Système nerveux

216 souris reçoivent une ou deux injections intrapéritonéales de psychédéliques agissant sur le récepteur 5-HT2A, puis sont tuées une heure plus tard. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et l'ensemble des animaux est mis à mort pour analyser la neurochimie de trente régions cérébrales. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu et qu'aucun point limite n'est rapporté pour ces composés, tout en prévoyant le cas d'une respiration altérée, d'une prostration, d'une immobilité en posture anormale ou de convulsions. Il précise alors que l'animal sera retiré du dispositif puis tué dans une chambre à dioxyde de carbone, rapidement s'il ne récupère pas, ou en fin de journée si les signes persistent.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l’effet d’agents pharmacologiques psychédéliques agissant sur le récepteur à la sérotonine 5-HT2A (psychédéliques classiques). Les agonistes de ce récepteur sont considérés comme des antidépresseurs et anxiolytiques potentiels, mais ils sont aussi des composés hallucinogènes. Compte tenu de l’expression diffuse de l’expression du récepteur 5-HT2A dans le cerveau, nous postulons que les effets de ces composés altèrent l’activité de nombreux systèmes de neurotransmissions et de réseaux neurobiologiques. Cette information n’existe pas. C’est la raison pour laquelle nous avons lancé ce projet de recherche en neuropharmacologie et qui s’insère dans le champ de la neurobiologie intégrative. Par ailleurs, ce projet vise aussi à inclure dans la question posée le rôle de l’environnement dans le mécanisme d’action de ces composés. Une analyse de la littérature montre en effet que ces composés ne sont pas évalués dans des protocoles d’exploration forcée, en d’autres termes, des protocoles qui mettent en jeu le comportement exploratoire de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes d'action des agents pharmacologiques psychédéliques sur l’activité des systèmes de neurotransmissions classiques dans le cerveau. Ces systèmes de neurotransmission jouent un rôle essentiel dans le traitement de l’information et les comportements. La réalisation de banque de données neurochimiques sur 30 régions cérébrales permettra de concevoir pour une première fois l’organisation fonctionnelle des systèmes de neurotransmission seuls ou en interaction sur plusieurs réseaux neurobiologiques dans le cadre du mécanisme d’action de ces composés. Cette permettra aussi de définir le rôle du récepteur cible des psychédéliques dans les effets neurochimiques de ces composés hallucinogènes, associés à des effets comportementaux (principalement le comportement exploratoire).

Procédures

Il y aura une voire 2 injections intrapéritonéales chez les souris qui seront réalisées par des expérimentateurs aguerris. La durée totale nécessaire à la préhension de la souris et à l'injection est estimée à moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Il n'y a à priori aucun effet indésirable attendu en dehors des effets de la préhension de l'animal et de l'injection sur les animaux qui sont euthanasiés 1 h après l'unique injection intrapéritonéale. Néanmoins, les effets des substances sont ambivalents nécessitant des études en dose réponse. Ils induisent des effets non toxiques sur la physiologie générale et ont des propriétés plutôt analgésiques. Il n’y a pas de points limites reportés pour ces composés dans la gamme des doses que nous avons déterminée. L’antagoniste MDL100907 a été caractérisé comme un antipsychotique de seconde génération, et est parfois administré chez l’homme. Il n’a pas d’effets secondaires connus. Les solvants contiennent parfois des composés potentiellement agressifs (Tween, DMSO), mais pas aux concentrations utilisées. L’utilisation de ces composés (Tween, DMSO) est nécessaire pour dissoudre les composés. Il n’y a pas de points limites mais il faut être vigilant. Dans le cas où une injection serait associée à des effets néfastes inattendus (respiration altérée, prostration, immobilité associée à une posture anormale, convulsions), l’animal sera retiré de la cage en plexiglas, et placé dans une cage d’hébergement classique contenant de la litière. L’animal sera euthanasié dans une chambre à dioxyde de carbone ultérieurement, c’est-à-dire rapidement si l’animal ne recouvre pas de la souffrance apparente, ou en fin de journée si les points limites ne disparaissent pas rapidement.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure en vue d'une analyse neurochimique de différentes structures cérébrales.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé que chez l'animal, le modèle murin étant un des plus classiquement utilisé pour ce type d'étude. En effet il s'agit d'évaluer des effets pharmacologiques sur des paramètres comportementaux et neurochimiques dans plusieurs régions cérébrales.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont conçus avec le minimum d’individu pour pouvoir réaliser des études statistiques valables. Ces analyses tiennent compte de comparaison de moyennes ou d’analyses plus complexes (analyses en corrélations, analyse multivariées).

Raffinement

Pour limiter au maximum le stress des animaux, ceux-ci sont habitués à l'expérimentateur (le même pendant toute la durée de l'expérience) dès leur arrivée dans l’animalerie agrée du laboratoire. Le temps d’acclimatation des animaux aux lieux sera d’au moins 10 jours. Les animaux seront hébergés dans des cages par 4 en présence de litière favorisant l’absorption des liquides vers le bas. Ces cages sont transparentes afin de favoriser le contact visuel. Ils auront également à leur disposition des formes d’enrichissement afin de réduire l’ennui et le stress comme des carrés de coton, un cylindre rigide en carton, jusqu’au jour de l’expérience. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler d'éventuelles souffrances entrainant des comportements particuliers: respiration anormale, agressivité vis à vis des congénères, auto-mutilation, diminution d'activité ainsi qu'un suivi de poids, une perte de poids anormale étant un indice de souffrance. Si un animal présentait des signes de souffrance, il sera isolé de ses congénères, la procédure sera arrêtée et il sera surveillé sur tous les paramètres précédemment cités. S’il ne récupère pas des paramètres normaux, le vétérinaire sera contacté pour évaluation de son état. En cas de lésions, un traitement analgésique local à la lidocaine pourra être envisagé.

Choix des espèces

La majorité des études sur le sujet sont réalisées sur des rongeurs de laboratoire, particulièrement chez la souris. L'utilisation de souris C57/ Bl6 permettra d'analyser nos résultats en se basant sur les données de la littérature de façon plus pertinente. Souris adultes de 3 à 6 mois

756 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant entre 5 et 74 séances d'imagerie sous anesthésie, d'une durée pouvant atteindre 1 h 30, sur une période allant jusqu'à 18 mois. Un nerf ciliaire leur est coupé pour léser l'innervation de la cornée, opération de 10 à 15 minutes, et un filament de nylon est posé sur leur œil une fois par mois pour déclencher le réflexe de clignement. Toutes sont tuées à la fin de la période de maintien, les yeux prélevés et les cornées disséquées, pour une étude qui cherche à comprendre comment les nerfs de la cornée se régénèrent, sans traitement candidat à ce stade. Le porteur justifie le choix de la souris en affirmant que "plus de 98 pourcent de son génome est identique à celui de l'Homme".

Objectifs

Les maladies de la cornée sont la deuxième cause de cécité dans le monde après la cataracte. Leur origine peut être génétique, dégénérative (vieillissement, diabète) et/ou environnementale. Il est donc essentiel de mieux comprendre la physiologie de la cornée pour proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de défauts de la cornée. L'atteinte de l'innervation cornéenne se traduit par des symptômes allant d'une diminution de la sensibilité oculaire sans lésion cornéenne au syndrome de l'oeil sec. Actuellement, il n'existe aucun traitement disponible en routine pour la gestion de l'innervation cornéenne. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la régénération de l’innervation cornéenne en temps réel dans des modèles murin de lésion de l'innervation de la cornée. Nous avons ainsi pour objectifs d’étudier différents mécanismes lors de la régénération axonale (interactions entre les nerfs et les cellules immunitaires ; interactions entre les nerfs et les cellules gliales ; mécanismes de dégénérescence nerveuse ; implication des molécules de guidage axonale). Afin de comprendre l’ensemble de ces mécanismes ainsi que leur modulation en fonction de l’âge des animaux, nous souhaitons réaliser cette étude sur populations d’âges différents (comparaison groupe jeune et groupe agé. ).

Bénéfices attendus

Aucun traitement n’est actuellement disponible en routine malgré le nombre important de patients atteints (estimé à 1 personne sur 2000). Les causes du développement de la maladie sont diverses : d'origine virale ou bactérienne, mais également des affections secondaires dues à d'autres pathologies telles que le diabète ou encore à des atteintes traumatiques ou chirurgicales. Cette étude permettra de mieux comprendre l'innervation de la cornée et les mécanismes sous-jacents impliqués dans sa plasticité, son remodelage et sa régénération à la suite de lésions; et ainsi d’identifier de nouvelles voies thérapeutiques pour le traitement de la kératite neurotrophique.

Procédures

Un partie des animaux recevra un traitement par gavage (réalisé une seule fois, sur animal vigile, l'acte dure moins de 1 min par animal). Les animaux subiront une chirurgie (lésion d'un nerf ciliaire) ; cet acte dure environ 10-15 min par animal et il est réalisé sur animal anesthésié et analgésié. Une fois par mois (soit 18 fois maximum selon les groupes), nous réaliserons un test de sensibilité de la cornée (réalisé sur animal vigile, l'acte dure environ 3 min par animal). Ce test est rapide et consiste à poser un filament de nylon sur l'oeil pour provoquer un reflexe de clignement de la paupière. Chaque animal sera imagé 1x par semaine pour une durée allant de 1 mois jusqu'à 18 mois selon les objectifs du projet (soit entre 5 et 74 sessions d'imagerie, selon la procédure, réalisées sous anesthésie d'une durée maximale de 1h30 chacune).

Impact sur les animaux

Une partie des animaux recevront un traitement par gavage (une seule fois). La contention au moment de sa réalisation peut être source de stress chez les animaux. L'introduction de la canule peut quelques fois provoquer des microlésions. Les animaux recevront deux injections par voie sous-cutané. Au moment de la réaliser, la contention et l'introduction de l'aiguille peut être source de stress pour les animaux. Une légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille peut aussi être ressentie. Pour réaliser ce projet, nous allons induire une lésion de l’innervation cornéenne par ablation d’un nerf ciliaire. La contention de l'animal pour la réalisation du test de sensibilité de la cornée peut également être source de stress. Ce test est rapide et consiste à poser un filament de nylon sur l'oeil pour provoquer un reflexe de clignement de la paupière. La répétition des sessions d'imagerie peut également être source de stress pour les animaux. L'anesthésie peut dans de rare cas amener un stress thermique ou une potentielle détresse respiratoire chez les animaux.

Devenir

A la fin de la période de maintien prévue, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques complémentaires (les yeux seront prélevés et l'ensemble des cornées des animaux sera disséqué).

Remplacement

Du fait de la complexité de l'oeil, de l’innervation cornéenne et des interactions entre les nerfs et les cellules, il n'est pas possible de modéliser les mécanismes de la pathologie que nous étudions par des modèles in vitro. L'utilisation de l'animal nous est donc indispensable pour étudier de façon complète les mécanismes du développement de la pathologie que nous étudions ainsi que les processus de régénération de l'innervation de la cornée.

Réduction

Ce projet impliquera au maximum 756 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables (nous utiliserons dans notre étude un test statistique adapté pour l'analyse de nos études) et atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Le nombre d'animaux requis pour ce projet a été déterminé à l'aide d'un logiciel.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton), avec un cycle jour-nuit de 12h. La température et l’hygrométrie sont régulés. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des points limites ont été définis (tels que la surveillance du poids des animaux, l'absence de locomotion, l'état du pelage, la prostration). Pour les étapes chirurgicales et les analyses par imagerie, les rongeurs bénéficieront d'une analgésie ainsi que d'anesthésie générale complémenté par une anesthésie locale de la cornée.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet plus de 98 pourcent de son génome est identique à celui de l’Homme. Par ailleurs, ce modèle permet la transgénèse et donc de pouvoir étudier in vivo les conséquences de la délétion d’un gène. La souris est un modèle utilisé depuis de très nombreuses années pour l’étude du système nerveux et de l’innervation cornéenne. De ce fait de nombreuses données sont déjà disponibles sur lesquelles notre étude peut se reposer. Nous réaliserons les expérimentations sur 2 groupes d’âges différents. Un premier groupe nommé jeune (animaux âgés d’environ 3 mois) et un groupe agé (animaux âgés d’environ 15 mois). Cela nous permettra de comparer les processus et capacités de régénération en fonction de l’âge.

La récompense qui fait tenir la tâche repose sur une restriction d'eau de moitié, laquelle fait perdre aux souris jusqu'à 10 % de leur poids, et leur tête reste immobilisée jusqu'à 45 minutes par séance. 480 souris sont utilisées dans ce premier volet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après 49 jours d'introduction de congénères inconnus dans leur cage pour installer un état anxieux. Le porteur qualifie pourtant la tâche de "non aversive et non douloureuse" et classe la restriction hydrique parmi les effets indésirables "mineurs". Toutes sont tuées à l'issue, leur cerveau prélevé pour des analyses post-hoc.

Objectifs

La phobie sociale, ou trouble de l'anxiété sociale (TAS), est une forme de trouble anxieux définie récemment, actuellement classée parmi les troubles psychiatriques les plus fréquents. Ce trouble se caractérise par une peur intense et persistante d'une évaluation négative potentielle par les autres lors d'interactions sociales, ce qui conduit souvent à l'évitement social et au repli sur soi. L'une des principales altérations du TAS, souvent considérée comme une cause sous-jacente, est une perturbation du traitement de l'information sociale. En effet, les individus socialement anxieux présentent des réponses exagérées et ont du mal à contrôler leur attention face aux stimuli socialement menaçants. Le toucher est une forme essentielle d'interaction sociale, et il a été observé que la perception tactile est altérée chez les personnes socialement anxieuses, qui semblent ne pas tirer profit de ses bienfaits et manifestent une aversion pour le toucher social. Cependant, les réponses neuronales et les processus attentionnels nécessaires pour filtrer les informations tactiles, lorsqu'elles deviennent non pertinentes, n'ont pas encore été étudiés. Dans cette étude, nous visons à caractériser la perception des stimuli tactiles, qu'ils soient sociaux ou non-sociaux, ainsi que le contrôle attentionnel dans le contexte du TAS. Nous proposons de développer et d'utiliser une nouvelle tâche de prise de décision perceptive, combinée à des mesures physiologiques de l'activité neuronale dans un modèle murin du TAS. Le projet est un multisite, et se déroulera dans deux EU differents. Nos résultats permettront d'approfondir la compréhension de la perception tactile et du contrôle de l’attention face aux stimuli tactiles dans le TAS, tout en révélant les mécanismes neuronaux sous-jacents. En utilisant une tâche adaptable pour des études humaines mesurant les réponses tactiles chez les individus socialement anxieux, nous espérons obtenir des résultats susceptibles d'améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de TAS.

Bénéfices attendus

Le trouble d'anxiété sociale (TAS) est un trouble psychiatrique chronique qui peut constituer un véritable handicap au quotidien. La prévalence estimée du TAS au cours de la vie est d'environ 4 %. Dans le trouble d'anxiété sociale (TAS), les personnes réagissent souvent de manière exagérée aux situations sociales perçues comme négatives et éprouvent des difficultés à contrôler leur attention face aux stimuli sociaux. Ces caractéristiques sont bien connues et pourraient être une des causes de ce trouble. Egalement, les individus socialement anxieux semblent ne pas tirer profit des bienfaits de l’interaction sociale. Comprendre les altérations neuronales à l'origine de ces difficultés sociales pourrait fournir des informations cruciales sur les modifications du fonctionnement cérébral dans le TAS. Ces recherches pourraient révéler de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer les symptômes du TAS, ou encore identifier des biomarqueurs permettant d'évaluer l'efficacité de traitements expérimentaux dans un cadre préclinique. Ces types d'études nécessitent cependant des approches invasives et des manipulations qui ne peuvent être réalisées dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude contribuera à une meilleure compréhension des types de cellules et des circuits impliqués dans l'altération de la perception sociale dans le TAS. Il s'agit de la première étude à caractériser ces altérations neuronales en utilisant une tâche adaptable aux études humaines, et elle a le potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la qualité de vie des personnes diagnostiquées avec un trouble d'anxiété sociale.

Procédures

Pour étudier le trouble de l’anxiété sociale, les animaux soumis à un protocole d'instabilité sociale pendant 49 jours au cours de l'adolescence et de l'âge adulte, similaire à celle des personnes qui se déplacent fréquemment (EU 1). Leur anxiété, réponses sensorielles et interactions sociales seront évaluées par les taches comportementales (EU 1). Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes (EU 1). Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques du control de l’attention, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive et non douloureuse, basé sur les récompenses, pendant 45 minutes par jour (EU 2). En même temps, nous effectuons des mesures physiologiques afin d'enregistrer l'activité des neurones du cerveau (EU 2). Afin de permettre cet enregistrement, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête) (EU 2). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête d’une minute à 45 minutes, pendant 5 jours. Cela permet aux animaux apprendre que cette immobilisation est réversible et pas douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera (EU 2).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables mineurs pouvant être rencontrés dans cette étude seront liés à : 1. Induction du trouble d'anxiété sociale : Le paradigme du stress d'instabilité sociale (SIS49D) qui consiste à introduire des partenaires inconnus du même sexe dans la cage d'accueil (deux fois par semaine) sera mis en œuvre et provoquera du stress. 2. Immobilisation partielle : Une fixation au niveau de la tête pendant la tâche de prise de décision n'est pas douloureuse mais va entrainer du stress aux animaux pendant les premières séances. 3. Restriction hydrique : La mise en place d’une récompense hydrique implique une restriction d'eau (50 % de la consommation ad libitum) qui va entrainer une perte de poids maximale de 10 %.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental car il s’agit d’une population clinique fragile et car les approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. Utiliser des modèles plus simples, comme la mouche du vinaigre, n’est pas adaptée à notre projet, car cet organisme n’a ni les structures du cerveau ni les comportements nécessaires pour étudier le contrôle de l’attention.

Réduction

Une conception expérimentale soignée garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Partie des protocoles comportementaux, physiologiques, et pharmacologiques ont déjà mis en place pour une étude précédente sur la perception tactile. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales, physiologiques, et pharmacologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Les neurones pyramidaux et inhibiteurs seront suivis simultanément et distingués par l'expression de rapporteurs spécifiques. Les injections du traitement seront suivies des injections contrôles dans les mêmes animaux. Ces mesures nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Tous les résultats scientifiques concernant les facteurs influençant le bien-être des animaux, ainsi que leur capacité à ressentir et à exprimer la douleur, la souffrance, l'angoisse et les dommages durables, seront pris en compte. Les expériences seront conçues et réalisées de la manière la plus éthique possible. Le matériel adéquat sera mis à disposition des personnes autorisées, compétentes et dûment qualifiées, qui respecteront rigoureusement les procédures mises en place. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : l'utilisation d'un tunnel ou des mains en forme de coupe. L’hébergement en cages collectives garantira des interactions sociales pendant et après l’induction du TAS. Le paradigme pour l’induction du TAS débutera pendant l’adolescence, car il est souvent associé à une plus grande agressivité lorsqu'il est appliqué à des souris adultes. Deux tubes en carton et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de garantir la poursuite de tous les comportements normaux des animaux et de réduire les incidents d'agression. La nourriture sera également disposée dans la cage pour diminuer les conflits pendant l’induction du TAS, et les animaux seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront transférés entre les deux sites dans leurs cages d'origine, pendant leur phase active, et placés dans l'obscurité à l'intérieur d'un chariot. Ils disposeront d’une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement. Pendant la restriction en eau, les animaux seront pesés chaque jour, et leur alimentation en eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10 %. L'hydrogel, fourni comme source d'eau, est considéré comme un enrichissement, car les animaux peuvent le manipuler avec leurs pattes avant. Avant les tâches comportementales, les animaux seront habitués à la pièce d’expérimentation. Pour la tâche de prise de décision, ils seront progressivement familiarisés avec la fixation de la tête pour garantir un stress minimal. Des stimulations tactiles non douloureuses seront utilisées pendant la tâche perceptuelle. L'anxiolytique sera administré par voie orale, dissous dans la boisson des animaux. Pour euthanasier les animaux, les souris seront d’abord anesthésiées. Des points limites spécifiques et des mesures conservatoires seront définis pour chaque phase de la procédure.

Choix des espèces

La souris a été choisie afin de rester cohérente avec les études antérieures sur le stress chronique induit par les interactions sociales. Les souris soumises au modèle de stress chronique d'instabilité sociale, qui sera utilisé dans cette étude, présentent une augmentation de l'anxiété et des perturbations dans les interactions sociales. Les rongeurs possèdent un système sensoriel très développé et sont considérés comme une espèce modèle pour l'étude du traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, les souris sont capables d'apprendre et d'exécuter des tâches de prise de décision perceptive, indispensables pour mieux comprendre les réponses tactiles. Conformément aux études précédentes, le protocole d’induction du TAS débutera à l’adolescence et se terminera à l’âge adulte. Toutes les autres étapes de l’expérience seront menées chez les souris adultes.

Fournir des anticorps à des équipes de recherche publiques ou privées, à raison d'environ 2 milligrammes par animal : 200 lapins New Zealand White sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre injections d'une information génétique codant l'antigène visé, par voie intradermique, intramusculaire ou sous-cutanée, puis subit trois prélèvements sanguins de 25 à 40 minutes après administration orale d'un tranquillisant. Le porteur signale de la fièvre, un inconfort modéré et l'apparition de petites boules au point d'injection, et compte deux lapins par protocole. Tous sont tués en fin de protocole parce que chaque immunisation est spécifique d'un antigène, ce qui interdit de les réutiliser ailleurs.

Objectifs

L’objectif du projet est de générer par une approche d’immunisation génique des anticorps de lapin contre des antigènes d’intérêt pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L’immunisation correspond à un processus d’éducation et d’activation du système immunitaire contre un antigène spécifique. Parmi les différentes approches d’immunisation existantes, l’immunisation génique sera utilisée. Cette approche émergente vise à faire produire transitoirement un antigène en administrant une information génétique codant in situ pour un antigène spécifique, initiant ainsi une réponse immunitaire. Les anticorps obtenus seront utilisés dans des approches allant de la recherche au diagnostic. Le nombre de lapins prévus par protocole permettra d’obtenir une quantité suffisante d’anticorps (environ 2 milligrammes par lapin) pour une utilisation sur plusieurs années.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voire thérapeutiques. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

4 injections en intradermique, en intramusculaire ou en sous-cutanée de l’information génétique codant pour l’antigène d’intérêt (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les prélèvements de sang n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor. Les prélèvements seront réalisés après administration par voie orale d’un tranquillisant à effet vasodilatateur, permettant de prélever le lapin dans de bonnes conditions pour le lapin et l'expérimentateur. L'injection couplée à un agent de transfection peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-agent de transfection). Les manipulations des lapins étant source de stress, une habituation sera mise en œuvre, afin de mettre en place une relation de confiance entre le lapin et les expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant notamment dans la caractérisation de molécules thérapeutiques, a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en œuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d’une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Deux chirurgies cérébrales, l'une de 45 à 90 minutes et l'autre de 90 à 120, une tête maintenue fixe jusqu'à 45 minutes par jour, une ration d'eau réduite de moitié : 480 souris subissent ce protocole dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. L'anxiété sociale leur est induite par 49 jours d'introduction répétée de congénères inconnus dans leur cage, de l'adolescence à l'âge adulte. Le projet vise à mesurer comment ces souris filtrent des stimuli tactiles, sociaux ou non, dans une tâche de décision récompensée par de l'eau. Le porteur annonce que l'anxiété, les réponses sensorielles et les interactions sociales seront évaluées par des tâches comportementales, sans dire lesquelles, et range la perte de poids de 10 % liée à la restriction hydrique parmi les effets indésirables "mineurs".

Objectifs

La phobie sociale, ou trouble de l'anxiété sociale (TAS), est une forme de trouble anxieux définie récemment, actuellement classée parmi les troubles psychiatriques les plus fréquents. Ce trouble se caractérise par une peur intense et persistante d'une évaluation négative potentielle par les autres lors d'interactions sociales, ce qui conduit souvent à l'évitement social et au repli sur soi. L'une des principales altérations du TAS, souvent considérée comme une cause sous-jacente, est une perturbation du traitement de l'information sociale. En effet, les individus socialement anxieux présentent des réponses exagérées et ont du mal à contrôler leur attention face aux stimuli socialement menaçants. Le toucher est une forme essentielle d'interaction sociale, et il a été observé que la perception tactile est altérée chez les personnes socialement anxieuses, qui semblent ne pas tirer profit de ses bienfaits et manifestent une aversion pour le toucher social. Cependant, les réponses neuronales et les processus attentionnels nécessaires pour filtrer les informations tactiles, lorsqu'elles deviennent non pertinentes, n'ont pas encore été étudiés. Dans cette étude, nous visons à caractériser la perception des stimuli tactiles, qu'ils soient sociaux ou non-sociaux, ainsi que le contrôle attentionnel dans le contexte du TAS. Nous proposons de développer et d'utiliser une nouvelle tâche de prise de décision perceptive, combinée à des mesures physiologiques de l'activité neuronale dans un modèle murin du TAS. Le projet est un multisite, et se déroulera dans deux EU differents. Nos résultats permettront d'approfondir la compréhension de la perception tactile et du contrôle de l’attention face aux stimuli tactiles dans le TAS, tout en révélant les mécanismes neuronaux sous-jacents. En utilisant une tâche adaptable pour des études humaines mesurant les réponses tactiles chez les individus socialement anxieux, nous espérons obtenir des résultats susceptibles d'améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de TAS.

Bénéfices attendus

Le trouble d'anxiété sociale (TAS) est un trouble psychiatrique chronique qui peut constituer un véritable handicap au quotidien. La prévalence estimée du TAS au cours de la vie est d'environ 4 %. Dans le trouble d'anxiété sociale (TAS), les personnes réagissent souvent de manière exagérée aux situations sociales perçues comme négatives et éprouvent des difficultés à contrôler leur attention face aux stimuli sociaux. Ces caractéristiques sont bien connues et pourraient être une des causes de ce trouble. Egalement, les individus socialement anxieux semblent ne pas tirer profit des bienfaits de l’interaction sociale. Comprendre les altérations neuronales à l'origine de ces difficultés sociales pourrait fournir des informations cruciales sur les modifications du fonctionnement cérébral dans le TAS. Ces recherches pourraient révéler de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer les symptômes du TAS, ou encore identifier des biomarqueurs permettant d'évaluer l'efficacité de traitements expérimentaux dans un cadre préclinique. Ces types d'études nécessitent cependant des approches invasives et des manipulations qui ne peuvent être réalisées dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude contribuera à une meilleure compréhension des types de cellules et des circuits impliqués dans l'altération de la perception sociale dans le TAS. Il s'agit de la première étude à caractériser ces altérations neuronales en utilisant une tâche adaptable aux études humaines, et elle a le potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la qualité de vie des personnes diagnostiquées avec un trouble d'anxiété sociale.

Procédures

Pour étudier le trouble de l’anxiété sociale, les animaux soumis à un protocole d'instabilité sociale pendant 49 jours au cours de l'adolescence et de l'âge adulte, similaire à celle des personnes qui se déplacent fréquemment (EU 1). Leur anxiété, réponses sensorielles et interactions sociales seront évaluées par les taches comportementales (EU 1). Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes (EU 1). Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques du control de l’attention, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive et non douloureuse, basé sur les récompenses, pendant 45 minutes par jour (EU 2). En même temps, nous effectuons des mesures physiologiques afin d'enregistrer l'activité des neurones du cerveau (EU 2). Afin de permettre cet enregistrement, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête) (EU 2). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête d’une minute à 45 minutes, pendant 5 jours. Cela permet aux animaux apprendre que cette immobilisation est réversible et pas douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera (EU 2).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables mineurs pouvant être rencontrés dans cette étude seront liés à : 1. Induction du trouble d'anxiété sociale : Le paradigme du stress d'instabilité sociale (SIS49D) qui consiste à introduire des partenaires inconnus du même sexe dans la cage d'accueil (deux fois par semaine) sera mis en oeuvre et provoquera du stress. 2. Immobilisation partielle : Une fixation au niveau de la tête pendant la tâche de prise de décision n'est pas douloureuse mais va entrainer du stress aux animaux pendant les premières séances. 3. Restriction hydrique : La mise en place d’une récompense hydrique implique une restriction d'eau (50 % de la consommation ad libitum) qui va entrainer une perte de poids maximale de 10 %.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental car il s’agit d’une population clinique fragile et car les approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. Utiliser des modèles plus simples, comme la mouche du vinaigre, n’est pas adaptée à notre projet, car cet organisme n’a ni les structures du cerveau ni les comportements nécessaires pour étudier le contrôle de l’attention.

Réduction

Une conception expérimentale soignée garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Partie des protocoles comportementaux, physiologiques, et pharmacologiques ont déjà mis en place pour une étude précédente sur la perception tactile. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales, physiologiques, et pharmacologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Les neurones pyramidaux et inhibiteurs seront suivis simultanément et distingués par l'expression de rapporteurs spécifiques. Les injections du traitement seront suivies des injections contrôles dans les mêmes animaux. Ces mesures nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Tous les résultats scientifiques concernant les facteurs influençant le bien-être des animaux, ainsi que leur capacité à ressentir et à exprimer la douleur, la souffrance, l'angoisse et les dommages durables, seront pris en compte. Les expériences seront conçues et réalisées de la manière la plus éthique possible. Le matériel adéquat sera mis à disposition des personnes autorisées, compétentes et dûment qualifiées, qui respecteront rigoureusement les procédures mises en place. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : l'utilisation d'un tunnel ou des mains en forme de coupe. L’hébergement en cages collectives garantira des interactions sociales pendant et après l’induction du TAS. Le paradigme pour l’induction du TAS débutera pendant l’adolescence, car il est souvent associé à une plus grande agressivité lorsqu'il est appliqué à des souris adultes. Deux tubes en carton et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de garantir la poursuite de tous les comportements normaux des animaux et de réduire les incidents d'agression. La nourriture sera également disposée dans la cage pour diminuer les conflits pendant l’induction du TAS, et les animaux seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront transférés entre les deux sites dans leurs cages d'origine, pendant leur phase active, et placés dans l'obscurité à l'intérieur d'un chariot. Ils disposeront d’une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement. Pendant la restriction en eau, les animaux seront pesés chaque jour, et leur alimentation en eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10 %. L'hydrogel, fourni comme source d'eau, est considéré comme un enrichissement, car les animaux peuvent le manipuler avec leurs pattes avant. Avant les tâches comportementales, les animaux seront habitués à la pièce d’expérimentation. Pour la tâche de prise de décision, ils seront progressivement familiarisés avec la fixation de la tête pour garantir un stress minimal. Des stimulations tactiles non douloureuses seront utilisées pendant la tâche perceptuelle. L'anxiolytique sera administré par voie orale, dissous dans la boisson des animaux. Pour euthanasier les animaux, les souris seront d’abord anesthésiées. Des points limites spécifiques et des mesures conservatoires seront définis pour chaque phase de la procédure.

Choix des espèces

La souris a été choisie afin de rester cohérente avec les études antérieures sur le stress chronique induit par les interactions sociales. Les souris soumises au modèle de stress chronique d'instabilité sociale, qui sera utilisé dans cette étude, présentent une augmentation de l'anxiété et des perturbations dans les interactions sociales. Les rongeurs possèdent un système sensoriel très développé et sont considérés comme une espèce modèle pour l'étude du traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, les souris sont capables d'apprendre et d'exécuter des tâches de prise de décision perceptive, indispensables pour mieux comprendre les réponses tactiles. Conformément aux études précédentes, le protocole d’induction du TAS débutera à l’adolescence et se terminera à l’âge adulte. Toutes les autres étapes de l’expérience seront menées chez les souris adultes. Conformément aux études précédentes (Saavedra-Rodríguez et Feig, 2013), le protocole SIS49D commencera pendant l’adolescence (P27) et finira quand les souris sont adultes (P76). Tous les autres étapes de l’expérience seront réalisées chez les souris adultes. Les premières tâches comportementales seront réalisées à P78 et P105. Les chirurgies seront réalisées à P115 et l’entrainement dans la tâche de décision sera réalisé depuis P132. Conformément aux études précédentes (Saavedra-Rodríguez et Feig, 2013), le protocole SIS49D commencera pendant l’adolescence (P27) et finira quand les souris sont adultes (P76). Tous les autres étapes de l’expérience seront réalisées chez les souris adultes. Les premières tâches comportementales seront réalisées à P78 et P105. Les chirurgies seront réalisées à P115 et l’entrainement dans la tâche de décision sera réalisé depuis P132.

Placés un par compartiment dans une cage grillagée, 400 rats respirent pendant six heures un composé organique volatil à concentration contrôlée. Vingt-cinq composés industriels sont testés, seize rats chacun, huit mâles et huit femelles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que somnolence, troubles de l'équilibre et pertes de coordination sont probables, et que l'exiguïté du compartiment peut provoquer du stress. La moitié des animaux est tuée à la sortie de la chambre d'exposition, l'autre 48 heures plus tard, pour doser la substance dans leur sang et leur cerveau.

Objectifs

Dans l’industrie, de nombreux Composés Organiques Volatils (COV) sont utilisés. Lorsqu’ils se dispersent dans l’air des ateliers, ils peuvent être inhalés par les travailleurs, passer dans le sang pour enfin s’accumuler dans certains organes, notamment le cerveau. Ce projet a deux objectifs principaux : 1) Mesurer la quantité de 25 COV différents dans le sang et le cerveau des rats après 6 heures d’inhalation. 2) Vérifier si ces substances sont complètement éliminées du sang et du cerveau 48 heures après la fin de l’exposition. Ces informations nous aideront à mieux comprendre comment ces substances se comportent dans le corps.

Bénéfices attendus

Les Composés Organiques Volatils (COV) sont des substances couramment utilisées dans l'industrie. Lorsqu’on les inhale, elles passent rapidement dans le sang et atteignent le cerveau. Ces produits peuvent provoquer des effets temporaires sur l’activité du cerveau comme la somnolence, une sensation d'ébriété ou des troubles de la concentration, ce qui peut augmenter les risques d'accidents au travail. Cependant, nous ne savons pas exactement à partir de quelle concentration ces effets apparaissent, car les études existantes se basent souvent sur des doses très élevées et mesurent les effets après l’exposition, pas pendant. Déterminer les seuils d’effet des COV sur l’activité du cerveau est donc notre objectif principal. Ainsi, en comparant les quantités de COV qui influencent l’activité cérébrale avec les limites d’exposition autorisées dans les environnements de travail, cette étude contribuera à mieux protéger les travailleurs en alertant le cas échant sur des dangers insoupçonnés. Cependant, cette étude nécessite une expérience préliminaire qui est le sujet du présent projet. Nous devons en effet vérifier en premier lieu que ces COV pénètrent bien dans le cerveau des rats mâle et femelle, et qu’ils sont complètement éliminés de l’organisme des en 48 heures.

Procédures

Pour chaque COV, 16 rats (8 mâles et 8 femelles) seront exposés pendant 6 heures à une concentration stable et contrôlée de la substance, dans des chambres spécialement conçues à cet effet. Les mâles et les femelles seront placés dans des chambres séparées. Après l’exposition, la moitié des rats (4 mâles et 4 femelles) sera mise à mort pour analyser la quantité de substance présente dans leur sang et leur cerveau. Les 8 autres rats seront observés pendant 48 heures avant d’être également mis à mort, afin de mesurer la quantité de substance encore présente dans ces mêmes tissus à ce moment-là.

Impact sur les animaux

Les substances étudiées ici peuvent affecter l’activité du cerveau. Il est donc probable qu’on observe des effets comme de la somnolence, des troubles de l'équilibre ou des problèmes de coordination. Ces effets, bien que réversibles, seront attentivement surveillés. Lors des expositions, les animaux seront placés dans des cages collectives en plastique grillagé divisée en 8 compartiments, à raison d‘un animal par compartiment. Il est possible que l’espace restreint du compartiment dans lequel les animaux seront placés puisse provoquer du stress chez eux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures, afin de prélever les tissus nécessaires pour les analyses.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car, pour savoir comment les COV s'accumulent et sont éliminés, il faut un organisme avec un métabolisme fonctionnel. Les tests en laboratoire sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas de répondre à ces questions.

Réduction

Le protocole a été conçu pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en incluant à la fois des mâles et des femelles. Pour chaque COV, 8 animaux (4 mâles et 4 femelles) seront utilisés pour mesurer les quantités présentes immédiatement après l’exposition, et 8 autres (4 mâles et 4 femelles) seront utilisés pour mesurer les quantités 48 heures après l’exposition.

Raffinement

Les animaux seront manipulés avec soin par du personnel qualifié. Ils seront surveillés chaque jour pour évaluer leur état de santé et leur comportement. Ils seront hébergés par deux dans un environnement enrichi avec des accessoires comme des tunnels en carton, des blocs à ronger ou des matériaux de nidification. Ils auront un accès illimité à la nourriture et à l’eau, sauf pendant les périodes d’exposition. Avant les tests, pour réduire le stress lié au fait de rester 8 heures dans des cages pendant les expositions, les rats seront progressivement habitués à ces conditions. Les cages seront équipées de grilles permettant aux animaux de voir et de sentir leurs congénères, ce qui les aidera à se sentir moins isolés. Pendant les heures d’exposition ainsi qu’après l’exposition, les rats seront attentivement surveillés, et tous les signes observés seront notés dans des tableaux prévus pour évaluer leur état général. En cas de problème, un barème permettra de décider des actions à prendre, comme l’arrêt de l’exposition ou, en cas de souffrance, la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des rats car leur métabolisme des COV est proche de celui des humains. En travaillant avec des mâles et des femelles, nous pourrons également étudier d’éventuelles différences dans la façon dont les substances sont transformées dans le corps en fonction du sexe.

7 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six injections dans l'abdomen, dix sous la peau, une injection quotidienne au pousse-seringue pendant vingt-huit jours, des chirurgies intracrâniennes, la pose de canules et de pompes osmotiques, un isolement d'une semaine, jusqu'à dix-huit semaines de régime obésogène, trois jeûnes et la coupure de la pointe de la queue pour les prises de sang. Le porteur signale que le régime gras provoque des problèmes de dents, que les chirurgies exposent à l'hypothermie et à des troubles cardiorespiratoires, et que l'enrichissement est retiré pendant l'isolement pour ne pas gêner les lasers qui mesurent l'activité locomotrice. Il écrit que chaque souris sera mise à mort à la fin de chaque procédure "dans le respect des 3R", les tissus de la moitié d'entre elles allant aux analyses moléculaires, ceux de l'autre moitié aux analyses histologiques.

Objectifs

Les hormones permettent à nos organes de communiquer entre eux et jouent ainsi un rôle essentiel au bon fonctionnement et au maintien de nos fonctions physiologiques, notamment celles régulées par le cerveau. Tout comme l’homme, la souris possède des récepteurs aux hormones dans des régions cérébrales essentielles dans la régulation du métabolisme énergétique. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour la mise en place de stratégie thérapeutique contre les troubles du métabolisme comme l’obésité. Notre objectif est de comprendre: 1- le nouveau rôle de récepteurs aux hormones dans la régulation du métabolisme énergétique dans un contexte physiologique et pathologique, 2- tester des nouvelles stratégies thérapeutiques dans la prise en charge de des troubles métaboliques comme l’obésité. Ces deux axes de recherche seront étudiés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les maladies métaboliques tel que l’obésité. De plus, il permettrait de comprend le nouveau rôle, au niveau du cerveau, de récepteurs dans l'intégration des signaux de satiété ou d'appétit venant de la périphérie.

Procédures

Injections intrapéritonéales (6 max par souris; durée

Impact sur les animaux

Les nuisances en lien avec les chirurgies sont 1) pendant les chirurgies, une hypothermie et des problèmes cardiorespiratoires, ainsi que du stress et un déssèchement des yeux 2) en post-chirurgie, des douleurs post-opératoires minorées par des antalgiques ainsi que du stress. Le régime riche en graisse va entrainer une prise du poids au fur et à mesure des semaines, les souris vont devenir un peu moins actives et développer des problèmes de dents à cause de croquettes plus souples que les croquettes standards. Lors des tests métaboliques, les animaux n’auront plus accès à la nourriture pendant plusieurs heures, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. Le gavage peut entrainer du stress dû à la contention et à la sonde de gavage. La coupure de la pointe de la queue lors de ces mêmes tests entraine une douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure pour prélèvements sanguins. Concernant l’isolement pour la mesure de paramètres métaboliques: l'isolement pendant une semaine chez la souris peut créer du stress. La mesure de composition corporelle nécessite une anesthésie qui peut également engendrer un stress chez la souris, la dose de rayons X nécessaire est faible et non-chronique et n’entraine donc pas de nuisance.

Devenir

Chaque souris sera mise à mort à la fin de chaque procédure, dans le respect des 3R. Une moitié sera dédié à l’étude moléculaire de différents tissus (hypothalamus, tronc cérébral, foie, pancréas, tissu adipeux). La seconde moitié sera dédié à l’étude histologique des mêmes tissus.

Remplacement

Pour réaliser les tests de métabolisme systémique et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables. De plus, pour réaliser les tests de comportements, il n'existe pas d'alternatives à l'utilisation d'animaux décrit actuellement dans la littérature. Des premiers tests ont été effectués in vitro, pour sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses comme antagoniste des récepteurs parathyroïdiens, ainsi que les concentrations de toutes les molécules qui seront utilisés pour transposer in vivo. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés (t test si 2 conditions / ANOVA si plus de 2 conditions).

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après notre propre expérience des différents modèles présentés. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux, des premiers tests ont été effectués in vitro.

Raffinement

Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi, en dehors des phases d’isolement. L’enrichissement se limite à la litière lors des phases d’isolement, pour éviter l’interaction avec les lasers qui détectent l’activité locomotrice des souris. Pour limiter les nuisances/effets indésirables des injection intrapéritonéales, nous utiliserons une aiguille fine. Pour le gavage, nous utiliserons une sonde souple pour limiter les nuisances. De plus, une anesthésie profonde sera réalisée à chaque acte chirurgicale pour limiter la douleur et un analgésique sera également utilisé en pré- et post-opératoire.

Choix des espèces

La souris est un des modèles les plus appropriés pour l'étude de l'obésité. Les souris sont faciles à manipuler. Dans cette étude, certaines souris entreront en suivi (régime spécifique ou standard) à l’âge de 11 semaines. En effet, à 11 semaines les souris, en plus d'avoir passé la maturité sexuelle seront plus robuste et auront atteint un poids qui va leur permettre de subir la prise de poids inévitable due au régime sans que cela n’impacte trop leur organisme.

1 980 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à vingt-deux injections dans l'abdomen, douze prélèvements de sang à la queue et douze semaines de régime enrichi en graisses. S'y ajoutent une biopsie de la queue, deux jeûnes de six et seize heures, un gavage, une injection dans le sinus rétro-orbitaire et une perfusion intracardiaque sous opioïde, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont mises à mort à l'issue pour prélever les organes. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, mettre en lumière le rôle du système nerveux dans la fonction du pancréas.

Objectifs

Le pancréas est central dans la régulation de la glycémie. Il produit les hormones permettant de réguler la glycémie. Comme tous les tissus, le pancréas est relié au cerveau par le système nerveux périphérique. Cependant, son rôle dans la fonction du pancréas n’est pas bien connu. Dans ce projet nous proposons d’étudier la contribution du réseau nerveux dupancréas, et notamment dans la sécrétion des hormones régulant la glycémie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en lumière le rôle du système nerveux dans la fonction du pancréas.

Procédures

1 biopsie de queue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 à 22 injections intra-peritonéales (20s), 1 injection sous-cutanée (10s), 2 jeun (6h et 16h), 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 injection intra-veineuse (5s), 1 chirurgie sans réveil (10min), 1 gavage (1min).

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale : douleur légère due à la piqure. -Injection intra veineuse rétro-orbitale : gêne, douleur légère au point d'injection. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment de l'injection. -Injection sous- cutanée : douleur légère due à la piqure. -Obésité : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Biopsie de queue : douleur modérée.-Gavage : contention soutenue et introduction de la sonde.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour permettre le prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier le rôle du système nerveux du pancréas en condition normale et de stress glycémique, tels que l'obésité et la mise à jeun. Le pancréas répond à la prise et la perte de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Une étude pilote avec des petits nombres d’animaux a été inclue pour mettre en place des protocoles adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères. Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours (souriceaux) et 22 semaines (adultes).

Dix marmousets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant enchaîner jusqu'à cent séances d'électrophysiologie de trois à six heures, après trois à cinq mois d'entraînement sous contention cinq jours par semaine. Deux chirurgies crâniennes sous anesthésie générale précèdent ces séances, l'une de quatre heures pour fixer un plot sur le crâne, l'autre allant jusqu'à sept heures pour implanter les chambres d'enregistrement. Le porteur énumère les suites possibles, douleurs, inflammations, infections, difficultés respiratoires, abcès, œdème cérébral, et mentionne des restrictions alimentaires partielles pendant l'entraînement. Six animaux au plus seront tués en fin de protocole, les autres pouvant être réutilisés dans d'autres projets ou replacés après désimplantation.

Objectifs

Dans la nature, de nombreuses espèces animales doivent anticiper les mouvements de leurs proies pour pouvoir les capturer, ou ceux de leurs prédateurs pour pouvoir les éviter. Pour cela, leur cerveau doit compenser les délais inhérents aux traitements des informations visuelles et motrices. Cependant, on en sait encore peu sur la façon dont différentes régions du cerveau, comme celles liées à la vision et au mouvement, collaborent pour effectuer cette tâche. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment ces zones du cerveau communiquent et s'organisent pour permettre à un marmouset d'attraper un objet en mouvement. Notre hypothèse de travail est que les processus d’anticipation permettant de compenser les retards neuronaux des systèmes visuel et moteur reposent sur des propagations d’activité neuronale. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons une tâche où la position et l'orientation de la cible varient au cours du temps. Nous combinerons différentes techniques de mesure d’activité dans les régions cérébrales d’intérêt, à l’échelle d’une aire cérébrale (imagerie optique) et à l’échelle du neurone (électrophysiologie). Nous utiliserons ces données pour créer un modèle informatique de l’anticipation visuomotrice capable de prédire comment le système nerveux réagit lorsque des perturbations surviennent pendant la tâche. Ce projet fournira des informations nouvelles sur la manière dont le cerveau exécute une fonction essentielle, à savoir attraper de simples objets en mouvement, malgré les incertitudes et les délais dans le traitement de l'information.

Bénéfices attendus

Ce projet améliorera notre compréhension des mécanismes par lesquels le cerveau traite et anticipe la trajectoire et l’orientation d’un objet en mouvement. Sur le plan visuel, il démontrera comment les propagations d’informations au sein de deux types de cartes corticales, l'une représentant la position de l’objet et l'autre son orientation, interviennent dans la prédiction des propriétés futures de l’objet (dans quelle position et quelle orientation il sera). Particulièrement, ces travaux vont nous apprendre comment ces deux informations se combinent pour former une image précise et anticipée des déplacements de l'objet. Sur le plan moteur, ce projet dévoilera comment les populations neuronales à moyenne et petite échelle coordonnent les mouvements proximaux du bras (pour la position de l’objet) et distaux de la main (pour son orientation). Pour finir, nous éclaircirons les phénomènes de transfert d’information de ces signaux d’anticipations, entre système visuel et moteur et leur rôle dans l’anticipation nécessaire à la tâche de capture. Dans un registre appliqué, ce travail contribuera à l’avancée de domaines tels que les interfaces cerveau-machine, en aidant par exemple à identifier quand et dans quelles zones du cerveau injecter des informations visuelles, ou comment utiliser les activités prémotrice et motrice pour optimiser le contrôle du mouvement.

Procédures

Les animaux participant à cette étude devront être progressivement habitués et entraînés pour passer les expériences, ce qui nécessitera de les manipuler plusieurs fois par semaine. Tous les animaux auront une Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) sous anesthésie générale (durée maximale : 2h30), une chirurgie crânienne sous anesthésie générale (durée maximale : 4h) pour la fixation d’un plot de tête, puis une série d’entraînements sous contention (5 fois/semaine pendant 3-5 mois, avec des sessions d’une heure maximum). Les animaux ayant réussi l'entraînement auront par la suite une 2ème chirurgie crânienne sous anesthésie générale pour implanter les chambres d’enregistrement ou les matrices multi-électrodes (durée maximale : 7h). Ensuite, des enregistrements cérébraux seront effectués, soit avec les animaux éveillés, soit sous anesthésie. Le nombre exact de sessions ne peut être déterminé à l’avance car il dépendra de l'état de santé des animaux, de la qualité des enregistrements, et de la quantité de données accumulée au fil des sessions. Cependant, nous estimons, pour les enregistrements éveillés, que le nombre maximum de sessions ne devrait pas excéder 20 et 50 pour les deux techniques d’imagerie optique utilisées, et 100 pour l’électrophysiologie. Ces sessions seront réparties à raison de 1 à 5 /semaine (durée entre 3 et 6h). Pour les enregistrements sous anesthésie, nous estimons un maximum de 10 sessions pour chacune des techniques, à raison d’une session/semaine (durée maximale : 6h). Certains animaux pourront également être soumis à une procédure terminale en fonction de leur état de bien-être et de la sévérité de la procédure, après concertation avec la SBEA et le vétérinaire référent. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et leur état de santé sera évalué tous les 6 mois. Les données nécessaires devraient être collectées sur une période de 36 mois.

Impact sur les animaux

Ces expérimentations impliquent des chirurgies, des anesthésies répétées dans le temps (IRM anatomique, chirurgie d’implantation des chambres d’enregistrement et du plot de tête), et une manipulation hebdomadaire voire quotidienne des animaux (entraînements vigiles, contention pour induction d'anesthésie, contention pendant les entraînements vigiles, enregistrements éveillés...) avec un isolement temporaire (≤24h) du groupe social lors des entraînements et enregistrements qui pourront induire du stress pendant les mois d'expérimentation. Du stress et des complications faisant suite aux chirurgies et anesthésies peuvent également survenir dans les jours qui suivent l'intervention (mise à jeun la veille de chaque anesthésie, isolement quelques heures en retour de chirurgie, douleurs, inflammation, infections, difficultés respiratoires, perte d'appétit, tremblements, abcès, oedème cérébral...). L’entraînement peut inclure des restrictions partielles de nourriture (fruits, porridge) qui sera fournie dans l’après-midi au lieu du matin/midi.

Devenir

Les animaux inclus dans la procédure terminale (≤6) seront mis à mort. En cas d’échec de l’entraînement, certains animaux pourront être sortis précocement du protocole en n’ayant subi que des procédures légères. Ils pourront alors être réutilisés dans d’autre protocoles. Pour les animaux implantés (plot de tête et chambres d’enregistrement) mais non inclus dans la procédure terminale, une décision sera prise en concertation avec la SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) sur leur devenir (ex : replacés après désimplantation) après avoir évalué l’état général et l’aspect cumulatif des procédures.

Remplacement

Ce projet porte sur l’étude de comportements visuomoteurs très précis dans l’espace et le temps et nécessite d’être réalisé sur des modèles animaux présentant une grande acuité visuelle et de bonnes capacités de contrôle du membre supérieur. Par ailleurs, il requiert l'enregistrement de l'activité cérébrale à des échelles mésoscopique et microscopique avec une grande résolution temporelle et spatiale, simultanément dans les aires visuelles et motrices, ce qu’il est impossible d’obtenir avec des méthodes non invasives. Le marmouset constitue un modèle idéal pour ce projet car il combine de très bonnes capacités de contrôle visuo-moteur avec un cerveau dont la petite taille facilite l’exploration simultanée de plusieurs structures corticales. L'utilisation du marmouset ne peut donc être remplacée.

Réduction

Globalement, nous estimons avoir besoin de 10 animaux pour ce projet. Afin de minimiser le nombre d'animaux, nous prévoyons d’utiliser plusieurs techniques d’enregistrement (imagerie et électrophysiologie) avec chaque animal. Il est vraisemblable que certains animaux (1-2) seront sortis du projet à des phases précoces et ne subiront que des procédures légères, car tous les animaux ne présentent pas la motivation nécessaire pour réaliser des tâches comportementales complexes (ici, fixation d’un point suivie de la capture d’un objet en mouvement, en situation de contention). Pour les animaux implantés (plot de tête et chambres d’enregistrement) mais non inclus dans la procédure terminale, une décision sera prise en concertation avec la SBEA sur leur devenir (ex : réutilisés après désimplantation) après avoir évalué l’état général et l’aspect cumulatif des procédures. Analyses et tests statistiques. Le faible nombre d'animaux estimé pour cette étude se justifie par le fait que l'unité d'observation « n » est l'activité d'un neurone ou d'une population de neurones, et non pas l'animal lui-même. C'est donc le nombre d'observations par animal, plutôt que le nombre d’animaux, qui est déterminant. Notre analyse sera basée sur l’élaboration de modèles prédictifs probabilistes (Bayesian) permettant de reconstruire l’activité neuronale dans différentes conditions expérimentales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par paires dans des volières adaptées et enrichies de plusieurs éléments (hamac, tunnels, nids suspendus, perchoirs...). Ils auront une phase d’habituation aux expérimentateurs, ce qui permettra de diminuer le stress lié à leur manipulation. Chaque étape de l’entraînement se fera par renforcement positif avec des cristaux de gomme arabique, des vers de farine ou de la gomme arabique diluée dans de l’eau (aliments présents dans le régime alimentaire des marmousets). Les phases d'apprentissage seront incrémentielles pour réduire au maximum le stress. Les procédures chirurgicales invasives seront effectuées sous anesthésie générale et une médication appropriée sera fournie dans le but d'éviter toute souffrance liée aux chirurgies. De plus, l’enregistrement simultané de grandes populations de neurones à l'aide d'électrodes à haute densité ou d’imagerie optique nous permettra d’acquérir rapidement une large quantité de données expérimentales, et donc de raffiner la méthodologie par rapport aux standards antérieurs en réduisant la durée des expériences. La chambre d'enregistrement a elle-même été raffinée et continue d’être améliorée au fur et à mesure de l'expérience acquise. Elle est composée d'un piston réglable en hauteur équipé d'une vitre courbe qui épouse la forme du cerveau sans le comprimer. Nous espérons ainsi limiter la repousse des tissus généralement observée, et par conséquent réduire le nombre d'interventions pour retirer ces tissus, ce qui minimisera les risques d'infection et le nombre d'interventions nécessaires à leur réalisation. L'état de santé des animaux sera suivi de près et quotidiennement par du personnel formé et qualifié, et une évaluation du vétérinaire référent et de la SBEA sera réalisée tous les 6 mois. L'expérience acquise au cours de ce projet nous permettra de raffiner nos techniques de chirurgie et d’assurer une meilleure récupération post-opératoire ainsi qu'une amélioration du bien-être tout au long de la période d’expérimentation.

Choix des espèces

Ce projet porte sur une tâche d’interception de cible et explore le fonctionnement du système visuel et moteur. Le système visuel diffère significativement d’un groupe d’espèces à l’autre (ex : rongeurs vs primates) et nécessite donc d'être étudié chez une espèce au plus proche de l’Homme. Le marmouset constitue un modèle tout à fait adéquat car c’est un primate non humain qui possède un système visuel très proche du nôtre, avec une hiérarchie des aires corticales supérieures identique. Concernant le volet moteur, la tâche étudiée se rapproche du répertoire comportemental naturel de cette espèce, qui capture et se nourrit de petites proies et d’insectes. Enfin, le marmouset est lissencéphale, ce qui rend l’ensemble des aires corticales visuelles et motrices facilement accessibles aux techniques d’imagerie et d’électrophysiologie. Age : à partir de 18 mois (animaux matures), car nous avons besoin que les animaux aient terminé leur croissance pour réaliser la tâche comportementale et pour supporter l'implantation de la chambre sur l'os du crâne. Poids : 0.3 à 0.5 kg