Système gastrointestinal

Parce que ce modèle "garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie", 90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès les premiers jours de vie, chaque souriceau est séparé de sa mère et reçoit une injection d'antibiotique sous la peau, puis, à partir de la quatrième semaine, un régime riche en graisses plus ou moins chargé en vitamine B9. Toutes sont tuées après six ou quatorze semaines pour prélever leur foie. Le porteur écrit que ce régime, qui fait passer les souris d'un foie gras à un cancer du foie, se déroule "sans douleur".

Objectifs

La maladie dite du « foie gras » peut évoluer en cancer du foie, une des principales causes de décès par cancer dans le monde. Un manque en vitamine B9 pourrait favoriser le développement de cette maladie et le cancer du foie. Cependant, son rôle exact n’est pas encore clair et les mécanismes impliqués ne sont pas bien compris. Le but du projet est donc de voir si la vitamine B9 peut influencer cette maladie et le cancer, et par quels mécanismes. Pour répondre à ces questions et étudier l’évolution de la maladie du « foie gras » en cancer, il n’est pas possible d’utiliser de cellules en culture. Par contre, des souris nourries avec un régime gras et traitées avec un antibiotique spécifique développent la maladie comme chez l’humain : d’abord une accumulation de graisse, puis une inflammation et des cicatrices, et enfin un cancer du foie. Pour déterminer si la vitamine B9 joue un rôle dans cette évolution, ces souris recevront soit une quantité insuffisante, soit une quantité excessive de cette vitamine. On pourra ainsi étudier quels sont les mécanismes mis en jeu et qui sont influencés par la présence ou l’absence de vitamine B9.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre comment le cancer du foie se développe lorsque l’alimentation est riche en gras, et comment un manque ou trop de vitamine B9 peut y contribuer. Nous espérons pouvoir identifier de nouveaux mécanismes de régulation de l’expression des gènes liés au cancer et donc mieux comprendre comment l’expression de certains gènes est mal régulée lors du développement du cancer du foie. Nous pourrons aussi savoir si cette vitamine peut protéger ou aggraver la maladie, ce qui aidera à proposer des conseils alimentaires pour les personnes à risque (comme celles atteintes de la maladie du « foie gras »). A plus long terme, les résultats pourraient contribuer à la découverte de nouveaux outils pour diagnostiquer ou traiter ce cancer.

Procédures

Les interventions seront effectuées sur les 90 souris : • Injection d'un antibiotique rapidement après la naissance, durant quelques minutes • Isolement de la mère pendant quelques minutes • Alimentation avec un régime riche en graisses avec une quantité normale, faible ou forte en vitamine B9 à partir de la 4 ème semaine jusqu'à la mise à mort de l'animal (après 6 semaines ou 14 semaines selon le groupe).

Impact sur les animaux

- Douleur liée à l’injection sous-cutanée de l'antibiotique. - Stress lié à la séparation du souriceau de la mère. - Une alimentation enrichie en graisses favorise la progression de la maladie du foie gras vers un cancer du foie dès la semaine 16, un processus potentiellement influencé par un manque de vitamine B9 ou par son enrichissement dans le régime alimentaire.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude. Le foie sera récupéré, afin d’étudier les mécanismes qui régulent l’expression des gènes.

Remplacement

Nous avons mené des études préliminaires sur des cellules de cancer du foie, cultivées avec ou sans vitamine B9. Nous avons trouvé que l’expression de certains gènes était modifiée quand il n’y avait pas de vitamine B9. Par contre, nous ne pouvons pas étudier avec ces cellules le développement de la maladie, tel qu’il se produit chez l’humain, avec la progression d'un foie gras vers le cancer. Seul le modèle animal permet de l'étudier.

Réduction

Pour cette étude, nous allons travailler avec 9 groupes de souris, en testant 3 types d’apport en vitamine B9 (normal, avec peu de B9, avec beaucoup de B9) à différents moments (3). Pour garantir des résultats fiables, nous avons calculé à l’aide de tests statistiques qu’il nous faut 10 souris par groupe, soit 90 au total.

Raffinement

À leur arrivée, les souris auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement avant de commencer les accouplements. Elles seront hébergées dans une animalerie répondant à tous leurs besoins (température, humidité, air filtré) et installées dans des cages ventilées avec des matériaux pour construire des nids. Les nouveau-nés recevront une injection unique d’antibiotique, réalisée par un expert, sans anesthésie car elle est rapide et peu invasive. Pour tout signe d'abandon ou d'isolement de plus d'une journée, l'animal sera placé avec une autre mère pour adoption. Si l'isolement persiste avec la nouvelle mère, l'animal sera mis à mort. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur bien-être, avec un suivi précis de leur état de santé et des pesées régulières. Après le sevrage, les souris seront nourries avec un régime riche en graisses qui provoque une progression de la maladie vers le cancer du foie, sans douleur. Elles seront regroupées par cinq dans des cages enrichies avec des objets pour jouer, se cacher, ronger et explorer, comme des tunnels, des dômes, et des bûchettes non toxiques. Tout est pensé pour leur assurer le meilleur confort possible. Si des signes de souffrance sont détectés et persistants, ou qu'une perte de poids trop importante est notée, les animaux souffrants seront mis à mort.

Choix des espèces

Les principaux modèles de maladie du foie gras ont été validés à l’échelle internationale sur des souris ou des rats. Nous avons choisi de travailler avec des souris car ce modèle, utilisé par nos collègues, garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie. Les souris utilisées proviendront de femelles gestantes, et les souriceaux débuteront le protocole avec l’injection d’un antibiotique rapidement après la naissance, qui permet d’instaurer un pré-diabète, une condition typique de la maladie du « foie gras ». Selon leur groupe, les souris seront suivies jusqu’à 4, 10 ou 18 semaines, correspondant respectivement aux étapes d’un foie normal, d’un « foie gras », et d’un cancer du foie. Ce protocole nous permet d’étudier les différentes étapes de l’évolution de la maladie du « foie gras » vers le cancer.

Toutes tuées en fin de protocole pour que soient prélevés leurs intestins et leurs cerveaux, 192 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant vingt et un jours, elles subissent des facteurs de stress imprévisibles, cage inclinée, litière humidifiée ou retirée, privation de nourriture pendant douze heures, cycle lumineux perturbé, et pour la seconde procédure une heure de contention, deux heures d'exposition à une odeur de prédateur et douze heures de litière fortement humide. S'y ajoutent un antibiotique dans l'eau de boisson, un gavage bactérien, une injection de pilocarpine et trois tests comportementaux nommés, open field, labyrinthe en croix surélevé et appétence au sucrose. Le porteur écrit qu'aucun prélèvement douloureux ne sera effectué sur les animaux vivants, puis affirme que remplacer l'expérimentation animale n'est pas possible ici parce que les effets du stress dépendent d'interactions propres à l'organisme.

Objectifs

Le microbiote intestinal est un ensemble de micro-organismes (bactéries, virus) qui vivent dans nos intestins et qui jouent un rôle crucial pour notre santé. Son équilibre est influencé par des facteurs liés à notre corps, comme notre génétique, ainsi que par des éléments extérieurs, comme notre alimentation et les médicaments que nous prenons. Des recherches récentes montrent que le stress, qu'il soit temporaire ou prolongé, peut modifier la composition de ce microbiote. En période de stress, les bactéries de notre intestin peuvent être exposées à des substances qui changent leur croissance et leur comportement. De plus, le stress pourrait faciliter le transfert de gènes entre les bactéries, y compris les gènes qui rendent certaines bactéries résistantes aux antibiotiques. L’ensemble de ces observations suggère que le stress pourrait augmenter la fréquence des transferts de gènes dans l’intestin et participer à la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques. Or, d’une part, le stress est un problème courant dans notre société, et, d’autre part, la résistance aux antibiotiques, en forte augmentation ces dernières années, devient une menace majeure pour la santé humaine. A l’heure actuelle, l’influence du stress sur la dissémination des gènes de résistances aux antibiotiques n’a jamais été évaluée dans un organisme vivant. Etant donné la complexité des interactions dans le microbiote intestinal entre les bactéries et les cellules humaines, il n’est pas possible d’explorer cette hypothèse en dehors d’un modèle animal. Ce projet a pour but d’étudier l’impact du stress sur la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques dans le microbiote intestinal de souris. Nous comparerons les effets de deux modèles de stress imitant chez l’humain les contrariétés de la vie quotidienne, le premier étant léger (protocole 1) et le second modéré (protocole 2), en examinant si le sexe des animaux (mâles ou femelles) influence leur réponse au stress.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus ici permettront de mieux comprendre les effets du stress sur la propagation de gènes de résistance aux antibiotiques dans le microbiote intestinal, en tenant compte de son intensité et des différences entre les sexes. Ces résultats seront innovants. Ils permettront de déterminer si le stress influence le microbiote intestinal, en particulier la transmission des gènes de résistance aux antibiotiques dans les intestins. Si on observe un effet du stress sur cette transmission, nous chercherons à identifier les mécanismes en jeu, ce qui pourrait ouvrir de nouvelles voies pour lutter contre la propagation de la résistance aux antibiotiques. Ces avancées bénéficieront à la fois aux humains et aux animaux, car la résistance aux antibiotiques affecte les deux.

Procédures

Les protocoles entraînant un stress léger (protocole 1) ou modéré (protocole 2) consistent à appliquer des facteurs de stress de manière imprévisible. Le stress durera 21 jours, avec 1 heure le matin, 2 heures l’après-midi et une période de stress pendant la nuit. Les facteurs de stress sont légers à modérés (par exemple, incliner la cage, humidifier ou enlever la litière) et il y aura des périodes d’au moins 2 heures où l’animal ne subira aucun stress. Aucun prélèvement douloureux ne sera effectué sur les animaux vivants. À la fin du protocole, un échantillon de salive sera prélevé. Par ailleurs, l’ensemble des animaux recevra un antibiotique à raison de 0.5 mg/L dans son eau de boisson à partir de J-3 du début du stress et durant les 21 jours de la durée du stress. A J0 du stress, la moitié des animaux se verra administrer en une fois par gavage la bactérie donneuse du plasmide de résistance aux antibiotiques. Des tests comportementaux (Open Field, Labyrinthe en croix surélevé, test d’appétence au sucrose) seront réalisés en fin de protocole de stress. Une injection intrapéritonéale de pilocarpine sera réalisée à la fin du protocole, afin de permettre le prélèvement d’une quantité suffisante de salive.

Impact sur les animaux

L’inclinaison de la cage va perturber la souris ; la privation de nourriture (12h) va induire un besoin non comblé ; dans la première procédure, la réduction de l’espace va induire un stress situationnel, la cohabitation et l’inversion de cage vont générer un stress social ; la litière humide ainsi que le placement dans une cage sans litière vont déranger l’animal ; le non-respect du cycle lumineux va induire un épuisement. L’ensemble de ces différents stress légers justifie un classement de la première procédure de stress imprévisibles en léger. Dans la seconde procédure, trois stress d’intensité plus importante seront utilisés : contention (1h), stress d’exposition à une odeur de prédateur (2h) et litière fortement humidifiée (12h), justifiant un classement de la deuxième procédure de stress imprévisibles en modéré. Le gavage nécessaire à l’administration des bactéries peut induire un stress léger (moins de 1 minute). L’injection de la pilocarpine peut induire une courte douleur d'intensité identique à celle de l'introduction d'une aiguille (moins de 1 minute). La pilocarpine induit des effets non douloureux chez l’animal, à savoir une hypersécrétion salivaire, lacrymale et gastrique, ainsi qu’une bradycardie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements intestinaux (pour mettre en évidence les transferts de gènes entre bactéries) et des prélèvements cérébraux (pour mettre en évidence le niveau de stress).

Remplacement

Les recherches en laboratoire montrent que des molécules libérées dans l’intestin en cas de stress pourraient influencer le transfert de gènes entre certaines bactéries. Cependant, ces études ne prennent pas en compte la complexité du microbiote intestinal. Les protocoles de stress chronique léger et modéré utilisés ici sont plus proches de la réalité que les modèles en laboratoire. Ainsi, il n'est pas possible de remplacer les expérimentations animales par des méthodes alternatives dans ce cas. En effet, les effets du stress dépendent de nombreuses interactions et processus biologiques spécifiques à l’organisme, ce qui ne peut être étudié que par des modèles in vivo (sur des animaux vivants).

Réduction

Le nombre minimal d’animaux utilisés pour ce projet a été calculé en utilisant des tests statistiques. Ces tests ont montré que nous aurons besoin de 12 animaux par groupe testé pour pouvoir obtenir des résultats analysables, soit un total de 192 animaux pour l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Les cages seront munies d’éléments permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera vérifié quotidiennement à la recherche de symptômes légers, modérés ou sévères référencés dans la grille de scoring interne à la structure. En cas de symptômes légers, les soigneurs et zootechniciens surveilleront particulièrement ces animaux. En cas de symptômes modérés, la structure bien-être animal sera sollicitée avec ou sans le vétérinaire référent. En cas de symptômes sévères, l’animal sera sorti du protocole.

Choix des espèces

Des études récentes ont validé les effets du protocole de stress léger que nous allons utiliser durant 3 semaines sur des souris. En effet, celui-ci entraîne une augmentation des marqueurs du stress dans le sang des animaux ainsi qu’un comportement anxieux tels qu’attendus dans notre étude. Notre étude portera sur des animaux mâles et femelles jeunes adultes.

Quinze jours d'acclimatation en cage chronobiologique, dix à quinze jours d'habituation au tapis roulant, puis un test d'endurance pouvant durer quatre-vingt-dix minutes, avec jusqu'à cinquante stimulations électriques pour forcer la course. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après le test, une scarification de la veine de la queue permet de doser le lactate et le sucre dans le sang, et l'entraînement se poursuit à raison de trois séances de vingt à quarante-cinq minutes par semaine. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, sauf jusqu'à quarante souris qui refuseraient de courir et seraient alors basculées vers d'autres procédures en cours.

Objectifs

Ce projet explore le rôle d’une protéine influencée par l’horloge biologique qui joue un rôle clé dans la gestion des sucres et des graisses, ainsi que dans le bon fonctionnement des muscles. Pour mieux comprendre son impact, les chercheurs ont développé un modèle animal dans lequel cette protéine est absente spécifiquement dans les muscles. Bien que cette absence ne provoque pas de changement visible au repos, les premières analyses suggèrent qu’elle pourrait affecter la capacité du corps à s’adapter à l’effort. Les chercheurs examineront comment les muscles de ces souris réagissent à un effort ponctuel à différents moments de la journée, comment ils s’adaptent à un entraînement prolongé et quelles sont les conséquences sur l’équilibre énergétique et inflammatoire du corps. Les résultats pourraient améliorer notre compréhension des mécanismes régulant l’endurance musculaire et ouvrir de nouvelles perspectives dans le domaine de la santé et du sport. Nous ne disposons pas de modèle de remplacement, cependant le raffinement et la réduction sont particulièrement appliqués. En outre, les procédures sont réalisées durant la phase de veille (donc d'activité) de la souris. A chaque étape du protocole, la règle des 3Rs sera appliquée.

Bénéfices attendus

Ce projet, pleinement justifié d’un point de vue scientifique et conforme à la règle des 3Rs, vise à explorer le rôle d’un gène impliqué dans le métabolisme glucidique et lipidique ainsi que dans la physiologie du muscle squelettique. Son objectif est d’approfondir l’influence de ce gène, dont l’expression fluctue au cours de la journée et est stimulée par l’exercice physique, sur la fonction musculaire et la coordination des réponses métaboliques et immunitaires à l’effort, soulignant ainsi l'importance du rythme circadien dans ces mécanismes. À court terme, nous pourrons évaluer son impact sur l’endurance, la récupération et l’adaptation musculaire à l’exercice, renforçant ainsi notre compréhension des interactions entre l’horloge biologique, l’activité physique et le métabolisme. L’étude tiendra également compte de l’influence du moment de la journée sur la physiologie de l’exercice. Sur la base des résultats obtenus, nous élargirons l’analyse aux voies de régulation et aux processus métaboliques et immuno-métaboliques les plus affectés par l’inactivation de ce gène dans le muscle squelettique. Par ailleurs, nous examinerons comment le désalignement du rythme circadien perturbe le métabolisme et comment l’exercice musculaire pourrait contribuer à sa régulation. Ce projet pourrait ainsi ouvrir la voie à une optimisation des recommandations en matière d’activité physique, de nutrition et de gestion du rythme circadien, avec des implications majeures pour la santé et la performance physique.

Procédures

Les souris devront réaliser un test de performance physique d'endurance dont la durée peut atteindre 90 minutes selon leurs capacités. La stimulation à la course durant ce test peut nécessiter l'utilisation de la stimulation électrique et dans ce cas, la souris peut recevoir au maximum 50 stimulations électriques à intensité faible induisant un léger picotement. En pratique le recours à la stimulation n'est pas souvent utile lorsque la souris se trouve dans sa phase de veille (active) lors du protocole d'exercice. Une scarification sur la veine de la queue pour prélever une microgoutte de sang, pour doser à l'aide d'une bandelette la lactatémie et la glycémie post-exercice, sera réalisée. Elle peut génèrer une douleur aigue d’intensité légère le temps de l'acte (

Impact sur les animaux

Il y a peu d’effets indésirables dans ce projet. Avec les systèmes de cycles inversés dans les cages de chronobiologie, nous avons pu observer une forte activité des souris durant la nuit. Le test de performance physique d’endurance et l’entrainement des souris seront effectués pendant la phase active nocturne des souris ce qui limite considérablement le stress lié aux procédures et le recours à un système de stimulation électrique (les souris courent la plupart du temps spontanément après habituation). L’intensité de la stimulation électrique utilisée pour contraindre les souris à courir, s’il le faut lors du test d’endurance uniquement, sera la plus faible possible. Elle est désagréable mais n’induit pas de douleur. Elle ne sera pas forcément utilisée et ne le sera pas du tout lors de l'entrainement et l'habituation des souris. En effet, les souris courent spontanément, sans contrainte et sans s'arrêter, alors qu'elles en ont la possibilité. Une nuisance pourrait être lié au fait de les confiner pour une durée maximum de 90 minutes sur un couloir de course (la largeur de 7 cm est suffisante pour que la souris coure sans se retourner ou se dévier latéralement ; la longueur de 50 cm permet d'avoir une distance suffisante pour éviter tout stress dû à un espace trop restreint et la hauteur des parois latérales de 15 cm minimise l’effet de confinement). Le fait qu'elles soient habituées à cette situation et qu'elles courent durant la procédure de manière volontaire ainsi que leur comportement, nous laisse penser que cette nuisance est minime. Une légère scarification sur la veine de la queue pourrait être considérée comme une nuisance. Elle est effectuée pour prélever une microgoutte de sang pour doser, à l'aide d'une bandelette, la lactatémie et la glycémie post-exercice et pourrait engendrer une douleur aigue d’intensité légère le temps de la scarification sans autre effet indésirable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes. Les animaux pouvant être réutilisés dans le cadre d'autres procédures en cours, sont ceux qui pourraient refuser de courir à l'issue de la période d'habituation au tapis roulant et qui ne seraient pas inclus dans les procédures. Cela peut concerner au maximum 40 souris pour l'intégralité des 2 procédures.

Remplacement

Nous utilisons des cultures de cellules musculaires et des traitements imitant les effets métaboliques de l'exercice pour étudier leurs réactions. D'autres types de cellules, comme des cellules graisseuses et immunitaires, sont également analysées après exposition aux substances libérées par les cellules musculaires traitées. Dans le cadre d’un projet de recherche, nous collaborons avec des équipes spécialisées pour examiner les fibres musculaires et développer un modèle mathématique du fonctionnement des muscles. Ces méthodes permettent de réduire l’utilisation d’animaux. Cependant, elles ne reproduisent pas les effets réels de l'exercice et de l'entraînement physique sur un organisme entier. C'est pourquoi l'utilisation d'animaux reste nécessaire pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été défini de manière à utiliser le minimum nécessaire pour détecter une différence statistiquement significative avec une puissance minimale de 80 %, tout en tenant compte d’une marge de 20 % de souris potentiellement exclues de l’étude (souris non coureuses). Ainsi, 10 animaux par groupe sont requis pour la procédure 1 (exercice) et 12 pour la procédure 2 (entraînement). Afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés et ainsi respecter le principe de réduction de la règle des 3R, nous avons optimisé l’organisation des expériences. Pour éviter de multiplier les manipulations, certaines analyses seront réalisées sur des souris sauvages au cours de la procédure 1. Cela permettra d’évaluer la faisabilité des protocoles et d’effectuer des mesures métaboliques (consommation d’oxygène) ou immunitaires (cytométrie en flux) nécessitant un traitement immédiat des échantillons après prélèvement. Des tests statistiques seront appliqués pour analyser nos résultats.

Raffinement

Pour assurer le raffinement de l’expérimentation et garantir le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place. Tout d'abord, les procédures seront effectuées lors de la phase active de la souris et en lumière rouge afin de ne pas perturber les rythmes veille-sommeil des souris. Les souris seront préalablement acclimatées et de manière progressive durant 15 jours aux cages chronobiologiques. L'environnement dans la cage est enrichi. De plus, les souris seront progressivement habituées à l’exercice sur tapis roulant pendant 10-15 jours afin de limiter leur stress et favoriser l'exercice volontaire sur tapis. Nous limiterons par ces biais le recours à la stimulation électrique qui peut être stressant pour la souris. Les souris seront surveillées quotidiennement par les animaliers et régulièrement par les expérimentateurs pour détecter rapidement tout signe de souffrance et y remédier. Enfin nous utiliserons la méthode "en cup" pour prendre une souris, une technique de manipulation douce et non stressante, qui consiste à soulever l'animal en formant une coupe avec les mains plutôt qu'en le saisissant par la queue. Pour éviter tout stress inutile, les souris destinées à l’euthanasie seront placées dans une salle séparée et les manipulations post-euthanasie se dérouleront dans une autre pièce. Nous veillerons à ce qu’aucune souris ne soit isolée dans sa cage lors des procédures.

Choix des espèces

La souris est un modèle idéal pour étudier l’impact de l’exercice sur la santé, car son métabolisme et son système immunitaire sont proches de ceux de l’humain. La souris est le seul modèle chez lequel des mutants du gène-cible peuvent être générés. Les échantillons permettent d’obtenir assez de matériel pour réaliser des analyses immuno-métaboliques des tissus prélevés. Des travaux antérieurs de notre équipe et les données in vivo de la littérature sont obtenus sur des souris et les modèles génétiques en question, ce qui permet de faire des comparaisons indispensables et de ne pas répéter certaines expériences. Les souris utilisées auront entre 2 et 6 mois, car c'est à cet âge que des études précédentes ont montré une baisse d’endurance.

Vingt-quatre gavages, deux séances de contention forcée de deux heures, un puçage, une prise de sang : chaque souris passe par cette série avant d'être tuée pour l'étude de ses tissus. 112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole teste par voie orale des métabolites bactériens dans un modèle murin de syndrome de l'intestin irritable, en mesurant la perméabilité intestinale, l'inflammation et la sensibilité viscérale, avec une priorité donnée aux femelles. Le porteur annonce deux séries de tests anxiodépressifs de deux heures sans préciser lesquels, et écrit attendre de l'administration du métabolite qu'elle "exacerbe" les altérations intestinales du modèle.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de tester in vivo (par administration orale) la capacité de ces métabolites bactériens à moduler les fonctions de l’intestin dans un modèle murin de SII. Plus particulièrement, nous évaluerons leurs effets sur (i) la perméabilité intestinale, (ii) l’inflammation, (iii) le stress oxydant, (iv) la viscéro-sensibilité et (v) la motricité intestinale. L’impact de ces métabolites sur la composition du microbiote sera également étudié dans les deux sexes. Le SII étant à prédominance féminine, la priorisation de nos études se portera sur les souris femelles. Les souris mâles seront également utilisées pour nous permettre de comparer l’effet sexe dans ce modèle murin de SII.

Bénéfices attendus

Nous anticipons que l’administration de ce métabolite exacerbera les altérations de l’homéostasie intestinale rencontré dans ce modèle murin. Ces travaux pourront conduire à la mise en place d’études ultérieures utilisant des probiotiques spécifiques capables de métaboliser/utiliser ces métabolites délétère et in fine réduire l’abondance de ces métabolites

Procédures

Les souris seront sujets aux interventions suivantes : 1- Puçage, 1 fois, 5 min/souris. 2- Gavages oraux, 24 fois, 5 secondes/souris 3- Stress de contention, 2 fois, 2h/souris 4- Tests anxiodépressifs, 2 fois, 2h/souris 5- Prise de sang, 1 fois, 1min/souris 6- Mise à mort, 1 fois, 2 secondes/souris

Impact sur les animaux

Les procédures impliquent l’administration orale récurrente de plusieurs substances afin de déclencher des effets cliniques modérés (troubles fonctionnels intestinaux). Pour cette raison, ces procédures sont classées dans la catégorie modérée. Le stress étant une composante indéniable dans la physiopathologie du SII, 2 séries de stress seront réalisés avec un délai suffisant pour une récupération maximale. Les animaux seront acclimatés aux pièces d’hébergement et manipulés fréquemment. Les études utilisant ce modèle murin de SII ne mentionnent pas de mortalité particulière mais la souffrance animale sera évaluée quotidiennement.

Devenir

L’ensemble des animaux seront mis à mort pour l’étude de leurs tissus à la fin du protocole et des procédures. Une utilisation conjointe sur plusieurs projets peut être envisagée par la récupération de tissus non utilisés lors de ce projet.

Remplacement

Le syndrome de l’intestin irritable implique de nombreux acteurs cellulaires dont le fonctionnement ou le métabolisme est altéré. En exemple, les cellules épithéliales intestinales (colonocytes, cellules muqueuses caliciformes, cellules L enteroendocrines), les cellules immunitaires intestinales (mastocytes et lymphocytes), les cellules nerveuses intestinales (cholinergiques) et les bactéries du microbiote intestinal. Le recours à l'expérimentation animale est de fait nécessaire pour mieux comprendre la physiopathologie du SII et intégrer la dérégulation globale de tous ces acteurs. Au regard de la règle des 3R, pour limiter le nombre d'animaux, certaines approches très mécanistiques sont menées actuellement sur des modèles cellulaires comme par exemple l'étude des voies régulant la fonction de barrière intestinale, l’inflammation, le stress oxydant et les fonctions neuroendocrines. Nous possédons au laboratoire diverses lignées cellulaires intestinales pouvant modéliser ces nombreux acteurs. Ces lignées ont été spécifiquement achetées grâce à des financements antérieurs. Nous possédons aussi l’expertise de la technique de co-culture sur inserts transwell qui permet d’évaluer le passage des molécules à travers la monocouche cellulaire. Ces outils in vitro sont indispensables car ils nous permettent de sélectionner les métabolites bactériens les plus intéressants à tester chez l’animal parmi la quinzaine que nous avons pu identifier dans la littérature.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux, l'effectif a été évalué par l'utilisation de tests statistiques. Lors de la réalisation de l’expérimentation nous prévoyons une perte en animaux de 0.00%. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes. Le protocole est optimisé de manière à réduire de manière significative l’utilisation importante d’animaux dans ce projet.

Raffinement

D'une façon générale, les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation, et hébergées au nombre maximum de 4 animaux par cage avec de l’enrichissement (coton pour le nid, maisons en carton, balles, tunnels, différents types de litière, papier kraft). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant tout début de protocole. Les animaux seront maintenus dans un environnement contrôlé et stabilisé. Une évaluation du bien-être de l’animal sera réalisée quotidiennement à l’aide du score de la « Mouse Grimace Scale » et les animaux recevront une injection d'analgésique adaptée pour prendre en charge la douleur si besoin. L’animal sera surveillé et remis dans sa cage d’origine. En situation de douleur persistante, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Ce projet est un projet de recherche en physiologie intégrée permettant d’étudier le dialogue altéré entre le microbiote intestinal, l’intestin et le cerveau dans le contexte du SII. Le recours à des modèles animaux est de fait indispensable pour (i) mieux comprendre l’influence bénéfique ou délétère de métabolites fécaux sur les animaux, et (ii) Identifier les effets sexe-dépendants en présence de ces métabolites. Le modèle murin est communément utilisé dans notre unité pour étudier les troubles fonctionnels intestinaux associés à d’autres pathologies comme l’obésité (alimentation riche en lipide) ou encore l’anorexie mentale (anorexie basée sur l’activité). La souche choisie de nos souris a un taux de réponse élevé à ces troubles par rapport à d'autres espèces animales voire d'autres souches. Le choix de la souris par rapport au rat se justifie également par les quantités et le coût des métabolites administrés. Pour l’ensemble des procédures, les souris seront livrées à l’animalerie centrale à leur septième semaine de vie pour un début de protocole à 9 semaines. À ce stade, nos études antérieures montrent une bonne réponse des animaux aux différents protocoles qui induisent des troubles fonctionnels intestinaux sans mortalité particulière

Gavées chaque jour pendant 75 jours, soumises à quatorze prélèvements de fèces de vingt minutes chacun, puis à un test de tolérance au glucose de trois heures, 160 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le régime riche en graisses et en sucres qui leur est imposé doit provoquer l'obésité, avec une mobilité réduite et un risque de dermatites et d'ulcérations cutanées. Le porteur signale aussi un risque de lésion de l'œsophage lié au gavage quotidien, et annonce deux tests d'évaluation de l'anxiété de vingt minutes sans préciser lesquels. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever l'intestin, le foie et le cerveau, afin de mesurer l'effet de probiotiques et de prébiotiques sur le microbiote intestinal.

Objectifs

L'épidémie d'obésité qui sévit à travers le monde (15,7 % des Français sont considérés obèses) est liée à une augmentation de la prévalence des maladies métaboliques, telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires. Au cours des dernières décennies, la recherche s’est tournée vers l’analyse du microbiote intestinal et de nombreuses publications ont démontré un rôle important de la dysbiose microbienne dans le développement des maladies métaboliques et inflammatoires. 38 000 milliards de bactéries vivent dans le microbiote et interagissent avec l'hôte, ce qui équivaut à plus de 100 fois le nombre de cellules de l'organisme humain. D'après l'ISAPP, l'International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics : " Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte". "Les prébiotiques sont des substrats qui sont utilisés sélectivement par les microorganismes de l'hôte, conférant un bénéfice pour la santé." Les prébiotiques et les probiotiques jouent des rôles complémentaires importants pour la santé intestinale. Il a été prouvé par plusieurs études que les probiotiques et les prébiotiques ont un rôle essentiel dans la gestion de l'obésité. Les probiotiques et les prébiotiques ont amélioré les niveaux de leptine et d'enzymes hépatiques liés à l'obésité. Les probiotiques et prébiotiques agissent en supprimant l'inflammation, en renforçant la barrière intestinale, en régulant l'activité des enzymes intestinales et la fonction neuroendocrine, affectant ainsi le stockage et la dépense énergétique. L'impact des modifications au niveau du microbiote peut agir directement sur l'axe intestin-cerveau. L'objectif de notre projet est de mettre en lumière l'importance de nouveaux probiotiques et des prébiotiques en tant que stratégie complémentaire pour traiter l'obésité, en agissant sur le microbiote intestinal, l'homéostasie intestinale ainsi que l'axe intestin-cerveau.

Bénéfices attendus

Pour évaluer l'efficacité des probiotiques ou des prébiotiques contre l'obésité en analysant les modulations du microbiote intestinal, il est impératif d'utiliser un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro ne peut remplacer la richesse du microbiote intestinal. A travers ce modèle, on peut tirer plusieurs bénéfices tels que : 1-Trouver des prébiotiques et probiotiques capables de réduire l'obésité chez la souris. 2-Observer une diminution des biomarqueurs liés à l'obésité. 3-Mettre en évidence des changements bénéfiques dans la composition du microbiote intestinal, avec une augmentation de l'abondance relative des bactéries bénéfiques. 4- Etudier l'impact des traitements sur l'axe intestin-cerveau. Nous espérons ainsi démontrer l'efficacité des prébiotiques et ainsi que des probiotiques pour la perte de poids et la normalisation de certains paramètres métaboliques tout en décryptant les mécanismes potentiels par lesquels les probiotiques et prébiotiques peuvent influencer la composition corporelle et le métabolisme.

Procédures

Gavages quotidien pendant 75 jours, qui dure moins de 30 seconde par souris. Prises de feces 14 fois pendant le protocole qui dure 20 min par prise. Test de tolérance au glucose, réalisé une seule fois et qui dure 3h avec une seule injection d'insuline. Test de tolérance à réalisé une seule fois pendant le protocole, avec une seule injection d'insuline. Deux tests d'évalution de l'anxiété chaque test dure 20 minutes par souris.

Impact sur les animaux

1 Le stress causé par le gavage quotidien, ainsi que le risque d'endommager l'œsophage. 2 Lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline , les injections peuvent entraîner de la douleur et de l'inconfort. Il est possible que ces procédures provoquent de l'irritation péritonéale. 3 L'obésité est le résultat d'une prise de poids excessive causée par un régime riche en graisses et en sucres. Cela va provoquer : • Une diminution de la mobilité due à un excès de poids. L'excès de sébum accroît le risque de lésions cutanées telles que les dermatites et les ulcérations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour réaliser les différentes analyses sur les organes tels que l'intestin, foie et cerveaux.

Remplacement

On a effectué une phase in vitro. L'impact des prébiotiques ainsi que de nouvelles souches potentiellement probiotiques a été testé in vitro. En analysant le spectre antimicrobien, la résistance aux enzymes, le pH et l'impact sur des cellules in vitro, on peut évaluer leurs effets anti-inflammatoires. En effectuant cette étape, on peut réduire le nombre de prébiotiques et de probiotiques utilisés pour la partie in vivo. Seuls les candidats ayant un impact sur la flore, une diminution de l'inflammation et une réduction de l'oxydation seront utilisés pour la partie in vivo. D’autre part, l'étude du microbiote intestinal nécessite obligatoirement l'utilisation d'un modèle animal puisqu'il est impossible de reproduire, in vivo , la structure écologique, constituée par des milliards de bactéries représentant 1000 espèces bactériennes majoritairement incultivables.

Réduction

Pour optimiser le nombre d'animaux nécessaires, on utilise les analyses statistiques standards. Il y aura que 8 animaux dans chaque groupe expérimental. Le nombre d’animaux a été optimisé via des méthodes statistiques standards. Dans le contexte de l'expérimentation animale, l'utilisation de tests statistiques appropriés peut contribuer à réduire le nombre d'animaux requis, tout en maintenant la validité scientifique de l'étude.

Raffinement

Amelioration de l'enrichissement par:. 1. Cylindres en plastiques : Ces cylindres offriront aux souris des possibilités supplémentaires d'exploration et de cachette, stimulant ainsi leur comportement naturel. 2. Bâtonnets à ronger : Ces bâtonnets permettront aux souris de satisfaire leur besoin naturel de ronger, contribuant à leur bien-être dentaire et comportemental. 3. Matériel de nidification supplémentaire : Nous fournirons des morceaux de coton supplémentaires pour permettre aux souris de construire des nids plus élaborés. Pour réduire le stress des animaux lors des manipulations, nous mettrons en place un protocole de pré-entraînement qui comprendra les étapes suivantes : 1. Habituation à la manipulation : Nous manipulerons doucement les souris pendant de courtes périodes (30 secondes à 1 minute) pendant la semaine précédant le début des procédures expérimentales. Cela permettra aux animaux de s'habituer au contact humain. 2. Simulation de procédures : Nous simulerons certaines procédures non invasives, comme le pesage ou le placement dans la cage de gavage, sans effectuer réellement ces procédures. Cela aidera les souris à se familiariser avec ces situations. 3. Exposition progressive aux équipements : Nous introduirons progressivement les équipements utilisés lors des procédures (comme les sondes de gavage) dans l'environnement des souris, sans les utiliser, pour réduire leur caractère anxiogène. Pour améliorer les conditions de vie des animaux en captivité et réduire les sources de stress, nous mettrons en place les mesures suivantes : 1. Surveillance documentée pendant les procédures expérimentales : • Mise en place de fiches de suivi individuelles pour chaque animal • Observation et enregistrement des signes spécifiques : • Poids • Présence de lésions cutanées • Comportement (isolement, posture inhabituelle, piloérection) • Consommation d'eau et de nourriture • Qualité du pelage • Mobilité 2. Protocole d'action en cas de détection de signes de détresse ou de malaise : • Consultation immédiate du vétérinaire responsable • Administration d'analgésiques si nécessaire • Ajustement des conditions d'hébergement (ex : isolation temporaire, enrichissement supplémentaire)

Choix des espèces

Les études sont réalisées sur des souris car il s’agit du modèle expérimental chez l’animal le plus utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude des effets induits par l'obésité en modèle riche en gras et sucres. La souris est un modèle remarquable pour étudier l'obésité, les animaux qui développent une inflammation et une résistance à l'insuline. En outre, nous avons mis au point tous les outils et techniques nécessaires pour mener à bien cette étude lors de nos travaux antérieurs sur ce modèle Le début des traitements à 6 semaines coincide avec le début de maturation de la flore intestinale.

Transgéniques, les souris de ce projet développent spontanément un carcinome hépatocellulaire, détectable au scanner vers vingt semaines. 40 vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec une injection dans la veine caudale, sept injections intra-abdominales sur deux semaines et demie, un isolement jusqu'à dix minutes dans une cage vide pour récupérer une crotte, et un scanner hebdomadaire sous anesthésie. Le porteur écarte le rat traité par un cancérogène chimique au motif que ce traitement serait plus douloureux et brouillerait les mesures de microbiote. Toutes sont tuées à la fin du traitement pour que leur tumeur soit prélevée.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) représente 95% des cancers du foie. Il est le sixième cancer le plus fréquent dans le monde (nombre de nouveaux cas par an) et le troisième plus mortel. De plus, le nombre de cas est en augmentation constante. Le CHC apparaît à la suite d’infection chronique par le virus de l’hépatite B ou C, ou de maladies hépatiques chroniques non virales, dues à la consommation d’alcool, à l’obésité ou au diabète. Il est trois fois plus fréquent chez l’homme que chez la femme. Pendant 15 ans, un seul médicament était préconisé pour les patients dont le CHC était non opérable. Il ralentissait l’évolution de la maladie, mais permettait rarement la guérison complète. Récemment, l’utilisation de l’immunothérapie a permis d’augmenter considérablement la survie des patients, mais pour un tiers d’entre eux seulement. Il est donc très important d’identifier d’autres traitements qui pourraient bénéficier à la majorité des patients atteints de CHC et de tester leur efficacité. Les altérations de protéines impliquées dans la régulation épigénétique (qui permet de définir comment les gènes vont être utilisés par une cellule) au cours du développement des cancers ont été rapportées dans de nombreux types de cancer dont le CHC. Il a été montré, à l’aide de culture de cellules en laboratoire, que l’inhibition de ces protéines entraîne la mort des cellules cancéreuses. D’autre part, un nombre croissant d’études montre que la composition du microbiote intestinal a une influence sur la réponse des patients au traitement anti-cancéreux. Il est à noter que notre laboratoire a mis en évidence des différences dans les altérations des régulateurs épigénétiques et dans la composition du microbiote entre mâles et femelles, chez des souris transgéniques développant un CHC. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité d’inhibiteurs de protéines impliquées dans la régulation épigénétique sur la croissance d’un CHC chez les souris mâles et femelles. Nous suivrons la taille de la tumeur au cours du traitement par imagerie scanner et nous analyserons les modifications de la composition du microbiote au cours du traitement.

Bénéfices attendus

La mortalité importante et précoce des patients atteints de CHC à un stade avancé oblige à intensifier la recherche de nouveaux traitements. Le ciblage de régulateurs épigénétiques est une option qui a montré son efficacité dans des modèles murins d’autres types de cancer et qui est actuellement en développement clinique. Nous pensons que l’administration d’un inhibiteur de ces régulateurs épigénétiques entraînera une réduction de la croissance tumorale dans notre modèle murin de CHC. En outre, nous pourrons déterminer si le sexe est un composant de cette réponse. En parallèle, nous caractériserons les modifications du microbiote au cours du traitement. Notre étude devrait nous permettre de tester l’efficacité de ce type de médicaments dans le CHC, ainsi que l’influence du sexe et de la composition du microbiote sur cette efficacité. Nos résultats contribueront à déterminer si un tel traitement peut être envisagé dans le traitement du CHC chez l’Homme.

Procédures

Pour pouvoir étudier le microbiote fécal, chaque souris sera isolée deux fois dans sa vie dans une cage vide jusqu’à obtention d’une crotte (10 minutes au maximum). Concernant le traitement, elles recevront une injection intraveineuse dans la veine de la queue (durée maximum trois minutes, comprenant le temps de contention et de préparation de la veine) et sept injections intra-abdominales (durée maximum 30 secondes par injection), à raison de trois injections par semaine. La croissance de la tumeur sera suivie par imagerie une fois par semaine, ce qui nécessitera une anesthésie gazeuse d’une durée de 7 à 10 minutes.

Impact sur les animaux

- A 20 semaines, les animaux inclus dans l’expérience recevront une injection unique dans la veine caudale (environ trois minutes, comprenant la contention et la préparation de la queue), ce qui engendrera du stress et une douleur au point d’injection. - Lorsqu’ils entreront dans la procédure et à la fin de celle-ci, le prélèvement d’une crotte nécessitera de les isoler dans une cage vide (de 30 secondes à 10 minutes maximum), ce qui les stressera. - Lorsqu’ils entreront dans le protocole de traitement, les animaux recevront 3 injections intrapéritonéales par semaine, pendant deux semaines et demi (7 au total), 30 secondes par injection. Toutes les injections se feront sur souris vigiles, ce qui engendrera du stress et une douleur au point d’injection. - Les animaux seront pesés avant chaque injection (30 secondes), engendrant là aussi un stress. - Les animaux seront surveillés pour détecter des signes liés à une gêne ou une douleur générée par la présence de tumeurs hépatiques ou par l’injection du médicament.

Devenir

A la fin du traitement, les souris seront mises à mort, pour prélever leur tumeur et étudier l’effet du traitement.

Remplacement

L’efficacité du traitement que nous voulons appliquer aux souris a été démontrée sur des cellules cancéreuses en culture par de nombreux laboratoires, dont le nôtre. Mais cette approche ne permet pas d’étudier l’effet du traitement sur le cancer lorsqu’il se développe au sein d’un organe, ni les modifications et le rôle potentiel du microbiote au cours du traitement. C’est pour cette raison que nous devons tester notre traitement sur des souris qui développent un cancer du foie.

Réduction

Nous avons utilisé un test statistique qui a permis de déterminer qu'il fallait au minimum 9 mâles et 9 femelles par groupe (un groupe recevant le traitement et un groupe contrôle), soit 36 animaux, pour que les résultats soient statistiquement significatifs. Comme nous utilisons le nombre minimum, nous conserverons deux mâles et deux femelles supplémentaires, au cas où une des souris entrées dans l’expérience décèderait. D’autre part, grâce au suivi par imagerie, nous pourrons homogénéiser les groupes en terme de taille de tumeur au début du traitement et être sûrs de ne traiter que des souris ayant développé un CHC, ce qui permettra d’obtenir des résultats fiables en utilisant un nombre minimum de souris.

Raffinement

A partir de 18 semaines, soit deux semaines avant l’apparition supposée de la tumeur, l’observation minutieuse de l’état général des animaux sera effectuée 2 fois par semaine, pour détecter tout signe de souffrance lié au développement de la tumeur, en particulier un gonflement abdominal. Pendant la durée de l’expérience, un traitement de la douleur sera mis en place si des signes de souffrance légère apparaissent et des points limites ont été définis en cas de signes de souffrance plus importants. A partir de 20 semaines, le suivi du développement tumoral par imagerie permettra d’éviter aux animaux une souffrance due à une taille de tumeur importante.

Choix des espèces

Les souris transgéniques sont souvent le seul modèle dont on dispose pour se rapprocher au mieux du développement du cancer chez le patient. Dans le cas du CHC, il est possible d’utiliser des rats traités avec un cancérogène chimique, mais le traitement chimique est plus douloureux. De plus, il risque d’avoir des effets sur le microbiote qui masqueraient ceux dus au développement de la tumeur. Comme nous souhaitons suivre l’effet du traitement lorsqu’une tumeur est présente, nous utiliserons des souris à partir de 20 semaines (âge auquel une tumeur est détectable par scanner). Nous utiliserons des animaux des deux sexes, pour étudier les différences éventuelles dans la composition du microbiote et la réponse au traitement entre mâles et femelles.