Système gastrointestinal
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Impact d’une perfusion hypothermique oxygénée continue entre prélèvement hépatique et reperfusion – Utilisation d’une machine de perfusion transportable Étude PILOTE préclinique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Tester en conditions réelles une machine de perfusion transportable pour greffons de foie : 6 jeunes porcs de 25 à 30 kg vont être utilisés dans cette étude pilote, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Après une prémédication d'une minute, seul acte pratiqué sur animal conscient, le foie est prélevé, avec deux prises de sang de 10 ml et deux biopsies hépatiques encadrant trente minutes d'ischémie chaude. La suite du protocole se déroule sur l'organe isolé, ce qui évite la transplantation chez des porcs receveurs et divise par deux, selon le porteur, le nombre de porcs utilisés. Une fois les porcs morts, les yeux et l'utérus feront en plus l'objet de prélèvements pour des études complémentaires.
Objectifs
Le but de ce projet est d’évaluer la faisabilité d’une perfusion hypothermique oxygénée continue via une machine de perfusion spécifiquement conçue en ce sens pour le greffon hépatique. La transplantation hépatique est le seul traitement curatif des maladies chroniques sévères du foie. Du fait du succès croissant de cette chirurgie, ses indications s’élargissent et nous faisons face à une pénurie mondiale de greffon. Afin de palier à cette pénurie, les chirurgiens se tournent de plus en plus vers des greffons dits « marginaux » dont le principal exemple est le greffon issu de donneur à cœur arrêté. Ils sont plus sensibles aux lésions d'ischémie-reperfusion qui sont causées par l’interruption de l’irrigation sanguine de l’organe entre le prélèvement et la transplantation. Ces greffons sont associés à un risque augmenté de perte du greffon et de décès du receveur après transplantation.
Bénéfices attendus
Cette étude permettrait d’évaluer la faisabilité en vie réelle, d’une perfusion hypothermique oxygénée continue lors du transport du greffon. Ce projet pourrait déboucher sur une diminution drastique (voir une suppression totale) de la durée d’ischémie froide subie par le greffon hépatique que l’on sait délétère et permettre, in fine, d’améliorer la qualité des greffons transplantés. Ce projet se situe dans la continuité d’un travail de recherche mené depuis plusieurs années, portant sur l’étude des différentes modalités de préservation dynamique sur machine de perfusion. Notre équipe de recherche bénéficie d’une expérience certaine dans l’utilisation de ce modèle suite à la réalisation de 3 thèses de doctorat et de 7 Master 2 portant sur l’étude des lésions induites lors de la préservation des greffons hépatiques. Ces travaux antérieurs ont abouti sur plusieurs publications qui ont permis d’améliorer la prise en charge des patients transplantés en pratique clinique.
Procédures
Le premier et seul acte invasif réalisé sur animal vigile concerne la réalisation d’une prémédication (durée 1minute) permettant ensuite le transport et la réalisation de l’anesthésie générale dans de bonnes conditions. Une période d’acclimatation préalable de 4 à 7 jours sera respectée avant le début des expériences, permettant aussi de faciliter cette prémédication qui sera réalisée dans des conditions moins stressantes pour l’animal. Par la suite, il s'agit d'une procédure chirurgicale sans réveil au cours de laquelle l'animal sera anesthésié et analgésié en continu sans réveil. La chirurgie consiste en la réalisation d’un prélèvement hépatique. Lors de la procédure chirurgicale, des prélèvements sanguins sont prévues à T0 pour obtenir un profil biologique basal de l’animal ainsi qu’après les 30min d’ischémie chaude afin d’obtenir un profil de greffon avant le début des stratégies de conservation. Les paramètres analysés sont : - la biochimie - les gaz du sang Ces prélèvements représentent un volume total de 10 ml x 2 de sang total au maximum, soit
Impact sur les animaux
Il s’agit dans le contexte de ce projet, d’une procédure sans réveil, réalisée sous anesthésie générale, avec un monitoring de l’analgésie per opératoire. Par ailleurs, le déroulé des sessions respecte la période d’acclimatation de ces animaux et les séances se déroulent dans le respect du bien-être animal. La procédure étant sans réveil, il n’y a par ailleurs pas de nuisances ou effets secondaires attendus au décours.
Devenir
Il s’agit d’une procédure chirurgicale sans réveil qui est principalement motivée par des raisons scientifiques qui justifient l’utilisation du modèle décrit. En effet, dans le respect du bien être animal, par soucis de standardisation, mais aussi pour permettre une analyse pertinente et exhaustive du greffon hépatique, seule la première partie nécessitant le prélèvement d’un greffon hépatique est réalisé chez l’animal. Dans la mesure où il s’agit d’un prélèvement d’organe la mise à mort de l’animal est indispensable en fin de procédure
Remplacement
A la place d’une transplantation hépatique chez des porcs receveurs, nous avons fait le choix de remplacer cette étape par une reperfusion normothermique oxygénée du foie par machine de perfusion ex-vivo. Cette technique ne nécessite pas d’animaux supplémentaires et se fait sur un organe isolé. De ce fait, nous réduisons par 2 le nombre d’animaux utilisés. La procédure expérimentale est par ailleurs actuellement maitrisée et reproductible ne justifiant pas le recours à une période de training, diminuant nettement le nombre d’animaux. Cette standardisation a permis aussi d’obtenir un taux de succès de la procédure de 100% permettant de définir un nombre plus juste d’animaux nécessaire.
Réduction
Comme énoncé précédemment, à la place d’une transplantation hépatique chez des porcs receveurs, nous avons fait le choix de remplacer cette étape par une reperfusion normothermique oxygénée du foie par machine de perfusion ex-vivo. Cette technique permet de réduire par 2 le nombre d’animaux utilisés. Après vérification de la mort de l’animal, nous réaliserons des prélèvements d’organes. Si l’objectif premier reste l’étude de la conservation du foie, les yeux, l’utérus voire d’autres organes, feront l’objet d’une étude complémentaire et donc d’un prélèvement post mortem. Cette démarche s’inscrit dans un souci de réduction afin d’optimiser les données recueillies sur un même animal.
Raffinement
Afin de réduire la souffrance animale, seul le premier temps de l’expérimentation, c’est-à-dire le prélèvement hépatique, sera réalisé sur les animaux sous anesthésie générale, sans réveil. Les animaux sont accueillis un minimum de 4 jours avant l’intervention pour permettre une acclimatation et une réduction du stress. Il n’y a pas de mise à jeun préopératoire afin de limiter le stress induit par l’intervention. Les animaux seront anesthésiés et monitorés pendant la totalité du prélèvement hépatique afin de s’assurer de la qualité de l’anesthésie et de leur bien-être. Ce prélèvement est maintenant bien standardisé et bien maitrisé par l’équipe.
Choix des espèces
Le foie de porc (chez de Jeunes porcs sevrés d’un poids de 25 à 30 kg à réception) présente une taille, un poids et une microstructure similaire au foie humain. Ces caractéristiques anatomiques et histologiques permettent d’effectuer un prélèvement d’organe standardisé et reproductible, ainsi que d’utiliser des machines de perfusion d’organes identiques à celles utilisées en pratique clinique. Un argument supplémentaire est l’utilisation et la validation de ce modèle animal dans la littérature scientifique sur la préservation des greffons hépatiques. Ceci permettra de comparer et de discuter les résultats obtenus au cours de ce projet avec les données déjà publiées. Enfin, en comparaison avec un modèle murin, les prélèvements de tissus et les analyses sanguines seront représentatif par rapport à l’homme. La dimension et la quantité de de tissus disponibles pour les analyses sont en adéquation avec l’objectif du projet et en conséquence, le nombre d’animaux à inclure sera réduit. De plus, la reperfusion normothermique sur machine de perfusion avec du sang non-dilué est difficilement réalisable sur un modèle murin compte-tenu du petit volume sanguin.
Rôle de la néoglucogenèse intestinale sur les conséquences métaboliques induites par l’absence de microbiote maternel EU2/2.
- Recherche fondamentale
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- Oncologie
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Une injection d'insuline chez des souris mises à jeun six heures peut les conduire jusqu'à la prostration, aux convulsions et au coma si l'hypoglycémie devient sévère, effet que le résumé énonce lui-même. 432 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 48 femelles reproductrices et 384 descendants, certains isolés soixante-douze heures en cage de mesure de la dépense énergétique. Le décompte déclaré les donne toutes tuées et aucune réutilisée, quand la rubrique sur leur destin précise que "Les mâles utilisés pour la reproduction seront réutilisés dans l'EU1". Ces mâles, décrits plus loin comme des "souris de réforme d'élevage", n'apparaissent dans aucun des deux chiffres.
Objectifs
La forte prévalence de l'obésité et du diabète, en particulier chez les enfants, souligne la nécessité de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de ces pathologies. Des études antérieures ont montré qu’une modification de l’environnement maternel contribue aux maladies métaboliques tout au long de la vie. Le microbiote intestinal constitue une communauté complexe et dynamique de bactéries vivant dans le système digestif. Des changements dans la composition ou la fonction du microbiote intestinal ont été associés au développement de maladies métaboliques. Des données récentes suggèrent que le microbiote intestinal maternel influence le métabolisme, le comportement, le développement du cerveau chez la progéniture. Cependant, il reste à déterminer comment le microbiote maternel exerce ces effets sur la descendance. Chez l’individu adulte, il est connu que le microbiote intestinal exerce des effets anti-obésité et anti-diabète en activant la production de glucose par l’intestin appelée la néoglucogenèse intestinale. Nos résultats récents montrent que l’activation de la néoglucogenèse intestinale pendant la période de gestation ou de lactation améliore durablement la santé de l’individu une fois adulte. Une absence de microbiote maternel pourrait donc bloquer la stimulation de la néoglucogenèse intestinale lors du développement et altérer la santé de l’individu à l’âge adulte. Dans cette étude, réalisée dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2), nous déterminerons si la stimulation génétique de la néoglucogenèse intestinale dès la gestation contrecarre les effets métaboliques induits par l’absence du microbiote maternel.
Bénéfices attendus
Cette étude fait partie d’un projet qui étudie le rôle du microbiote maternel sur le métabolisme de la descendance. L’objectif du projet est de moduler le microbiote uniquement pendant la période de gestation et de lactation. Chez l’homme, l’alimentation maternelle est associée à une stimulation de la néoglucogenèse intestinale en comparaison avec une alimentation utilisant du lait infantile. Si nos résultats démontrent que la stimulation de la néoglucogenèse intestinale dès la gestation programme de manière positive la santé de l’individu adulte, nous pourrons proposer des perspectives efficaces pour contrecarrer le développement des maladies métaboliques. Ces perspectives pourront par exemple se traduire par des modifications de l’alimentation des mamans et de leurs nourrissons destinées à induire la néoglucogenèse intestinale.
Procédures
Pour sélectionner les souris transgéniques, un petit morceau de tissu (biopsie) sera prélevé à toutes les souris du projet pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes (EU1). Les 48 femelles subiront un gavage les trois premiers jours après l’accouplement (30 secondes) et un prélèvement de sang (30 secondes) 21 jours après la mise bas (EU1). Parmi ces femelles, 32 recevront un traitement d’antibiotiques : 16 pendant 21 jours et 16 pendant 36 jours. Parmi les 384 descendants, 144 : - seront soumis à un régime hypercalorique dès l’âge de 6 semaines et pendant 11 semaines (EU1 + EU2). - subiront 2 tests pour analyser la régulation de leur glycémie pendant 2h après l’injection de glucose ou d’insuline (injections réalisées en 20 à 30 secondes chez la souris maintenue en contention) chez des animaux mis à jeun pendant 6h (EU1). Pour chaque test, 7 prélèvements de sang seront réalisés à l’extrémité de la queue en 15 secondes maximum sur des souris libres de mouvement. Une seule incision de l’extrémité de la queue sera réalisée avant le premier prélèvement de sang (EU1). - seront soumises à mesure de la composition corporelle par un analyseur dédié (EU2). Cette mesure sera réalisée chez l’animal éveillé mais maintenu immobile. Elle est rapide (2 minutes) et non invasive - seront isolées pendant 72h dans des cages spécifiques pour mesurer leur dépense énergétique (EU2). On mesurera leurs échanges gazeux (respiration), leur prise alimentaire et hydrique et leur activité physique. Cette mesure se fait de manière non-invasive. En fin d’expérience, une prise de sang terminale sera faite rapidement (en moins de 15-20 secondes) après une mise à jeun pendant 6h (EU1). L’animal sera mis à mort immédiatement après la prise de sang pour permettre le prélèvement de certains organes, qui seront ensuite étudiés en laboratoire (EU1).
Impact sur les animaux
Le traitement aux antibiotiques n’entraine pas de modification du comportement maternel, de perte de poids et de mal-être. Le gavage pourrait provoquer une légère irritation de l’œsophage. Les prélèvements sanguins peuvent engendrer une légère douleur de très courte durée au moment de la piqure. La réalisation de certains gestes (biopsie, injections, mesure de la composition corporelle) peut entrainer un léger stress lors de l’immobilisation nécessaire. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont également : - une douleur lors de la biopsie. - les symptômes liés à une hypoglycémie liée à l’injection d’insuline, c’est-à-dire une baisse de leur activation jusqu’à leur prostration, un mal-être, voir des convulsions et un coma si l’hypoglycémie est sévère. - un stress léger dû à la privation de nourriture pendant 6h. - un stress pendant l’isolement de 72h pour la dépense énergétique.
Devenir
Les 48 femelles et 384 souriceaux issus des croisements seront mis à mort pour prélèvements d’organes. Les mâles utilisés pour la reproduction seront réutilisés dans l’EU1.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur des cellules ou organoïdes car elle concerne l’influence de l’environnement maternel sur un paramètre d’un descendant. Les connaissances actuelles ne permettent pas de reproduire la complexité de l’environnement maternel sur un modèle cellulaire représentant l’organe du descendant.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans la procédure d’étude a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et des connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, 8 descendants par condition seront utilisés pour étudier les conséquences de l’absence de microbiote intestinal maternel sur les souriceaux et 12 descendants par condition pour étudier les conséquences sur les descendants adultes. Au total, ce projet réalisé sur 5 ans nécessitera 432 souris transgéniques. Les mâles utilisés pour l’obtention des portées sont des souris de réforme d’élevage.
Raffinement
Pour favoriser l’accouplement, le soir précédent l’accouplement, de la litière des mâles sera introduite dans la cage des femelles et vice et versa. Les portées seront équilibrées à 8 bébés par portées en réalisant des adoptions de souriceaux issus de grandes portées par des mères de petites portées. Pour limiter le stress de séparation des nouveau-nés de leur mère en cas d’adoption, l’expérimentateur se frottera les mains avec la litière et les souriceaux à adopter seront déplacés avec de la litière et une partie du nid. Pour limiter l’irritation, le gavage sera réalisé avec une sonde de gavage souple préalablement trempée dans une solution d’eau sucrée pour favoriser la déglutition de l’animal. Pour les mesures répétées de la glycémie, une petite incision de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une pommade anesthésiante. Le sang sera ensuite prélevé sans autre incision pour l’ensemble des prélèvements Les volumes de sang prélevés resteront très limités conformément aux recommandations internationales sur le bien-être animal. Les souris seront transportées entre l’EU1 et l’EU2 dans des cages permettant de conserver le confinement, selon les conditions règlementaires. La durée du trajet n’excède pas 10 minutes. Le stress lié à l’isolement pour la mesure du métabolisme énergétique sera atténué en plaçant de la litière souillée de la cage d’origine des souris et par l’ajout d’un tube leur permettant de se cacher. Une période de découverte de ce nouvel environnement sera réalisée pendant 3 h, puis une période d’acclimatation de 24h précédera les mesures. Les animaux seront pesés toutes les semaines et seront observés pour détecter tout signe de mal-être, souffrance, lésions ou de détérioration de l’état de santé général avec la mise en place de points limites précoces. Ces points sont spécifiques au projet et adaptés à l’âge des animaux et aux interventions réalisées.
Choix des espèces
Le rôle de la production endogène de glucose par l’intestin pendant la période néonatale a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Nous étudions l’importance du microbiote intestinal maternel sur la descendance donc cette étude concerne des femelles adultes âgées de 14 semaines. Leurs descendants seront étudiés à 10 jours et à l’âge adulte (entre 6 et 17 semaines).
Comprendre comment les contaminants alimentaires perturbent la flore intestinale et l’hôte chez la souris en étudiant ses protéines
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. La moitié d'entre elles naissent sans microbiote et reçoivent par un gavage unique une flore intestinale d'origine humaine, puis toutes mangent pendant vingt-huit jours un aliment contaminé par un pesticide, une toxine de champignon ou un désinfectant, avec prélèvement de crottes deux fois par semaine. À la fin, toutes sont tuées pour analyser les protéines de leurs tissus intestinaux, et le porteur annonce que l'exposition alimentaire "ne devrait pas induire de nuisances pour les animaux". Sur le remplacement, il décrit des méthodes de laboratoire "de plus en plus développées" pour reproduire ces interactions, avant de conclure qu'il "reste nécessaire d'étudier leurs effets chez l'animal".
Objectifs
Le microbiote intestinal est constitué de milliers de micro-organismes, tels que des bactéries, des champignons et des virus, qui vivent dans notre intestin. Il joue un rôle important dans le maintien de notre santé et peut être impliqué dans le développement de certaines maladies. Son équilibre peut être perturbé par différents facteurs, notamment l’alimentation, certaines maladies ou l’exposition à des substances présentes dans notre environnement telles que les pesticides, les toxines produites par des champignons ou les produits désinfectants. Ces perturbations peuvent fragiliser la paroi intestinale et favoriser des problèmes liés au métabolisme ou au système immunitaire. Nous étudierons l’impact des contaminants sur les protéines produites par les souris et les micro-organismes des flores intestinales (de souris ou humanisées), en comparaison avec les souris témoins. Cette étude nous apportera des informations sur l’état de santé de l’intestin et sur les interactions de la flore intestinale avec l’organisme hôte.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment trois contaminants peuvent modifier le microbiote intestinal et altérer le fonctionnement de l’organisme. Les résultats permettront notamment d’identifier les changements dans la composition du microbiote, son activité et la réponse de l’organisme après exposition à ces substances. En mettant ces différents changements en relation, nous chercherons à mieux comprendre comment l’exposition à des substances toxiques peut perturber l’équilibre du microbiote et contribuer au développement de certaines maladies. Les résultats obtenus pourront contribuer à améliorer l’évaluation des risques liés à ces contaminants et à mieux protéger la santé humaine et animale, dans une approche « Une seule santé ». Le projet permettra également de développer des méthodes et des outils d’analyse facilitant l’utilisation de la métaprotéomique pour étudier les perturbations du microbiote, afin de mieux prendre en compte ces effets dans l’évaluation des risques liés aux contaminants.
Procédures
Seules les souris axéniques au départ (souris à flore humanisée) subiront un seul gavage qui ne durera pas plus d'une minute. Le gavage sera effectué sur des animaux éveillés et ne sera réalisé qu’une seule fois pour l’inoculation du microbiote d’origine humaine. L’administration des contaminants se fera par l’alimentation pendant toute la durée de l’exposition (28 jours), après l’inoculation du microbiote et sa stabilisation (sauf pour les animaux avec aliment témoin). Des échantillons de matières fécales (1 à 2 crottes) seront prélevés chez l’ensemble des souris une fois par semaine entre leur arrivée et le démarrage de la supplémentation, puis deux fois par semaine jusqu'à la fin de l’étude.
Impact sur les animaux
Le gavage, qui pourrait constituer une source de stress pour les animaux, sera réalisé par un opérateur expérimenté afin d'assurer la sécurité des animaux et de réduire leur inconfort lors de la contention. L’administration des contaminants se fera par l’alimentation pendant toute la durée de l’exposition, après inoculation du microbiote et sa stabilisation (sauf pour les animaux avec aliment témoin). Elle ne devrait pas induire de nuisances pour les animaux ni provoquer de perturbation au niveau de la faim et de la soif. Les opérateurs sauront rapidement repérer d’éventuels signes cliniques afin de limiter leur souffrance.
Devenir
À la fin de la procédure, l’ensemble des animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses protéomiques sur leurs tissus intestinaux.
Remplacement
À ce jour, il est difficile de reproduire complètement les interactions entre le microbiote intestinal et l’organisme avec des modèles cellulaires. L’intestin est en effet un système complexe qui fait intervenir plusieurs éléments, notamment la digestion, le système immunitaire et le microbiote. Pour les contaminants présents dans les aliments, des méthodes de laboratoire sont de plus en plus développées afin de reproduire ces interactions. Cependant, il reste nécessaire d’étudier leurs effets chez l’animal afin de prendre en compte l’ensemble des mécanismes se produisant après l’ingestion d’un contaminant, ainsi que leurs conséquences sur les protéines présentes dans l’intestin.
Réduction
Nous avons réduit au minimum le nombre de souris par lot, à savoir 10 souris (5 mâles et 5 femelles) réparties dans 4 lots pour les souris conventionnelles et 4 lots pour les souris à flore humanisée. Ces lots sont eux-mêmes subdivisés en 4 groupes de traitement (comprenant le groupe contrôle de chaque flore et chaque sexe), soit un total de 5 x 2 (sexes) x 4 (lots contaminés ou de contrôle) x 2 (flore murine ou humanisée) = 80 souris nécessaires à cette étude pour obtenir la puissance statistique suffisante, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, en tenant compte de la variabilité des données métaprotéomiques pour les effets de la flore, du traitement et du sexe.
Raffinement
Le transport des animaux sera assuré par un transporteur agréé garantissant leur bien-être. À leur arrivée dans nos locaux, ils seront hébergés par groupe de cinq (mâles et femelles séparés) dans des cages. Pour les animaux axéniques, les cages seront à l’intérieur d’un isolateur avec une ventilation adéquate. Les animaux auront à leur disposition de la litière en bois, un palier et un tunnel suspendu, des igloos, des matériaux pour la nidification et d'autres matériaux d'enrichissement tout au long du protocole. Une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée, avec utilisation d’une grille de scoring pour la détection des points limites. Le seuil de déclenchement est fixé selon un score défini au préalable et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, consistance des fèces, perte de poids de plus de 15 %, déshydratation, yeux et abdomen creux) suffisamment prédictifs et spécifiques à ce projet.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé pour étudier les perturbations du microbiote intestinal. La souche utilisée est particulièrement bien documentée et permet de reproduire et d’étudier ces perturbations dans des conditions contrôlées. Elle permet notamment d'administrer facilement des contaminants dans l'alimentation, de contrôler les doses utilisées et de suivre l'évolution de la perturbation du microbiote ainsi que son éventuel retour à l'équilibre. Les souris axéniques, c’est-à-dire dépourvues de microbiote, constituent également un modèle reconnu pour étudier le rôle du microbiote humain et ses interactions avec l’organisme. Leur utilisation dans ce projet est cohérente avec la première partie de l’étude qui utilise la même souche de souris, mais avec un microbiote normal. Les souris axéniques auront 5 semaines à leur arrivée et commenceront le traitement à l’âge de 9 semaines. Cet âge correspond au début de la maturité sexuelle et au stade « jeune adulte » chez la souris. Il est adapté aux objectifs du projet, les perturbations du microbiote intestinal étudiées concernant notamment cette période de la vie. Les souris conventionnelles seront également traitées à partir de l’âge de 9 semaines afin de conserver les mêmes conditions d’âge entre les différents groupes.
Allaitement et transmission des Orthoflavivirus (Zika, dengue et fièvre jaune) : approches mécanistiques chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
2 213 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, mères allaitantes et souriceaux de deux à vingt et un jours. Chaque femelle peut être infectée par la dengue, Zika ou la fièvre jaune, subir jusqu'à trois prises de sang en huit jours, recevoir une injection d'hormone, puis passer cinq minutes sous anesthésie générale sans réveil pour le prélèvement de son lait. Les souriceaux sont infectés par voie orale ou par gavage, et le porteur indique que certains peuvent exceptionnellement s'aggraver rapidement jusqu'à la mort, plus souvent avec le virus Zika qu'avec celui de la fièvre jaune. Aucune souris ne sort vivante de la zone de sécurité biologique de niveau 3, et le porteur écrit que cette recherche fondamentale "n'aura pas d'application médicale immédiate".
Objectifs
L’objectif général du projet est de caractériser les mécanismes de transmission par l’allaitement des orthoflavivirus (virus de la dengue, Zika et fièvre jaune) et d’identifier les déterminants viraux et les facteurs du lait maternel impliqués dans cette transmission. Cet objectif se décline en trois objectifs scientifiques : Objectif 1 : Évaluer la transmission du virus de la dengue par l’allaitement et par voie orale • Caractériser la dissémination du virus de la dengue vers les glandes mammaires au cours de l’infection. • Déterminer la présence de virus infectieux dans le lait maternel et en caractériser les formes (virus libre et/ou associé aux cellules). • Évaluer l’infectivité du virus par voie orale chez les souriceaux. • Analyser la transmission du virus aux souriceaux lors de l’allaitement. Objectif 2 : Caractériser les facteurs viraux et la composition du lait en contexte d’infection • Rechercher la présence de la protéine virale NS1 sous forme sécrétée dans le lait maternel pour les trois virus. • Déterminer les formes de NS1 (libre et/ou associée à des lipoprotéines). • Analyser la composition du lait (lipides, lipoprotéines, apolipoprotéines) en conditions infectées et non infectées. • Étudier les interactions entre les particules virales, NS1 et les composants lipidiques du lait. Objectif 3 : Étudier l’infection des glandes mammaires et ses conséquences • Déterminer le tropisme cellulaire de l’infection dans les glandes mammaires. • Évaluer l’impact de l’infection sur l’intégrité des tissus mammaires. • Analyser la réponse immunitaire locale associée à l’infection. Les données obtenues permettront de mieux comprendre les mécanismes de transmission des virus par l’allaitement et d’identifier des facteurs modulant la transmission/l’infectivité virale dans ce contexte. Pour compléter ces expériences, des modèles in vitro d’épithélium intestinal seront utilisés pour étudier l’impact de NS1 et/ou des lipides et des lipoprotéines du lait sur la capacité des virus à franchir la barrière intestinale, étape clé de l’infection orale chez le nouveau-né.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mieux comprendre si certains virus transmis par les moustiques, comme ceux de la dengue, du Zika ou de la fièvre jaune, peuvent également être transmis de la mère au nouveau-né par l’allaitement. Les chercheurs étudieront si ces virus peuvent être présents dans le lait maternel, sous quelle forme ils s’y trouvent et comment ils pourraient éventuellement franchir les défenses naturelles de l’intestin du nourrisson. Ils analyseront également l’impact de l’infection sur les glandes mammaires et sur la composition du lait. Les résultats permettront de mieux comprendre les interactions entre les virus, le lait maternel et le nouveau-né. Ils contribueront à combler un manque important de connaissances sur une voie de transmission encore mal connue. Cette recherche est avant tout une recherche fondamentale visant à améliorer les connaissances scientifiques. Elle n’aura pas d’application médicale immédiate, mais les données obtenues pourront à terme aider à mieux évaluer les risques potentiels pour les nourrissons et à orienter les futures stratégies de prévention.
Procédures
Une partie des souris seront infectées avec un virus (dengue, Zika ou fièvre jaune) par une injection sous-cutanée une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées par administration orale dans la bouche à l’aide d’une pipette ou par gavage avec une sonde souple une fois pour une durée de quelques secondes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 8 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. Certaines souris feront l’objet d’une injection intrapéritonéale d’hormone une fois pour une durée de quelques secondes puis de prélèvement de lait maternel, sous anesthésie générale sans réveil, une fois pour une durée de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les administrations et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention et une introduction d’une aiguille (ou d’une sonde souple pour le gavage) selon les bonnes pratiques vétérinaires. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. Par conséquent, l’impact principal de nos procédures proviendra de l’infection virale elle-même (virus de la dengue, Zika ou de la fièvre jaune (virus sauvage ou souche vaccinale)). Dans certains cas (selon le virus, la dose infectieuse, la voie d’injection), l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids inférieure à 5% et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante, une apathie, et des signes extérieurs de souffrance tels qu’un dos voussé, un pelage hérissé, et/ou un faciès de souffrance. Dans le cas particulier de l’infection de souriceaux, d’après notre expérience avec les virus Zika et de la fièvre jaune, certains animaux peuvent exceptionnellement présenter une aggravation rapide de leur état, pouvant entraîner des signes de souffrance importants ou une mortalité malgré la surveillance mise en place. Ce phénomène reste rare, mais il est observé plus fréquemment avec le virus Zika qu’avec le virus de la fièvre jaune.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ces animaux auront été infectés et manipulés en zone de sécurité biologique de niveau 3.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans une collaboration de recherche visant à mieux comprendre et mesurer les risques en santé humaine liés à la transmission des virus de la dengue, Zika et de la fièvre jaune par le lait, ainsi que les mécanismes et les facteurs de risques associés. Des expériences in vitro, utilisant des organoïdes et cultures de cellules primaires, seront réalisées en parallèle de ce projet pour caractériser l’impact de facteurs viraux ou composants du lait maternel sur le franchissement de la barrière intestinale du nourrisson. Cependant, aucune expérience in vitro ne peut permettre de répondre aux objectifs de ce projet (étude de la dissémination du virus dans les glandes mammaires des individus infectés, de la charge virale dans les glandes mammaires et le lait, le tropisme cellulaire de l’infection dans la glande mammaire, l’impact de l’infection sur la composition du lait maternel, l’efficacité de transmission par allaitement et l’impact à plus ou moins long terme de l’infection sur l’intégrité et la fonction de la glande mammaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire grâce à une planification rigoureuse des expériences, permettant de sélectionner les conditions d’étude les plus pertinentes et de limiter les répétitions inutiles. Les résultats acquis au cours des premières étapes du projet seront utilisés pour déterminer les conditions expérimentales dans la suite du projet, et éviter la réalisation de conditions expérimentales superflues sur un grand nombre d’animaux. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir de l’expérience acquise lors de travaux antérieurs et de manière à obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en utilisant le plus petit effectif compatible avec cet objectif. Les animaux étant infectés et les analyses nécessitant le prélèvement de différents organes, ils ne pourront pas être réutilisés dans d’autres expériences. En revanche, après la mise à mort, un maximum d’échantillons sera prélevé sur chaque animal afin d’exploiter au mieux les tissus collectés et de limiter le recours à des animaux supplémentaires. Le nombre de répétitions pour chaque expérience pourra éventuellement être réduit au cours du projet grâce à des analyses statistiques intermédiaires.
Raffinement
Deux enrichissements seront utilisées dans toutes les cages contenant des souris lactantes et leurs portées : des igloos ainsi que du coton afin notamment que les mères puissent construire des nids pour leurs portées de souriceaux. Durant la gestation et après la mise bas, chaque mère sera toujours hébergée en compagnie d’une autre femelle adulte (mère elle-même ou pas) , ce qui selon notre expérience réduit considérablement leur stress et le risque que la(les) mère(s) mange(nt) ses(leurs) souriceaux. Tous les gestes techniques effectués sur les mères allaitantes et leurs portées ont été discutés avec la structure du bien-être animal et adaptés spécifiquement afin de garantir un maximum de bien-être pour tous les animaux durant toutes les expériences. Les expérimentateurs changeront également de gants entre les manipulations de chaque portée pour ne pas perturber la reconnaissance (par l’odorat) des souriceaux par leur mère. Dans certains cas, l'infection se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et d’autres signes de souffrance (dos voussé, poils hérissés, faciès douloureux). Les animaux infectés seront évalués quotidiennement pendant la période symptomatologique (précisée dans chaque procédure) avec plusieurs points limites : perte de poids importante (>20%, ou colonne vertébrale visible), dos voussé, faciès douloureux, isolement dans la cage et/ou perte de mobilité. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire. Au besoin, une réhydratation sous-cutanée sera effectuée, et les cages pourront être chauffées. Des points limites (précisés dans chaque procédure) spécifiques et précoces seront utilisés afin de minimiser la souffrance.
Choix des espèces
La souris A129 est un modèle d’étude scientifiquement reconnu pour l’infection par les orthoflavivirus, notamment les virus Zika et de la fièvre jaune . Ce modèle nous a déjà permis d’effectuer des études publiées sur l’efficacité de la transmission des virus Zika et de la fièvre jaune par allaitement, et a permis de montrer des résultats discriminants concernant l’efficacité de cette vie de transmission selon les virus et les souches sauvages ou vaccinales. Cette lignée est établie depuis longtemps et est élevée dans notre animalerie. Bien que les glandes mammaires de souris soient de forme plane et au nombre de 10, leur structure interne et composition cellulaire est semblable aux glandes mammaires humaines. Ce modèle permet d’utiliser un nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, comme l’indiquent nos précédentes études. Les animaux utilisés dans les procédures seront : Des souris femelles adultes (procédures 1, 2 et 4, car études concernant les glandes mam-maires et/ou l’allaitement), et des souriceaux mâles et femelles (âge : entre 2 et 21 jours, pro-cédures 2, 3 et 4). Le choix des âges utilisés est lié à la nature du projet, qui est d’étudier la présence de virus infectieux dans les glandes mammaires et le lait, le tropisme viral dans les glandes mammaires, et l’impact de l’infection sur les glandes mammaires ; ainsi que la transmission par voie orale ou directement par allaitement aux souriceaux.
Rôle des perturbations métaboliques associées à l’obésité dans le cancer colorectal héréditaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Quatre lignées de souris à phénotype dommageable développent des lymphomes spontanés à partir de cinq mois, et des tumeurs intestinales à partir de six mois en condition d'obésité. 720 souris de ces lignées vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une alimentation qui les rend obèses, un traitement injecté dans le péritoine, des palpations abdominales deux fois par semaine, et pour les tests métaboliques une mise à jeun la veille puis des prélèvements de sang répétés à la veine de la queue après incision. Le porteur décrit des masses tumorales pouvant entraîner diarrhées, prolapsus, signes d'anémie, et annonce la mise à mort en fin d'expérimentation "afin de réaliser des prélèvements terminaux".
Objectifs
Le cancer colorectal est l'un des cancers les plus fréquents et représente un enjeu majeur de santé publique. Bien que plusieurs facteurs génétiques jouent un rôle dans son initiation, la majorité des cancers colorectaux sporadiques sont imputables à des facteurs environnementaux tels que l'obésité, le tabagisme et les carcinogènes alimentaires. Il est bien connu que le risque de développer un cancer colorectal augmente avec l'obésité. Cependant, les mécanismes biologiques par lesquels les régimes alimentaires occidentaux influencent le développement du cancer colorectal ne sont pas bien compris. Ce projet de recherche a pour objectif global d’identifier comment les perturbations métaboliques déclenchées par une alimentation obésogène promeuvent la progression du cancer colorectal et de caractériser les liens complexes entre l'obésité et le contrôle du métabolisme.
Bénéfices attendus
Ce projet représente un enjeu majeur de santé publique et permettra de développer de nouvelles voies thérapeutiques pour les patients obèses atteints de cancers digestifs.
Procédures
Les souris seront soumises ou non à un régime alimentaire les rendant obèse, puis un traitement leur sera administré intra-péritonéalement (temps estimé : 15 secondes). Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien et seront pesés 2 fois par semaine (temps par pesée : 10 secondes). Afin de suivre l’évolution tumorale, les souris seront, à l'occasion de la pesée, palpées au niveau abdominal (temps estimé : 15 secondes). Pour les tests métaboliques, les animaux seront mis à jeun la veille. Ensuite, les souris recevront une injection intrapéritonéale de glucose ou d'insuline (temps estimé : 15 secondes). A l’issue de l'injection, des prélèvements sanguins seront effectués (temps estimé : 30 secondes) à la veine caudale après incision transversale légère au niveau de la queue à intervalles de temps réguliers pour mesurer la glycémie ou une éventuelle intolérance à l’insuline.
Impact sur les animaux
Le phénotype attendu des animaux est le développement le développement spontané de lymphomes à partir de 5 mois de vie et en condition d’obésité, des tumeurs intestinales, à partir de 6 mois de vie. Les nuisances associées à ce développement de tumeurs peuvent être les suivantes : développement d’une masse tumorale pouvant entrainer des troubles digestifs (diarrhées, prolapsus notamment), des signes d'anémie, ou troubles du comportement. À ces effets liés au modèle s’ajoutent les nuisances expérimentales : les manipulations et contentions répétées peuvent être sources de stress pour les animaux. L’administration de tamoxifène est également susceptible d’induire des effets indésirables transitoires, tels qu’une gêne locale. Enfin, les prélèvements sanguins répétés peuvent engendrer une douleur légère à modérée au point de prélèvement, ainsi qu’un stress associé à la manipulation, et, en cas de répétition rapprochée, un risque d’affaiblissement ou d’anémie.
Devenir
Les souris seront euthanasiées en fin d'expérimentation afin de réaliser des prélèvements terminaux
Remplacement
Les questions posées dans ce projet portent sur la manière dont les tumeurs apparaissent et évoluent au fil du temps. Pour y répondre, il est nécessaire d’utiliser des souris, car elles permettent d’étudier le fonctionnement du corps dans son ensemble. En effet, le comportement des cellules cancéreuses, notamment leur métabolisme, peut être très différent entre des expériences en laboratoire (sur cellules isolées) et un organisme vivant. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier ces phénomènes de façon aussi complète. L’utilisation de souris reste donc indispensable, en particulier pour comprendre les premières étapes de formation des tumeurs. Enfin, ce projet vise aussi à étudier les interactions entre différents organes et la tumeur, ainsi qu’à identifier des marqueurs détectables dans le sang. Ces objectifs nécessitent obligatoirement une étude sur un organisme entier.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé pour obtenir des résultats fiables, tout en évitant de devoir refaire les expériences. Seuls les régimes alimentaires ayant montré les effets les plus marqués seront testés. Chaque groupe comprendra 20 souris (10 par type d’alimentation), ce qui permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour tirer des conclusions solides. Pour analyser les résultats, nous comparerons la croissance des tumeurs entre les différents groupes au fil du temps, ainsi que les caractéristiques biologiques des tumeurs prélevées. Des méthodes statistiques adaptées seront utilisées pour comparer les données entre groupes. Au total, sur les 5 ans du projet, jusqu’à 720 souris pourront être utilisées, réparties en plusieurs groupes expérimentaux. Ce nombre repose sur des calculs statistiques ainsi que sur l’expérience du laboratoire avec des modèles similaires
Raffinement
Ces 4 lignées à phénotype dommageable présentent des caractéristiques phénotypiques spécifiques liées à l’émergence de lymphomes spontanés dont il faudra tenir compte. Un examen journalier des animaux inclus dans les groupes expérimentaux sera effectué pour renseigner dans des fiches de suivi individuelles les premiers signes comportementaux associés à une douleur liée à l’émergence de tumeurs (ataxie, troubles de la respiration, isolement, absence de mobilité ou agitation anormale, modification de l’embonpoint, hérissement des poils, dos voûté…). La sévérité de ces signes sera déterminée selon une grille d’évaluation jointe en annexe qui permettra la mise en place de soins éventuels ou conduira à l’euthanasie des animaux. Les souris seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 animaux maximum par cage. Dans chaque cage nous ajouterons de l'enrichissement (bâtonnets en coton (safe roll), frisottis, cabane en carton)). Les groupes expérimentaux seront réalisés de telle sorte à limiter la présence d’animaux isolés.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères qui sont un modèle représentatif de l’homme et présentant une reproduction rapide, ce qui permet de raccourcir le temps des projets. De plus, les modèles de souris ont été validés dans l'étude de la physiopathologie intestinale car elles développent des tumeurs proches de celles observées chez l'Homme. Nous utiliserons des souris avec ou sans système immunitaire fonctionnel, traitées à partir de 7 semaines, âge correspondant à leur maturité sexuelle.
Impact de l’exercice volontaire sur la progression de la maladie d’Alzheimer chez la souris : microbiote intestinal, métabolites circulants et inflammation cérébrale
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
420 souris d'une lignée reproduisant la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements terminaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal concerné reçoit une substance par voie orale puis subit trois prélèvements sanguins par incision, espacés d'une heure dans la même journée, séquence répétée à sept, dix et quinze mois. Les tests portent sur la mémoire sociale, la reconnaissance et la localisation d'objets et la mémoire spatiale, l'un d'eux obligeant la souris à nager quatre essais par jour pendant cinq jours. Tout cela pour mesurer les effets d'une roue d'exercice laissée en cage, que le porteur décrit comme une approche "simple et accessible".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer et, plus largement, certaines formes de vieillissement du cerveau s’accompagnent souvent d’une baisse progressive de la mémoire et d’autres capacités de réflexion. Aujourd’hui, les solutions thérapeutiques restent limitées. De nombreuses études chez l’humain et chez l’animal indiquent que l’activité physique est une approche simple et accessible, qui peut aider à préserver les fonctions cognitives. En revanche, comment l’exercice produit ces effets reste incompris, notamment via des mécanismes qui impliquent l’ensemble de l’organisme. Des travaux récents suggèrent que l’intestin pourrait jouer un rôle important dans la communication avec le cerveau. Les micro-organismes naturellement présents dans l’intestin (le microbiote) peuvent influencer des substances circulant dans le sang, qui à leur tour pourraient agir sur l’inflammation et sur certaines cellules du cerveau impliquées dans la protection et l’équilibre du tissu cérébral. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le lien entre activité physique, fonctionnement de l’intestin et évolution des troubles de la mémoire dans un modèle de souris de la maladie d’Alzheimer. Plus précisément, nous voulons déterminer si l’exercice volontaire peut modifier des signaux venant de l’intestin et si ces changements sont associés à une meilleure préservation des fonctions de l’hippocampe (une région clé pour la mémoire). À terme, ce travail vise à identifier des pistes biologiques pouvant expliquer pourquoi certaines personnes résistent mieux que d’autres au déclin cognitif.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera d’abord des bénéfices scientifiques à court terme en améliorant la compréhension des liens entre l’intestin et le cerveau au cours de la maladie d’Alzheimer. Il cherchera à préciser comment les micro-organismes naturellement présents dans l’intestin (le microbiote) et certaines molécules circulant dans le sang peuvent influencer l’inflammation et le fonctionnement du cerveau, notamment dans une région essentielle pour la mémoire (l’hippocampe). Grâce à un suivi à plusieurs moments de l’évolution de la maladie et à des mesures complémentaires (tests de mémoire, analyse dans le sang, étude du microbiote, observation de cellules impliquées dans la défense du cerveau, et évaluation de dépôts caractéristiques de la maladie), l’étude pourra identifier des profils biologiques associés à une plus grande vulnérabilité, ou au contraire à une meilleure résistance du fonctionnement cognitif. Le projet évaluera aussi l’effet d’une intervention simple et accessible, l’activité physique volontaire, afin de déterminer si elle peut favoriser des changements bénéfiques du côté de l’intestin et du sang, et s’ils sont associés à une meilleure préservation de la mémoire. L’étude intégrera également des indicateurs du fonctionnement intestinal (par exemple le transit et la perméabilité), pour mieux comprendre le rôle possible de la barrière intestinale et de l’inflammation générale dans la communication intestin–cerveau. À plus long terme, l’identification et la mise à l’épreuve de molécules candidates pourrait aider à repérer des marqueurs de progression de la maladie ou de réponse à l’exercice, et ouvrir des pistes pour de futures stratégies de prévention ou d’accompagnement combinant hygiène de vie et actions ciblant le métabolisme.
Procédures
Certains animaux recevront une substance par voie orale, la procédure dure moins de 30 secondes et est réalisée sur animal vigile. Ces mêmes animaux auront 3 prélèvements sanguins espacés de 1h chacun, réalisés sur animal vigile sans anesthésie mais avec une analgésie locale, et ceci se répètera 3 fois à au moins 3 mois d'intervalle. Pour certains animaux 3 tests comportementaux seront effectués au cours de 2 à 3 semaines. Ils peuvent induire du stress du fait du déplacement des souris vers de nouvelles pièces et de la mise en contact avec de nouveaux objets.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus dans ce projet sont limités et seront surveillés tout au long de l'étude. Activité physique volontaire (roue en cage) : chez certains animaux, elle peut s'accompagner d'une légère diminution du poids, transitoire et d'intensité faible. Administration orale de substances : certains animaux recevront ponctuellement des substances par voie orale. La manipulation est brève (environ 15 secondes) et peut provoquer un inconfort ou un stress transitoire d'intensité légère lié à la contention. Prélèvements sanguins: ces prélèvements nécessitent une petite incision. Elle peut entraîner une douleur brève au moment du geste (environ 10 secondes) et une gêne locale temporaire d'intensité légère (petite plaie, sensibilité) jusqu'à cicatrisation, généralement en quelques jours. Chaque prélèvement est répété 3 fois dans la même journée à une heure d'intervalle. L'ensemble « administration orale + prélèvements » est réalisé à 7, 10 et 15 mois, avec plusieurs mois entre les séances, ce qui permet une cicatrisation complète et limite les effets cumulatifs. Tests comportementaux : ces tests peuvent générer un stress léger car ils reposent sur la nouveauté et l'exploration, mais ils sont de courte durée (sur 1 à 3 jours). Un des tests de mémorisation peut induire un stress modéré car l'animal doit nager ; le protocole est réparti sur 6 jours (4 essais/jour pendant 5 jours, puis 1 essai le 6ème jour).
Devenir
A la fin des procédures expérimentales, les animaux sont mis à mort afin de réaliser des prélèvements terminaux indispensables pour répondre aux objectifs du projet.
Remplacement
Le projet a pour objectif d’étudier, chez l’animal, l’effet d’une activité physique volontaire puis de l’administration de certaines molécules d’intérêt sur l’évolution de troubles de la mémoire et sur la communication entre l’intestin et le cerveau dans un modèle murin de maladie d’Alzheimer. Une partie essentielle du projet repose sur l’évaluation de capacités complexes (mémoire sociale, reconnaissance/localisation d’objet, apprentissage et mémoire spatiale). Ces fonctions ne peuvent pas être mesurées de façon pertinente avec des méthodes sans animal (cellules en culture, tissus isolés, ou modèles informatiques). De plus, l’étude porte sur des interactions entre plusieurs organes et sur des mécanismes qui évoluent dans le temps : intestin et microbiote, substances circulant dans le sang, réponses immunitaires, puis effets sur le cerveau. Ces échanges, qui dépendent du fonctionnement global de l’organisme et de différents stades de la maladie, ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des approches alternatives. Conformément à la démarche des 3R, lorsque des molécules ou des voies biologiques prioritaires seront identifiées, des approches complémentaires hors de l’animal pourront être utilisées (par exemple sur des cellules) pour préciser certains mécanismes. Toutefois, ces méthodes ne peuvent pas remplacer l’étude in vivo nécessaire pour établir le lien entre l’intervention (exercice/administration), les changements dans l’organisme et les effets sur le cerveau et le comportement.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé au plus juste à partir de nos données antérieures dans ce modèle et des informations disponibles dans la littérature. Il est fixé entre 10 et 15 animaux par groupe. Ces effectifs correspondent au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, notamment pour comparer les groupes entre eux et analyser l’évolution de la maladie au cours du temps chez les mêmes animaux. Le choix des effectifs tiennent également compte de la variabilité naturelle entre individus, pour les tests de comportement, du désintérêt de certains animaux à utiliser la roue d’exercice placée dans la cage et enfin à une mortalité plus élevée de la lignée de souris alzheimer au cours du vieillissement. Intégrer ces facteurs dès la planification évite d’avoir à constituer de nouvelles cohortes en cours d’étude.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et les pratiques de manipulation sont conçues pour réduire au maximum le stress et le risque de blessures. Les souris seront hébergées en groupes stables de 2 à 4 dans des cages enrichies avec du matériel de nidification et un élément d’enrichissement (bûchette), afin de favoriser les comportements naturels (repos, exploration, construction du nid). L’activité physique se fera via une roue en cage, permettant à l’animal de choisir librement l’intensité et la durée. Afin de préserver les périodes de repos et d’éviter une activité excessive, les roues pourront être retirées pendant la phase d’inactivité (journée), ce qui encourage le repos. Les mâles peuvent parfois présenter des comportements d’agressivité. Pour limiter ce risque, les groupes seront constitués le plus tôt possible (après le sevrage et dès que le génotype est connu) afin de stabiliser les relations sociales. Les animaux seront surveillés régulièrement pour détecter rapidement tout signe de tension (poursuites répétées, morsures, plaies, perte de poils, amaigrissement). Si un risque de blessure apparaît, une adaptation de l’hébergement sera mise en place, pouvant aller jusqu’à l’hébergement individuel du ou des animaux concernés, uniquement si nécessaire pour prévenir les blessures, réduire la nuisance et maintenir les animaux tout au long de la procédure. Les tables de suivi de soins des animaux comportent des points limites stricts et spécifiques au projet, définis en concertation avec le vétérinaire référent, permettant une prise de décision rapide et standardisée en cas d'altération de l'état général.
Choix des espèces
Le choix de la souris est justifié car elle constitue un modèle de référence pour étudier la mémoire et les fonctions de cérébrales: l’organisation du cerveau est largement conservée chez les mammifères. Les connaissances disponibles chez la souris sur les mécanismes liés à l’inflammation cérébrale et aux modifications observées dans la maladie d’Alzheimer permettent d’établir, dans des conditions contrôlées, des liens entre changements dans le cerveau et performances de mémoire. De plus, les tests de comportement utilisés dans ce projet sont bien validés chez la souris et sont connus pour être influencés par des interventions de mode de vie, comme l’activité physique. La souris est également une espèce de référence pour étudier le rôle de l’intestin et des micro-organismes intestinaux (microbiote) dans la communication intestin–cerveau. L’activité physique peut modifier la composition et le fonctionnement du microbiote. Le choix d’une roue en cage permet une activité volontaire, où l’animal choisit lui-même l’intensité et la durée, ce qui limite le stress par rapport à des méthodes plus contraignantes. Nous utiliserons un modèle murin bien établi de la maladie d’Alzheimer, qui présente avec l’âge des changements caractéristiques et des troubles de la mémoire, ainsi que des modifications rapportées du microbiote. Ce modèle est donc adapté à une étude dans la durée des liens entre intestin, sang et cerveau, et des effets potentiels de l’exercice. Seuls des animaux jeunes adultes à âgés seront inclus, afin d’étudier l’évolution liée à l’âge : les plus jeunes auront 4 mois (âge où les animaux sont adultes) et les plus âgés 15 mois (âge correspondant à un stade avancé de vieillissement chez la souris). Cette plage d’âges est nécessaire pour suivre la progression des troubles au cours du temps et évaluer l’effet d’une intervention mise en place précocement.
Rôle de la bactérie Akkermansia municiphila dans l’immunité et l’inflammation intestinale dans un modèle murin de prédisposition à la maladie de Crohn
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, 352 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles appartiennent à une lignée mise au point par une autre équipe pour reproduire certains aspects de la maladie de Crohn, et reçoivent par voie orale une bactérie intestinale cinq fois par semaine pendant trois mois, plus une injection et un prélèvement de sang. Le porteur indique que ces administrations répétées peuvent causer une douleur modérée, une gêne ou une irritation courant sur les trois mois, et une perte de poids passagère. Sur le remplacement, il décrit des organoïdes intestinaux "intéressants et prometteurs" qui ne permettent pas d'observer "l'impact du reste de l'organisme", et conclut au "besoin de travailler sur l'animal".
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’étudier l’impact d’une bactérie habituellement présente dans l’intestin, appelée Akkermansia muciniphila (ou AKK), sur l’inflammation intestinale qui caractérise la maladie de Crohn. AKK est connue pour avoir des effets bénéfiques pour l’organisme et est considérée un probiotique prometteur, son abondance est fortement diminuée lors de la maladie. Dans un 1er objectif, nous administrerons cette bactérie AKK à des souris présentant des symptômes de la maladie de Crohn et analyserons les effets sur l’immunité et l’inflammation intestinales. Dans un 2ème objectif, nous nous intéresserons aux interactions entre la bactérie AKK et certaines cellules de la membrane intestinale. Cette membrane est une barrière essentielle pour notre organisme qui permet l'absorption des nutriments et de l'eau, et assure une protection contre les agents pathogènes. De plus, certaines cellules qui la constituent jouent un rôle dans l’inflammation présente dans la maladie de Crohn. Ces deux objectifs nous permettront de mieux comprendre comment la maladie de Crohn se développe et les mécanismes mis en jeu. Ces mécanismes restent encore peu connus mais impliquent une mauvaise régulation de l’équilibre entre le malade et son microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet en santé humaine seront à court terme une meilleure connaissance des effets de la bactérie AKK sur l’intestin, l’identification de ses bienfaits dans des conditions où l’intestin est très inflammé, et la compréhension de ses interactions avec l’organisme. Ces bénéfices pourront s’appliquer à large échelle puisque le nombre de patients atteints de maladie inflammatoire de l’intestin comme la maladie de Crohn ne cesse d’augmenter dans le monde et aucun traitement efficace n’existe à ce jour. A moyen terme, ce projet permettra de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge de cette maladie.
Procédures
Chaque animal sera soumis aux gestes suivants : - Administration orale (5 fois/semaine pendant 3 mois, 3 minutes par geste) - 1 injection (1 fois, 3 minutes) - Prélèvement de sang (1 fois, 5 minutes)
Impact sur les animaux
L’administration des antibiotiques peut conduire à un inconfort intestinal. L'injection pourra entraîner une douleur et un stress légers de courte durée. Les administrations orales pourront entraîner un stress de manipulation, une douleur modérée et une gêne ou irritation courant sur les trois mois de durée du projet. Une perte de poids passagère peut se produire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Il existe des modèles intéressants et prometteurs en 3 dimensions (que l’on appelle organoïdes intestinaux) qui reproduisent les structures de la membrane de l’intestin, qui constitue une barrière cruciale entre l’environnement et le corps, et qui permettent d’étudier les interactions entre l’intestin d’un hôte et sa flore bactérienne. A ce jour, ces modèles peuvent donner des informations préliminaires mais ils ne permettent pas d’observer l’impact du reste de l’organisme : la circulation sanguine, le système immunitaire, les autres organes de la digestion. Or ces différents éléments jouent un rôle très important dans la physiologie de l’organisme mais aussi dans les maladies, et ne peuvent être reproduites totalement in vitro pour le moment. Nous avons donc besoin de travailler sur l’animal pour mieux comprendre les mécanismes responsables du développement des pathologies intestinales et les causes à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
Les effectifs ont été estimés à l’aide d’un test statistique pour obtenir un nombre minimum d’individus tout en permettant d’obtenir des résultats statistiques significatifs. Afin de limiter le nombre d’animaux, les prélèvements de tissus seront utilisés dans différents types d’expériences prévues pour ce projet.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum la douleur et l’angoisse que certaines procédures pourraient engendrer chez les animaux, des étapes d’entraînement des animaux ont été prévues, une surveillance accrue sera mise en place, des protocoles d’anesthésie et analgésie ont été définis. Pour traiter les impacts indésirables, une surveillance intensive sera réalisée, des points limites précoces ont été spécifiés, un suivi de poids quotidien et la mise en place d’une grille d’évaluation de l’animal seront réalisés et un régime alimentaire adapté sera fourni. Des critères d’arrêt de souffrance ont été définis.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif et immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. Afin de tester la capacité de la bactérie AKK présente dans le microbiote intestinal à réduire ou prévenir l’inflammation intestinale (son abondance est fortement réduite chez les patients atteints de la maladie de Crohn qui développent une inflammation chronique de l’intestin), nous utiliserons un modèle préalablement développé dans cette espèce par une autre équipe récapitulant certains aspects de la pathologie humaine. De plus, nous combinerons ce modèle avec un autre modèle de souris afin d’analyser les communications entre cette bactérie et les cellules de la membrane de l’intestin et de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu. Nos travaux précédents ont montré que l’inflammation modérée dans le modèle de prédisposition génétique à la maladie de Crohn que nous utilisons se produit à l’âge adulte, progressivement, entre 3 et 6 mois. Dans le but de tester si la bactérie peut prévenir le développement de cette inflammation, des animaux âgés de 3 à 6 mois seront utilisés. De plus, les expériences visant à tester si l’exposition à la bactérie peut améliorer l’inflammation lorsque qu’elle est présente, des animaux âgés de 6 à 9 mois seront utilisés. Nous utiliserons les animaux des 2 sexes pour ce projet.
Étude du développement du cancer colorectal chez la souris à partir de tissus tumoraux murins et humains
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Toutes tuées pour que leurs organes soient récupérés et analysés, 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des polypes colorectaux, murins ou humains, leur sont implantés par chirurgie sous anesthésie gazeuse au niveau du rein ou dans l'abdomen, suivis de cinq prélèvements sanguins hebdomadaires. Le porteur écrit que le rein porteur de l'implant "n'assurera plus son rôle habituel, mais l'autre rein prendra le relais pour maintenir le bon fonctionnement de l'organisme", et décrit deux à quatre semaines plus tard des douleurs au rein ou à l'abdomen, une perte de poids, des tremblements et des difficultés à se déplacer dues au volume de la tumeur. Une partie des souris a le système immunitaire affaibli pour accepter les tumeurs humaines, l'autre le garde intact.
Objectifs
Le cancer colorectal est la deuxième cause de mortalité liée au cancer en France, avec environ 17 000 décès par an. Il se développe souvent à partir de polypes bénins (une petite excroissance dans le côlon), mais seuls certains évoluent en cancer, en raison d’une grande variabilité biologique encore mal comprise. Pour mieux comprendre l’évolution de ce cancer et tester de nouvelles thérapies, des modèles expérimentaux chez la souris sont indispensables. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre pourquoi certains polypes deviennent cancéreux. Pour cela, des polypes colorectaux seront implantés chez la souris afin d’observer leur capacité à former des tumeurs et d’étudier le rôle de leur environnement. Deux méthodes d’implantation seront utilisées (au niveau du rein ou dans l’abdomen), reconnues pour leur reproductibilité et leur fiabilité. Les expériences seront menées sur différents types de souris afin de reproduire diverses situations. Cette approche permettra de mieux comprendre les mécanismes précoces du cancer colorectal et d’améliorer, à terme, l’évaluation du risque. Ce projet contribuera au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques
Bénéfices attendus
Nous souhaitons comprendre le rôle de tout ce qui entoure la tumeur, appelé microenvironnement : ce sont les cellules, les tissus et les molécules autour du polype, qui peuvent aider ou freiner son développement. Grâce à cette étude, nous espérons découvrir ce qui se passe au tout début de la maladie et peut-être trouver des indicateurs biologiques qui permettraient de mieux diagnostiquer ou de suivre le cancer du côlon chez l’homme.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale pour la transplantation de polypes au niveau du rein ou dans l’abdomen. Les actes s’effectueront sous anesthésie générale gazeuse et sous analgésie (moins de 25 minutes). Au total, 5 prélèvements sanguins seront réalisés une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure. Les différents gestes seront compris entre 20 et 90 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir un stress temporaire lors de leur manipulation et de l’anesthésie. Après l’intervention chirurgicale, une douleur passagère peut apparaître, comme après toute opération, avec un faible risque de complications locales (irritation ou infection de la zone opérée). Les effets sur les animaux peuvent évoluer avec le temps : 1 à 2 semaines après la chirurgie : Les animaux peuvent présenter de petits changements liés à la croissance de la tumeur, comme une légère baisse d’activité, un pelage un peu moins entretenu ou une gêne très discrète dans leurs déplacements. Dans le cas d’une implantation réalisée au niveau du rein, ce dernier n’assurera plus son rôle habituel, mais l’autre rein prendra le relais pour maintenir le bon fonctionnement de l’organisme. 2 à 4 semaines après l’implantation : Lorsque la tumeur est plus volumineuse, les effets peuvent devenir plus visibles : douleurs au niveau du rein ou de l’abdomen, perte de poids, diminution importante de l’activité. Les animaux peuvent aussi présenter des tremblements, un pelage négligé et des difficultés à se déplacer en raison du volume de la tumeur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et les organes d’intérêts seront récupérés pour pouvoir les analyser.
Remplacement
Ce projet vise à évaluer la capacité des polypes (une petite excroissance dans le côlon) à former des tumeurs, afin de mieux comprendre comment débute le cancer colorectal. Pour étudier ces mécanismes, il est nécessaire que l’on s’appuie sur des animaux, qui nous permettent d’étudier toutes les interactions des tumeurs avec le reste de l’organisme. Les souris utilisées dans ce projet reproduisent de manière fidèle les premières étapes de la formation des tumeurs intestinales. À ce jour, aucun modèle en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permet de reconstituer toutes les composantes d’un tissu vivant dans son intégralité. C’est pourquoi l’utilisation de ces animaux reste indispensable pour répondre aux questions scientifiques posées dans ce projet.
Réduction
Nous avons choisi le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats fiables, en nous appuyant sur des données scientifiques et des méthodes statistiques. Nous mettrons en œuvre en priorité la première méthode, dont la mise au point est plus simple. Si celle-ci permet d’atteindre les objectifs du projet, la seconde méthode ne sera pas réalisée, ce qui permettra de réduire le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Nous avons mis en place toutes les mesures nécessaires pour assurer le bien-être des animaux. Leur état sera vérifié chaque jour, et les procédures seront réalisées sous anesthésie et analgésie pour éviter la douleur et réduire le stress. Les animaux seront maintenus au chaud jusqu’à leur réveil après la chirurgie. Nous surveillerons attentivement tout signe de malaise. En cas de problème, des actions rapides seront mises en place pour soulager l’animal, comme une alimentation plus facile à consommer, des améliorations de l’environnement ou l’administration d’antidouleurs en complément si besoin.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l’utilisation de la souris qui est proche de l’humain sur le plan physiologique. Pour mener ces recherches, deux types de souris sont utilisés de façon complémentaire. Des souris au système immunitaire intact sont nécessaires pour comprendre comment les défenses naturelles de l’organisme influencent le développement des tumeurs. En parallèle, des souris dont le système immunitaire est affaibli sont indispensables pour pouvoir étudier des tumeurs humaines implantées chez l’animal. L’association de ces deux approches permet de mieux comparer les situations et d’obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe chez l’être humain. Les animaux seront utilisés à partir de l'âge de 2 à 3 mois, lorsqu'ils auront atteint leur maturité physiologique et immunitaire, ainsi qu'un poids minimal de 20 g.
Elevage de souris transgéniques à des fins de recherche biomédicale à visée thérapeutique MODIFICATION
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Tuées, gardées pour la reproduction ou versées à d'autres protocoles, 25 400 souris vont être élevées sur trois ans pour fournir sept lignées génétiquement altérées, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers et modérés. Entre 7 et 12 jours de vie, chaque souriceau subit un tatouage des phalanges et le prélèvement d'un morceau de queue de moins de 0,5 mm pour le génotypage. Celles qui portent les mutations neuromusculaires étudiées peuvent présenter une atteinte locomotrice, une polypnée ou des signes de déshydratation, et le porteur écrit les tuer avant l'apparition des symptômes quand aucun protocole ne les réclame. Le champ structuré du devenir compte ces 25 400 souris comme mortes, alors que le texte annonce qu'une partie reste en vie pour la reproduction ou pour d'autres projets, sans en donner la proportion.
Objectifs
Ce projet a pour but de produire et de génotyper des animaux d'élevage à des fins d'utilisation scientifique. Il permettra l’élevage de 7 souches de souris génétiquement altérées nécessaires à la mise en œuvre de différents projets de recherche ayant pour but de comprendre la physiopathologie des maladies étudiées dans notre Laboratoire et de trouver des approches thérapeutiques innovantes pour des maladies neuromusculaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de molécules d’intérêt ou de produits de thérapie génique pour un groupe de maladies humaines rares et orphelines de médicaments, sur des modèles de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de maladies neuromusculaires rares.
Procédures
Les prélèvements de tissus à partir d'un très petit morceau de queue sont réalisés sur animaux vigiles. Cet acte est réalisé en même temps que le tatouage des phalanges et n’est pratiqué qu’une seule fois. Au total, moins de 5 minutes sont nécessaires pour réaliser ces deux actes par animal. En effet, si les prélèvements de tissus s'executent en moins d'une minute, les instruments doivent être désinfectés entre chaque animal ce qui peut prendre 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la méthode de prélèvement de tissu sur jeunes animaux vigiles pour le génotypage. La contention d’animaux jeunes pour se faire peut entrainer un stress et une douleur légère passagère ne dépassant pas quelques heures. Les animaux porteurs des pathologies étudiées dans notre Laboratoire peuvent présenter un phénotype dommageable de type atteinte locomotrice, polypnée ou signes de déshydratation. Ces symptômes peuvent correspondre à un degré d'inconfort jugé modéré.
Devenir
Euthanasie des animaux ou maintien en en vie pour la reproduction ou une utilisation continue dans des projets applicatifs.
Remplacement
Un effort de remplacement est réalisé en amont voire en parallèle du programme d'élevage. En effet, nous essayons dans un premier temps de répondre aux questions biologiques qui se posent à nous à l'aide de modèles cellulaires. L’utilisation d’animaux dans des études n'est effective que lorsque les modèles cellulaires ne peuvent pas répondre aux questions biologiques. Par exemple, lorsqu'il est nécessaire d’étudier les symptômes liés à des troubles du comportement moteur caractéristiques des maladies neuromusculaires que nous étudions ou encore pour étudier la biodistribution d’un traitement dans l'organisme.
Réduction
Nous avons prévu d’utiliser un total de 25400 souris pour fournir les animaux nécessaires à l'ensemble des expériences pour les 5 années d'études à venir sachant que nos besoins peuvent évoluer en fonction d'éventuelles ré-orientations des objectifs scientifiques à l'appui de nouvelles publications scientifiques et de nouveaux résultats. Aussi nous sommes-nous basés sur les données statistiques de 2022 et 2023 ainsi que sur l'historique des données de production des lignées maintenues dans notre établissement pour faire cette estimation. Cette base d'estimation nous amène à envisager une moyenne de 5080 souris par année pour les 7 lignées de souris objet de ce dossier, soit un total de 25400 souris sur 5 ans. Les deux sexes seront utilisés dans les protocoles lorsque la maladie n’est pas liée au sexe ou que le projet n’est pas dépendant d’un des deux sexes.
Raffinement
Dans ce programme d’élevage, les animaux mimant les pathologies étudiées seront utilisés pour les projets applicatifs ou seront euthanasiés avant l’apparition des symptômes. Nous évitons ainsi l’expression du phénotype dommageable quand il n’est pas associé à un besoin expérimental. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi (maisonnette en cellulose, bâtonnets en bois, élément pour la confection des nids, copeaux, tunnel, autres éléments spatiaux d'enrichissement) et sont observés quotidiennement. Au moment du sevrage, nous ne séparons les fratries que par sexe et ne regroupons pas les mâles (frères et germains) à plus de 2 semaines d'écart d'âge pour limiter le risque d’agressivité. De la nourriture est ajoutée directement sur le sol de la cage et des pipettes d’eau plus longues sont mises en place pour que les juvéniles sevrés ou les animaux présentant une atteinte locomotrice aient facilement accès à l'eau et à l'aliment. Le cas échéant, un aliment hydratant et nourrissant peut être placé à même le sol dans une coupelle pour les animaux déshydratés. Pour ne plus attraper les animaux par la queue lors du change des litières, les zootechniciens utilisent leurs mains jointes en creux ou des tubes pour inciter les animaux à passer d’une cage à l’autre par eux-mêmes. Concernant les biopsies de tissu pour l'identification génétique des animaux, elles sont effectuées une seule fois entre 7 et 12 jours de vie par prélèvement d'un très petit bout de queue (moins de 0,5 mm). Ce prélèvement de tissu est réalisé à un âge où l’ossification et l’innervation des tissus ne sont pas encore bien différenciées.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter les mutations génétiques responsables des différentes maladies étudiées dans notre Equipe, ce qui en font le plus petit modèle animal présentant les signes cliniques et pathologiques mimant ces maladies. Les animaux de ce projet d’élevage seront utilisés à un stade précoce pour les identifications individuelles (microtatouage) et l'identification génétique ; et à un stade plus tardif de maturité sexuelle pour le renouvellement des reproducteurs.
Mécanismes des maladies chroniques du foie et identification de nouveaux traitements chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
5 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à douze injections, subissent jusqu'à huit contentions, une biopsie et un régime hyperlipidique qui peut leur faire perdre du poids au moment de la mise sous régime. Le projet cherche les mécanismes de l'inflammation chronique et de la fibrose du foie, et le porteur affirme qu'il n'existe pas de "modèles cellulaires" permettant d'étudier les interactions entre cellules du foie et cellules immunitaires. La justification de l'effectif tient en une phrase, un nombre minimal par groupe suffisant pour des tests statistiques, sans qu'aucun calcul ni aucune taille de groupe ne soit donné pour ces 5 600 souris.
Objectifs
Les maladies chroniques du foie touchent un nombre croissant de personnes dans le monde. Elles peuvent évoluer progressivement, depuis une accumulation excessive de graisse dans le foie jusqu'à des lésions importantes pouvant entraîner une perte de son bon fonctionnement et, dans les cas les plus graves, un cancer du foie. Malgré leur fréquence, les mécanismes responsables de leur apparition et de leur aggravation restent encore mal compris. Ce projet a pour objectif d'étudier, à l'aide de modèles de souris, les mécanismes biologiques impliqués dans ces maladies afin d'identifier de nouveaux facteurs capables de ralentir leur progression, en particulier ceux liés à l'inflammation persistante et à la formation de tissu cicatriciel dans le foie. À terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou traiter les maladies chroniques du foie.
Bénéfices attendus
Ce projet répond à la nécessité de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui favorisent l'apparition et la progression des maladies inflammatoires chroniques du foie. Il vise à étudier la façon dont les différentes cellules du foie communiquent entre elles et à comprendre le rôle de certaines protéines ainsi que des gènes qu'elles contrôlent dans ce processus. Ces recherches pourraient permettre d'identifier de nouvelles pistes de traitement et de mieux comprendre les mécanismes qui favorisent l'amélioration ou le ralentissement de l'évolution de ces maladies.
Procédures
Entre 1 et 8 contentions et entre 1-12 injections de traitements (20 secondes) chez des animaux éveillés. Pour certains animaux avec anesthésie : 1 Injection (30 secondes).
Impact sur les animaux
La contention peut induire un stress. Les animaux ressentiront une douleur légère et transitoire lors du prélèvement d'une biopsie. Ils subiront un stress et ressentiront une douleur légère et transitoire lors des injections. L'anesthésie peut engendrer une légère hypothermie. Le régime hyperlipidique peut entrainer une perte de poids transitoire lors de la mise sur régime.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs foies, nécessaires aux différentes analyses.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de modèles cellulaires permettant d’étudier les interactions existantes entre les cellules du foie et les cellules immunitaires dans le contexte de développement de maladie du foie. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour étudier les effets de ces interactions puisqu'elles mettent en jeu différents types cellulaires dans un environnement physiologique complexe.
Réduction
Un nombre minimal d’animaux sera inclus dans chaque groupe, tout en étant suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et permettre l’application de tests statistiques entre les différentes conditions. Les données expérimentales montrent que les atteintes hépatiques observées dans les différents modèles murins sont plus marquées chez les femelles que chez les mâles. Nous considérerons ainsi les deux sexes tout au long du projet de manière à déterminer pourquoi le développement des maladies du foie est plus sévère chez les femelles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par groupe sociaux dans un environnement enrichi. Le suivi de ces animaux sera quotidien par le personnel de l’animalerie et par l'expérimentateur pendant la durée de la procédure. Les points limites établis spécifiquement pour ce projet seront strictement respectés.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme espèce d’étude car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre la souris et l’homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Les souris adultes mâles et femelles seront âgées de 10 semaines à 7 mois dans ce projet.
Elevage de lignées de souris permettant d’étudier les cellules souches de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Tatouage d'un ou deux coussinets des pattes et biopsie de la queue, sous une contention d'environ cinq minutes : voilà ce que subissent les souriceaux de cet élevage de lignées génétiquement modifiées. 15 360 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour fournir des souris aux études sur les cellules souches de l'intestin. Le champ structuré du devenir annonce 15 360 souris réutilisées et aucune mise à mort, alors que le texte du projet écrit que "Les animaux adultes surnuméraires seront mis à mort", sans que leur nombre apparaisse nulle part. Sur le raffinement, le porteur tient en une phrase, un environnement enrichi et un maintien en groupe social.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de permettre l'élevage et la caractérisation génétique de lignées de souris génétiquement modifiées, afin de fournir des modèles pertinents pour l'étude des cellules souches intestinales au cours du développement, de la régénération et des pathologies pédiatriques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont, d'une part, de fournir des animaux ayants des gènes spécifiques d'intérêt pour nos études et, d'autre part, de comprendre les signaux qui régulent le développement et le maintien des cellules souches pour comprendre comment l'intestin se régénère après blessure.
Procédures
Les souriceaux subiront une contention d'environ 5 minutes pendant laquelle un ou deux coussinets des pattes seront tatoués et une biopsie de queue sera prélevée.
Impact sur les animaux
La contention peut provoquer un stress léger de courte durée chez l’animal. Par ailleurs, le prélèvement de tissu peut provoquer une légère douleur au moment du geste.
Devenir
Les animaux seront utilisés dans des projets scientifiques ou pour renouveler les accouplements. Les animaux adultes surnuméraires seront mis à mort.
Remplacement
Le projet étudiera comment le microenvironnement de l'intestin influence sa santé. Réduire le projet à un modèle de cellules isolées en culture pourrait nous priver de découvertes pertinentes liées à la complexité des interactions systémiques présentes dans l'intestin et il est donc essentiel d'étudier les cellules dans leurs conditions physiologiques.
Réduction
Les stratégies d’accouplement ont été élaborées selon des expériences antérieures pour générer un nombre restreint mais suffisant d’animaux pour réaliser au mieux les expériences. De plus, chaque souris fera l'objet de multiples analyses et les tissus prélevés seront exploités pour plusieurs types d'expériences. Les animaux ne portant pas le génotype d'intérêt seront eux aussi utilisés pour des expériences n'impliquant pas le besoin de marquage cellulaire.
Raffinement
les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi et en groupe social.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est un modèle largement reconnu et particulièrement avantageux pour la recherche sur l'intestin grâce à ses similiratités avec la physiologie humaine. Ceci en fait un excellent modèle translationnel, promettant des avancées inestimables pour la compréhension des fonctions intestinales en santé comme en maladie. De plus, de nombreux modèles transgéniques d'intérêt pour notre étude ont déjà été établis chez la souris. Les souriceaux ont entre 7 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets. Le prélèvement caudal est fait en meme temps pour permettre une caractérisation génétique avant le sevrage.
Effets de métabolites microbiens sur la physiologie gastro intestinale et le comportement de la souris dans le contexte de l’autisme
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Une solution colorée est administrée par sonde buccale à 96 souris pour mesurer leur temps de transit intestinal, après deux semaines d'exposition à une molécule bactérienne dans l'eau de boisson. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance léger, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélever organes et tissus, le porteur indiquant qu'elles ne pourraient pas être réutilisées sans fausser d'autres résultats. Un test impose cinq heures de privation de nourriture, un autre une heure seule dans une cage propre pour compter les crottes. Le projet annonce des tests de comportement portant sur les interactions sociales, les déplacements, les comportements répétitifs et l'anxiété, sans préciser lesquels seront employés, et le porteur souligne lui-même qu'il ne cherche pas à reproduire la complexité de l'autisme chez la souris.
Objectifs
Certains troubles du développement du cerveau, comme les troubles du spectre de l’autisme, peuvent être associés à des difficultés dans les interactions sociales, à des comportements répétitifs, à de l’anxiété, mais aussi à des troubles digestifs. On sait aujourd’hui que l’intestin et le cerveau communiquent entre eux. Dans l’intestin, les bactéries participent à la digestion et peuvent produire de petites molécules qui passent dans l’organisme. Certaines de ces molécules pourraient agir à la fois sur l’intestin et sur le cerveau. Dans ce projet, nous étudions une de ces petites molécules produites par des bactéries intestinales lors de la transformation de certains composants de l’alimentation. Le but du projet est de savoir si une exposition prolongée à cette molécule peut modifier le comportement et le fonctionnement intestinal chez la souris. Pour cela, des souris recevront cette molécule dans leur eau de boisson, puis leur comportement et leur transit intestinal seront étudiés. Nous regarderons notamment si cette molécule modifie les interactions sociales, les comportements répétitifs, l’anxiété ou le fonctionnement de l’intestin. Ce projet ne vise pas à reproduire toute la complexité de l’autisme chez la souris, mais à mieux comprendre si une molécule produite par les bactéries intestinales peut influencer à la fois l’intestin et le comportement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment une molécule produite par les bactéries intestinales peut influencer à la fois le comportement et le fonctionnement de l’intestin. Les résultats permettront de savoir si une exposition prolongée à cette molécule modifie les interactions sociales, les comportements répétitifs, l’anxiété ou le transit intestinal chez la souris. Ils aideront ainsi à mieux comprendre les liens possibles entre l’intestin, les bactéries qui le colonisent et le cerveau. Ce projet présente un intérêt pour la recherche sur les troubles du neurodéveloppement, comme les troubles du spectre de l’autisme, car ces troubles peuvent être associés à la fois à des difficultés de comportement et à des troubles digestifs. À plus long terme, ces connaissances pourront orienter de nouvelles recherches visant à mieux comprendre le rôle du microbiote intestinal et des molécules qu’il produit dans le fonctionnement du cerveau et de l’intestin.
Procédures
Les souris recevront la molécule étudiée dans leur eau de boisson. Cette étape ne nécessite pas de geste direct sur les animaux. Après deux semaines, les souris passeront plusieurs tests de comportement. Chaque test sera réalisé une seule fois par animal. Ces tests permettront d’observer les interactions sociales, les déplacements, les comportements répétitifs et l’anxiété. Leur durée sera courte : environ 5 à 10 minutes selon les tests. Un test nécessitera une privation de nourriture de 5 heures avant de mesurer le temps mis par la souris pour manger dans un nouvel environnement. Les souris auront ensuite deux tests pour étudier le fonctionnement de l’intestin. Pour mesurer la production de crottes, chaque souris sera placée seule pendant 1 heure dans une cage propre. Pour mesurer le transit intestinal, une solution colorée sera administrée par la bouche à l’aide d’une petite sonde. Le temps d’apparition des premières crottes colorées sera ensuite mesuré. Ce test durera au maximum 6 heures. Aucune chirurgie ne sera réalisée. Aucun prélèvement sanguin ne sera effectué.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont surtout liés aux tests réalisés sur les souris, et non à la molécule donnée dans l’eau de boisson. L’exposition prolongée à cette molécule ne devrait pas provoquer d’effet indésirable important. Dans les conditions prévues, les collaborateurs du projet n’ont pas observé de signe préoccupant chez les souris exposées. Les tests de comportement peuvent provoquer un stress bref, par exemple lorsque la souris est manipulée, placée dans un nouvel environnement, isolée temporairement ou mise en présence d’une autre souris inconnue. Ces tests ne sont pas douloureux, mais ils peuvent entraîner une gêne ou une anxiété passagère. Les tests du fonctionnement intestinal nécessitent une administration par la bouche à l’aide d’une petite sonde. Ce geste peut provoquer un stress bref lié à la contention et, plus rarement, une irritation digestive. Ces effets sont attendus comme temporaires. Les animaux seront surveillés afin de détecter tout signe de douleur, de stress prolongé ou d’altération de leur état général.
Devenir
À la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort par une méthode réglementaire. Cette mise à mort est nécessaire car les souris auront reçu la molécule étudiée pendant plusieurs semaines et auront réalisé l’ensemble des tests prévus. Elles ne pourront donc pas être réutilisées dans une autre étude sans risque de fausser de nouveaux résultats. La mise à mort permettra aussi de récupérer des organes ou des tissus après la mort, afin de réaliser des analyses complémentaires. Ces analyses aideront à mieux comprendre les effets de la molécule étudiée sur l’organisme.
Remplacement
Ce projet ne peut pas être réalisé uniquement avec des cellules, des organes isolés ou des modèles informatiques. La question posée concerne à la fois le comportement et le fonctionnement de l’intestin. Pour y répondre, il faut pouvoir étudier un animal vivant, dans lequel l’intestin et le cerveau communiquent entre eux. Des cellules en culture peuvent aider à comprendre certains mécanismes simples, mais elles ne permettent pas d’observer des interactions sociales, des comportements répétitifs, de l’anxiété ou le transit intestinal. Le recours à la souris est donc nécessaire pour savoir si une exposition prolongée à une molécule produite par des bactéries intestinales peut modifier à la fois le comportement et le fonctionnement de l’intestin.
Réduction
Le nombre de souris a été limité au minimum nécessaire pour répondre à la question scientifique. Le projet utilisera 96 souris au total. Les animaux seront répartis en groupes permettant de comparer les souris recevant la molécule étudiée et les souris contrôles, chez les mâles et chez les femelles. Les mêmes souris seront utilisées pour les tests de comportement puis pour les tests du fonctionnement intestinal. Cela évite d’utiliser des groupes différents pour chaque type de test. Cette organisation permet de réduire le nombre total d’animaux tout en obtenant les informations nécessaires pour étudier les effets de la molécule sur le comportement et l’intestin.
Raffinement
Tout sera fait pour limiter le stress et l’inconfort des souris. Les animaux seront hébergés en groupes, avec du matériel pour faire un nid et un abri. Ils auront une période d’acclimatation d’au moins 7 jours après leur arrivée. Les souris seront habituées progressivement aux manipulations avant les tests, afin de réduire le stress lié à la prise en main et à la contention. Les tests seront réalisés dans un environnement calme, dans des conditions standardisées. Les animaux seront replacés dans leur cage d’origine après chaque test. Lorsque cela sera possible, un seul test sera réalisé par jour afin de limiter la fatigue et le stress. Les gestes nécessitant une contention, comme l’administration orale utilisée pour le test du transit intestinal, seront réalisés par du personnel formé. L’état général des animaux sera surveillé au cours de la procédure. Tout animal présentant un signe de douleur, de stress prolongé ou d’altération importante de son état général sera retiré de la procédure.
Choix des espèces
La souris a été choisie car elle permet d’étudier à la fois le comportement et le fonctionnement de l’intestin chez un animal vivant. Ces deux aspects sont importants dans ce projet, car nous voulons savoir si une molécule produite par des bactéries intestinales peut agir à la fois sur l’intestin et sur certains comportements. La souris est aussi une espèce adaptée pour observer les interactions sociales. Elle vit naturellement avec d’autres souris et son comportement peut être étudié avec des tests simples et bien connus. Elle permet donc d’évaluer si la molécule étudiée modifie les contacts avec les autres souris, l’anxiété, les comportements répétitifs ou le transit intestinal. Les souris seront utilisées après le sevrage, à l’âge de 3 à 4 semaines. Le traitement commencera vers l’âge de 4 semaines, une période où l’animal est encore en développement et où le cerveau et le comportement continuent de mûrir. Les tests seront ensuite réalisés après plusieurs semaines de traitement. Ce choix permet d’étudier si l’exposition à cette molécule pendant une période importante du développement peut modifier le comportement et le fonctionnement de l’intestin.