Système gastrointestinal
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Caractérisation de l’efficacité de nouveaux agents bloquant les récepteurs CB1R sur l’obésité induite par un régime gras chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
130 souris vont être utilisées, chacune soumise à vingt semaines de régime riche en graisses avant d'être tuée à l'âge de 24 semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatorze fois par animal, la veine caudale est incisée sous anesthésique local pour prélever deux à deux microlitres et demi de sang. Pendant douze jours, trois composés bloquant un récepteur sont administrés par gavage, l'obésité provoquée pouvant gêner l'accès à la nourriture et à l'eau et entraîner des dermatites. Le porteur présente ces bloqueurs comme prometteurs au vu d'un essai clinique de phase II déjà évalué positivement chez l'être humain pour un composé de la même famille.
Objectifs
L’obésité et ses conséquences métaboliques sont de plus en plus répandues et souffrent d’un manque de traitements pharmacologiques fiables. Nous développons de nouveaux composés à but thérapeutique ciblant le récepteur X et l’objectif de ce projet est de testé le potentiel anti-obésité de trois nouveaux composés chez la souris rendue obèse suite à une alimentation riche en graisse.
Bénéfices attendus
L’obésité représente un véritable enjeu de santé publique ; cette pathologie étant classée parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir son évolution. L’étude, le développement et la caractérisation de nouvelles cibles et de nouveaux agents pharmacologiques apparaît donc primordial afin de remédier à ce besoin médical non satisfait. Les bloqueurs des récepteurs X présentent un intérêt certain, l’un deux ayant récemment été évalué de manière positive lors d’une étude clinique de phase II pour l’obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à un régime riche en graisse pendant 20 semaines. Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et n’aura lieu que 14 fois par animal. Les injections de glucose d’insuline n’auront lieu qu’une seule fois et nécessiteront l’immobilisation de l’animal pour une durée de 5 secondes. Pendant les 12 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage. Pour chaque gavage, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes.
Impact sur les animaux
Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses sera surveillé quotidiennement car bien que cette pathologie ne soit pas un point limite, ses conséquences peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peut également entraîner le développement passager de dermatite. Aucune autre nuisance n’est attendue mis à part un potentiel stress des animaux lors des tests métaboliques.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.
Remplacement
L’obésité est une pathologie multifactorielle entraînant une résistance à l’insuline, des dépôts ectopiques de graisse, une élévation du glucose sanguin, le tout ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur ce type de molécules, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de réaliser des effets doses, ni de multiplier les temps de traitements, pour un large spectre de molécules, dont celles utilisées dans ce projet. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux et le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Depuis leur arrivée en provenance du fournisseur, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 2 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Toutes les précautions sont prises en terme d’analgésie, d’euthanasie et d’application stricte des points limites spécifiques au modèle d’étude et au type d’interventions prévues dans ce projet.
Choix des espèces
L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Son métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction de l’obésité sera réalisée chez des souris de 6 semaines. Les souris seront âgées de 22 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 24 semaines lors de la mise à mort. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.
Implication du microbiote intestinal dans le développement de l’Arthrite Juvénile Idiopathique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Cinq injections intrapéritonéales espacées de deux jours déclenchent chez les souris un emballement du système immunitaire qui provoque une perte de poids caractéristique et une fatigue généralisée. 380 souris vont être utilisées, 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 140 un niveau modéré, toutes tuées puis autopsiées. Une partie, née sans microbiote et maintenue en isolateur stérile, reçoit par gavage orogastrique le microbiote des souris précédentes avant de subir à son tour cinq injections. Le porteur décrit un modèle "pas mortel" et réversible, tout en indiquant qu'il est impossible de soulager ces effets par des antalgiques sans compromettre l'intérêt du modèle animal.
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier l'implication du microbiote dans le développement de l'Athrite Juvenile Idiopathique au travers de la relation hôte-microbiote
Bénéfices attendus
Ce travail doit permettre de mettre en évidence l'implication du microbiote et/ou les groupes bactériens susceptibles d'être impliqués dans le processus d'inflammation chez les personnes souffrant d'Arthrite Juvénile Idiopathique, et ainsi, de mieux comprendre la relation hôte-microbiote dans ce contexte pathologique.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 types d'interventions au cours de projet : 1) 5 injections tous les 2 jours pour les souris conventionnelles avec soit d'ODN 1826 (nom de l'oligomère qui va entrainer un emballement du système immunitaire et reproduire les conséquences métaboliques que l'on retrouve dans l' Arthrite Juvénile Idiopatique) soit de l'eau stérile. ces injections seront réalisées en moins de 30 secondes en intra-péritonéale, sous contention du manipulateur, permettant ainsi l'induction du syndrome d'activation des macrophages caractéristique de l'Athrite Juvénile Idiopathique. 2) les souris axéniques recevront les microbiotes des lots SHAM (lot ayant reçu l'eau stérile) et ODN (lot ayant reçu l'ODN 1826) par gavages orogastriques. 1 seule intervention, en tout début de procédure et d'une durée inférieure à la minute est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés et enfin 3) Des prelèvements de fecès seront réalisés avant implantation du microbiote, 15 jours après l'implantation, et de façon hebdomadaire pendant la durée du projet, cette intervention peut prendre quelques minutes ne fonction de l'animal mais il n'est tenu que le temps de récupération des fecès, soit une dizaine de seconde. 10 jours avant la fin du projet, 5 injections intrapéritonéales seront réalisées tous les 2 jours, en moins de 30 secondes, avec soit l'oligomère, pour les souris des lots ODNi (fecès ODN+ODN 1826), soit avec le véhicule (eau stérile) pour le lot Shami (fecès eau stérile + ODN 1826), enfin 4) les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane pour effectuer le prélèvement d'un maximum de volume sanguin puis seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale., cette intervention est réalisée en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Ce modèle infectieux de stimulation des TLR-9 mime la "tempête" inflammatoire retrouvée chez les patients souffrants d'AJI qui provoque un déréglement globale du système immunitaire, qui n'est pas mortel et qui est réversible quelques jours après l'arrêt des injections. Toutefois, il provoque chez l'animal une perte de poids caractéristique et une fatigue généralisée, de plus malgré la rapidité de l'intervention (une dizaine de seconde), les souris vont subir la douleur liée à l'introduction de l'aiguille en intrapéritonéale et le stress lié à la contention. En ce concerne le modèle de souris à microbiote contrôlé, les effets décrits ci-dessus seront potentiellement retrouvés chez les animaux recevant les injections d'ODN et potentiellement chez les animaux constituant les autres lots. Les animaux subiront également le stress dû à la contention lors du gavage orogastrique bien que cette manipulation ne dure que quelques secondes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’étude des mécanismes de l'Arthrite Juvénile Idiopathique (AJI), plus particulièrement l’implication du microbiote intestinal et la relation dans le développement de la pathologie, ne peut être évaluée que sur un organisme vivant, pris dans sa globalité.
Réduction
Pour le respect de la règle des 3Rs, le nombre de chaque groupe d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour discriminer un effet statistiquement significatif entre les traitements. Les résultats obtenus dans les différents lots seront comparés à l’aide d'un test statistique adapté. Les animaux utilisés sont des souris mâles et femelles conventionnelles et axéniques (nées sans microbiote), ces dernières seront, hébergées dans des isolateurs stériles. Un projet pilote de 20 souris (10 femelles et 10 mâles) sera préalablement réalisé pour valider le modèle au sein de notre établissement utilisateur. 3 séries d’expérimentations seront réalisées sur 1) un modèle murin de stimulation de recepteurs,(les TLR-9) qui jouent un rôle très important dans les réponses immunitaires et qui, dans ce cas, permettent de déclencher le syndrome d'activation des macrophages, désordre immunologique caractéristique de l'Athrite Juvénile Idiopathique puis sur 2) un modèle murin axénique de transplantation du microbiote provenant du premier modèle. Chaque expérience sera constituée de 2 lots de 20 souris conventionnelles (10 femelles et 10 mâles pour chaque lot) - un lot de 20 souris (nommé ODN) recevra une injection d'un l'oligonucléotide (l'ODN 1826) qui se fixe sur TLR-9 déclenchant ainsi l'activation des macrophages - un lot de 20 souris (nommé Sham) qui recevra une injection du seul véhicule de l'ODN 1826 (Eau stérile). Le microbiote de chaque lot sera ensuite transplanté dans 4 lots de 20 souris axéniques (10 femelles et 10 mâles) : - un lot de 20 souris qui recevra le microbiote provenant des souris ODN - un lot de 20 souris qui recevra le microbiote provanant des souris Sham - un lot de 20 souris qui recevra le microbiote provenant des souris ODN plus une injection intrapéritonéale de l'oligomère (nommé ODN injec) - un lot de 20 souris qui recevra le microbiote provenant des souris Sham plus une injection intrapéritonéale de l'oligomère ( nommé Sham injec) Ainsi, 380 souris au total seront utilisés pour ce projet, 140 conventionnelles et 240 axéniques.
Raffinement
le modèle de stimulation des TLR-9 est un modèle communément utilisé pour les études concernant le syndrome d'activation des macrophages caractéristique de l'Arthrite Juvénile Idiopathique (AJI), cependant ce sera la première fois qu'il sera mis en place au sein de notre établissement utilisateur, c'est pourquoi nous souhaiterions, au préalable du projet, réaliser une étude pilote sur un effectif de 20 souris conventionelles C57Bl6 (10 femelles et 10 mâles) répartis selon les lots décrits ci dessus. La réalisation de cette expérimentation pilote nous permettra de valider le modèle, de l'induction aux analyses post mortem, dans notre contexte expérimental. Le modèle de souris à microbiote contrôlé est un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif. La souris est en effet reconnue pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote du donneur. La transfection de microbiote est réalisée, sous contention de quelques secondes, par du personnel formé et expérimenté. Ces modèles infectieux provoquent un déréglement globale du système immunitaire, qui n'est pas mortel et qui est réversible quelques jours après l'arrêt des injections. Toutefois, il provoque chez l'animal une perte de poids caractéristique et une fatigue généralisée. Il est cependant impossible de réduire ces effets par l'emploi d'antalgiques sans compromettre l'intêret du modèle animal. Dautre part, lors de l'étape de transfection et comme pour tout projet d'expérimentation réalisé au sein de l'établissement utilisateur, les animaux utilisés feront l’objet d’une surveillance quotidienne sur le temps d'implantation du microbiote (15 jours) pour détecter tout signe d'inconfort, de douleur, de détresse ou d'angoisse pour le réduire, le soulager, le supprimer. Dès l'apparition de ces signes, l'arbre décisionnel joint sera suivi et, à cette étape, l'animal pourra être sorti du projet sans euthanasie pour une phase de récupération sous protocole de soin visé par le vétérinaire.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des souris femelles et mâles C57BL6 âgés de 6 à 7 semaines conventionnelles ou axéniques. Le modèle de stimulation des TLR-9 est un modèle communément utilisé pour les études concernant le syndrome d'activation des macrophages caractéristique de l'Arthrite Juvénile Idiopathique (AJI). Ce modèle infectieux mime la "tempête" inflammatoire retrouvée chez les patients souffrants d'AJI. Le modèle de souris à microbiote contrôlé est communément utilisé pour les études concernant le tube digestif. L'animal est, en effet reconnu, pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote du donneur. Pour le modèle de stimulation des TLR-9, les souris seront âgés de 8 semaines au moment de l'injection de l'ODN1826. Pour le modèle de transfection fécale chez la souris axénique, les animaux seront âgés de 8 semaines. Pour les 2 modèles, ce stade de développement, jeune adulte, est optimal pour permettre une bonne reproductibilité de l'induction du syndrome d'activation des macropahges et bonne implantation des microbiotes transplantés.
Comparaison de deux méthodes pour étudier la fonction gastro-intestinale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Le gavage par sonde gastrique remplacé par une bille sucrée à avaler seule, 48 souris vont être utilisées pour comparer les deux méthodes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chacune est mise à jeun douze heures à deux reprises, isolée six heures à deux reprises, contentionnée et gavée, et subit une biopsie de l'oreille. Toutes sont tuées à la fin pour prélèvement d'organes. Le porteur inscrit ce travail dans une démarche d'amélioration du bien-être des animaux non-humains, et affirme qu'il est "indispensable" de décrire au préalable la méthode la moins invasive.
Objectifs
La motilité gastro-intestinale (GI) est un processus physiologique complexe permettant la progression des aliments dans le tube digestif. Ce mécanisme est essentiel pour assurer les fonctions GI. Des perturbations de cette motilité sont fréquemment observées dans les maladies GI mais pas seulement. Actuellement, les expériences de mesure du transit intestinal chez les souris de laboratoire constituent le principal modèle d’étude pré-clinique pour la motilité intestinale. Ces études se basent sur des expériences au cours desquelles les animaux ingèrent un composant coloré, puis sont observés jusqu’à obtention de la première fécès colorée. Dans la majorité des cas, l’ingestion du composant coloré se fait par gavage à l’aide d’une sonde gastrique. Cela nécessite de contentionner correctement l’animal et de maitriser le geste nécessaire à l’insertion de la sonde. Ces manipulations sont généralement sources de stress pour l’animal et pour l’expérimentateur. Il semble cependant possible de s’affranchir de ces contraintes, en fabriquant (à partir de rouge carmin, d’agar et de sucrose) des croquettes que les souris vont manger spontanément. L’objectif du projet est de comparer les résultats obtenus et leur reproductibilité en fonction de la méthode utilisée (gavage gastrique ou prise spontanée), et de déterminer si la prise spontanée peut se substituer au gavage par sonde.
Bénéfices attendus
Si les données en prises spontanées sont fiables et reproductibles, ce projet permettra de s’affranchir des contraintes liées au gavage gastrique par la suite. Ce projet s’inscrit dans la démarche d’amélioration du bien-être animal.
Procédures
Les animaux seront soumis à: mise à jeun (2 fois, 12h) ; contention et gavage (1 fois, moins d'une minute) ; un isolement (deux fois, 6h). La biopsie est un geste qui consiste à prélever un petit morceau de tissu, ici au niveau de l’oreille.
Impact sur les animaux
Risque (faible) l'inflammation/infection consécutif à la biopsie : traitement local Risque de fausse route lors du gavage : mise à mort immédiate de l'animal Stress lié à la contention et à l'isolement Perte de poids lié à la mise à jeun
Devenir
A l'issue de projet, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
De nombreuses pathologies présentent des deficits au niveau du transit intestinal. Les modèles de ces pathologies sont majoritairements des modèles souris. C’est pourquoi afin d’utiliser ce symptome comme marqueur d’efficacité dans les traitements pré-cliniques il est indispensable d’en d’écrire au préalable la méthodologie la plus appropriée et la moins invasive pour aller mesurer la durée du transit.
Réduction
Les animaux utilisés pour ce projet sont issus du surplu d’animaux sains obtenus dans les croisements nécessaires à l’obtention d’animaux expérimentaux dans d’autres projets menés. Afin de diviser par deux notre nombre d’animaux nécessaire nous avons choisis de mesurer la durée du transit avec les deux méthodes pour chaque animal. Les données obtenues feront l’objet d’une évaluation statistique préliminaire. A ce moment là, si la différence est suffisament importante et montre une différence statistique nous n’augmenteront pas le nombre d’animaux à passer en expérimentation.
Raffinement
L’hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l’expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées au maximum par 5 dans des cages enrichies (litière, dôme et bandelettes en carton) avec nourriture et eau ad libitum, dans une pièce thermo-contrôlée en alternance jour/nuit. La manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress. Une période d’habituation à l’expérimentateur est prévue. En parallèle, l'état général de nos animaux ainsi que l'état de la cage, de la nourriture et de l'eau seront surveillés quotidiennement. Le rouge carmin est un colorant non toxique utilisé chez l’homme pour étudier la durée du transit intestinal en médical. Nous avons mis au point un système de vidéo pour surveiller les animaux à distance sans avoir à les déranger lors de l’expérimentation. Suite à la restriction de nourriture durant 12h, une attention particulière sera portée sur le poids des animaux dans les jours qui suivent la session de mesure du transit. Pour ce projet, des points limites stricts et spécifiques ont été définis. En cas de besoin, des antalgiques de type anti inflammatoires pourront être administrés aux animaux.
Choix des espèces
De nombreuses pathologies présentent des deficits au niveau du transit intestinal. Les modèles d’études de ces pathologies sont souvent des modèles souris. C’est pourquoi afin d’utiliser ce symptome comme marqueur d’efficacité dans les traitements pré-cliniques il est indispensable d’en d’écrire au préalable la méthodologie la plus approprié pour aller mesurer la durée du transit. Aucun modèle in vitro ne permet de décrire la motilité intestinale dans sa physiologie complète. Les animaux seront utilisés à 50 jours de vie et à 100 jours de vie. Nous avons opté pour un stade juvénile et un stade adulte car la physiologie animale change entre ces deux périodes de vie et il est possible que nous observions des différences. De plus les symptômes gastro-intestinaux ne s’exprimment à différents stades suivant la pathologie. De ce fait, nous choisissons de couvrir les deux stades majeurs.
Effet d’un apport en oligosaccharides du lait sur le développement du système immunitaire et du microbiote intestinal des porcelets
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Tués à la fois pour analyser leur intestin et parce qu'ils auront consommé un ingrédient interdit en alimentation porcine, 48 porcelets sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent chaque jour pendant treize jours cinq millilitres d'eau enrichie en oligosaccharides, maintenus immobiles jusqu'à cinq minutes, puis subissent une prise de sang à dix-neuf jours, couchés sur le dos. Quatre truies reçoivent une injection d'hormone pour un prélèvement de lait, leurs porcelets étant séparés d'elles quarante minutes avant, et huit porcelets supplémentaires servent à l'entraînement des manipulateurs avant de rester dans l'établissement avec les truies. Le porcelet est retenu comme espèce cible parce que ses troubles digestifs d'élevage sont traités aux antibiotiques, l'objectif final étant de concevoir pour la filière un aliment premier âge enrichi.
Objectifs
Les oligosaccharides du lait sont des composés spécifiques du lait, formés de quelques molécules de sucres simples et présentant une grande diversité de structure. Ils ne sont pas digérés par les jeunes mammifères mais utilisés par leurs bactéries intestinales. Dans l’espèce humaine, ils peuvent avoir des effets bénéfiques sur le microbiote intestinal des bébés (effet prébiotique), contre des pathogènes, bactéries, virus et parasites (effet anti-adhésion) et sur l’activité des cellules intestinales épithéliales et immunitaires. Leurs effets dépendraient de leur structure. Certaines préparations infantiles sont désormais enrichies en oligosaccharides du lait. Chez les animaux d’élevage, leurs bénéfices sont peu ou pas connus. En élevage porcin, les porcelets sont très susceptibles aux troubles digestifs, dont les diarrhées, qui sont généralement traités par des antibiotiques. Dans l’enjeu de réduire l’usage des médicaments en élevage et d’améliorer le bien-être des animaux, il est impératif de développer des stratégies préventives qui permettent d’améliorer la santé des porcelets. Dans ce contexte, le projet vise à valider les effets de deux oligosaccharides du lait sur le microbiote intestinal, le système immunitaire intestinal et la santé de ces porcelets. Les porcelets seront allaités normalement par leur mère et recevront la supplémentation par voie orale de 8 à 20 jours d’âge. Les deux oligosaccharides sont choisis sur la base de la littérature scientifique et d’études préalablement menées in vitro.
Bénéfices attendus
Le principal résultat attendu est de valider l'effet bénéfique de deux oligosaccharides du lait sur les porcelets. Nous montrerons in vivo la capacité d'une supplémentation en oligosaccharide à modifier le microbiote et les cellules immunitaires intestinales des porcelets. En outre, nous attendons des effets différents des deux oligosaccharides car ceux-ci diffèrent en structure. Nous montrerions alors pour la première fois l’importance de la structure des oligosaccharides du lait dans le développement de la communauté bactérienne intestinale des porcelets. Pour la filière porcine, nos résultats pourraient conduire à la conception d'un aliment premier âge pour porcelet allaité qui serait enrichi en oligosaccharides bénéfiques, aliment qui permettrait de réduire les problèmes digestifs des porcelets notamment au sevrage, une phase critique en élevage.
Procédures
Quarante-huit porcelets recevront 5 ml d’eau enrichie ou non en oligosaccharide par voie orale, quotidiennement pendant 13 jours, et subiront une prise de sang à 19 jours. Huit autres porcelets recevront 5 ml d’eau une fois par jour pendant 3 jours. L’administration de liquide dure 5 minutes au maximum. La prise de sang correspond à 5 minutes de contention maximum dont 2 minutes maximum pour le prélèvement. Quatre truies seront soumises à un prélèvement de lait à 7 et 19 jours de lactation, avec une injection d’hormone (1 fois, quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances des 48 porcelets sont liées au traitement quotidien et aux prélèvements. L’administration dans la gueule de 5 ml de liquide n’entraîne pas de douleur mais entraîne un stress lié à la nécessité d’immobiliser les porcelets pendant 5 minutes au maximum. La prise de sang nécessite d’immobiliser les porcelets sur le dos pendant 5 minutes au maximum et elle engendre la douleur d’une piqure. Les 8 autres porcelets subiront le stress de la contention lors de l’administration d’eau. Le prélèvement de lait à la truie nécessite de séparer les porcelets de la truie pendant 40 minutes avant le prélèvement. Il nécessite aussi une injection d’hormone pour induire l’éjection du lait, ce qui engendre la douleur de la piqure à la truie.
Devenir
48 porcelets seront mis à mort afin d'étudier les effets des traitements sur la flore et le système immunitaire de leur intestin et parce qu'ils auront consommé un ingrédient non autorisé en alimentation porcine. 8 autres porcelets n’ayant pas reçu d’oligosaccharides et les 4 truies, tous soumis à une procédure de sévérité légère, poursuivront leur carrière dans l'établissement utilisateur.
Remplacement
En préalable à ce projet, des études in vitro ont été menées pour comparer les effets de plusieurs oligosaccharides du lait sur des bactéries intestinales porcines. Elles nous ont permis de sélectionner deux oligosaccharides efficaces pour stimuler la croissance et l’activité métabolique de certaines bactéries in vitro. Le projet a pour objectif de valider in vivo l’effet bénéfique de ces deux oligosaccharides sur la flore intestinale des porcelets et d’étudier les conséquences sur leur système immunitaire intestinal et leur santé. L’enjeu finalisé est le développement d’un aliment pour porcelet allaité. Ces objectifs nécessitent d’utiliser des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux prévus est de 60. Huit porcelets seront nécessaires pour que les intervenants s’entraînent à la supplémentation orale, à raison de 4 porcelets par binôme d’intervenants répétés sur 3 jours. Les 52 autres animaux sont 4 truies et 48 porcelets. Le nombre de 48 porcelets (16 par lot expérimental) tient compte des pertes potentielles pendant la lactation en élevage (porcelet écrasé par sa mère ou malade). Il garantit d’avoir au final 12 porcelets par lot, nombre suffisant et nécessaire pour identifier des effets. Ce choix est basé sur nos expériences précédentes, validées. Les modèles statistiques prévus permettront de mettre en évidence des effets significatifs entre les différents traitements s'il y en a, sur les paramètres étudiés au niveau intestinal et sanguin. Dans l’établissement utilisateur, chaque truie met bas en moyenne 16 porcelets nés vivants et en allaite au moins 12 ; 4 truies permettent donc d’étudier 48 porcelets.
Raffinement
Les procédures seront réalisées en respectant des points limites afin de réduire la souffrance et la douleur des animaux. Les mesures de raffinement consisteront à réduire le plus possible l’intensité et la durée de la douleur ou du stress que peuvent engendrer les interventions. La durée de contention des porcelets sera limitée à 5 minutes pour l’administration orale des traitements et la prise de sang. La prise de sang sera stoppée au bout de 2 minutes. Les porcelets seront particulièrement surveillés après cette prise de sang. Lors de la séparation des porcelets de la truie avant le prélèvement de lait, les porcelets seront placés dans une caisse laissée à proximité de leur mère afin de réduire le stress des porcelets et des mères. Les porcelets sont remis avec leur mère dès la fin du prélèvement
Choix des espèces
Le porc est l’espèce cible du fait des problèmes digestifs fréquemment rencontrés par les porcelets en élevage. Ces problèmes sont traités par des médicaments et peuvent entraîner la mort dans les cas les plus sévères. Une supplémentation en oligosaccharide du lait des aliments premier âge pour porcelets allaités pourrait être une solution préventive à ces problèmes. Le stade choisi pour les porcelets, entre 7 et 20 jours d’âge environ, est la période où commence à s’établir leur microbiote et leur système immunitaire intestinal. C’est donc la période adéquate pour essayer d’augmenter la santé intestinale afin de préparer les porcelets au sevrage qui a lieu entre 3 et 5 semaines en élevage conventionnel. Le stade choisi pour les truies, de 7 à 20 jours de lactation, correspond à la période d’allaitement des porcelets expérimentaux.
Etudes du métabolisme et du comportement au cours du vieillissement de la souris (Etablissement utilisateur 2/2)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié d'entre elles passant dix-huit mois sous régime gras avant d'être transportées vers un second établissement pour y subir jusqu'à six tests de comportement. Dans le premier site, elles sont pesées sept fois, injectées, gavées, prélevées à trois reprises, mesurées trois fois pour leur masse grasse et isolées quarante-huit heures en cage individuelle. Les tests portent sur l'anxiété, l'activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices et les capacités physiques, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une avancée potentielle en connaissances et l'identification de cibles pour de futurs médicaments, quand la certitude porte sur dix-huit mois de régime imposé et sur la mise à mort finale pour analyse histologique.
Objectifs
Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladies du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Il étudie aussi l'impact du vieillissement biologique dans la survenue des pathologies avec l'âge et le déclin des fonctions physiques et cognitives. Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes au cours du vieillissement - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme (vieillissement biologique). Le projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet aboutira à une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ Dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques de protéines, notamment mitochondriales impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique, sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes du métabolisme lipidique et glucidique et de régulation de la fonction mitochondriale, et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, - Comprendre l'impact du vieillissement sur le fonctionnement des organes, 2/ Dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l’homme: - Identifier des voies de signalisation et cibles thérapeutiques du métabolisme énergétique et lipidique, visant au développement de futurs médicaments.
Procédures
Dans le premier établissement, la moitié des animaux (souris) seront mis sous régime gras pendant 18 mois. Ils subiront, des pesées (7 fois, 30 sec), une injection (5 sec), un gavage (30 sec) et des prélèvements à 3 reprises (5 sec à 3 min), une mesure de la composition corporelle en matières grasses à 3 reprises (4min) et une mesure de la dépense énergétique où l’animal est hébergé seul (1 fois pendant 48h). Dans le second établissement, ils subiront jusqu’à 6 tests de comportements (durée 6min à 30min) afin d’évaluer l'anxiété, l’activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices, et les capacités physiques de l’animal.
Impact sur les animaux
Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Le changement de régime alimentaire peut induire un stress à l'animal (degré modéré). La faim est une nuisance pouvant survenir lors de la mise à jeun des animaux (degré léger). La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux à l'occasion des prélèvements (degré léger à modéré), ou de leur isolement dans certaines procédures (degré léger). La peur et le stress peuvent aussi survenir lors la découverte de nouveaux environnements (degré léger), ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant prélèvement (degré léger à modéré). D'autres nuisances sont la douleur à l'injection (degré modéré), lors des prélèvements (degré léger à modéré), ou à l'occasion de certains tests comportementaux (degré léger à modéré).
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort à des fins d’analyse et d’études histologiques.
Remplacement
Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques En parallèle,des tests de culture cellulaire sont à l'étude pour étudier des mécanismes précis et limiter le nombre d'animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur la base de nos études antérieures ou de la littérature correspondante. Dans ce contexte, le nombre d’animaux utilisé dans chaque groupe étudié sera suffisant pour réaliser les analyses statistiques. De plus, plusieurs données scientifiques pourront être obtenues avec un même animal ce qui réduira le nombre d'animaux dans le projet.
Raffinement
Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre : - les moyens pour limiter le stress aux animaux seront appliqués: avant les expériences, les animaux seront manipulés et habitués à l’expérimentateur afin de favoriser leur coopération dans les actes non invasifs et non douloureux. Ils seront acclimatés aux différentes conditions expérimentales (pièce, hébergement individuel, et différents expérimentateurs). Les expériences seront réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs. - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur. - des anesthésiques et analgésiques seront utilisés dans les procédures en terminal. Un transporteur agréé pour le transport d'animaux sera réquisitionné. La durée du transport entre les établissements utilisateurs n’excèdera pas les 30 minutes. Les animaux seront transportés dans leur cage d'origine (enrichissement compris) afin de limiter le stress lié au transport. Des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis, - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits, - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après les actes quand c'est nécessaire (application d’un désinfectant et d’une pommade cicatrisante en cas des blessures superficielles sur la peau) , - la mise en place de procédures de mise à mort quand c'est nécessaire.
Choix des espèces
La finalité du projet est d'identifier les effets de la mutation de protéines, notamment mitochondriales, impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique et le vieillissement. Ainsi, il est indispensable de travailler sur l’animal entier pour comprendre le rôle de ces protéines. Le choix du modèle souris vient du fait que celui-ci offre de larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Il est possible, grâce à ce modèle, d’invalider l’expression des protéines étudiées dans ce projet, et ainsi d'évaluer leur rôle. Nous disposons de lignées murines transgéniques sur ces protéines pour réaliser notre projet. Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides et des glucides sur ce modèle animal. Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'athérosclérose et de la maladie du foie (inflammation et stéatose) sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour démarrer le régime dans les études portant sur l'étude du métabolisme ou de l'athérosclérose. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris et l'impact du régime alimentaire sur l'altération des fonctions au cours du vieillissement de l'animal. Dans les articles scientifiquement, le vieillissement chez la souris, est classiquement étudié chez des souris âgées de 12 à 18 mois.
Implication de la Phosphatidyléthanolamine (PE) du macrophage dans le développement de l’inflammation systémique associée au syndrome métabolique dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées avec de la moelle osseuse modifiée, laissées plusieurs mois, avant huit à vingt-quatre semaines de régime enrichi en graisses, en cholestérol et en sucre destiné à provoquer obésité, résistance à l'insuline, maladie du foie et athérosclérose. Suivent des mises à jeun, cinq microprélèvements de sang à la queue par test, des tests de tolérance au glucose et aux lipides sur animal vigile, et pour une partie une échographie cardiaque sous anesthésie. Les retombées annoncées se limitent à envisager un lipide comme marqueur de risque et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, quand l'obésité provoquée, elle, est immédiate. Le porteur affirme que le dialogue entre organes ne peut pas s'étudier en culture cellulaire et que le projet ne s'envisage qu'à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Les maladies métaboliques telles que l’obésité sont caractérisées par des désordres touchant le métabolisme énergétique, et notamment des lipides. Elles sont fréquemment associées à des complications cardiaques et vasculaires. L’accumulation de lipides dans la paroi des artères est une conséquence fréquente qui peut conduire à des accidents vasculaires comme la crise cardiaque. Elle est associée à d’autres troubles comme l’obésité, le diabète, le cholestérol ou la maladie du foie gras. Ces maladies touchent plusieurs organes et doivent être étudiées de façon globale afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués. Parmi les mécanismes suggérés dans la littérature scientifique, une modification de certaines cellules immunitaires pourrait avoir un rôle important. Parmi ces éléments, un lipide essentiel pourrait être crucial. Cependant, le mécanisme d’action n’est pas compris pour le moment. Nous souhaitons donc dans ce projet bloquer la production de ce lipide essentiel uniquement dans les cellules immunitaires identifiées comme importantes afin d’identifier les mécanismes que ce lipide contrôle, notamment dans la progression des troubles qui sont associés à l’obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence les mécanismes associés à l’émergence des maladies liées à l’obésité et aux troubles métaboliques qui en découlent tels que l’athérosclérose ou l’insulino-résistance, et plus particulièrement d’identifier un lipide clé des macrophages dans ce processus. Cette étude nous permettra de comprendre l’importance de la dérégulation de l’homéostasie lipidique des macrophages dans le développement des maladies cardiométaboliques et d’explorer les dialogues inter-cellulaire et inter-organes. L’ensemble de ces données permettra d’envisager ce lipide comme un marqueur pertinent, et ainsi d’identifier et de stratifier des populations humaines potentiellement à risque et finalement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux impliqués dans ce projet seront soumis à une greffe de moelle osseuse qui implique une irradiation préalable (moins de 15 min) et une injection de cellules de moelle modifiées, sous anesthésie (5 min). Après plusieurs mois de repos pour que la greffe ait bien prise, les souris seront mises en présence d’un régime riche en graisses et en sucre pour une durée de 8-24 semaines. Avant et après régime, sur les souris vigiles nous évaluerons la masse grasse ce qui nécessite une courte contention (moins de 5 min), et elles seront testées par un faible prélèvement de sang sous anesthésie. A la suite du régime riche en graisse, les souris seront mises à jeun et rapidement évaluées sur le plan métabolique (moins de 2 h). Les réponses des souris à une ingestion de sucre ou de graisse seront alors évaluées grâce à de très faibles prélèvements de sang à la queue (5) sur de courtes périodes (moins de 2h). De même, la réponse des souris à l’insuline, afin d’estimer un potentiel diabète, sera réalisé selon la même procédure (2h). Afin que les évaluations soient fiables, les animaux seront vigiles et libres de leurs mouvements. De même, les évaluations seront distribuées équitablement afin d’éviter toute fatigue. Le comportement des animaux sera mesuré sur plusieurs jours grâce à des cages munies de divers capteurs. Enfin, une partie des animaux sera évaluée sur le fonctionnement du cœur par une échographie et un électrocardiogramme. Ceci sera réalisé sous anesthésie afin de garantir l’immobilité des souris et la qualité des images sans stresser l’animal. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet.
Impact sur les animaux
Les souris seront exposées à des régimes riches en graisses, en cholestérol, et en sucre pendant plusieurs semaines (8 à 24) afin d’induire une obésité et de provoquer les désordres métaboliques qui lui sont associée : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, maladies du foie non alcoolique, troubles du rythme, athérosclérose, troubles du rythme cardiaque…. Ces régimes pourraient induire un inconfort et une difficulté de déplacement dus à l’obésité développée. L’injection de progéniteurs de moelle-osseuse aux souris pourrait induire une douleur de courte durée et un risque d’hématome ou d’hémorragie. De plus, les souris seront soumises à un phénotypage métabolique qui inclus un jeûne non-strict de quelques heures ce qui peut engendrer une sensation de faim chez l’animal. Les injections pour le test de sensibilité à l’insuline et l'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose et un le suivi de glycémie (ou lipides) associé avec des prélèvements sanguins de faible volume pourront induire un stress et une douleur légère de courte durée. L'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose ou de lipide pour le test de tolérance aux lipides pourrait induire des microlésions et des irritations.
Devenir
Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins pour répondre à la question (ou aux objectifs) scientifique de ce projet.
Remplacement
Le dialogue inter-organes (coeur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (macrophages/hépatocytes ou adipocytes) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires. Ainsi l’impact induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, l’altération de la fonction des cellules immunitaires dans un organe peut avoir un écho profond dans des organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués
Réduction
Le projet impliquera 560 animaux au total. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre d’évaluations à réaliser, et donc le nombre d’animaux requis. La composition et la durée du régime riche en graisse utilisé ici sera déterminée par les résultats d’une étude pilote en cours. Cette méthode nous permet ainsi d’assurer avec un faible nombre d’animaux le succès de ce projet et une utilisation rationnée et réduite au strict nécessaire.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel ou à 30 degrés Celsius est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les greffes et les explorations cardiaques seront réalisées sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux. Les animaux seront vérifiés quotidiennement et un suivi régulier du poids sera effectué afin de s'assurer du bien-être des animaux. Pour faciliter l'alimentation, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage en cas de nécessité. Conformément à la réglementation, les actes techniques seront réalisés par du personnel formé et compétent pour respecter le bien-être animal et diminuer leur stress. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris constitue le modèle privilégié pour l’étude des mécanismes impliqués dans la pathophysiologie des maladies métaboliques : la souris est le mammifère le moins évolué qui développe rapidement des maladies métaboliques similaires à l’Homme. L’analyse de l’athérosclérose requiert une modification du métabolisme lipidique et une altération de la communication inter-organes. Nous utiliserons une lignée de souris qui présente un métabolisme lipidique plus proche de ce que l’on peut observer chez l’Homme. Des souris âgées de 10 à 12 semaines, un âge auquel elles sont suffisamment matures pour supporter la transplantation, seront utilisées. Les régimes obésogènes seront mis en place à l'âge de 12 à 16 semaines, afin de laisser le temps aux souris de récupérer de leur transplantation.
Effets de différentes matrices laitières sur l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale après un stress de séparation maternelle.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Comparer l'effet de plusieurs matrices laitières fermentées sur la barrière intestinale suppose ici de séparer des ratons de leur mère trois heures par jour, à heure fixe, pendant quinze jours. 495 rats vont être utilisés, mères et petits, tous tués à l'issue pour prélever l'intestin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les ratons reçoivent en plus un gavage quotidien pendant dix jours, geste dont le porteur reconnaît qu'il peut irriter le tube digestif, et la séparation maternelle peut leur faire perdre du poids. Le porteur indique que ce modèle a déjà été conduit avec le même partenaire industriel et que les produits fermentés font l'objet d'une "attention sociétale" pour leurs propriétés bénéfiques.
Objectifs
Le syndrome de l’intestin irritable est une maladie intestinale chronique impliquant des facteurs génétiques, environnementaux, nutritionnels. Chez les patients souffrant de ce syndrome sont observés des altérations de la barrière intestinale, une faible inflammation et des modifications de la flore bactérienne intestinale. Un stress psychologique chronique précoce comme le stress de séparation maternel induit des modifications de la fonction barrière de l’intestin durables et il est reconnu comme un important facteur de risque impliqué dans l’initiation et l’aggravation de symptômes du syndrome de l’intestin irritable. Des matrices laitières fermentées à base de lait de vache peuvent fournir un large nombre de peptides à action biologique bénéfique dans le tractus gastro-intestinal. Certains peptides peuvent agir sur les cellules productrices de mucus jouant un rôle crucial dans la protection de la barrière intestinale. De manière intéressante, il a été montré qu’un peptide à action bénéfique issu d’une matrice laitière fermentée était capable d’interagir avec les cellules intestinales en préservant l’équilibre intestinal et par conséquent de prévenir des effets néfastes dans un modèle expérimental de stress précoce. L’objectif de ce projet de recherche est d’évaluer et comparer les effets d’une consommation orale chronique de différentes matrices laitières fermentées (à base de lait de vache) contenant ce peptide et issues de technologie différentes, chez des jeunes rongeurs sur l’altération de la barrière intestinale ex-vivo induite par le stress de séparation maternel. Cette étude pré-clinique permettrait à terme d’identifier des matrices capables de réduire les perturbations intestinales et de proposer des solutions thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les produits fermentés font l objet d'une attention sociétale du fait des propriétés bénéfiques pour la santé humaine. Leurs bénéfices potentiels pour la santé reposent sur l'apport des micro-organismes qui atteignent vivants l'intestin ou par l 'apport de métabolites spécifiques issus de l'activité des ces micro-organismes. Ce projet doit permettre d’identifier des matrices laitières intéressantes dans protection de la barrière intestinale dans un modèle de fragilisation de celle-ci qui reproduit les mêmes caractéristiques que le syndrome de l’intestin irritable . Ces travaux visent à développer des traitements préventifs et thérapeutiques pour ce syndrome.
Procédures
Les animaux recevront par voie orale, des matrices laitières ou du sérum physiologique à une fréquence de 1 fois par jour pendant 10 jours. Les gestes de l’administration orale sont de courte durée, (approximativement 30 sec) effectués par l’agent expérimenté en charge de ces études. Les ratons seront soumis au stress de séparation maternelle trois heures par jour sur une période de 15 jours à heure fixe le matin (9h-12h) puis replacés par portée avec leur mère respective.
Impact sur les animaux
Des nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être : une mobilité réduite liée à la préhension pour le gavage, geste d’une durée inférieur à 1 minute ainsi qu’une douleur ou irritation du tube digestif d’administration. Le stress de séparation maternelle d’une durée de trois heures pendant quinze jours pourrait engendrer une perte de poids des ratons.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer des prélèvements de tissus post-mortem pour différentes analyses et dosages.
Remplacement
Le Syndrome de l 'intestin irritable est une pathologie dont l'origine est méconnue et dont la physiopathologie est complexe (ex. dysfonctionnement de l’axe intestin-cerveau, augmentation de la perméabilité intestinale, altération de la flore intestinale etc..), par conséquent, il n’est pas possible de reproduire cette pathologie en recherche pré-clinique sur un modèle in vitro. Ainsi dans l’objectif de tester des traitements en l’occurrence des matrices laitières sur les paramètres le plus caractéristiques pour cette pathologie comme l’altération de la barrière intestinale, le modèle animal semble l’approche la plus appropriée pour l’obtention de résultats transposables à l’homme.
Réduction
L’amélioration de la performance pour le bien-être animal acquise par les études précédentes a abouti à une réduction de la mortalité chez les ratons et permet l'utilisation du nombre d’animaux utilisés au plus juste. Le nombre calculé nécessaire, basé sur des études antérieures en prenant compte la variabilité inter-individuelle est de 10 animaux par groupe pour cette étude. Il a été calculé à l'aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Pour assurer une fiabilité des résultats et limiter le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière sera accordée au bien-être de l’animal (contrôle de l’environnement, respect du cycle jour nuit). A leur arrivée les animaux seront hébergés individuellement au calme et surveillés pendant une période d’acclimatation (7 jours). L’acclimatation permet de récupérer du stress lié au transport et de s’adapter aux nouvelles conditions de vie. Ce n’est qu’à l’issue de cette période que les animaux seront inclus dans l’étude. Dans le but d’améliorer le bien-être de ces animaux captifs, des bûchettes en peuplier et des nids de cellulose seront disposés dans chaque cage. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée pour détecter à temps toute anomalie et minimiser la durée de toute souffrance constatée. Toute souffrance, toute détresse ou tout inconfort réels ou potentiels des animaux seront minimisés ou soulagés par le choix de points limites les plus précoces et compatibles avec notre objectif scientifique recherche.
Choix des espèces
La souche de rat utilisée présente une bonne analogie physiologique intestinale et pharmacologique avec celle de l’homme et est utilisé pour étudier les mécanismes impliqués dans le Syndrôme de l 'intestin irritable. Nous utiliserons cette espèce qui a fait l’objet d’études précédentes menées dans notre équipe (soumises à autorisation de projet) avec ce partenaire industriel et qui ont permis une bonne connaissance et conduite de ce modèle de stress de séparation maternelle. Le modèle de stress de séparation maternelle implique l’utilisation de femelles gestantes et de leurs descendants mâles et femelles en période néonatale, 5 jours après leur naissance et l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale sera étudiée à l'issue du 24 ème jour de naissance, après euthanasie à partir de prélèvements intestinaux.
Etude de l’impact de la protéine HBSP du Virus de l’Hépatite B, exprimée dans son contexte génomique, sur l’immunopathogenèse hépatique chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever foie et rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral porteur du génome de l'hépatite B leur est injecté dans une veine, puis, selon les groupes, elles reçoivent deux fois par semaine pendant quatre semaines un produit provoquant une fibrose du foie, une injection unique déclenchant un cancer du foie, ou des anticorps détruisant une partie de leurs cellules immunitaires. Certaines subissent ces injections dès quinze jours de vie. Le porteur écrit que ces atteintes hépatiques entraînent des nuisances "inexistantes ou minimes", et affirme que le modèle murin est "indispensable" puisque aucun modèle in vitro, même un organoïde multicellulaire, ne reproduit les échanges entre le foie et le système immunitaire.
Objectifs
L'infection par le Virus de l'hépatite B (VHB) a touché plus d'un milliard de personnes dans le monde et est responsable d'infection chronique pour 250 millions de personnes, aujourd'hui. Ces infections chroniques peuvent conduire à la cirrhose et au cancer du foie. Environ un million de personnes décèdent tous les ans de cette infection virale. Il est donc essentiel de comprendre cette maladie virale afin de développer de nouvelles approches théraputiques. Notre projet de recherche basé sur nos précédents travaux, porte sur l'impact de l'expression d'un des gènes du VHB sur la pathogenèse hépatique et notamment en modulant la réponse immunitaire. Nous souhaitons évaluer le rôle de ce gène viral et les mécansimes associés en utilisant des virus complets ou délétés sur ce gène. Le modèle murin est indispensable pour évaluer les nombreuses interactions existantes entre les cellules du foie infectées et les cellules de l'environnement hépatique dont les cellules immunologiques. Cependant, le modèle murin n'étant pas infectable par le VHB. C'est pourquoi, nous avons généré des vecteurs viraux modifiés génétiquement qui sont d'une part, capables d'infecter le foie des souris et d'autre part, d'exprimer soit le génome complet soit un génome partiel du VHB. Ces vecteurs viraux et les modèles murins nous permettront ainsi d'évaluer l'impact d'une des protéines virales sur la pathogenèse hépatique et de déterminer le rôle de la réponse immunitaire dans cette progression.
Bénéfices attendus
Nos données acquises nous éclairerons sur la pathogenèse hépatique et le risque de développement du cancer du foie associé à une infection par le virus de l'hépatite B (VHB). Elles pourraient conduire à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant l'infection par le VHB et des complications hépatiques associées chez les patients infectés par le VHB.
Procédures
Le transfert du génome du virus de l'hépatite B (VHB) sera réalisé après anesthésie (par injection pendant 5-10 secondes par voie intra-péritonéale) sur l'ensemble des souris incluses. Ce transfert sera réalisé par une unique injection par voie intra-veineuse (injection de 5-10 secondes). Parmi ces animaux, un groupe de souris vigiles sera soumis à une injection intra-péritonéale (5 à 10 secondes) deux fois par semaine pendant 4 semaines d'un réactif générant une fibrose hépatique. Un autre groupe également vigile sera soumis à une injection unique intra-péritonéale (5 à 10 secondes) d'un réactif générant un cancer du foie. Un troisième groupe de souris vigile aura été pré-immunisé par une injection intra-veineuse unique (de 5 à 10 secondes). Un dernier groupe de souris vigiles subira une déplétion de sous-population de cellules immunitaires par injections d'anticorps par voie intra-péritonéale (5 à 10 secondes) deux fois par semaine pendant 1 à 2 semaines. Au cours de cette étude, nous serons également amenés à prélever du sang (1 à 5 minutes). Le nombre de prélèvement de sang varie de 1 à 2 selon le temps d'expérimentation (de 7 semaines à 6 mois) de chaque procédure. Les animaux seront anesthésiés avant ce prélèvement de sang. A la fin de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L'anesthésie des animaux pourrait engendrer un stress thermique. L’induction des pathologies hépatiques sont bien connues et ont montré des nuisances légères ou modérées de l'atteinte hépatique. La manipulation des souris, en particulier les injections, peuvent induire un stress et pourraient conduire à une douleur légère de courte durée au site d'injection au moment du geste. L'administration de différentes drogues pourrait induire une inflammation, une fibrose et un cancer hépatique. Néanmoins, compte tenu des court temps expérimentaux effectués et/ou du faible impact de certaines des drogues utilisées, les nuisances cliniques seront inexistantes ou minimes. Ils pourraient éventuellement générer quelques troubles digestifs transitoires et rapidement réversibles. Les prélèvements sanguins pourraient être source de stress au moment de l’anesthésie et conduire à des saignements/hématomes.
Devenir
Pour l’ensemble des animaux inclus dans ce projet, l'euthanasie est requise afin de prélever des échantillons biologiques (foie, rate,...) pour permettre de réaliser de nombreuses analyses expérimentales post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) et, ainsi, répondre à la question scientifique posée. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux par une méthode réglementaire.
Remplacement
De précédents résultats effectués sur des hépatocytes primaires humains (PHH) in vitro suggèrent un rôle du VHB dans le recrutement et l'activation des différents intervenants du système immunitaire intra-hépatique. La mise en place d'un modèle in vitro récapitulant la réponse immunitaire innée et acquise, le recrutement des cellules de la moelle osseuse, ainsi que les interactions entre le foie et le système digestif (interactions essentielles à la pathogenèse hépatique) n'est pas réalisable à ce jour in vitro, même dans un modèle d'organoïdes multicellulaires. C'est pourquoi il est nécessaire de réaliser ces travaux dans un modèle in vivo afin étudier l'impact du VHB sur le recrutement et l'activation des différents acteurs du système immunitaire, par interaction directe et/ou indirecte avec les hépatocytes infectés.
Réduction
La réduction de l'échantillonnage d'animaux est liée à l'approche statistique qui nécessite 30 souris par condition afin d'évaluer une différence significative entre les groupes par des tests statistiques. Le nombre total d'animaux sera de 1050 souris. Ce nombre a été évalué selon un calcul de puissance adapté en prenant la somme de toutes les expérimentations prévues dans ce projet de recherche. A l'issue de ces expérimentations, de nombreux tissus seront récupérés sur chaque souris (sang, foie, rate...) afin de permettre de réaliser un grand nombre d'analyses sur une même souris et ainsi de répondre aux questions scientifiques soulevées.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation pour l’espèce concernée et un suivi quotidien sera assuré par un personnel formé et compétent. De plus, les cages seront raffinées par la présence de lanières Kraft et des abris en carton et installées sur des portoirs ventilés. Aucune souris ne sera isolée dans une cage. Les animaux seront manipulés uniquement par du personnel qualifié et sensibilité au bien-être animal. Les procédures nécessitant l'endormissement de l'animal sont raffinées avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, la gestion du risque d’hypothermie par l’utilisation d’une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant durant les manipulations des animaux sous anesthésie, et l’ajout d’un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire si besoin. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le modèle murin syngénique (de génome identique) est un modèle parfaitement calibré à l'expérimentation animale. De plus, il existe une homologie relative avec l'Homme dans le fonctionement du système immunitaire et les interactions foie/autres tissus, que nous souhaitons étudier ici. Les animaux nés dans notre établissement seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie pour l'initiation du cancer du foie, soit au moment ou quelques semaines après le sevrage pour les autres types d'expérimentation. Les souris adultes provenant de notre fournisseur seront de même fond génétique que les souris provenant de notre établissement. Ces souris seront acclimatées à notre environnement expérimental au moins une semaine avant inclusion dans une de nos procédures. Ces souris seront identifiées à l'inclusion dans une de nos procédures.
Etudes du métabolisme et du comportement au cours du vieillissement de la souris (Etablissement utilisateur 1/2)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié soumise à un régime gras pendant dix-huit mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe 48 heures seul en cage de mesure de la dépense énergétique, subit sept pesées, une injection, un gavage et trois prélèvements, puis jusqu'à six tests évaluant l'anxiété, l'activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire et les capacités sensorimotrices. La faim liée à la mise à jeun, la peur pendant les manipulations et l'isolement figurent parmi les nuisances déclarées. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur "l'animal entier" et retient la souris pour la facilité d'y invalider des gènes, les corps servant ensuite aux analyses histologiques.
Objectifs
Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladies du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Il étudie aussi l'impact du vieillissement biologique dans la survenue des pathologies avec l'âge et le déclin des fonctions physiques et cognitives. Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes au cours du vieillissement - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme (vieillissement biologique). Le projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet aboutira à une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ Dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques de protéines, notamment mitochondriales impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique, sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes du métabolisme lipidique et glucidique et de régulation de la fonction mitochondriale, et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, - Comprendre l'impact du vieillissement sur le fonctionnement des organes, 2/ Dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l’homme: - Identifier des voies de signalisation et cibles thérapeutiques du métabolisme énergétique et lipidique, visant au développement de futurs médicaments.
Procédures
Dans le premier établissement, la moitié des animaux (souris) seront mis sous régime gras pendant 18 mois. Ils subiront, des pesées (7 fois, 30 sec), une injection (5 sec), un gavage (30 sec) et des prélèvements à 3 reprises (5 sec à 3 min), une mesure de la composition corporelle en matières grasses à 3 reprises (4min) et une mesure de la dépense énergétique où l’animal est hébergé seul (1 fois pendant 48h). Dans le second établissement, ils subiront jusqu’à 6 tests de comportements (durée 6min à 30min) afin d'évaluer l'anxiété, l’activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices, et les capacités physiques de l’animal.
Impact sur les animaux
Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Le changement de régime alimentaire peut induire un stress à l'animal. La faim est une nuisance pouvant survenir lors de la mise à jeun des animaux.La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, à l'occasion des prélèvements ou de leur isolement dans certaines procédures. La peur et le stress peuvent aussi survenir lors la découverte de nouveaux environnements, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant prélèvement. D'autres nuisances sont la douleur à l'injection, lors des prélèvements, ou à l'occasion de certains tests comportementaux.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort à des fins d’analyse et d’études histologiques.
Remplacement
Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques En parallèle,des tests de culture cellulaire sont à l'étude pour étudier des mécanismes précis et limiter le nombre d'animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur la base de nos études antérieures ou de la littérature correspondante. Dans ce contexte, le nombre d’animaux utilisé dans chaque groupe étudié sera suffisant pour réaliser les analyses statistiques. De plus, plusieurs données scientifiques pourront être obtenues avec un même animal ce qui réduira le nombre d'animaux dans le projet.
Raffinement
Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre : - les moyens pour limiter le stress aux animaux seront appliqués: avant les expériences, les animaux seront manipulés et habitués à l’expérimentateur afin de favoriser leur coopération dans les actes non invasifs et non douloureux. Ils seront acclimatés aux différentes conditions expérimentales (pièce, hébergement individuel, et différents expérimentateurs). Les expériences seront réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs. - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur. - des anesthésiques et analgésiques seront utilisés dans les procédures en terminal. Un transporteur agréé pour le transport d'animaux sera réquisitionné. La durée du transport entre les établissements utilisateurs n’excèdera pas les 30 minutes. Les animaux seront transportés dans leur cage d'origine (enrichissement compris) afin de limiter le stress lié au transport. Des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis, - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits, - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après les actes quand c'est nécessaire, - la mise en place de procédures de mise à mort quand c'est nécessaire.
Choix des espèces
La finalité du projet est d'identifier les effets de la mutation de protéines, notamment mitochondriales, impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique et le vieillissement. Ainsi, il est indispensable de travailler sur l’animal entier pour comprendre le rôle de ces protéines. Le choix du modèle souris vient du fait que celui-ci offre de larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Il est possible, grâce à ce modèle, d’invalider l’expression des protéines étudiées dans ce projet, et ainsi d'évaluer leur rôle. Nous disposons de lignées murines transgéniques sur ces protéines pour réaliser notre projet. Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides et des glucides sur ce modèle animal. Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'athérosclérose et de la maladie du foie (inflammation et stéatose) sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour démarrer le régime dans les études portant sur l'étude du métabolisme ou de l'athérosclérose. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris et l'impact du régime alimentaire sur l'altération des fonctions au cours du vieillissement de l'animal. Dans les articles scientifiquement, le vieillissement chez la souris, est classiquement étudié chez des souris âgées de 12 à 18 mois.
Caractérisation du rôle du plasmalogène dans la colonisation intestinale de la bactérie Veillonella parvula.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Comprendre comment une bactérie intestinale résiste au stress oxydatif mobilise 216 souris, dont des souriceaux de deux à trois semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent la bactérie par gavage et par voie rectale une à trois fois, subissent des prélèvements de fèces et un écouvillon buccal deux à trois fois par semaine pendant toute l'expérience, deux prises de sang en quinze jours et, pour certaines, des antibiotiques dans l'eau de boisson pendant une à deux semaines. Le porteur affirme que l'administration de la bactérie n'a "pas d'effet négatif visible", tout en reconnaissant que les sondes peuvent irriter l'œsophage ou le rectum. Toutes sont tuées à la fin pour prélèvement d'organes, le porteur écartant les organoïdes intestinaux au motif qu'ils ne reproduisent ni l'absence d'oxygène ni les interactions avec l'hôte.
Objectifs
La bactérie d’intérêt est une bactérie commensale, anaérobie, qui est présente dans la cavité buccale et le tractus intestinal chez l’humain. D’après les données de la littérature, elle colonise l’hôte dès la petite enfance et persiste tout au long de la vie. Cependant à ce jour, les facteurs qui permettent à certaines bactéries de s’établir dans le microbiote n’ont été que très peu étudiés. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de la résistance au stress oxydatif dans la capacité de la bactérie d’intérêt à coloniser et à survivre dans la cavité buccale et le tractus intestinal de la souris. Nos travaux in vitro ont mis en évidence le rôle crucial de certains lipides membranaires, les plasmalogènes, dans la résistance au stress oxydatif chez la bactérie d’intérêt. Nous voulons maintenant étudier l’impact des plasmalogènes dans les conditions de vie physiologiques de cette bactérie. Afin de répondre à cet objectif, le projet comportera 4 expériences - Procédure 1 : Comparaison de la colonisation de la souche sauvage et de la souche mutée pour le gène d’intérêt chez des souris adultes sans germe et à flore conrôlée par voie orale et rectale. - Procédure 2 : Test du rôle du plasmalogène dans la capacité de la bactérie d’intérêt à coloniser dans un écosystème à fortes compétitions. La capacité de colonisation de la souche sauvage et de la souche mutée de la bactérie d’intérêt sera comparée chez des souris conventionnelles après administration orale et rectale. Une étude pilote sera menée afin de savoir si un pré-traitement antibiotique est nécessaire. - Procédure 3 : Etude du rôle du gène d’intérêt dans la primo-colonisation de la bactérie d’intérêt chez des souris souriceaux à flore contrôlée et conventionnelle. Les capacités de colonisation de la souche sauvage et de la souche de la bactérie d’intérêt mutée seront comparées chez des souriceaux âgés de 2 semaines. - Procédure 4 : Test du rôle du gène d’intérêt dans la colonisation par transmission verticale chez les souriceaux à flore conventionnelle. Nous comparerons la transmission des deux souches de la la bactérie d’intérêt depuis des souris parentales vers leurs descendances. Les gène sd’intérêts sont présents chez de nombreuses bactéries intestinales appartenant à différents groupes, ainsi nos résultats fourniront des informations fondamentales au-delà de la bactérie d’intérêt.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre l’importance des lipides membranaires dans la résistance au stress oxydatif lors de la colonisation des bactéries commensales. Au-delà du seul cas de la bactérie d’intérêt, ces résultats ont un intérêt plus large car ces lipides sont présents chez un grand nombre de bactéries. A ce jour, nous connaissons très mal les facteurs essentiels à la colonisation des bactéries dans l’intestin et à leur persistance, en particulier pendant la primo-colonisation dans l’enfance. Ce sont des informations importantes car nous savons que le microbiote joue un rôle clef dans cette période de maturation des fonctions intestinales et immunitaires. De plus, ce projet amènera des connaissances spécifiques sur la bactérie d’intérêt, qui est corrélée dans différentes publications avec un moindre développement des allergies dans l’enfance et à des effets anti-inflammatoires dans certains pathologies. Le projet apportera des connaissances essentielles sur la résistance au stress lors des épisodes inflammatoires et permettra de mieux comprendre pourquoi certaines bactéries bénéfiques sont perdues. Ces connaissances sont nécessaires à moyen terme pour comprendre comment restaurer certaines bactéries dans le cadre de maladies inflammatoires. A plus long terme, le projet vise à contribuer au développement d’approches thérapeutiques de modulation ou de restauration du microbiote intestinal.
Procédures
Gavage et administration rectale (quelques minutes sur chaque souris, une à trois fois au cours de l’expérience) Prélèvement de fèces et d’un écouvillon buccal (quelques secondes, 2 à 3 fois par semaine sur chaque animal, pendant toute la durée de l’expérience) Le prélèvement de sang prend environ 1 minute et sera répété 2 fois en l’espace de 2 semaines. Administration d’antibiotiques dans l’eau de boisson pendant 1à 2 semaines.
Impact sur les animaux
Nos données préliminaires montrent que l’administration de la bactérie d’intérêt chez les souris n’a pas d’effet négatif visible sur les animaux : pas de perte de poids ni d’augmentation du stress des animaux, pas d’inflammation au-delà des effets induits par la contention et les administrations orales ou rectales. Les administrations orales et rectales, peuvent causer des irritations de l’œsophage ou du rectum dues à la sonde. Ces irritations seront réduites grâce à l’usage de sonde souple de taille adaptée. D’après notre expérience, l’administration des antibiotiques dans l’eau de boisson n’engendre pas chez les animaux de gêne perceptible.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de prélever les organes, du sang et tissus d’intérêt et d’effectuer des analyses complémentaires.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de la résistance au stress oxydatif dans la capacité de la bactérie d’intérêt à coloniser et survivre dans la cavité buccale et le tractus intestinal de la souris. Nos travaux in vitro ont mis en évidence le rôle crucial de certains lipides membranaires, les plasmalogènes, dans la résistance au stress oxydatif de la bactérie d’intérêt ce qui a permis de réduire ainsi de manière significative notre utilisation d'animaux dans notre projet. Nous voulons maintenant étudier l’impact d’autres molécules dans les conditions physiologiques de cette bactérie. L’utilisation d’un modèle murin est nécessaire pour démontrer le rôle d’un gène dans la colonisation intestinale car malgré l’existence de modèles cellulaires in vitro comme les d’organoïdes intestinaux, ceux-ci ne reproduisent pas l’environnement intestinal. La plupart des modèles ne permettent pas de reproduire l’absence d’oxygène. De plus ces modèles ne permettent pas d’étudier les interactions de notre bactérie d’intérêt avec l’hôte et avec les autres bactéries. Enfin, il n’existe pas à ce jour de méthode permettant d’analyser le processus de colonisation intestinale. La souris est un modèle adapté car l’environnement intestinal et la composition du microbiote sont assez similaires à l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide de statisticiens et il est le minimum nécessaire et suffisant pour déterminer si les différentes souches ont des capacités de colonisation différentes dans nos différents modèles. D’après nos résultats préliminaires, nous ne nous attendons pas à ce qu’il existe un biais lié au sexe. Nous suivrons les animaux de manière longitudinale afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux dans les différentes études, à la fin du premier réplicat les résultats seront analysés et nous n’entreprendrons le second réplicat expérimental que si cela est justifié par des nécessités statistiques. Nous ré-utiliserons certains animaux de notre expérience pilote à des fins de reproduction, nécessaire à l’expérience visant à vérifier la transmission verticale de la bactérie. Les autres animaux ne pourront être réutilisés car nous devrons précéder au prélèvement du tractus intestinal.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Nous nous efforçons de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une évaluation régulière des animaux et à la mise en place de points limites pertinents. Le gavage et l’administration rectale seront pratiqués avec du matériel adapté : sondes de gavage souples adaptées à l’âge de souris et à usage unique. Cela permettra de réduire significativement les nuisances liées aux gestes techniques eux-mêmes. De plus, si la colonisation fonctionne avec une seule administration, les autres administrations ne seront pas pratiquées. D’après les données provenant d’expériences précédentes, l’administration des antibiotiques dans l’eau de boisson chez ne provoque pas de nuisances chez animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence pour étudier les relations hôte-microbiote car l’environnement intestinal murin et la composition du microbiote sont assez similaires à l’humain. Les animaux utilisés seront des souriceaux de 3 semaines, avant que le microbiote n’ait fini sa maturation afin d’évaluer la colonisation de la bactérie pendant la période juvénile, et des adultes de 7-8 semaines afin d’avoir des animaux avec un microbiote stabilisé et d’étudier la colonisation chez l’adulte.
Enregistrements des activités nerveuses autonomes en réponse au gout du gras chez les souris Knock-out CD36 lingual
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
L'objet réel de ce projet est une lignée de souris créée par l'équipe elle-même : 120 souris mâles privées d'un récepteur du goût du gras au niveau de la langue vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées d'eau six heures, elles subissent une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie profonde, un enregistrement de vingt minutes de l'activité de leurs nerfs autonomes, puis une ponction intracardiaque juste avant la mise à mort. Le porteur signale la peur liée à la contention et les douleurs causées par la chirurgie. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à mieux connaître cette lignée pour qu'elle serve ensuite de modèle à l'étude de la préférence pour le gras, et le porteur juge ce modèle "indispensable" puisqu'il n'existe que chez la souris.
Objectifs
Le goût du gras représente une sixième saveur de base aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. Les récepteurs gustatifs, sur les cellules des papilles gustatives, permettent la détection des saveurs. Pour les lipides, ce sont les récepteurs lipidiques qui sont responsables de la perception du goût du gras et du renforcement de la préférence pour le gras. Le signal gustatif est transmis de la langue au cerveau par les nerfs gustatifs puis le cerveau communique avec le système digestif pour préparer le système digestif à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue (papilles gustatives) – cerveau – intestin. Pour étudier spécifiquement le rôle d’un des récepteurs lipidiques dans la perception du gras, nous avons développé un modèle de souris n’exprimant pas ce récepteur au niveau de la langue. Nous avons observé que ces souris perdent la préférence pour le gras. De plus, elles développent des troubles métaboliques tels que des augmentations de la glycémie, de l’insulinémie et de la glucagonémie. L’insuline et le glucagon, sont des hormones sécrétées par le pancréas, qui permettent de réguler la glycémie. Elles sont sous le contrôle du système nerveux autonome, qui assure la communication entre le cerveau et l’intestin. Ces observations nous suggèrent que l’absence de d’un récepteur lipidique dans les papilles gustatives perturbe la communication entre la langue, le cerveau et l’intestin. Afin d’explorer le rôle du système nerveux autonome dans les perturbations métaboliques observées chez ces souris, nous prévoyons de mesurer l’activation de ces nerfs en réponse au dépôt de lipides sur la langue. Ces mesures seront effectuées chez des souris normales ou n’exprimant pas un récepteur lipidique au niveau des papilles gustatives.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra de mieux comprendre une nouvelle souche de souris génétiquement modifiée, n’exprimant pas un des récepteurs lipidiques au niveau de la langue. Ces souris pourront donc servir de modèle animal pour étudier la préférence pour le gras.
Procédures
Toutes les souris (120 souris) sont concernées par les points suivants : - Privation d’eau uniquement pendant 6 heures avant le début de la procédure. - une seule intervention chirurgicale suivie d’un seul enregistrement d’activité nerveuse par souris (souris profondément anesthésiées) ; durée de la chirurgie 20 minutes au maximum et durée de l’enregistrement nerveux 20 min. - un seul prélèvement sanguin en intracardiaque par souris durée de 2 minutes maximum. Prélèvement sanguin sur souris profondément anesthésiées juste avant mise à mort.
Impact sur les animaux
Le projet requiert de mettre à jeun hydrique les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaires lors des manipulations. Les souris peuvent subir des douleurs causées par la chirurgie.
Devenir
A l’issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort, pour étudier leurs organes et tissus.
Remplacement
L’activité nerveuse autonome ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de l’expérimentation in vivo. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique, valable avec un test adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien-être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur (le manipulateur portera une blouse propre jetable et des gants nettoyés avec l’alcool 70%), désinfection des surfaces, utilisation d'un champ stérile, stérilisation des outils de dissections, tonte de la zone d’incision et désinfection de la peau. La délimitation des points limites permet d’éviter au maximum les douleurs sévères ou souffrance chez la souris afin de favoriser un état stable dans le bien-être animal. La douleur de la souris est en amont, prise en charge via l’utilisation d’analgésiques,15 minutes avant l’anesthésie. Ceci permettra entre autres de calmer l’animal et de maximiser l’effet de l’anesthésie. Des aiguilles fines biseautées seront utilisées lors des injections et des prélèvements, pour minimiser la douleur.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la régulation nerveuse du système gastrointestinal et du comportement alimentaire. Cette technique est plus difficile à réaliser chez la souris que chez le rat, mais notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils d’analyse biologique contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et la modification de gènes s’exprimant au niveau de la langue étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Les souris mâles utilisées auront minimum 2 mois car avant 8 semaines, les souris sont trop petites pour effectuer une chirurgie.
Développement de comprimés mucoadhésifs et pH-sensibles ciblant le tractus gastro-intestinal
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Destinés à être réutilisés dans un autre projet à l'issue, 6 chiens vont être utilisés dans des procédures que le porteur classe en souffrance légère, aucun n'étant tué. Chacun avale par gavage un comprimé contenant du sulfate de baryum, puis passe deux anesthésies générales dans la même journée pour deux scanners de dix minutes, l'opération étant répétée huit jours plus tard. Le jeûne imposé la veille au soir et maintenu entre les deux scanners porte à vingt heures la privation de nourriture, et le porteur signale une possible constipation ou de faibles douleurs abdominales. Des tests in vitro et ex vivo ont déjà établi que ces comprimés adhèrent aux zones visées, le chien étant retenu pour son anatomie digestive proche de celle de l'être humain, sa "facilité de travail" et sa "résistance au jeun importante".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de prouver la capacité de ciblage des comprimés développés. Ces comprimés présentent à la fois la capacité d'être adhérent à la paroi de l'intestion mais ils sont également sensible au pH, leur permettant ainsi de venir adhérer sur la paroi d’une zone précise et prédéfinie du système digestif. Les applications de ces comprimés sont nombreuses. Ils sont notamment pertinents pour venir cibler les maladies du tube digestif, en proposant une action locale ; mais ils peuvent également présenter un intérêt pour améliorer l’absorption de principes actifs à fenêtre d’absorption étroite. Différents tests in vitro et ex vivo ont déjà été réalisés permettant de prouver les capacités de ces comprimés à adhérer aux zones d’intérêt. Afin de démontrer leur efficacité, nous souhaitons maintenant tester leur précision de ciblage in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’attester de la fiabilité des comprimés mucoadhésifs développés, c’est-à-dire de leur capacité à adhérer à des zones précises du système digestif. Les applications de ce type de formes pharmaceutiques sont multiples. En effet, l'adhésion aux parois intestinales peut permettre (1) le ciblage de sites spécifiques, (2) l’augmentation du temps de résidence sur un site de libération défini, (3) ou l’augmentation des interactions entre la forme pharmaceutique et les différentes muqueuses permettant l’augmentation du temps de délivrance du produit. Afin de cibler le système digestif, l’administration des médicaments doit se faire par voie orale. La voie orale est la voie généralement privilégiée pour l’administration de médicaments car elle présente de nombreux avantages. Elle permet une administration du médicament simple, sûre, efficace et garantit un meilleur respect des thérapies par les patients. De plus, elle bénéficie d’une documentation riche et a fait l’objet du développement d’outils de préformulation largement approuvés. Cependant, de nombreux facteurs limitent l’efficacité des traitements oraux, notamment le faible transfert de l'intestin au sang de certaines substances actives qui ne possèdent pas des propriétés de solubilité ou perméabilité suffisantes, le temps de vidange gastrique très court limitant l’absorption ou l’action locale de certaines substances actives au niveau gde l'estomac, ou encore la faible absorption de certaines substances actives présentant des fenêtres d’absorption intestinale étroites en raison d’un trop faible temps de résidence lié au transit gastro-intestinal. Dans ce contexte, les formes pharmaceutiques mucoadhésives peuvent être une solution pour améliorer le ciblage et le temps de résidence dans le tube digestif.
Procédures
Après administration du produit testé, les chiens seront anesthésiés pour de leur passage au scanner. L'induction consiste en une injection d'anesthésiant dans le muscle, puis l'animal est intubé dès qu'il perd conscience. L'injection ne dure que quelques secondes. Il est prévu de réaliser 2 scanners de 10 minutes dans la journée donc deux anesthésies. Les animaux seront mis à jeûn (solide) la veille au soir de chaque anesthésie-administration.
Impact sur les animaux
L'administration orale du comprimé provoque une désagrément de très courte durée. Les animaux seront mise à jeun (solide) la veille au soir de chaque anesthésie-administration. Une mise à jeun de 8H minimum est nécessaire pour éviter tout risque de fausse déglutition lors des anesthésies. De plus, l'estomac des animaux doit être vide afin d'éviter toute intéraction avec le bol alimentaire qui pourrait géner l'adhésion du comprimé, cela nécessite une mise à jeun de 4H, soit le temps de la vidange gastrique chez le chien. La mise à jeun sera maintenu entre les deux scanners puisque que ceux-ci ne sont espacés que de 4H. La durée totale entre le début de la mise à jeun et la reprise de l’alimentation sera de 20H. Les autres nuisances dûes au projet seront, l'administration du comprimé par gavage (très rapide), à l'induction de l'anesthésie (très rapide) avant chaque scanner. Ces nuisances seront subies à deux reprises pour chaque essai à 8 jours d'intervalles. . Le sulfate de baryum, ajouté à la formulation en tant qu’agent radio-opaque, est également une substance considérée comme sûre et les risques d’effets indésirables sont limités. Certains troubles gastro-intestinaux peuvent cependant parfois être observés comme une légère constipation ou de faibles douleurs abdominales si le chien rencontre des difficultés à éliminer la substance.
Devenir
Le projet étant peu invasif et ne nécéssitant pas d'euthanasie, les chiens pouront être réutilisés pour un autre projet
Remplacement
Différents tests in vitro et ex vivo ont déjà été réalisés permettant de prouver les capacités mucoadhésives de ces comprimés sur les zones d’intérêt. Afin de démontrer leur efficacité, nous souhaitons maintenant tester leur précision de ciblage in vivo. De ce fait, les formulations développées doivent être administrées selon la voie d’administration chez l’Homme, et ce sur des modèles animaux présentant des caractéristiques physiologiques au plus proches del'homme, tel que le Chien.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 6 chiens pour ce projet. Ce nombre est jugé suffisant pour obtenir des données exploitable. Un essai correspond à l'administration des deux formulations à 8 jours d'intervalle sur 3 chiens. Il n'est pas obligatoire que les mêmes chiens soient réutilisés d'un essai à l'autre.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement après la mise à jeun et l'administration du comprimé. Une surveillance accrue sera mise en place de la première aneshésie jusqu'à la fin de la procédure de mise à jeun. En cas de besoin un vétérinaire sera joignable. Une pesée et un examen clinique seront réalisés chaque jour lorsqu'il y a des anesthésies puis une fois semaine pour s'assurer de la bonne clinique des animaux. Les animaux feront l'objet d'un conditionnement positif, basé sur des intéractions amicales avec les personnels en charge des soins, et l'administration de récompenses lors de différents exercices (monter sur la balance, s'immobiliser, se coucher, etc.), ceci afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Afin d’éviter tout stress des animaux durant l’administration des éléments d’essai, les animaux seront habitués à être manipulés sur une table d’auscultation et ils seront conditionnés à rester calmes quand le technicien doit réaliser les administrations. Tout au long (scanner) de l’intervention sous anesthésie générale, les paramètres physiologiques (fréquence cardiaque, bonne oxygenation) des animaux seront suivis.
Choix des espèces
Ce modèle présente des caractéristiques anatomiques, fonctionelles et de pH proche de l'homme. S'ajoute a ces arguments la facilité de travail avec le chien ainsi que sa résistance au jeun importante, ce qui permet de limiter les risques d’hypoglycémie. Les animaux seront des adultes ayant fini leur croissance afin d'avoir un système digestif et enzymatique mature.