Système nerveux

272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent un traitement par gavage puis un suivi mensuel de la force musculaire, des tests de sociabilité et un test du nid avec isolement d'une nuit, avant un électromyogramme sous anesthésie et la mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur teste si la relocalisation de la protéine FUS dans le noyau des neurones rétablit les capacités motrices. Il présente une extension possible à l'humain comme un axe futur, sans traitement existant à ce jour.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable caractérisée par une paralysie des muscles qui entrainent le décès des patients par insuffisance respiratoire. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime cette maladie en reproduisant la mutation d’une protéine mutée chez les patients. Le but du projet est de relocaliser cette protéine dans le noyau des neurones et de voir si cela suffit à rétablir les capacités motrices de nos souris.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement efficace de la SLA. Le but de ce projet est de tester une nouvelle approche en remettant une protéine qui s’est déplacée à cause de la maladie dans sa localisation normale puis d’évaluer si cette stratégie permet de rétablir les capacités motrices de ces souris. Si en remettant FUS à sa place, nous arrivons à réduire les troubles moteurs et sociaux observés, nous pourrons envisager que les prochains axes de recherche se tourneront vers la possibilité de trouver un moyen pour relocaliser FUS dans le noyau des patients souffrants de SLA.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure d’administration par gavage d’un traitement durant 5 jours. Nous réaliserons un suivi mensuel des capacités motrices (force musculaire) sur un dispositif dédié afin de voir l’évolution de la maladie. Ce test se passe en 3 session de 3 minutes maximum chacune, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes. Les animaux seront toujours remis en groupe et de l’enrichissement sera mis à disposition dans leur cage d’élevage. Nous réaliserons deux tests de sociabilité 2 ou 3 fois au cours de la vie de l’animal (à 4, 10 et peut-être 14 mois selon l’évolution de la maladie). Le premier test dure 5 minutes tandis que pour le second, les souris passeront 4 sessions de 5 minutes chacune (avec des phases de retour en cage de 8 minutes entre les sessions). La passation du premier et du second test sera espacée d’une semaine. Le test du nid sera réalisé 2 ou 3 fois au cours de la vie de l’animal et nécessitera que les souris soient isolées durant une nuit. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris endormies afin d’éviter toute souffrance.

Impact sur les animaux

Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement. Pour éviter cela, l’expérimentateur en charge de cette partie a suivi des formations pour apprendre à réaliser ce geste et s’est entrainé un grand nombre de fois. Nous pourrions également observer un léger stress causé par la passation du test moteur et des tests de sociabilité. Un temps de repos sera systématiquement appliqué pour les procédures nécessitant plusieurs passages successifs pour le test moteur. Si nous remarquons que les souris sont fatiguées, nous espacerons les différentes sessions. Un délai d’une semaine sera appliqué entre chaque test social. La procédure d’électro myo gramme qui permet d’observer la présence ou non d'atteinte des muscles sera réalisée sous anesthésie, les souris ne ressentiront donc aucune douleur.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures 1 et 2 car nous avons besoin de prélever les tissus pour vérifier 1. la relocalisation nucléaire de FUS mais aussi 2. pour étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer s’il est possible de remettre à sa place une protéine dont le changement de localisation entraine la SLA. Pour étudier cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale (avec l’apparition possible des troubles de la sociabilité) mais aussi une complexité structurelle du système nerveux, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme. La souris nous offre la possibilité de travailler avec ces deux niveaux de complexité.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé le suivi longitudinal. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pilote pour valider l’approche expérimentale utilisée et potentiellement réduite le nombre de groupes contrôles que nous utiliserons. Si cette étude pilote est validée sur ces deux aspects, nous pourrons réduite de moitié les animaux nécessaires à la réalisation de la seconde partie du projet.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles.

455 souris vont être utilisées, 450 tuées à l'issue et 5 mâles reproducteurs réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente femelles gestantes reçoivent des injections sous-cutanées pendant vingt-huit jours, de la gestation jusqu'à trois semaines après la naissance, et les souriceaux sont tués pour prélever leur cerveau. Le porteur teste un peptide censé limiter la mort neuronale dans un modèle murin de trisomie 21. Il inscrit ce traitement dans le cas où les parents décident de poursuivre la grossesse après un diagnostic prénatal.

Objectifs

La trisomie 21 est le syndrome génétique le plus fréquent dans la population générale. En raison des différentes politiques de dépistage et d’interruption médicale de grossesse, cette maladie concerne 1 naissance sur 700 à 1 naissance sur 2000 dans les pays industrialisés. Le projet s’inscrit dans une étude visant à développer une nouvelle approche thérapeutique visant à corriger les désordres neurologiques impliqués dans la trisomie 21. Agir sur le nombre de neurones pourrait permettre de diminuer le risque de déficience intellectuelle dans cette pathologie et de changer son pronostic. Pour cela, le but est de trouver un traitement pour protéger le cerveau lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse. Notre étude s’intéresse à une molécule d’origine embryonnaire qui possède des propriétés neuroprotectrices et qui diminue la mort des neurones. Il pourrait donc protéger contre de tels désordres neuro-développementaux. Notre première étude a montré des effets positifs sur le cerveau de souriceaux présentant des caractéristiques de la trisomie 21, traités pendant la gestation. Dans cette étude, le traitement sera administré par injection sous-cutanée à la mère durant la gestation et durant 21 jours après la naissance. Des analyses seront réalisées sur les cerveaux de la descendance ayant reçu ou non le traitement afin de déterminer de quelle façon il est protecteur, d’évaluer son innocuité et sa persistance à l’âge adulte. 5 mâles reproducteurs et 30 femelles seront nécessaires pour le traitement et quatre groupes de souriceaux seront constitués : des témoins traités et non traités et des trisomiques traités et non traités, pour un total de 420 souriceaux.

Bénéfices attendus

Cette pathologie, associée à une déficience intellectuelle, à des troubles du comportement et du langage, impacte l’autonomie des personnes porteuses de ce syndrome. Ce projet permettrait de continuer à explorer les mécanismes conduisant à des anomalies cérébrales dans la trisomie 21 ainsi que de pouvoir définir les mécanismes impliqués dans les effets du traitement administré. Ce traitement pourrait être considéré comme une approche thérapeutique dans le but de diminuer la déficience intellectuelle lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse suite à un diagnostic prénatal de trisomie 21.

Procédures

5 mâles seront utlisés pour la reproduction. 30 femelles recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ou du traitement. Ce geste sera réalisé sur l’animal vigile, à partir du 14ème jour de gestation, jusqu’à 21 jours après la naissance des souriceaux soit durant 28 jours. Les souris issues des femelles gestantes seront utilisées pour étudier les mécanismes impliqués dans l’effet du traitement sur le cerveau.

Impact sur les animaux

Les injections aux femelles gestantes de la molécule seront effectuées sur l'animal vigile et effectuée selon les bonnes pratiques vétérinaires et n'induisent pas de douleur ou d’inconfort à l'animal autre que la piqûre de l'aiguille ainsi que du stress engendré par la manipulation.

Devenir

Tous les souriceaux utilisés seront mis à mort afin de prélever les cerveaux pour effectuer des analyses sur le nombre de neurones, la mort neuronale ainsi que pour déterminer les mécanismes d’action du traitement. Toutes les femelles pour les analyses du foie et des reins afin de confirmer la sécurité du traitement. Les mâles reproducteurs seront réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

Pour atteindre les objectifs du projet basé sur un traitement, un organisme entier et vivant est nécessaire, n’ayant pas la possibilité de créer artificiellement la complexité d’un organisme avec tous les différents types de cellules présentes dans le cerveau.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé après avoir établi l’ensemble des procédures expérimentales à l’aide d’un test de puissance statistique en se basant sur la variabilité entre animaux et la distribution des valeurs.

Raffinement

Afin de garantir le bien-être des animaux, le milieu sera enrichi par l’ajout d’un nid végétal et d’un rouleau en carton. Pour les femelles gestantes et avec leurs petits, de l’enrichissement supplémentaire sera apporté sous forme d’une cabane en carton. Les approches expérimentales seront accompagnées d’une surveillance journalière afin de vérifier tout comportement anormal traduisant une souffrance, comme des signes de prostration, d’agressivité, d’apparence physique. Le poids des femelles gestantes sera relevé tous les jours lors de l’injection du traitement. Une absence de prise de poids sera particulièrement surveillée afin de déterminer s’il s’agit d’une dégradation de l’état de santé de l’animal et/ou d’une interruption de la gestation afin de retirer l’animal de l’étude. Du gel enrichi pourra être proposé dans la cage. Concernant plus spécifiquement les souriceaux, ils seront observés lors des pesées ayant lieu trois fois par semaine selon des critères spécifiques liés à leur âge (coloration, mouvement, respiration, comportement, etc). Lors de la manipulation des souris, les mains de l’expérimentateur seront systématiquement frottées avec de la litière de la cage afin de favoriser des odeurs familières moins stressantes pour les petits et la mère. Un changement de gants aura lieu entre 2 cages de femelles gestantes.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris dans ce projet nous permet de pouvoir réaliser des analyses sur un modèle établi comme modèle de la trisomie 21. Les injections du traitement seront réalisées sur des femelles adultes à partir du 14ème jour de gestation jusqu’à 21 jours après la naissance des souriceaux (soit durant 28 jours) afin de réaliser le traitement durant la gestation et après la naissance. Les analyses réalisées sur le cerveau des souris 30 jours après leur naissance permettront d’étudier l’effet du traitement sur les désordres neurodéveloppementaux et d’évaluer la persistance de son efficacité au stade jeune adulte. Ceci permettrait également à l’étude d’évaluer le potentiel thérapeutique transposable à l’Homme dans le cas d’une administration chez la femme pendant la grossesse pour corriger très précocement la déficience intellectuelle associée à la trisomie 21.

1 336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit l'objectif en une phrase et ne détaille comme acte qu'un tatouage et une biopsie à quatre jours, alors que la mutation de deux gènes peut empêcher la myélinisation. Il indique que les souriceaux pourraient présenter dès la naissance des rétractions articulaires les rendant immobiles, avant une mise à mort pour prélever les nerfs sciatiques. L'écart est net entre un effectif de plus de mille animaux et une justification scientifique réduite à quelques lignes.

Objectifs

Cette étude vise à confirmer l’importance de deux protéines dans la formation du système nerveux et leur impact en développement humain.

Bénéfices attendus

Dans le cas de de maladies neurogénératives telles que Charcot-Marie-Tooth, les neuropathies périphériques ou l'arthrogrypose , les causes précises restent parfois obscures et, malheureusement, aucun traitement curatif n'existe. Nous identifierons ainsi un nouvel acteur qui pourra être utilisé en diagnostic et qui pourrait être une cible thérapeutique

Procédures

Les animaux sont tatoués et prelevés par biopsie à 4j, sous anesthésie afin de les identifier. Cette procédure unique dure moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Comme la mutation des 2 gènes risque d’impacter le développement de la myéline périphérique, les souriceaux pourraient présenter des rétractions articulaires qui les rendraient immobiles dès la naissance

Devenir

Tous les animaux seront euthanasies pour prélèvement des nerfs sciatiques post-mortem pour analyse de celui-ci par différentes méthodologies complémentaires

Remplacement

L'arthrogrypose est une maladie musculaire et articulaire avec une atteinte de l’intégrité des axones, suite à leur non myélinisation. Ce phénotype a été visualisé chez l'Homme. Les multiples tissus impactés et l' interaction entre différents types de cellules impliquées dans la mise en place du système nerveux périphérique est donc nécessaire pour faire cette étude et nécessite donc un organisme entier mammifère. Aucun système cellulaire ex vivo ne peut rendre compte de la physiologie du développement qui fait intervenir des interactions cellulaires (contact entre nerfs et muscles), molécules informatives véhiculéee par le sang (hormones, cytokines) ou des effets environnementaux. Cette complexité est donc difficile voir impossible à reproduire in vitro et nécessite donc l’utilisation d’animaux notamment dans notre cas et le remplacement complet n’est pas possible. De plus, l'inactivation d'un gène dans une lignée de cellules spécifiques indispensable pour nos études n'est possible que chez le rongeur.

Réduction

D ans un 1e temps, nos lignées sont le plus souvent hétérozygotes pour le gène étudié. Ensuite, ces derniers seront croisés entre eux pour générer les homozygotes et les contrôles au sein de la même portée afin de limiter les animaux ne protant pas mutations. Le nombre d'animaux utilisés à des fins de recherche a été calculé en tenant compte de la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux dans une animalerie agrée, dans des conditions de températures et hygrométrie controlées. Elles ont acces ad libitum à la nourriture et l'eau. Les cages présentent un enrichissement du milieu et sont quotidiennement surveillées (week end inclus). Des protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis en cas de souci et tous les prévelements sont post-mortem. Des points limites précoces ont été clairement définis afin d'éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utilisons l'animal le plus utilisé par les chercheurs, la souris. Ces animaux constituent un excellent modèle pour l’étude du développement, des processus morphologiques et des pathologies, observées chez les Mammifères. Leur génome est très bien connu, ce qui permet de les "modifier génétiquement". Cet avantage nous permet d’utiliser des souris mutées et des souris sauvages du même fond génétique dans nos études expérimentales. De plus,l'inactivation du gène d'intérêt dans une lignée de cellules spécifiques indispensable pour nos études, n'est possible que chez le rongeur. Les stades de développement choisis sont ceux qui sont aussi pertinents chez l'Homme afin de pouvoir transposer les résultats

688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hypothyroïdie leur est induite par un régime carencé et un antithyroïdien, associée à une chirurgie cérébrale et à un hébergement en obscurité constante ou en cycle jour-nuit atypique, en cage individuelle. Le porteur attend une bradycardie, une température abaissée et un état d'anxiété supérieur à la normale, évalué par des tests comportementaux, avant la mise à mort pour prélèvement de tissus. Les débouchés annoncés pour les patients, une luminothérapie ou des thérapies comportementales, restent conditionnés à la mise en évidence d'un dérèglement de l'horloge interne.

Objectifs

L'hypothyroïdie correspond à un déficit en hormones thyroïdiennes. Toutes causes confondues, l'hypothyroïdie touche près de 10% de la population. Les patients souffrent de fatigue chronique, de bradycardie, d'une sensibilité accrue au froid, et de prise de poids. Ils présentent aussi des troubles liés à l'humeur tels qu'irritabilité, anxiété ou dépression, dont l'étiologie reste mal comprise. Plusieurs observations sur des patients et des modèles animaux suggèrent que l'hypothyroïdie pourrait perturber l'horloge circadienne. Cette horloge biologique coordonne les rythmes physiologiques et comportementaux avec le cycle jour-nuit. Comme le dérèglement de l'horloge cause des troubles de l'humeur tels que ceux observés chez les patients hypothyroïdiens; il est tentant de supposer un lien de causalité entre ces troubles et les rythmes biologiques au cours de l'hypothyroïdie. Nous souhaitons tester cette hypothèse dans un modèle murin d'hypothyroïdie induite.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de mieux comprendre l'étiologie des troubles de l'humeur souvent associés à l'hypothyroïdie, et d'envisager des approches thérapeutiques au-delà du traitement hormonal de substitution. En effet, la prise d'hormone thyroïdienne est efficace pour le traitement de l'hypothyroïdie sur le long terme, mais définir et ajuster la dose optimale de chaque patient s'avère souvent très long et laborieux. La mise en évidence d'un dysfonctionnement de l'horloge circadienne ouvrirait de nouvelles possibilités d'accompagnement des patients dysthyroïdiens pendant cette période d'ajustements hormonaux, par exemple par la mise en place d'une luminothérapie ou de thérapies comportementales pour resynchroniser les rythmes biologiques.

Procédures

Induction d'une hypothyroïdie par régime hypo-iodé et traitement anti-thyroïdien. Maintenue pendant 2 à 3 semaines. Prélèvement unique de 3µl de sang, à la pointe de la queue de souris vigiles. Chirurgie cérébrale ciblée, sous anesthésie générale. Hébergement en cycle jour-nuit atypique (11.5 heures de lumière, 11.5 heures d'obscurité; ou obscurité constante pendant 2 semaines). Hébergement en cage isolée, avec contacts sociaux visuels.

Impact sur les animaux

La présence d'un agent anti-thyroïdien dans l'aliment hypo-iodé le rend moins appétant. Les souris mangent moins mais continuent à prendre du poids, et se stabilisent à environ 90% du poids des souris nourries avec l'aliment contrôle. Les souris hypothyroïdiennes présentent aussi une température corporelle légèrement abaissée par rapport aux souris contrôles (uniquement pendant leur phase d'inactivité), ainsi qu'une bradycardie (ralentissement de la fréquence cardiaque d'environ 25%). Comme cela est le cas chez les patients, nous nous attendons aussi à un état d'anxiété supérieur à la normale, qui sera évalué au travers des tests comportementaux. Le fonctionnement de l'horloge interne sera testé par mesure de l'activité locomotrice volontaire en absence de repères temporels (suppression du cycle jour-nuit). Cette étape requiert un hébergement des souris en cages individuelles équipées d'une roue d'activité, dans l'obscurité constante pendant une vingtaine de jours. Un prélèvement sanguin unique sera réalisé pour évaluation du statut thyroïdien par dosage hormonal. Cela nécessite la collecte d'une goutte de sang suite à une incision à la pointe de la queue (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement de tissu.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour étudier l'impact d'une perturbation systémique (l'hypothyroïdie) sur le fonctionnement du cerveau et ses conséquences en terme de comportement. La souris constitue un excellent modèle d'étude des rythmes circadiens chez les Mammifères, pour lequel la physiologie générale, les comportements, et le fonctionnement de l'horloge interne sont suffisamment bien décrits pour servir de référence dans le cadre de ce projet. Notre objectif sur le long terme est d'établir un modèle mathématique suffisamment riche et prédictif pour anticiper le devenir de l'horloge circadienne dans différentes situations physiopathologiques en complément/remplacement des modèles animaux. Les données que nous obtiendrons dans ce projet s'inscrivent dans cette ambition et serviront à préciser et compléter une version initiale du modèle que nous avons proposé.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux impliqués dans les tests comportementaux a été estimée par un calcul de puissance a priori (n=26 souris par groupe). Chaque souris sera évaluée de façon longitudinale dans plusieurs tests, permettant de réduire le nombre total d'animaux. Pour la procédure d'imagerie in vivo, chaque souris sera testée sous régime contrôle et sous régime hypothyroïdien. Chaque souris étant son propre contrôle, le nombre d'animaux impliqués sera réduit. Notre expérience démontre qu'il faut opérer 6 à 8 souris pour obtenir n=4 souris avec un signal suffisamment fort afin de décrire le fonctionnement de suffisamment de neurones horloges dans une condition donnée (un minimum de 10 neurones visibles dans le champ optique par animal.

Raffinement

Dans un souci de raffinement du protocole, nous avons préféré mettre en oeuvre un modèle d'hypothyroïdie induite plutôt que de réaliser une ablation chirurgicale de la glande thyroïde. Cette approche ne nécessite pas d'adaptation particulière des conditions d'élevage. Toutefois, l'apport de matériel de nidification sera renforcé afin de permettre aux souris hypothyroïdiennes (en légère hypothermie) de mieux maitriser la température de leur environnement. Les animaux seront habitués à être manipulés par la personne en charge des tests comportementaux. En vue d'évaluer le statut thyroïdien de façon la moins invasive possible, nous avons développé un protocole de dosage ultra-sensible de l'hormone TSH, à partir d'un volume extrêmement faible de sang total (3 µl, à comparer avec 50 à 100 µl pour les kits commerciaux). La chirurgie préparatoire à la procédure d'imagerie est conduite sous anesthésie générale, avec médication post-opératoire pendant 48 heures. Toutes les souris hébergées en cage isolée conserveront un contact visuel avec d'autres congénères. L'hébergement dans les cages à roue constitue un enrichissement très apprécié, et la mesure de l'activité locomotrice volontaire fournira un index de l'état général des souris : toute souris parcourant une distance inférieure de 50% à celle parcourue par les souris contrôles sera pesée et observée. En cas de perte de poids supérieure à 10% du poids initial, de prostration ou de poil hérissé, les souris auront accès à de la nourriture hydratée et/ou un anti-inflammatoire non-stéroïdien pendant 24 à 72 heures. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris devait atteindre un poids inférieur de 15% à son poids initial, alors elle sera mise à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère de choix dont l'horloge circadienne et la physiologie thyroïdienne reposent sur les mêmes principes moléculaires et cellulaires que l'espèce humaine. Cette espèce donne accès à un large éventail d'outils génétiques et moléculaires pour manipuler les systèmes biologiques (ex : nous utiliserons ici des lignées exprimant des allèles modifiés de gènes de l'horloge), ou pour mesurer l'activité neuronale par imagerie in vivo. Jeunes adultes de 6-7 semaines en début d'expérimentation.

1 124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une douleur chronique leur est infligée par chirurgie de la patte, entretenue de cinq à douze semaines, avec jusqu'à vingt-cinq tests comportementaux par animal pour la mesurer. Le porteur indique que cette douleur ne peut pas être soulagée puisqu'elle est l'objet même de l'étude, menée pour tester un plasma riche en plaquettes. Les bénéfices annoncés pour les patients, prévention et soulagement de douleurs neuropathiques et post-chirurgicales, restent renvoyés au conditionnel et à un usage clinique futur.

Objectifs

La douleur neuropathique est par définition consécutive à une lésion ou une maladie affectant le système somatosensoriel. Chez la plupart des patients, elle a une origine périphérique, par exemple à la suite d'une lésion des nerfs périphériques. La douleur post-chirurgicale chronique quant à elle est définie comme une douleur qui persiste au-delà de 2 mois après la chirurgie sans autre cause potentielle de douleur telle qu’une infection. Généralement chroniques et invalidantes, ces 2 grands types de douleurs, fréquemment rencontrés dans la population, affectent fortement la qualité de vie des patients et ont un impact socio-économique important par leurs répercussions sur la vie professionnelle. La prise en charge de ces douleurs constitue donc un enjeu important de santé publique. D'un point de vue thérapeutique, ces douleurs sont cependant difficiles à traiter. Certains antidépresseurs et anticonvulsivants sont actuellement les meilleures thérapies disponibles mais leur utilisation clinique est limitée par des effets indésirables. Il en est de même pour les douleurs post-chirurgicales chroniques habituellement traitées avec des opiacés qui entraînent de nombreux effets indésirables et parfois même une addiction. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements et/ou approches thérapeutiques pour soulager ces types de douleurs chroniques. Dans ce contexte, un nouvel outil thérapeutique autologue a été développé ces dernières années : l'injection de plasma riche en plaquettes (PRP) qui est un concentré sanguin plaquettaire autologue contenant une concentration naturelle de facteurs de croissance et de cytokines. Cette technique, largement utilisée en rhumatologie ou en médecine du sport reste encore peu utilisée dans le domaine de la douleur chronique. L'intérêt médical de cette préparation est que les plaquettes concentrées vont favoriser une augmentation des facteurs de croissance libérés au niveau du site de lésion, favorisant ainsi le processus de guérison. Cependant, le mécanisme d'action du PRP reste peu clair. Pour aller au-delà des connaissances actuelles, nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique du PRP dans un modèle murin de douleur neuropathique induite par une compression du nerf sciatique, de généraliser cette évaluation à une autre étiologie de douleur couramment rencontrée : la douleur post-chirurgicale et d'étudier les mécanismes d'action sous-jacents.

Bénéfices attendus

Nous postulons que le PRP pourrait non seulement avoir un potentiel thérapeutique dans le soulagement de la douleur neuropathique installée, mais pourrait également être bénéfique dans la prévention de son initiation et de son maintien. Le PRP pourrait également être efficace pour traiter d’autres étiologies de douleurs comme les douleurs post-chirurgicales qui sont actuellement mal soulagées par les analgésiques acutels (patients non répondeurs ou présentant trop d'effets indésirables). Nous espérons, avec ce projet, proposer un outil thérapeutique pour empêcher le développement des douleurs neuropathiques et post-chirurgicales. A l’issue de ce projet, nous espérons pouvoir proposer ce traitement chez l’Homme en clinique afin de prévénir et de soulager les douleurs neuropathiques et post-chirurgicales. Cette avancée pourrait également permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une douleur chronique allant de 5 semaines pour la douleur post-chirurgicale à 12 semaines maximum pour la douleur neuropathique. Les animaux subiront donc une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ sous anesthésie générale. Un groupe d’animaux recevront du plasma riche en plaquettes (PRP) au niveau du site de lésion pendant la chirurgie et un autre groupe d’animaux recevront du PRP par administrations lombaires sous anesthésie gazeuse (5 administrations maximum espacées de 24h, la durée d’une injection intrathécale est de 5 min environ) une fois la douleur chronique installée. Ces animaux subiront également plusieurs tests comportementaux (maximum 25 tests par animal avec un délai de 24h minimum entre chaque test) afin d’évaluer leur douleur (durée des tests allant de 2 min à 20 min avec l’habituation). La durée totale du projet sera de 14 semaine pour la douleur neuropathique et de 7 semaines pour la douleur post-chirurgicale.

Impact sur les animaux

Il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Mais l'objectif de l'étude est d'évaluer l'effet analgésique préventif et curatif du PRP, celui-ci devrait donc avoir un effet bénéfique sur la douleur. Suite à la chirurgie neuropathique ou incision de la patte, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies neuropathiques ou incisionnelles vont induire une réponse inflammatoire classique et attendue qui permet la mise en place de ces modèles. Certains animaux vont subir des injections intrathécales lombaires. Les animaux subiront toute une batterie de tests comportementaux nociceptifs sur lesquels ils gardent le contrôle (retrait de la patte).

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour prélèvements.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’effet thérapeutique du PRP dans un modèle de douleur neuropathique ainsi que dans un modèle de douleur post-opératoire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 14 souris mâles et 14 souris femelles, le risque de variabilité lié à l’activité intrinsèque du PRP étant inconnu et non négligeable. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d'analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la Société du Bien-Etre Animale (SBEA) de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie du crâne d'environ une heure trente pour l'implantation de capteurs intracérébraux, puis deux tests comportementaux et un régime cétogène, afin de suivre le glucose et le lactate du cerveau chez l'animal éveillé. Le porteur choisit le rat plutôt que la souris pour sa taille, seule capable de porter le dispositif miniature fixé sur la tête. Il présente les effets neuroprotecteurs du régime au-delà de l'épilepsie comme des hypothèses, l'apport immédiat restant la mise au point d'un système de mesure sans fil.

Objectifs

Le jeûne induit des adaptations métaboliques qui produisent des effets bénéfiques sur la santé, notamment mentale. Au fil des jours de jeûne, l’organisme puise son énergie dans les réserves de graisses du tissu adipeux et les corps cétoniques issus de leur dégradation, remplacent en partie le glucose dans le sang et le cerveau. Cet état métabolique, appelé cétose, peut-être reproduit par un régime dit cétogène, riche en graisse et dépourvu de sucres. Certains effets neuroprotecteurs du jeûne sont reproduits par le régime cétogène, notamment l’effet anti-épileptique, d’autres sont encore à l’état d’hypothèse, comme des effets anti-neurodégénératifs et protecteurs vis-à-vis de la maladie d’Alzheimer ou de Parkinson. Cependant, les effets de ce régime sur le métabolisme cérébral sont encore mal connus. Malgré l’absence de sucres dans la nourriture ingérée sous régime cétogène, le foie reste capable de produire du glucose. Cependant l’évolution des concentration intracérébrales de glucose au cours d’une diète cétogène reste inconnue, tout comme celle du lactate. Or le glucose et le lactate sont les principaux métabolites énergétiques du cerveau et la compréhension des effets du régime cétogène sur le métabolisme cérébral commence par une connaissance de ses effets du le glucose et le lactate cérébraux. Le but de ce projet est de monitorer les concentrations interstitielles de glucose et de lactate dans le cerveau au cours des premiers jours d’un régime cétogène grâce à des biocapteurs électrochimiques. Ce projet est aussi un défi technologique car la détection du glucose et du lactate repose sur des capteurs dont la durée de vie in vivo n’excède par 12h. Un nouveau procédé de fabrication qui permet d’obtenir une sensibilité stable pendant 5 à 7 jours a été mis au point. Ce projet permettra aussi de valider le concept d’un monitorage de plusieurs jours chez l’animal vigil, grâce à ces nouvelles microélectrodes.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet permettra d’évaluer comment la diète cétogène affecte le métabolisme cérébral. D’un point de vue méthodologique, ce projet permettra de mettre au point un système sans fil innovant, embarqué sur la tête de l’animal et qui rendra possible les études du métabolisme cérébral chez l’animal vigil. Sachant que l’anesthésie générale perturbe largement le métabolisme et notamment la régulation du glucose et du lactate intracérébral, cette innovation permettra une meilleure compréhension des mécanismes régulant le métabolisme cérébral. L’effet du régime cétogène sur le métabolisme cérébral une thématique importante du laboratoire pour laquelle un autres financement a déjà été obtenu de la FRC, la possibilité d’étudier ces effets chez l’animal vigil sans anesthésie représente un progrès considérable.

Procédures

Une chirurgie initiale durant environ 1h30 avec implantation de capteurs intracérébraux Deux tests comportementaux chez l'animal vigil et modification de l’alimentation. Les animaux seront hébergés individuellement pour pouvoir suivre leur prise alimentaire.

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du crâne qui peut occasionner des douleurs qui seront traitées par l’administration de buprénorphine pendant les premières 24h, puis de carprofène pendant 12h supplémentaires. Ensuite, l’animal sera soumis à des protocoles des stimulations sensorielles très peu invasives. Le régime cétogène présente aussi peu d’effets secondaires, ceux-ci incluent une constipation ou des diarrhées peu fréquentes. Sur l’ensemble du projet la nuisance principale représente le réveil après la chirurgie du crâne, ce qui justifie un niveau de gravité modéré.

Devenir

La survie des animaux impliquerait une deuxième chirurgie pour la désimplantation des électrodes et probablement des souffrances consécutives à l'intervention

Remplacement

Le régime cétogène induit des adaptations lentes du métabolisme dès le changement de régime alimentaire. Ces adaptations impliquent l’ensemble de l’organisme : intestins, foies, pancreas, circulation sanguine, reins, cerveau. Il est donc nécessaire d’avoir recours à l’animal vivant pour étudier ce phénomène. Le remplacement par des approches in vitro n’est pas possible actuellement.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour permettre des analyses statistiques fiables. Au cours de ce projet, les analyses statistiques consisteront à comparer les données obtenues pendant la phase de diète standard 36h-48h après chirurgie, à celles obtenues après 3 jours de diète cétogène. Des tests de t de Student appariés seront appliqués après une analyse de normalité par le test de shapiro-Wilk. Dans le cas d’échantillons de données non normales, des tests de Mann-Whitney seront pratiqués. Les effectifs sont calculés sur la base de 10 animaux par groupe. Des mâles et des femelles seront inclus à part égale dans l’étude et nous disposerons de 5 comparaisons pour pouvoir détecter d’éventuelles différences liées au sexe. Les analyses statistiques seront pratiquées dès que six animaux auront été enregistrés. S’ils sont significatifs ou si des calculs de taille d’échantillon par des test beta révèlent qu’aucune différence claire n’apparaît, les expériences seront interrompues sans utiliser l’effectif annoncé au départ, ce qui peut réduire l’effectif.

Raffinement

Tout au long de ce projet, les animaux seront hébergés par paire dans des cages enrichies avec des matériaux de nidification et des baguettes de bois à ronger, afin d’améliorer leur bien-être général. Pendant la phase de réveil après chirurgie, le bien-être de l’animal sera évalué par une grille de score et la douleur sera traitée par des analgésiques. Tout au long du projet, des interactions régulières avec la cellule bien-être et la vétérinaire référente permettront éventuellement d’intégrer des mesures supplémentaires permettant d’améliorer le confort des animaux (par exemple un allongement de la période d’administration des analgésiques au-delà des premières 36h).

Choix des espèces

La plupart des études sur les effets du régime cétogène ont été effectuées chez le rongeur, qui représente le modèle animal de prédilection dans ce domaine, ce qui permet de s'appuyer sur un corpus bibliographique conséquent. Par rapport à la souris, le rat présente une taille et une masse musculaire plus importantes. Seul cet animal pourra porter le poids du potentiostat miniature évalué à moins de 10 g. Rats adultes de 10 semaines (environ 330g chez les mâles et 240g chez les femelles). L'étude concerne des animaux adultes

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale pour injection de virus et implantation d'une fibre optique, un isolement d'une semaine pour la calorimétrie, une restriction hydrique pour les tests d'apprentissage et une aversion olfactive provoquant un inconfort gastrique. Le porteur étudie le rôle de neurones de l'hypothalamus dans la prise alimentaire et l'olfaction, en lien avec l'obésité. Il affirme que ces paramètres comportementaux ne peuvent être obtenus ni in vitro ni chez les invertébrés, dépourvus des structures cérébrales équivalentes.

Objectifs

Le métabolisme et le comportement alimentaire sont en majeur partie régulé par le cerveau. L'expression des certains facteurs au niveau cérébral pourrait en particulier avoir des effets sur le dialogue entre olfaction et métabolisme . Ces mécanismes étant encore très mal connus, le but de cette étude est de les disséquer afin de comprendre leur impact des conditions physiologiques et physiopathologiques (obésité). L’inactivation ou la surexpression ciblée de facteurs de transcription dans des régions précises du cerveau de souris sera mise en place pour mieux comprendre leur rôle. La balance énergétique des animaux (calorimétrie indirecte) ainsi que différents comportements (tests olfactifs) seront alors analysés. L’activité des neurones sera également enregistrée à l’aide d’une méthode optique (photométrie fibrée). Cette étude ne peut être remplacée par d’autre moyen, comme la culture cellulaire, car nous regardons le métabolisme et le comportement de l'animal. Ce projet utilisera le minimum de souris nécessaire (4 études comportant des groupes de 12 à 16 souris (contrôles et traitées); soit 396 souris sur les 4 ans de projet) et respectera le bien-être animal. Lors de ces études la règle des trois R sera respectée, le nombre d’animaux sera réduit au minimum et nous raffinerons les procédures pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Nous effectuerons l'administration d'analgésique lors des procédures. Les cages individuelles sont agrémentées d’un nid végétal et quelques croquettes sont mises à même le sol pour éviter les douleurs de tension au niveau de la suture après les opérations.

Bénéfices attendus

En combinant des études comportementales et métaboliques après l’inactivation ou la surexpression ciblée d'une protéine dans des régions précises du cerveau de souris, nous comprendrons mieux les liens entre les régulations neuronales hypothalamiques et la métabolisme en lien avec l'obésité. Nous considérons que cette étude apportera également une information importante concernant la composante olfactive de la prise alimentaire et de la balance énergétique chez la souris dans les différentes conditions décrites. Ce sont des paramètres très sensibles où le bien-être animal est absolument crucial, autant pour l’animal que pour la validité des résultats obtenus.

Procédures

Nous utiliserons différentes procédures de chirurgie pour l’injection de virus et l’implantation chronique de fibre optique pour des études chez les souris éveillées (chirurgie entre 40 min et 1h), Analyse de calorimétrie indirecte (les animaux sont isolés pour environ 7 jours), Analyse métabolisme du glucose (prélèvements de sang sur environ 2h d’expérience), Tests olfactifs (30 min d'habituation à la cage puis 30 min de test le jour suivant), aversion olfactive conditionnée (injection d’une solution induisant un inconfort gastrique de 1 heure environ, test le jour suivant), test d'apprentissage (environ 1 séances de 20 min par jour pendant 8-10 jours, la prise hydrique des animaux est diminuée dans la cage d'hébergement, les animaux boivent dans la cage de test).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pourront se produire lors de la chirurgie cérébrale, lors de la mise en restriction alimentaire ou hydrique, lors de l'isolement des souris. La chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer douleur et problème de récupération. Pour toutes ces raisons, nous avons prévu des injections d'anti-inflammatoire et une récupération post-chirurgicale sous surveillance pour détecter toute perte de poids ou d'autres problèmes de santé ou de bien-être. Pour les tests métaboliques, des problèmes de volume sanguin prélevé peuvent survenir mais nous avons prévu les prélévements en calculant au plus près les volumes nécessaires aux mesures de l'insuline donc les volumes sont minimes (détaillées dans les procédures expérimentales). Lors de la restriction alimentaire les souris sont surveillées, si un mal être est observé chez un individu il est immédiatement remis ad libitum. Pour la procédure de régime hypercalorique, nous n'avons pas de nuisance attendue. Nous n'avons jamais observé de problèmes de souris ne voulant pas se nourrir avec une nourriture hyperlipidique. De plus, le surpoids induit chez les souris sous régime hyperlipidique n'entrave pas leur locomotion.

Devenir

Mise à mort pour tous les animaux afin de prélever le cerveau pour vérifications des points d'injections et analyses.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles).

Raffinement

Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 3 mois) afin que les réseaux neuronaux soient bien établis et que les expériences ne soient pas perturbées par une plasticité neuronale accrue.

852 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie d'électroporation in utero, les souriceaux une électroporation sous anesthésie par le froid, et la moitié des portées est placée huit jours dans un environnement appauvri en oxygène. Le porteur indique que cette hypoxie provoque un retard de croissance et des lésions cérébrales diffuses, tout en affirmant qu'elles n'entraînent pas de troubles du comportement. Il décrit l'approche in vivo comme "incontournable", les lésions post-hypoxiques dépendant de mécanismes qu'il juge impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

Objectifs fondamentaux du projet : 1) fournir des hypothèses de recherche et des pistes de mécanismes cellulaires pour les chercheurs travaillant sur l’étude du développement cérébral; 2) développer de nouvelles approches permettant de promouvoir la régénération du cerveau après une lésion périnatale.

Bénéfices attendus

Sur un plan fondamental, nos résultats permettront de caractériser le rôle des voies de signalisation morphogéniques (c-à-d les voies impliquées dans le développement du tissu) dans l’induction de quiescence et l’activation des cellules souches neurales du cerveau postnatal. Les données issues de ce projet permettront également de comprendre quels sont les mécanismes qui font que la réparation cérébrale est limitée après la naissance, ce qui pourra conduire à l’identification d’indicateurs biologiques ou de pistes thérapeutiques ultérieures. Nos résultats permettront aussi d’évaluer la pertinence d’une manipulation de ces voies de signalisation pour encourager la régénération du cerveau après une lésion précoce.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Des femelles et des souriceaux seront soumis à une administration unique de tamoxifène. Des souriceaux seront soumis à une procédure d'électroporation postnatal qui ne nécessite pas de chirurgie, mais qui s'effectue sous cryo-anesthésie. Après la naissance, la moitié des animaux (femelles et portée) seront soumis pendant 8 jours à un environnement appauvri en oxygène Les prélèvements seront réalisés postmortem pour l’étude du cerveau par histologie

Impact sur les animaux

Pour les souris femelles : L’injection de tamoxifène peut entraîner des complications lors de la mise bas, qui sont prévenues par co-injection de progestérone. L’administration se fera par gavage afin d’éviter tout risque d’injection à proximité d’un embryon. L’hypoxie chronique peut entrainer une réduction de la quantité et qualité de lait que produisent les femelles, qui est évitée en échangeant régulièrement les femelles entre les conditions normales et réduites en oxygène. Pour les souriceaux : L’électroporation postnatale implique une anesthésie sur glace. Afin d’éviter toute brulure cutanée, le souriceau est isolé de la glace. L’hypoxie chronique entraîne un retard de croissance transitoire et des lésions cérébrales diffuses, qui n’induisent cependant pas de troubles du comportement spontané des souris élevées en cage.

Devenir

Afin d'effectuer des analyses permettant d'étudier l'impact des manipulations sur le comportement et le devenir des cellules souches neurales, les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour collecter les tissus et effectuer des analyses transcriptomiques ou histologiques.

Remplacement

Une approche in vivo est incontournable pour ce projet de recherche. En effet, les lésions neurologiques post-hypoxiques dépendent de mécanismes complexes (interactions cellulaires, rôle de la réponse immunitaire, inflammation tissulaire) impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de reconstituer la complexité des différents micro environnements dans lesquelles les cellules souches neurales transitent et se développent.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d’expériences publiées. Les portées seront analysées au fur et à mesure afin d’atteindre au plus vite le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. De plus certaines expériences en conditionneront d'autres. Par exemple, si l’électroporation d’une forme inactive d’un récepteur n’induit aucune activation des cellules souches neurales, alors les expériences de knock-out conditionnel de ce récepteur prévues dans la procédure 2 seront abandonnées, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. La méthode d’échantillonnage utilisée permet non seulement un échantillonnage homogène de notre région d’intérêt, mais aussi l’utilisation des mêmes cerveaux pour des marquages variés, nous permettant de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Enfin, nous avons mis en place dans l’équipe depuis plusieurs années un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissue permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (anesthésie et analgésie). Un suivi journalier des animaux post chirurgie ou post hypoxie, permet de déterminer des points limites stricts et spécifiques au projet par le calcul un score d'inconfort à partir duquel l’animal reçoit une injection d’analgésique, un suivi plus fréquent, ou est euthanasié. Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance, au moyen notamment d’un enrichissement varié stimulant la nidation. Les femelles seront régulièrement échangées entre les cages standards et celles réduites en oxygène, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux.

Choix des espèces

L’architecture du cerveau de la souris est proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales ainsi que dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral. Par ailleurs, nous avons établi des méthodes d’étude des cellules souches neurales et des progéniteurs de la zone périventriculaire et un modèle de lésion cérébrale périnatale, qui nous assurent que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines. Pour les expériences de manipulations génétiques in utero, des embryons de 15±1 jours seront ciblés. Pour les expériences de manipulations génétiques postnatales, des souriceaux de 2±1 jour seront utilisés. Le choix de ces deux temps d’intervention se fera en fonction de la nature des protéines ciblées, pour permettre une expression maximale au moment de l’hypoxie. Les souriceaux seront placés en condition hypoxique du 3ème jour au 11ème jour après la naissance. Cette période correspond au 3ème semestre de croissance intra-utérin chez l’homme. Ce modèle permet donc de reproduire les périodes d’hypoxie fréquentes observées chez les grands prématurés. Enfin l’administration de molécules thérapeutiques se fera en fin de période hypoxique aux jours 11 et 12, afin de tester leur capacité à régénérer le tissu.