des déficits ou améliorations comportementales suite à une modification génétique dans le domaine de l’anxiété, de la dépression et de l’activité motrice des animaux. Certaines modifications génétiques qui n’ont à l’origine pas ces cibles (ici : anxiété, dépression et activité locomotrice) peuvent quand même avoir des effets. Il est donc nécessaire d’étudier ces effets pour aider à la compréhension de mécanismes cellulaires et/ou neuronaux encore méconnus.

Procédures

A la fin de l’étude, juste avant la mise à mort, le cerveau de l’animal est prélevé. Cette procédure est réalisée sous anesthésie générale et elle dure en moyenne 15 minutes (dans sa totalité). Le prélèvement de cerveau est une demande fréquente dans les études de recherche préclinique. Cela permet de réaliser des mesures de paramètres biochimiques.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, il s'agit d'étudier les potentiels changements comportementaux induits par une modification génétique sur l’anxiété, la dépression et l’activité motrice des animaux. Les animaux reçoivent aucune administartion. Ils sont manipulés et pesés au moment des différents tests comportementaux. Au cours de l'étude, l’état général des animaux est quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Durant le test de la nage forcée, si la souris met la tête sous l’eau, elle est immédiatement retirée du bécher et placée dans une cage contenant un linge pendant 10 minutes pour retourner ensuite dans sa cage d’origine.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l'étude à un prélèvement de cerveau, sous anesthésie générale.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer une modification du niveau d’anxiété, de dépression ou de déficit moteur, le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 12 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées dans ce projet sont : IP3R1 (fl/fl) et C57BL6/J Entre 7 et 15 semaines au moment des tests. Le Sponsor souhaite comparer certains résultats obtenus précédemment sur ces animaux à ceux obtenus dans ce projet.