Système nerveux

Une grille de score quotidienne et un arbre décisionnel peuvent conduire à la mise à mort avant terme, cas que le porteur estime à moins de 2 % des animaux. 1 834 rats vont être utilisés, dont 1 738 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après un diabète déclenché chimiquement, ils développent pendant toute la durée de l'étude une allodynie et une hyperalgésie déclarées sévères, une soif et des urines abondantes également sévères, une fonte musculaire modérée, et subissent entre neuf et onze injections ainsi que des tests de sensibilité répétés toutes les trente minutes pendant trois heures. La raison de la mise à mort tient en une ligne du RNT, l'état douloureux chronique de l'animal, état que le protocole a lui-même installé pour évaluer des antalgiques.

Objectifs

La neuropathie diabétique est une des complications les plus fréquentes du diabète de type 1 (DT1, insulino-dépendant) et de type 2 (DT2, insulino résistant) touchant jusqu’à 50% des patients diabétiques et responsable de neuropathie douloureuse pour 50% d’entre eux. Ses principaux symptômes associent des douleurs évoquées (hyperalgie, allodynie), spontanées (décharges électriques, sensation d’étau, …), une perte de la sensibilité thermique. Les neuropathies douloureuses sont difficiles à traiter et, en raison de leur chronicité, elles sont fréquemment associées à des comorbidités anxieuses, dépressives et cognitives. Ces co-morbidités peuvent interférer avec les actes de la vie courante et avoir un impact important sur la qualité de vie des patients. A l’heure actuelle, trois classes pharmacologiques sont recommandées en 1ère intention dans cette indication : les antidépresseurs tricycliques, les inhibiteurs de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline et les anti-épileptiques ligands des canaux calciques voltage-dépendants. Néanmoins, ils ont une efficacité limitée d'où un besoin urgent d’innovation thérapeutique. Sur la base de ce constat clinique, la modélisation de la neuropathie diabétique douloureuse est une nécessité. Le modèle de neuropathie diabétique chimiquement induite reproduit les mécanismes lésionnels métaboliques du DT1 associés aux symptômes de d'hypersensibilité et aux co-morbidités cognitives. Nous proposons d’étudier dans ce modèle animal à haute valeur translationnelle, l’implication de récepteurs de la sérotonine, dans les mécanismes physiopathologiques de la douleur neuropathique afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant d’améliorer la prise en charge des douleurs neuropathiques. Les données précédemment acquises indiquent que cet objectif, pourrait être atteint en modulant l’activité de récepteurs de la sérotonine. Ce projet, qui mettra en œuvre des approches comportementales, pharmacologiques et moléculaires a pour but d’identifier les mécanismes spinaux sous-tendant les effets bénéfiques des modulateurs testés sur la douleur neuropathique diabétique.

Bénéfices attendus

Si l’administration des agents pharmacologiques permet de soulager les symptômes douloureux et les co-morbidités associées, alors on peut espérer i) soit le repositionnement de certains de ces agents déjà introduits dans des essais cliniques pour une autre indication (troubles cognitifs associés à la maladie d’Alzheimer), ii) soit le développement de nouveaux agents. Au vu du nombre croissant de patients atteints de diabète dans le monde, de la sévérité des douleurs neuropathiques, de l'efficacité très limitée et des nombreux effets indésirables des traitements disponibles, le développement de thérapeutiques médicamenteuses efficaces dans le traitement des douleurs neuropathiques est fortement attendu.

Procédures

Les animaux vigiles sont soumis à des tests comportementaux de sensibilité 21 jours après l'induction du diabète puis, après l'administration de l'agent pharmacologique ou du véhicule, 1 fois toutes les 30 min pendant 3 h maximum (au total entre 5 et 7 mesures). Le test de cognition est réalisé une seule fois, 21 jours après l'induction du diabète, il dure 10 minutes. Les animaux rentrant dans deux procédures ne subissent qu'un seul test de sensibilité et le test cognitif. Entre leur arrivée et leur mise à mort, les animaux subissent: entre 9 et 11 injections. La durée totale de chaque injection (qui comprend l'immobilisation du rat dans la main de l'opérateur et l'injection) est de 10 secondes. Pour mesurer la glycémie, une goutte de sang est recueillie par piqûre de l'extremité de la queue du rat, une ou deux fois pendant toute la durée de l'étude (piqûres espacées de 7 jours). La piqûre et le recueil de la goutte de sang durent 5 secondes.

Impact sur les animaux

Chez les rats diabétiques, un arrêt de la croissance pondérale (sans perte de poids par rapport au poids initial), une polydypsie (sévère), une polyurie (sévère), une perte de la masse musculaire (modérée), une apparition d’une allodynie et/ou d'une hyperalgésie (sévère) persistant pendant toute la durée de l’étude sont attendus. Injections réalisées sur animal vigile : stress (modéré) lié à l’immobilisation du rat dans la main de l’opérateur et douleur (légère) liée à la piqure. Tests comportementaux réalisés sur animal vigile : stress (modéré) dû au changement de salle (salle de stabulation vers salle d’expérimentation). Stress (modéré) lors des tests de sensibilité dû à l’immobilisation du rat entre les mains de l’opérateur (durée 15 sec). Aucun effet indésirable majeur n’est attendu après administration des agents pharmacologiques.

Devenir

Mise à mort en raison de l'état douloureux chronique de l'animal.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal vigile, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements antalgiques potentiels sur la douleur et les co-morbidités associées. Le modèle de diabète induit chimiquement fait référence dans la communauté scientifique. Sa répétition est nécessaire afin d’évaluer l’effet de nouveaux composés pharmacologiques sur les symptômes douloureux de la neuropathie et les co-morbidités cognitives associées.

Réduction

n= 8 rats/condition (traitement); la taille de l’échantillon a été définie selon la variabilité (10%) des paramètres étudiés (hyperalgie, allodynie ; troubles cognitifs) grâce à une approche statistique. Les rats diabétiques ayant reçu le véhicule lors du test de stimulation thermique seront introduits dans le test de cognition. Ainsi, 160 rats (80 mâles et 80 femelles) seront concernés sans pour autant augmenter la durée de vie de l'animal. Les rats ne développant pas d'hyperglycémie sont systématiquement réinjectés 7 jours plus tard avec la même dose de l'agent inducteur. S'ils demeurent résistants alors ils seront écartés de l'étude pharmacologique. Ceci permet de limiter à 10% la proportion de rats non diabétiques.

Raffinement

Le protocole mettant en jeu un modèle de douleur chronique, une attention particulière est portée aux animaux, aux conditions de stabulation et aux soins post-induction du diabète. Les rats sont observés tous les jours et évalués à l’aide d'une grille de score spécifique au modèle; des points limites adaptés au modèle et un arbre décisionnel sont mis en place , pouvant conduire à la mise à mort de l'animal (très rare < 2%). En raison de polydipsie et de polyphagie développées après l'induction du diabète, les personnels veillent à ce qu’il y ait un apport en eau suffisant et permanent (2 biberons de capacité double/cage) ainsi qu’en granulés dans la mangeoire. Les rats diabétiques sont stabulés à raison de 3 rats/cage maximum, le milieu des cages est enrichi par des tunnels en matière plastique, des morceaux de bois à ronger, du coton pour construire un nid et les litières sont partiellement changées quotidiennement en enlevant une partie de la sciure souillée et en apportant de la sciure fraiche afin de conserver l'environnement olfactif du rat.

Choix des espèces

Le choix du rat est justifié par i) sa pertinence physiologique (nombreuses similarités structurelles et fonctionnelles de son système nerveux avec l’humain) pour permettre des extrapolations ; ii) la richesse de ses comportements facilement observables et mesurables, reproductibles, pour l’étude des fonctions cognitives et de la douleur ; iii) sa facilité de manipulation et sa docilité, iv) son cycle de vie court (permettant d’étudier en quelques semaines les effets d’une pathologie chronique qui évolue sur plusieurs mois chez l’homme) ; v) la possibilité de développer des modèles de maladies humaines, dont le diabète de type 1, permettant de tester de nouvelles thérapies potentielles avant de passer aux essais cliniques chez l’humain. Rats jeunes adultes (âgés de 7-8 semaines): des jeunes adultes sont préférés car le taux de létalité est plus bas (3 % chez les 6-11 semaines et 220-400 g) que chez des rats plus âgés (83 % chez les rats de 12-17 semaines).

Biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie, isolement jusqu'à sept jours en attente du résultat de génotypage, puis placement en arène de comportement pendant six heures au maximum sous stimulations visuelles ou mécaniques. 5 520 poissons zèbres vont être utilisés, dont 500 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 5 020 dans des procédures légères. Les larves sont immobilisées dans l'agar pour l'enregistrement de leur activité neuronale, jusqu'à cinq sessions de trente minutes à deux heures, ce qui peut provoquer une baisse d'oxygénation et des tentatives de fuite, afin de relier des mutations de gènes parkinsoniens à des défauts moteurs. Une centaine de poissons adultes seront proposés à l'adoption par du personnel de l'établissement, les autres étant tués, y compris les reproducteurs maintenus jusqu'à dix-huit mois pour entretenir les lignées.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson ont des origines génétiques et environnementales, affectant la motricité, la posture et la cognition. Pour comprendre ces troubles comportementaux, un modèle animal s’impose. Nous étudions le poisson zèbre car cet organisme partage 70 pourcents de ses gènes avec l'humain et est transparent durant son développement larvaire, permettant une observation non invasive du cerveau et de la moelle épinière. Le poisson zèbre offre des avantages pour étudier la posture et la locomotion, car ses contraintes posturales et biomécaniques sont plus proches de celles des humains (bipèdes) que celles des quadrupèdes. Nous comparerons dans ce projet des poissons témoins à des mutants présentant des pertes de fonction pour des gènes identifiés chez des patients Parkinsoniens avec un développement précoce de la maladie. Nous analyserons chez ces mutants leur navigation en réponse à des stimulations sensorielles, leur capacité à capturer des proies, et examinerons les défauts des circuits moteurs sous-jacent par des techniques innovantes d’imagerie et de physiologie. Cette approche permettra d'identifier les origines des défauts du comportement moteur dans les circuits neuronaux du cerveau et de la moelle épinière et d'améliorer notre compréhension des maladies neurodégénératives.

Bénéfices attendus

Ce projet offre deux bénéfices principaux : d’un point de vue translationnel pour l’humain et d’un point de vue fondamental pour augmenter nos connaissances sur les formes larvaires des poissons. D’un point de vue scientifique, ce projet permettra d’améliorer notre compréhension du rôle des gènes dans l’organisation et la fonction des circuits moteurs vertébrés. Notre approche se fonde sur des résultats obtenus pour des gènes associés à la maladie de Parkinson. En vue de progresser dans notre compréhension de la maladie de Parkinson, ce projet permettra d’établir un lien entre mutations géniques et le dysfonctionnement et la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques qui affectent les circuits moteurs. Ainsi d’un point de vue sociétal, il permettra à plus long terme d’identifier de nouveaux traitements par stimulation ciblée génétiquement des circuits moteurs chez les patients Parkinsoniens. D’un point de vue écologique, le contrôle de la locomotion chez les poissons aux stades larvaires est très peu connu. Notre étude permettra en se focalisant sur le poisson zèbre et en le comparant à d’autres espèces grâce à des collaborations (poissons cavicoles du Mexique, poissons clown de la barrière de corail), d’établir des principes fondamentaux conservés dans la navigation larvaire des espèces aquatiques.

Procédures

Afin de connaitre le patrimoine génétique d’une partie des poissons potentiellement mutants, une biopsie minimale de la nageoire caudale sera réalisée sous anesthésie générale (durée de moins d’une minute par animal et une seule fois). Ils seront ensuite hébergés seuls jusqu’à réception des résultats (durée inférieure à 7 jours). Dans le but de déceler des dysfonctionnements des circuits moteurs associés à des mutations identifiées chez des patients de la maladie de Parkinson, une partie des poissons zèbre seront placés dans des arènes de comportement. Après une habituation de 30 minutes maximum, ces poissons seront soumis à des stimulations visuels ou mécaniques légères pour évaluer leur aptitude motrice et cela pendant 360 minutes maximum. Afin de comprendre l’effet des mutations génétiques sur les neurones impliqués dans le contrôle du mouvement, une partie des animaux sera placée sous un microscope afin d’enregistrer l’activité de populations de neurones par imagerie ou par électrophysiologie (une session de 30 min à 2h maximum par jour, qui sera répétée si besoin jusqu’à 5 fois).

Impact sur les animaux

Les manipulations et déplacements des aquariums nécessaires au cours du projet pourront être source de stress pour les animaux. Chez l’adulte, l’acte de biopsie consistant à prélever un échantillon de nageoire caudale sous anesthésie générale brève (moins de 3 minutes) peut provoquer un stress lié à la capture et une légère douleur due à la lésion de l’extrémité de la nageoire. L’anesthésie présente des risques très limités pour l’animal du fait de sa durée courte et de la sédation peu profonde. Il est possible qu’un phénotype dommageable émerge par suite des modifications génétiques générées. Les effets indésirables de nos expériences comportementales sur les larves sont le confinement dans une arène et la stimulation sensorielle qui peuvent augmenter leur stress. L’immobilisation des larves pour les enregistrements optiques et électrophysiologiques peut générer du stress lors de l’immobilisation en agar, une diminution d’oxygénation, un comportement moteur d’échappement ou une réduction des fréquences operculaire et cardiaque.

Devenir

A l’issue des manipulations, l’ensemble des animaux sera euthanasié. Des prélèvements de tissus seront effectués pour analyser l’anatomie du système nerveux. Une partie des animaux sera maintenue en vie pour être adoptée (une centaine d’animaux) si leurs caractéristiques génétiques et leur statut sanitaire le permettent. Les poissons adultes permettant le maintien des lignées sur la durée du projet seront maintenus en vie jusqu’à 18 mois, âge de fin de vie où ils seront euthanasiés.

Remplacement

Les études de mutations de la maladie de Parkinson in vitro ont permis d’observer des défauts cellulaires au niveau des mitochondries, mais n’expliquent pas la source des défauts moteurs et ne permettent pas d’élucider quels réseaux neuronaux au sein des circuits moteurs demeurent résilients chez ces mutants. Une étude comportementale est inévitable pour comprendre comment des mutations génétiques entrainent des défauts moteurs. Pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents aux pertes de fonction motrice, il est nécessaire de procéder à la perte de fonction du gène ciblé dans des animaux modèles car posture, locomotion ou cognition ne peuvent être évidemment récapitulées in vitro. Pour l’étude du tronc cérébral dans le contrôle moteur, le poisson zèbre (Danio rerio) est un organisme génétique modèle dont le génome comporte 70 pourcents de conservation avec celui de l’être humain. L’analyse du comportement du poisson zèbre porteurs de mutations de gènes candidats parkinsoniens en comparaison à des animaux intacts permettra ainsi d’associer ces mutations à des défauts moteur.

Réduction

Afin de limiter le plus possible le nombre d’animaux pour notre étude, nous avons évalué le nombre d’individus nécessaires pour chaque procédure. Pour cela nous nous sommes basés sur un calcul de puissance statistique prenant compte de l’amplitude des effets et de la variabilité du comportement afin d’avoir le nombre minimal d’individus pour détecter un effet. Pour diminuer le nombre d’adultes à élever, si cela est compatible avec les mutations générées, nous génotyperons dès le stade larvaire ce qui permettra de n’élever que des poissons d’intérêts (poissons porteurs des mutations d’intérêt et témoins sains. Pour identifier avec le minimum d’animaux possibles les mutations entraînant des défauts moteurs, nous utiliserons une approche de criblage reposant sur l’analyse des stades larvaires entre 5 et 7 jours de développement. Pour chaque quantification, les tests statistiques appropriés seront utilisés pour évaluer la significativité des effets observés. Le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet sera de 5 520 poissons zèbre.

Raffinement

L’hébergement des animaux sera conforme à la réglementation : en incubateur jusqu’à 6 jours puis mise en eau avec flux progressif favorisant une prise alimentaire optimale. Nous respecterons le besoin social des poissons zèbre et, quand utile, un enrichissement avec des poissons de souche différente aura lieu pour former un groupe social avec un sexe ratio optimal. Les poissons en aquarium seront nourris 2 à 3 fois par jour avec une nourriture adaptée à leur taille et stade physiologique. Surveillés chaque jour, ils sont hébergés dans des conditions précautionneuses : suivi des paramètres physico-chimiques de l’eau journalier et contrôle sanitaire 3 fois/an. Une fois par semaine, notre équipe observera en détail les poissons mutants en vérifiant mobilité, flottabilité, prise alimentaire et morphologie adéquate pour leur âge. Nous manipulerons à minima les animaux avec des instruments atraumatiques (épuisette, cuillère) en plastique. Autant que possible, nous génotyperons les larves à 3 jours par « grattage » minimalement invasif de la queue pour n’élever que des poissons mutants et témoins sauvages et diminuer la variabilité de phénotypes en les séparant précocement. Quand le génotypage adulte s’impose, la biopsie de la nageoire caudale se fera sous anesthésie générale via des manipulations atraumatiques et un prélèvement limité avec outils désinfectés. Nous n’inclurons dans nos procédures expérimentales que des larves ou adultes en apparente bonne santé. Les animaux auront une période d’habituation adéquate au changement environnemental dans les chambres de comportement et d’imagerie. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Afin de limiter l’inconfort des animaux et de diminuer la douleur lorsque des enregistrements par imagerie et électrophysiologie, les larves seront anesthésiées durant toutes les phases de manipulation et de préparation des enregistrements. L’anesthésie sera graduellement levée une fois que l’animal sera préparé. Afin d’offrir une fin de vie de qualité pour nos poissons non utilisés, nous offrons la possibilité au personnel formé et sensibilisé aux bases de l’aquaculture de pouvoir recueillir des animaux adultes chez eux via un programme d’adoption dédié.

Choix des espèces

Le poisson-zèbre est un modèle de choix pour étudier les défauts moteurs associés à des mutations dans des gènes critiques pour le fonctionnement des neurones et conservés au sein des espèces vertébrées. Notre connaissance réduite de la structure et du fonctionnement dynamique des circuits moteurs vient notamment du fait qu’ils sont difficiles d’accès chez les mammifères. Le poisson zèbre dont le tronc cérébral et la moelle épinière restent accessibles optiquement pendant le premier mois de vie est donc un modèle de choix pour mesurer l’activité neuronale de manière dynamique et non invasive en utilisant la lumière car les circuits moteurs sont ainsi conservés au niveau moléculaire, anatomique et physiologique. Notre projet repose sur l’étude des comportements larvaires et adultes. Nous sonderon phénotypes moteurs tels que navigation et capture de proies sur des larves de 5-7 jours puis les comportements sociaux sur des larves de 21-28 jours. Nous utiliserons l’électrophysiologie et l’imagerie optique reposant sur la transparence du tronc cérébral et de la moelle épinière de la larve auront lieu de 7 à 28 jours de développement.