Système immunitaire

Une instillation nasale de virus grippal ou une injection de cytomégalovirus dans le péritoine, puis une série de tâches non nommées mesurant anxiété, humeur et mémoire : 856 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque un syndrome fébrile pouvant durer sept jours, avec perte de poids et anxiété, et chaque souris passe jusqu'à dix jours seule en cage pour l'évaluation individuelle. Le porteur écrit pourtant que "les tests comportementaux ne génèrent aucun stress" et qu'il n'a pas noté d'état de stress lié à l'isolement, dans un projet dont l'objet est précisément de mesurer un état d'abattement et d'isolement provoqué par l'infection. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever organes et sang.

Objectifs

Le système immunitaire est requis pour la défense de l’hôte contre les agressions de corps étrangers (virus, bactéries, etc..). Les cellules dendritiques (DC) sont des acteurs clés du système immunitaire, en première ligne dans la reconnaissance des microbes. Lorsqu’elles détectent un corps étranger, les DC produisent des molécules véhiculées dans tout le corps pour orchestrer l’activation de tous les autres acteurs du système immunitaire. Une production de ces molécules spécifiques dérégulée en temps et/ou en quantité peut avoir un rôle délétère, parfois fatal, sur l’individu infecté, comme observé récemment dans le cadre du Covid. Au cours des infections virales, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC), sont la principale source de molécules spécifiques qui signalent l'infection et sont source d'inflammation appelées Interférons (IFN). Les IFN sont indispensables pour limiter la propagation de virus. Cependant, lorsque les pDC sont absentes ou incapables de produire des IFN, l'hôte infecté contrôle toujours efficacement l'infection. La capacité des pDC de produire des IFN est retrouvée dans la majorité des vertébrés, cette capacité est donc probablement très ancienne. Il est alors possible que cette fonction ne serve pas uniquement à combattre des infections virales, mais aussi à remplir d'autres fonctions importantes dans l'organisme. Notre objectif est de tester si les molécules produites par les pDC induisent un état d'abattement, d’isolement et d'affaiblissement des capacités de reconnaisance/conscience de l'environnement à court ou long-terme, comportement qui ressemble aux états dépressifs. Les pDC pourraient aussi participer à la mise en place d'une détérioration des cellules du cerveau dans la maladie d'Alzheimer (AD), la première maladie neurodégénérative qui affecte plus d'1 million de personnes en France, a un poids sociétal lourd pour les familles et reste sans traitement efficace. Afin de tester cette hypothèse nous induirons la perte des cellules pDC dans un modèle de souris, combinée ou non à des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer et que nous infecterons avec deux types de virus : la souche A du virus de la grippe (IAV) qui induit une infection restreinte du système respiratoire, ou le cytomégalovirus murin (MCMV) qui induit une infection dans tout l'organisme et persiste sous forme latente, cachée. Nous évaluerons l’impact de ces infections sur le comportement des souris par des tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les interactions entre systèmes immunitaire et nerveux. Si notre hypothèse est correcte, il sera envisageable de cibler la production d'agent participant à l'inflammation pour développer de nouvelles stratégies de thérapie pour les patients dépressifs, ou souffrant d'un affaiblissement des capacités de reconnaisance/conscience de l'environnement progressifs. Ces nouvelles approches seront d’abord validées dans un cadre infectieux, ensuite elles pourront être étendues à d’autres contextes inflammatoires, les maladies impliquant une dégénérescence des cellules du cerveau et en particulier la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Des souris seront infectées soit par une courte injection par voie intrapéritonéale à l'état vigile d'un faible volume de liquide physiologique contenant du virus. D'autres souris recevront une faible dose de virus par instillation nasale réalisée une seule fois sous anesthésie générale gazeuse de courte durée. Une prise de sang sera effectuée sur les souris infectées, une seule fois sur animal vigile. Il s'agit d'un geste rapide (moins de 5 minute par souris). Un point de compression sera ensuite réalisé à l'aide d'une compresse stérile jusqu'à arrêt d'un saignement potentiel. Les souris effectueront ensuite une séquence de tâches afin d'évaluer leur comportement et plus précisément leur niveaux naturels d'anxiété, leur humeur motivée ou déprimée, et leurs capacités d'apprentissage et de mémoire. La séquence durera moins de deux semaines et comprendra la séparation des animaux pour leur évaluation à l'échelle individuelle sur une durée correspondant à moins de 30 minutes au total par jour pendant 4 jours, ou pendant moins de 10 jours dans le cas de l'évaluation de la mémoire à long-terme. Les souris seront libres de leurs mouvements et en capacité d'explorer dans des cages au cours de chaque test comportemental. Aucune tâche nécessite un effort particulier, ou génère quelque douleur ou angoisse, du fait que les stimulations ne dépassent pas celles rencontrées naturellement en zootechnie, et sont associées à des récompenses alimentaires positives.

Impact sur les animaux

Dans le cas d'infection par les virus, les animaux présentent un syndrome fébrile, associé à des symptômes généraux comme de la fièvre indiquant que l'organisme lutte contre une infection. Ce dernier peut durer jusqu'à 7 jours et entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les injections ne sont source d'aucun stress particulier, du fait qu'elles ne sont pas répétées, du faible volume injecté, et du fait de la manipulation journalière préalable des souris par le personnel qualifié dans la semaine précédente. La prise de sang peut généré un stress léger du fait de la contention. Dans le cadre d'un test d'évaluation du comportement, les animaux sont hébergés temporairement en cage individuelle. Du fait de l'enrichissement de leur habitat, du caractère temporaire (moins de 10 jours), il n'a pas été noté d'état de stress lié à l'isolement, mais ces manifestations seront étroitement surveillées. Les souris étant libres d'exploration, non restreintes et les tâches étant toutes effectuées dans la salle d'hébergement où elle ont été acclimatées, les tests comportementaux ne génèrent aucun stress et du fait que les stimulations ne dépassent pas celles rencontrées naturellement en zootechnie, et sont associées à des récompenses alimentaires positives, ceci afin de pouvoir justement mesurer leur état d'anxiété naturel.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser divers prélèvements d'organes et/ou de sang utilisés pour des analyses complémentaires. Ces prélèvements sont essentiels pour étudier les paramètres inflammatoires et les mécanismes cérébraux entrant en jeu dans ce projet.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades moléculaires impliquées dans les capacités cognitives et la réponse adaptative des comportements. Les études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition, et sont ainsi complétées par l'utilisation de l'animal qui seule permet d'étudier la coordination des différentes régions du cerveau entre elles et leurs intéractions avec le reste de l'organisme et en particulier le système immunitaire.

Réduction

Tous ces animaux seront sous un même fond génétique homogène (gènes communs) pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que l'analyse d'un total de 12 animaux par groupe répartis sur deux expériences reproduites étaient nécessaires. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 2 fois de manière indépendante.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés de 2 à 5 individus compatibles. Un animal sera euthanasié en cas de mal-être trop important évalué par l'utilisation d'une grille de scoring. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont : respiration anormale, perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, aspect du poil anormal. Les souris sont préalablement familiarisées avec l'aliment de convalescence (gel) dans les jours précédant l'infection, ce qui optimise leur convalescence. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids). Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Lors des prélèvement de sang, avec utilisation de tubes de contention, l'animal sera surveillé et le geste sera réalisé rapidement afin de limiter l'évènement stressant, les souris seront replacées avec leurs congénères et il sera vérifié que le prélèvement ne les a pas affaiblies ou perturbées (changement de comportement). Enfin, les tests comportementaux sont choisis et menés en respectant les besoins écologiques des modèles: la recherche spatiale est motivée par récompense positive, les souris sont acclimatées à tous les tests et habituées aux dispositifs au moins une semaine avant chaque test. Les tests ne requièrent que mobilité, exploration libre d'objets, d'eau de boisson sucrée ou stimulus sonore de niveau équivalent à celui auquel elles peuvent être exposée lors du change de cage.

Choix des espèces

Les réactions physiologiques de la souris face à des corps étrangers, ici des virus, sont suffisamment proches de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire et nerveux de ces 2 espèces. Ce point est maintenant formellement établi dans la littérature en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires, notamment pour l'étude de la maladie d'Alzheimer. Seuls des animaux adultes seront étudiés ici de façon à ce que leur système immunitaire soit mature. Enfin dans le cas des modèles de la maladie d'Alzheimer, une maladie neurodégénérative dont le premier facteur de risque est l'age, des animaux adultes plus mûrs mais non vieillissants seront étudiés pour correspondre au mieux au métabolisme d'un humain de 45 ans ou plus.

Quatre lignées de souris à phénotype dommageable développent des lymphomes spontanés à partir de cinq mois, et des tumeurs intestinales à partir de six mois en condition d'obésité. 720 souris de ces lignées vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une alimentation qui les rend obèses, un traitement injecté dans le péritoine, des palpations abdominales deux fois par semaine, et pour les tests métaboliques une mise à jeun la veille puis des prélèvements de sang répétés à la veine de la queue après incision. Le porteur décrit des masses tumorales pouvant entraîner diarrhées, prolapsus, signes d'anémie, et annonce la mise à mort en fin d'expérimentation "afin de réaliser des prélèvements terminaux".

Objectifs

Le cancer colorectal est l'un des cancers les plus fréquents et représente un enjeu majeur de santé publique. Bien que plusieurs facteurs génétiques jouent un rôle dans son initiation, la majorité des cancers colorectaux sporadiques sont imputables à des facteurs environnementaux tels que l'obésité, le tabagisme et les carcinogènes alimentaires. Il est bien connu que le risque de développer un cancer colorectal augmente avec l'obésité. Cependant, les mécanismes biologiques par lesquels les régimes alimentaires occidentaux influencent le développement du cancer colorectal ne sont pas bien compris. Ce projet de recherche a pour objectif global d’identifier comment les perturbations métaboliques déclenchées par une alimentation obésogène promeuvent la progression du cancer colorectal et de caractériser les liens complexes entre l'obésité et le contrôle du métabolisme.

Bénéfices attendus

Ce projet représente un enjeu majeur de santé publique et permettra de développer de nouvelles voies thérapeutiques pour les patients obèses atteints de cancers digestifs.

Procédures

Les souris seront soumises ou non à un régime alimentaire les rendant obèse, puis un traitement leur sera administré intra-péritonéalement (temps estimé : 15 secondes). Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien et seront pesés 2 fois par semaine (temps par pesée : 10 secondes). Afin de suivre l’évolution tumorale, les souris seront, à l'occasion de la pesée, palpées au niveau abdominal (temps estimé : 15 secondes). Pour les tests métaboliques, les animaux seront mis à jeun la veille. Ensuite, les souris recevront une injection intrapéritonéale de glucose ou d'insuline (temps estimé : 15 secondes). A l’issue de l'injection, des prélèvements sanguins seront effectués (temps estimé : 30 secondes) à la veine caudale après incision transversale légère au niveau de la queue à intervalles de temps réguliers pour mesurer la glycémie ou une éventuelle intolérance à l’insuline.

Impact sur les animaux

Le phénotype attendu des animaux est le développement le développement spontané de lymphomes à partir de 5 mois de vie et en condition d’obésité, des tumeurs intestinales, à partir de 6 mois de vie. Les nuisances associées à ce développement de tumeurs peuvent être les suivantes : développement d’une masse tumorale pouvant entrainer des troubles digestifs (diarrhées, prolapsus notamment), des signes d'anémie, ou troubles du comportement. À ces effets liés au modèle s’ajoutent les nuisances expérimentales : les manipulations et contentions répétées peuvent être sources de stress pour les animaux. L’administration de tamoxifène est également susceptible d’induire des effets indésirables transitoires, tels qu’une gêne locale. Enfin, les prélèvements sanguins répétés peuvent engendrer une douleur légère à modérée au point de prélèvement, ainsi qu’un stress associé à la manipulation, et, en cas de répétition rapprochée, un risque d’affaiblissement ou d’anémie.

Devenir

Les souris seront euthanasiées en fin d'expérimentation afin de réaliser des prélèvements terminaux

Remplacement

Les questions posées dans ce projet portent sur la manière dont les tumeurs apparaissent et évoluent au fil du temps. Pour y répondre, il est nécessaire d’utiliser des souris, car elles permettent d’étudier le fonctionnement du corps dans son ensemble. En effet, le comportement des cellules cancéreuses, notamment leur métabolisme, peut être très différent entre des expériences en laboratoire (sur cellules isolées) et un organisme vivant. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier ces phénomènes de façon aussi complète. L’utilisation de souris reste donc indispensable, en particulier pour comprendre les premières étapes de formation des tumeurs. Enfin, ce projet vise aussi à étudier les interactions entre différents organes et la tumeur, ainsi qu’à identifier des marqueurs détectables dans le sang. Ces objectifs nécessitent obligatoirement une étude sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé pour obtenir des résultats fiables, tout en évitant de devoir refaire les expériences. Seuls les régimes alimentaires ayant montré les effets les plus marqués seront testés. Chaque groupe comprendra 20 souris (10 par type d’alimentation), ce qui permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour tirer des conclusions solides. Pour analyser les résultats, nous comparerons la croissance des tumeurs entre les différents groupes au fil du temps, ainsi que les caractéristiques biologiques des tumeurs prélevées. Des méthodes statistiques adaptées seront utilisées pour comparer les données entre groupes. Au total, sur les 5 ans du projet, jusqu’à 720 souris pourront être utilisées, réparties en plusieurs groupes expérimentaux. Ce nombre repose sur des calculs statistiques ainsi que sur l’expérience du laboratoire avec des modèles similaires

Raffinement

Ces 4 lignées à phénotype dommageable présentent des caractéristiques phénotypiques spécifiques liées à l’émergence de lymphomes spontanés dont il faudra tenir compte. Un examen journalier des animaux inclus dans les groupes expérimentaux sera effectué pour renseigner dans des fiches de suivi individuelles les premiers signes comportementaux associés à une douleur liée à l’émergence de tumeurs (ataxie, troubles de la respiration, isolement, absence de mobilité ou agitation anormale, modification de l’embonpoint, hérissement des poils, dos voûté…). La sévérité de ces signes sera déterminée selon une grille d’évaluation jointe en annexe qui permettra la mise en place de soins éventuels ou conduira à l’euthanasie des animaux. Les souris seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 animaux maximum par cage. Dans chaque cage nous ajouterons de l'enrichissement (bâtonnets en coton (safe roll), frisottis, cabane en carton)). Les groupes expérimentaux seront réalisés de telle sorte à limiter la présence d’animaux isolés.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères qui sont un modèle représentatif de l’homme et présentant une reproduction rapide, ce qui permet de raccourcir le temps des projets. De plus, les modèles de souris ont été validés dans l'étude de la physiopathologie intestinale car elles développent des tumeurs proches de celles observées chez l'Homme. Nous utiliserons des souris avec ou sans système immunitaire fonctionnel, traitées à partir de 7 semaines, âge correspondant à leur maturité sexuelle.

Irradiées moins de quatre minutes sur animal vigile, opérées de la peau pendant trente minutes sous anesthésie, puis prélevées au sang jusqu'à trois fois, 1 160 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont immunodéficientes, donc plus exposées aux infections, et reçoivent une greffe de moelle osseuse issue de souris immunocompétentes. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les organes lymphoïdes, le projet cherchant à savoir si l'expression en deux copies d'un gène du chromosome X explique la plus forte réponse immunitaire des femelles. Le porteur conclut que peu de nuisances sont attendues, sans dire à quoi sert la chirurgie cutanée, ce que vise l'irradiation, ni pourquoi 1 160 souris sont prévues quand il annonce cinq souris par groupe.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes génétiques liés au chromosome X responsables de la plus grande susceptibilité des femmes aux maladies autoimmunes. Nous nous intéressons aux mécanismes responsables de l’émergence de cellules immunitaires dans lesquelles un gène de l’X est exprimé à partir des deux chromosomes et leur rôle dans la réponse immunitaire chez les souris femelles. Pour cela nous réaliserons des greffes de cellules, provenant de nos différents modèles génétiques qui permettent de suivre et quantifier l’expression de ce gène dans des souris immunodéficientes.

Bénéfices attendus

Les femelles développent des réponses immunitaires de plus forte amplitude et de meilleure qualité que les mâles, mais sont plus susceptible de développer des maladies auto-immunes. Ce projet vise à démonter s’il existe un lien direct de causalité entre l’expression en deux copies d’un gène du chromosome X dans les cellules immunitaires et une réponse humorale de meilleure qualité et plus robustes chez les femelles.

Procédures

Les animaux pourront subir : une irradiation légère de moins de 4 minutes sur animal vigile ; une chirurgie cutanée légère (30 min) sous anesthésie, des injections (durée moins de 1 minute) 2 fois sur animal vigile ou anesthésié; des prélèvements veineux sur animal vigile (1 min) au maximum tous les 15 jours (3 fois) durant la procédure.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sont immunodéficientes et peuvent donc être davantage susceptibles de développer des infections. L'irradiation peut entrainer un stress et de légers troubles cutanés. Les injections peuvent entrainer une douleur modérée et un stress transitoire. Cependant ces souris immunodéficientes seront reconstituées avec de la moelle osseuse de souris immunocompétentes et possèderont donc un système immunitaire équivalent aux souris sauvages. Globalement peu de nuisances sont attendues sur les animaux. Pour les gestes réalisés sur animal vigile (contention, injection intrapéritonéale), un léger inconfort, du stress et des douleurs légères sont à prévoir, mais cela sera transitoire car les substances injectées ne sont pas irritantes.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever les organes lymphoïdes pour analyses cytométriques et/ou transciptomiques et/ou histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro pour reproduire les différentes étapes de développement et différentiation des lymphocytes B dans la moelle osseuse et les organes lymphoïdes.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'expériences effectuées nous utilisons un nombre d'animaux suffisant par expérience pour 1) obtenir des résultats statistiquement interprétables et 2) faire des analyses différentes. De manière générale, nous avons estimé que 2 lots expérimentaux devront être produits afin de reproduire les expériences de façon indépendante et que d’après nos données expérimentales un effectif de 5 souris/ groupe serait suffisant. Le calcul d’effectif a été réalisé avec un logiciel approprié.

Raffinement

Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé à l’expérimentation animale. Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adaptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Afin de limiter les risques d’infection des animaux immunodéficients ils seront placés dans des cages sur portoirs ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environnement de toutes les cages sera enrichi (igloo, sizzelnest, rouleau en carton). Les animaux seront manipulés sous hotte. La définition des points limites adaptés à la procédure et les critères d’arrêts sont définis suivant un arbre décisionnel validé par le SBEA. Un suivi pondéral des animaux sera réalisé une fois par semaine.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme modèle expérimental pour étudier les mécanismes d’échappement à l’inactivation du chromosome X et les conséquences sur l’immunité chez les souris femelles car il s’agit d’un modèle approprié proche de ce qui se passe dans l’espèce humaine. Nous avons déjà développé des modèles génétiques uniques et originaux chez la souris pour suivre les cellules immunitaires d’intérêt. Ces modèles ont tous été validés et serviront de source de cellules pour un transfert dans des souris immunodéficientes. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte entre 7-8 semaines.

Six tests comportementaux par souris sur trois semaines, dont un labyrinthe en Y et une piscine équipée d'une plateforme de sortie, plus quatre prélèvements sanguins isolés et trois séries de prélèvements étalées sur deux heures : 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de dix-huit jours reçoivent de l'ovalbumine par voie intrarectale sous anesthésie, puis sont tués par dislocation cervicale une heure après leur réveil. L'objet est de mesurer les effets des additifs des laits infantiles sur l'intestin et le cerveau, avec des résultats destinés à éclairer l'Efsa et l'Anses. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de "non invasifs et n'induisant pas de stress", tout en annonçant que certaines souris pourraient développer une inflammation intestinale chronique et un comportement anxieux.

Objectifs

Le lait maternel joue un rôle essentiel dans la croissance des nouveau-nés. Il module entre autres le microbiote intestinal, qui lui-même participe au bon développement du cerveau et de la santé. De nombreux nourrissons sont alimentés avec des laits de substitution en poudre. Ces préparations contiennent des additifs, utilisés notamment pour améliorer leur texture ou leur conservation. Il a déjà été montré que certains de ces additifs peuvent perturber l’équilibre du microbiote intestinal, entraînant une dysbiose et une inflammation intestinale chez l’adulte. En revanche, leurs rôles et leurs conséquences sur le développement du cerveau durant la période néonatale sont peu explorées et leurs effets à plus long terme sur le comportement restent inconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier chez l'animal les effets de la consommation durant la période néonatale de laits contenant ces additifs sur l’axe intestin-cerveau à différentes périodes de la vie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. Sur le plan fondamental, ce projet apportera des connaissances nouvelles sur les mécanismes par lesquels l'alimentation agit sur la santé intestinale et le développement cérébral durant la période néonatale, et sur la façon dont les perturbations précoces du microbiote peuvent influencer l’apparition d’inflammation intestinale et le comportement à long terme. Sur le plan appliqué, les résultats viendront éclairer les évaluations des risques sanitaires liés à ces additifs chez les nourrissons. Ils pourront orienter l'optimisation des formulations des laits infantiles et fournir des éléments scientifiques utiles aux instances de réglementation (Autorité européenne de sécurité des aliments (Efsa), agence nationale de sécurité sanitaire (Anses)), dans une perspective de meilleure protection de la santé des nouveau-nés. Enfin, ces travaux contribueront à enrichir les recommandations nutritionnelles destinées aux familles et aux professionnels de santé.

Procédures

Les animaux subiront 4 prélèvements uniques de sang pour une durée inférieure à 1 minute afin de mesurer la gly-cémie. Les animaux subiront 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements mul-tiples seront séparés d’au moins une semaine afin de mesure la glycémie lors d’un test de tolérance au glucose. Les animaux adultes seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs et n'induisant pas de stress chez l'animal. Les animaux adultes seront au préalable soumis à une phase d’habituation d’une semaine qui n'induira que peu ou pas de stress chez: chaque jour, ils seront exposés à l’expérimentateur et à la salle de comportement pendant une durée de 30 minutes à 1 heure, afin de réduire le stress lié à la manipulation et à l’environnement expérimental. À l’issue de cette période, une série de tests comportementaux sera réalisée pour évaluer différents aspects tels que l’anxiété, la sociabilité, la mémoire et l’hyperactivité. Ces évaluations reposeront sur les paradigmes suivants : • tes de l’anxiété : Les dispositifs expérimentaux combineront des zones ouvertes/éclairées et des zones fermées/protégées. Le temps de présence dans chaque type de zone sera quantifié sur une période de 10 minutes • évaluation de la mémoire : phase d’habituation de 10 minutes durant laquelle l’animal est placé dans une arène contenant des objets, dans un labyrinthe en Y ou dans une piscine équipée d'une plateforme pour permettre à l'animal de sortir de l'eau. Suite à une modification de la configuration (changement d’objets ou d’accessibilité des zones), une phase de test de 10 minutes permettra de mesurer la capacité de reconnaissance ou de spatialisation de l’animal. • évaluation de la sociabilité : mesureront la préférence naturelle de l’animal à interagir ou à passer du temps à proximité d’un congénère plutôt que d’un objet inanimé, sur une durée de 10 minutes Chaque test comprendra une phase d’habituation de 10 minutes à l’arène, suivie d’une phase de test de 10 minutes par animal. La fréquence des tests est limitée à un seul test par jour et par animal au maximum, pour un total d’environ 6 tests par animal répartis sur une période de trois semaines. • animaux jeunes adultes agés de 18 jours subiront une administration intrarectale d’ovalbumine après anesthésie à l’isoflurane. Après 1h de phase de réveil, ils seront mis à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Certaines procédures pourraient induire une inflammation intestinale chronique de bas bruit sans ulcération majeure et qui n’a pas de conséquences visibles sur le phénotype. De plus, certains animaux pourraient développer des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse ainsi que présenter un comportement anxieux. Les tests comportementaux réalisés sur animaux adultes entraineront peu ou pas de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car l’analyse de leurs organes est nécessaire pour répondre à notre hypothèse de travail.

Remplacement

Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant, le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment cerveau/intestin/microbiote en lien avec le développement d’inflammation chronique de bas bruit et de troubles du comportement. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie du développement cérébral et du comportement de ces animaux est très différente de celle des mammifères.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 12 souris par condition et par sexe était nécessaire afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès de biostatisticiens pour des projets similaires. De plus, il s’agit d’une expérience au design longitudinal, ce qui nous permet d’observer le phénotype des souris aux différents stades de développement et donc limiter le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.

Choix des espèces

Cette étude privilégie la souris comme modèle de référence pour analyser l'impact des additifs alimentaires sur le microbiote intestinal et le développement cérébral néonatal. Ce choix se justifie par la capacité à suivre précisément les interactions microbiote-système immunitaire dès la naissance grâce à des outils d'analyse avancés. Bien que simplifiée, la physiologie mu-rine offre une pertinence conceptuelle et souvent directe pour comprendre les mécanismes chez le nouveau-né humain. En pratique, la souris est indispensable : sa reproduction rapide permet d'obtenir de grandes portées pour suivre les effets à long terme d'une exposition nutritionnelle précoce, de la nais-sance à l'âge adulte. De plus, c'est l'espèce la mieux maîtrisée pour évaluer les fonctions co-gnitives et comportementales en milieu contrôlé. Ces avantages combinés garantissent une efficacité optimale dans la recherche tout en assurant une représentation physiologique fiable des processus biologiques humains. Le premier groupe sera suivi jusqu’à l’âge du sevrage, soit environ trois semaines. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le cerveau sont particulièrement sensibles à l’environnement nutritionnel. Le second groupe sera suivi jusqu’au 18ème jour de vie. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le système immunitaire sont modulés par l’environnement nutritionnel. Le troisième groupe sera maintenu dans les mêmes conditions jusqu’à l’âge adulte, l’exposition aux additifs étant limitée à la seule période néonatale. Ce suivi longitudinal permettra de vérifier si les éventuelles perturbations observées chez le jeune animal perdurent et influencent le comportement et l’état général à long terme. L’utilisation de ces deux stades est indispensable à la démarche scientifique : la période néonatale représente le moment critique de l’exposition alimentaire, tandis que l’évaluation à l’âge adulte est nécessaire pour mesurer l’existence d’effets différés.

Vingt administrations intranasales, cinq injections dans le muscle et quatre prélèvements sanguins par souris sur dix-sept semaines : 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet est de tester un vaccin dirigé contre une molécule du système immunitaire, l'interleukine-5, présenté comme moins coûteux et moins contraignant que les anticorps injectables déjà commercialisés. Le porteur ajoute que les réactions immunitaires provoquées par les injections interdisent toute réutilisation, tout placement et toute adoption. Sur le choix de l'espèce, il retient des lignées consanguines et déclare que pour les souris de laboratoire "la pertinence biologique et biomédicale est établie", ajoutant que ses procédures ont "un caractère de stricte nécessité".

Objectifs

Certains globules blancs appelées éosinophiles jouent un rôle important dans plusieurs maladies inflammatoires chroniques, notamment l'asthme allergique, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) et la sinusite chronique avec polypes nasaux. Dans ces cas, les éosinophiles peuvent devenir hyperactifs et contribuer à une inflammation persistante, entraînant des symptômes tels que des difficultés respiratoires, des poussées fréquentes et une diminution de la qualité de vie. Une substance naturelle présente dans l'organisme, appelée interleukine-5 (IL-5), est un facteur clé de la croissance, de l'activation et de la survie des éosinophiles. C'est pourquoi des traitements bloquant l'IL-5 ou son récepteur ont été mis au point. Ces médicaments, administrés par injection, ont démontré leur efficacité pour réduire les poussées de la maladie, diminuer les hospitalisations et améliorer les symptômes et le bien-être général des personnes souffrant d'asthme éosinophilique, de BPCO et de sinusite chronique avec polypes nasaux. Bien que ces traitements soient efficaces, ils sont coûteux et nécessitent des injections à vie, ce qui peut être gênant et pénible pour les patients. Une approche alternative envisagée dans le cadre de ce projet pourrait consister à mettre au point un vaccin qui aide l'organisme à réduire l'activité de l'IL-5 sur une plus longue période. Cela pourrait offrir une option thérapeutique plus pratique et plus rentable aux personnes atteintes de maladies liées aux éosinophiles.

Bénéfices attendus

Malgré le succès relatif des médicaments à base d’anticorps thérapeutiques (anticorps monoclonaux) visant à réguler une molécule du système immunitaire (comme le messager appelé interleukin-5 « IL‑5 » dans l’asthme), ces traitements sont chers et nécessitent de nombreuses injections à l’hôpital. Nous pensons qu’un traitement tel qu’une vaccination contre une molécule du système immunitaire (IL-5) sera aussi efficace et moins couteux et contraignant afin de réduire à long terme les symptômes asthmatiques.

Procédures

Procédure 1 : 1 injection intramusculaire (durée de quelques secondes) 5 fois par animal sur une période de 70 jours. 1 prélèvement sanguin (durée de quelques secondes) 4 fois par animal sur une période de 80 jours. Procédure 2 : 1 injection intramusculaire (durée de quelques secondes) 5 fois par animal sur une période de 70 jours 1 prélèvement sanguin (durée de quelques secondes) 4 fois par animal sur une période de 80 jours 1 administration intranasale (durée de quelques secondes) 12 fois par animal sur une période de 6 semaines Procédure 3 : 1 injection intramusculaire (durée de quelques secondes) 5 fois par animal sur une période de 17 semaines 1 prélèvement sanguin (durée de quelques secondes) 4 fois par animal sur une période de 17 semaines 1 administration intranasale (durée de quelques secondes) 20 fois par animal sur une période de 17 semaines

Impact sur les animaux

Il se peut que l'administration d'un vaccin induise une réaction locale inflammatoire de courte durée. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume requièrent une contention. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs poumons pour des analyses post-mortem. Par ailleurs, les réactions immunitaires induites par les injections empêchent toute réutilisation scientifique ultérieure, ainsi que tout placement ou adoption.

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes moléculaires du système immunitaire sont difficiles, voire impossible à étudier in vitro, en raison de l'implication de plusieurs organes et de l'absence d'un système circulatoire intact. Les thérapies objets d’investigations, ne peuvent pas être remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé avec l’objectif de le réduire autant que possible, tout en ayant suffisamment d'individus pour estimer correctement la variabilité inhérente à la recherche biologique in vivo. Ce nombre inclut le nombre nécessaire de contrôles et la nécessité de reproduire les résultats. L'estimation du nombre minimal d’animaux par groupe a été réalisée par analyse de puissance, sur la base de données publiée pour ce modèle d’asthme et des test statistiques qui seront employés ici.

Raffinement

Mesures prises pour minimiser les atteintes au bien-être des animaux : Les conditions d’environnement sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des maisonnettes/igloo en plus du coton compressé (utilisé par les souris pour construire des nids) pour donner un abri immédiat aux souris, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Il se peut que l'administration d'un vaccin induise une inflammation locale. Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Une désinfection locale (bétadine ou alcool) sera réalisée avant l’injection et un massage à l’eau tiède après l’injection pour minimiser ou éviter l’inflammation locale. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal déterminé par le vétérinaire. L’animal sera mis à mort si une aggravation des signes cliniques est observé malgré le traitement. Des points limites spécifiques et précoces ont été définis pour chaque procédure afin d’anticiper toute douleur et/ou détresse de l’animal. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention manuelle de courte durée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte à adulte » : entre 6 et 15 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.

Toute souris qui montre l'un des signes d'alerte définis est prise en charge puis tuée si son état l'exige. 8 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever foie, cœur et poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines portent une inflammation chronique qui ramène leur survie moyenne à six mois environ, avec problèmes cardiaques, gêne respiratoire et pâleur des oreilles et des pattes. D'autres reçoivent pendant quatorze semaines des régimes enrichis en acides gras ou des traitements, avec injections, prélèvements de sept gouttes de sang sur deux heures, prises de température, ou une administration par voie aérienne chaque jour pendant trois semaines. Le porteur justifie l'effectif en indiquant qu'un groupe de dix suffit à obtenir des résultats fiables et que "tous les animaux nés seront inclus dans les expériences", sans expliquer comment on parvient de là à 8 240.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre le lien entre les problèmes de métabolisme et l’inflammation dans certaines maladies comme les maladies auto-immunes. Pour cela, nous utiliserons des souris qui ont des troubles similaires à ceux observés chez certaines personnes malades. Nous avons déjà pu observer que ces souris produisent des lipides qui accentuent l’inflammation provoquée par la maladie . Nous voulons maintenant savoir si agir sur l’inflammation et le métabolisme en même temps pourrait aider à mieux traiter ces maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait aider à mieux comprendre certaines maladies inflammatoires de type maladie auto-immunes et à trouver de nouvelles façons de les traiter en agissant à la fois sur les défenses naturelles du corps et sur son métabolisme.

Procédures

Certains animaux recevront des régimes alimentaires spécifiques supplémentés en certains acides gras ou des traitements pharmacologiques pendant 14 semaines, puis seront testés pour voir comment leur corps réagit au sucre (glucose) ou à l’insuline, et comment leur foie régule le taux de sucre dans le sang. Ces tests seront espacés d’au moins 14 jours. Pour cela, il faudra prélever environ 7 petites gouttes de sang sur une période de 2 heures. Ces tests seront réalisés sur des animaux vigiles mais manipulés avec précaution. -Injection 1 fois/2 semaines (x3) ; Prélèvement goutte sang 6 fois/2 semaines (x3) D’autres animaux recevront ces mêmes régimes alimentaires spécifiques ou des traitements pharmacologiques pendant 14 semaines, puis seront prélevés au niveau sanguin toutes les 4 semaines pour suivre des marqueurs sanguins inflammatoires. -Administration traitement 2 fois/semaine (x14) ; Prélèvement sang 1 fois/4 semaines (x4) ; Prise de température environ 1min/2 semaines (x7) Des animaux modèles de maladies inflammatoires chroniques recevront des traitements pharmacologiques pendant 3 semaines via une administration par voie aériennes. Des animaux, dont on aura induit l’inflammation seront traités par voie aérienne ou par injection. -Injection 1 fois ; Administration traitement voie aérienne 40 secondes/jour (x21) Ou 30 secondes/jour (x21)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, certains animaux utilisés présentent une inflammation chronique importante, ce qui réduit fortement leur espérance de vie, avec une survie moyenne d’environ 6 mois. Ces animaux peuvent développer des problèmes cardiaques, respirer difficilement ou avoir une peau pâle au niveau des oreilles et des pattes, signes d’un cœur fatigué. D’autres animaux peuvent aussi montrer une faiblesse du système immunitaire, des inflammations des poumons et un poids plus faible que les animaux sains. À noter que certains animaux porteurs d’une seule copie du gène concerné ne développent aucun signe de maladie et vivent normalement.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort pour prélèvement des organes d’intérêt (foie, cœur, poumons...)

Remplacement

Ce projet a besoin d'utiliser des modèles animaux, car les méthodes alternatives comme les tests en laboratoire sur des cellules ne permettent pas d’étudier comment les organes communiquent entre eux, ni comment un changement d’alimentation peut influencer tout le corps, notamment le métabolisme et les réactions inflammatoires.

Réduction

Nous adapterons le nombre d’animaux utilisés en fonction des besoins réels de l’étude. Tous les animaux nés seront inclus dans les expériences. Des groupes de référence seront utilisés pour chaque groupe étudié. Par ailleurs, nos expériences précédentes et une analyse préalable nous indiquent qu’un groupe de 10 animaux est suffisant pour obtenir des résultats fiables d’un point de vue statistique.

Raffinement

Des signes d’alerte spécifiques ont été définis pour repérer rapidement tout problème lié à leur état de santé. Si un animal montre l’un de ces signes, il sera immédiatement pris en charge et euthanasié si nécessaire. Leurs besoins sociaux et biologiques sont bien connus, ce qui permet de réduire au maximum toute douleur ou souffrance. Les animaux vivront par petits groupes de cinq, dans des cages enrichies avec une maisonnette et du coton pour leur confort. Lors des expériences, un anti-douleur sera appliqué sur leur queue pour limiter toute gêne.

Choix des espèces

Les souris adultes ( à partir de 6 semaines) sont les animaux les plus utilisés pour étudier le fonctionnement du système immunitaire et du métabolisme, notamment pour comprendre comment certains régimes alimentaires influencent ces mécanismes. Grâce à de nombreux modèles génétiquement modifiés disponibles, nous pouvons obtenir des résultats fiables et les comparer facilement avec ceux d'autres études.