Système immunitaire

30 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis replacés d'après le porteur, sauf ceux qui atteignent un point limite et sont alors tués. Pendant 314 jours, chaque lapin subit jusqu'à onze interventions : cinq séances d'injections sous la peau en dix points, parfois avec de l'adjuvant complet de Freund qui peut laisser des nodules inflammatoires et un œdème plusieurs jours, et six prises de sang de 2 à 5 mL. Les anticorps obtenus doivent servir à des tests rapides de détection de résidus d'antibiotiques, de toxines ou de polluants. Le porteur reconnaît l'existence de bibliothèques d'anticorps produites en laboratoire, qu'il juge "inadaptées aux contraintes de notre projet".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux de lapin à des fins diagnostiques et scientifiques, en réponse à des besoins environnementaux, en santé publique et en recherche. Ces anticorps constituent des outils essentiels pour la détection de petites molécules d’intérêt, telles que des contaminants environnementaux, des résidus de médicaments ou des toxines bactériennes, et permettent le développement de tests immunologiques sensibles et spécifiques, notamment sous forme de tests rapides ou de dosages de type ELISA. Les anticorps produits dans ce cadre présentent des caractéristiques d’affinité et de spécificité adaptées à leur utilisation dans des dispositifs de diagnostic à grande échelle. En l’état actuel des connaissances, la phase initiale d’immunisation chez l’animal reste nécessaire pour générer une réponse immunitaire polyclonale diversifiée et de haute affinité. Cette étape permet la production de lymphocytes B spécifiques qui ne peuvent pas encore être reproduits de manière équivalente par des approches entièrement in vitro ou synthétiques. Le recours aux animaux est donc strictement limité à cette phase d’immunisation. Les étapes ultérieures de caractérisation et de sélection des anticorps sont réalisées à partir de techniques in vitro, sans réutilisation d’animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à lever un verrou technologique majeur pour la santé publique, l'environnement et la sécurité sanitaire : la détection ultra-sensible et rapide de petites molécules d'intérêt (toxines, polluants, résidus médicamenteux). Ces cibles sont historiquement très difficiles à identifier avec des anticorps murins (souris), qui manquent d'affinité pour de si petits motifs. Le recours au modèle lapin est scientifiquement indispensable car la diversité de son répertoire immunitaire permet d'obtenir des anticorps à très haute affinité, garantissant des seuils de détection jusqu'alors inaccessibles. Les bénéfices socio-économiques et sanitaires se traduiront par le développement de tests rapides sur le terrain (bandelettes, dosages ELISA) répondant à deux enjeux critiques. D'une part, dans le cadre de la lutte contre l'antibiorésistance et les urgences infectieuses, la propagation des bactéries résistantes aux antibiotiques de dernier recours (comme les carbapénèmes) constitue une menace sanitaire mondiale. Les anticorps générés permettront de concevoir des tests de détection rapide utilisables au chevet du patient (sur urines, sang ou colonies) afin d'identifier les mécanismes de résistance en quelques minutes et d'adapter immédiatement le traitement. D'autre part, en matière de surveillance environnementale et de sécurité sanitaire, ces outils permettront le suivi d'ultra-traces de micropolluants et de toxines dans des matrices complexes comme l'eau potable ou les fluides biologiques, assurant ainsi une prévention sanitaire efficace et accessible. Enfin, ce projet s'inscrit pleinement dans une démarche éthique et d'application stricte des 3R. Les procédures sur les lapins se limitent exclusivement à des étapes d'immunisation et de prélèvements sanguins légers sous anesthésie, sans aucune mise à mort requise dans le cadre du protocole. La phase animale est par ailleurs restreinte à la réponse immunitaire initiale, car les gènes codant les anticorps d'intérêt seront directement isolés par clonage pour assurer l'ensemble de la production ultérieure exclusivement in vitro sous forme recombinante. Cela garantit la pérennité de ces outils de diagnostic sans aucun recours ultérieur à l'animal.

Procédures

Les animaux seront immunisés sous contention douce et sous anesthésie locale topique (crème EMLA appliquée 30 à 45min avant le geste), par des injections sous-cutanées multipoints brèves (durée de 2 à 3 minutes par animal pour répartir le volume en 10 points d’injection) d’une molécule appelée immunogène qui correspond à la cible d’intérêt. Chaque animal recevra au total un nombre maximal strict de 5 sessions d'injections dans le cadre du protocole : une injection initiale à J+1 suivie de quatre rappels répartis sur l'étude. Des prélèvements sanguins de 2 à 5mL chacun, également réalisés sous anesthésie locale, seront effectués à intervalles réguliers (8 à 10 jours après chaque injection ainsi qu’un prélèvement final à J+314) afin de suivre la réponse immunitaire des animaux. Ces prélèvements représentent un nombre exact de 6 interventions sur la durée globale du protocole, avec une durée très brève de 1 à 2 minutes par prélèvement. Au total, chaque animal sera soumis à un nombre maximal absolu de 11 interventions sur l'ensemble des 314 jours de l'étude.

Impact sur les animaux

Une douleur et/ou une infection au niveau des points d’injection sont susceptibles de survenir, bien que limitée par l’application d’une anesthésie locale (lidocaïne) au point d’injection ou de prélèvement. En cas d'utilisation d'adjuvant complet de Freund pour l'immunisation primaire, une réaction inflammatoire nodulaire locale ou un œdème peut persister plusieurs jours sur les sites d'injection, générant une sensibilité prolongée qui fera l'objet d'un suivi quotidien strict. La douleur aiguë liée à la piqûre est donc très brève, mais une gêne locale d'intensité légère à modérée peut être ressentie les jours suivants selon l'adjuvant employé. Une douleur légère peut toutefois être ressentie lors des prélèvements sanguins. Les manipulations nécessaires peuvent entraîner un stress transitoire chez certains animaux, de l’ordre de quelques minutes, qui sera minimisé par une habituation préalable à la manipulation et à la contention douce.

Devenir

Tous les animaux (n = 30) seront replacés, sauf avis contraire du vétérinaire ou en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole, auquel cas ils seront mis à mort.

Remplacement

Il existe aujourd’hui des méthodes alternatives permettant de générer ou de sélectionner des anticorps sans recourir directement à l’immunisation d’animaux, (notamment l’utilisation de bibliothèques d’anticorps produites en laboratoire), mais elles restent inadaptées aux contraintes de notre projet pour trois raisons principales. En premier lieu, notre objectif est de détecter des molécules d'intérêt extrêmement petites (comme les carbapénèmes). Pour ces petites cibles, les banques d'anticorps artificielles manquent de sensibilité et échouent à fournir des seuils de détection suffisamment fins dans des échantillons complexes (sang, eau). En second lieu, le lapin possède un système immunitaire unique. Contrairement à d'autres espèces comme la souris, son organisme est capable d'adapter et de perfectionner naturellement la structure de ses anticorps pour épouser la forme de ces très petites molécules. Les technologies actuelles ne parviennent pas à reproduire cette maturation naturelle avec le même niveau de précision. Enfin, notre protocole repose sur l'isolement de ces cellules d'intérêt. L'immunisation initiale de l'animal est indispensable pour stimuler la production de ces lymphocytes B. Une fois ces cellules sélectionnées, nous récupérons leur matériel génétique pour produire définitivement les anticorps en laboratoire, de manière recombinante. Toutes les étapes ultérieures de sélection, de caractérisation et de production à grande échelle des anticorps sont ensuite réalisées exclusivement in vitro, sans recours supplémentaire à l’animal.

Réduction

Chaque production d’anticorps polyclonaux sera réalisée à partir de deux lapins par immunogène. Ce choix tient au fait que les animaux peuvent répondre différemment à une même substance injectée. Certains développent une réponse immunitaire plus forte ou plus adaptée que d’autres. L’utilisation de deux animaux permet donc d’identifier celui qui présente la meilleure réponse immunitaire grâce à une analyse réalisée sur des prélèvements sanguins, sans procédure supplémentaire sur l’animal. Le lapin présentant la réponse la plus adaptée est ensuite utilisé pour la production des anticorps. Le second animal permet de sécuriser la production : il peut être utilisé uniquement si la réponse du premier animal s’avère insuffisante en termes de qualité ou de performance des anticorps obtenus.

Raffinement

Les lapins seront hébergés par paire dans des cages communicantes afin de limiter l’isolement social tout en permettant le suivi individuel des animaux. Les cages seront aménagées pour favoriser le bien-être des animaux : elles comprendront un milieu enrichi avec une tablette, des haltères, des balles, des bâtonnets en bois à ronger et du foin. Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long des procédures par du personnel qualifié. Afin de réduire le stress et la douleur liés aux expérimentations, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale à l’isoflurane et/ou avec anesthésie locale lorsque cela est compatible avec les procédures. Le niveau de douleur attendu ne doit pas dépasser celui ressenti lors d’une injection chez l’humain. Tout animal présentant des signes de souffrance ne pouvant être atténués par des mesures compensatoires (surveillance rapprochée, enrichissement, ajout de nourriture liquide, etc.) sera euthanasié.

Choix des espèces

Le lapin (Oryctolagus cuniculus) a été choisi comme modèle pour la production d’anticorps polyclonaux, en raison de son répertoire immunitaire diversifié et de sa capacité à générer des anticorps de haute affinité et spécificité, particulièrement adaptés à des cibles difficiles à adresser avec les anticorps murins, notamment les petites molécules. Les animaux utilisés seront des lapins adultes, car à ce stade le système immunitaire est pleinement mature. Cette maturité est essentielle pour obtenir une réponse immunitaire robuste et reproductible, garantissant la qualité et la diversité des anticorps produits. De plus, les lapins sont des animaux de taille moyenne permettant de réaliser les injections multiples et prélèvements sanguins répétés dans des conditions de confort et de sécurité optimales, tout en limitant le stress et l’inconfort. Leur utilisation répond ainsi à des critères éthiques et pratiques, tout en assurant la fiabilité scientifique des résultats. Nous utiliserons des lapins âgés de minimum 12 semaines au démarrage des immunisations. Les animaux adultes ont la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses humorales lors des immunisations successives.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut être mise à jeun jusqu'à six fois, gavée sans anesthésie et soumise jusqu'à six prises de sang sous anesthésie, avec des isolements de trente minutes pour recueillir ses fèces. Il s'agit de vérifier si des nanoparticules d'ARN messager avalées déclenchent une réponse immunitaire dans l'intestin, le vaccin oral restant un bénéfice "à long terme". Des essais sur cellules et sur un intestin reconstitué en trois dimensions ont précédé, mais le porteur écrit que ces méthodes "ne reflètent pas entièrement la réalité du corps vivant".

Objectifs

Développer des vaccins plus efficaces contre les infections au niveau des muqueuses est un enjeu important, notamment celles qui commencent au niveau des muqueuses. Les muqueuses sont en effet la porte d’entrée de nombreux virus et bactéries. Parmi elles, la muqueuse intestinale est particulièrement intéressante, car elle contient de nombreux éléments du système immunitaire et peut déclencher une forte défense directement à l’endroit où l’infection débute. Cependant, administrer un vaccin par voie orale est difficile à cause de l’acidité de l’estomac, des enzymes digestives et de la couche de mucus qui protège l’intestin. La pandémie du Covid-19 a permis le développement de nouveaux vaccins utilisant l’ARN messager (ARNm), une molécule naturellement présente dans notre organisme qui donne aux cellules les instructions pour fabriquer des protéines. Cet ARNm est transporté par des nanoparticules composées de lipides. Néanmoins, il n’existe encore aucun vaccin à ARNm pouvant être pris par voie orale. Pour relever ce défi, des nanoparticules combinant des lipides et des polymères pourrait offrir une meilleure protection de l’ARNm et faciliter son passage jusqu’à la muqueuse intestinale. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer si ces nanoparticules peuvent induire une réponse immunitaire après administration par voie orale.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’évaluer les capacités d’immunisation des nanoparticules d’ARNm chez la souris. Les bénéfices scientifiques du projet portent principalement sur la compréhension des mécanismes impliqués dans l’induction d’une réponse immunitaire au niveau de l’intestin (cinétique d’apparition des anticorps, acteurs immunitaires, chimie et composition des nanoparticules utilisées). Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à ARNm administré par voie orale, pouvant être adapté à différents agents infectieux touchant le système digestif.

Procédures

560 souris seront soumises à des mises à jeun (6 fois par animal maximum) et à des injections et/ou administrations (6 fois/animal maximum, durée moins d’une minute par administration), dont 370 maximum seront administrées sous anesthésie (1 fois/animal, durée 5min). Un groupe de 285 souris sera soumis à des prélèvements sanguins (3 fois/animal, durée 1 min) sous anesthésie (3 fois/animal, durée 5 min), prélèvement de fèces (6 fois/animal, durée maximal de l'isolement : 30 min) et des prélèvements de salive (2 fois/animal, durée 1 min). Un autre groupe de 275 souris sera soumis à des prélèvements sanguins (6 fois/animal, durée 1 min) sous anesthésie (6 fois/animal, durée 5 min), prélèvement de fèces (6 fois/animal, durée maximal de l'isolement : 30 min) et des prélèvements de salive (2 fois/animal, durée 1 min).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : - Contention : la manipulation des animaux peut entraîner un stress léger et transitoire. - Anesthésie gazeuse : la phase d’induction peut générer un stress modéré en raison du bruit, de l’odeur et d’une sensation respiratoire désagréable. - Mise à jeun : les souris seront mises à jeun six heures avant l’administration par gavage oral, ce qui peut entraîner une hypoglycémie transitoire, une augmentation du stress et une légère hypothermie. - Administration dans le muscle : l’injection peut induire un inconfort léger au site d’injection. - Administration orale par gavage : ce geste réalisé sur animal vigile entraîne un stress léger lié à la contention et un inconfort transitoire post-administration. - Prélèvement de sang : un risque de lésion des vaisseaux sanguins et des nerfs oculaires existe (risque faible lorsque le geste est maîtrisé). - Prélèvement des fèces : l’isolement temporaire des animaux est indispensable pour prélever les fèces et peut être à l’origine d’un stress léger. - Administration dans le ventre : réalisée sur animal vigile, ce geste peut entrainer un stress léger dû à la contention et un inconfort léger au site d’injection (procédure de classe légère). - Administration d'une molécule qui peut induire des effets transitoires tels que des tremblements, une diarrhée, une piloérection et une augmentation du toilettage.

Devenir

A l’issu des procédures, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de prélever les organes d’intérêts.

Remplacement

Avant de tester les nanoparticules chez l’animal, des expériences ont été réalisées sur des cellules intestinales et immunitaires, ainsi que sur un modèle en trois dimensions reproduisant partiellement l’intestin humain. Cependant, ces modèles ne reflètent pas entièrement la réalité du corps vivant et ne possèdent pas certaines structures de la paroi intestinale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet tout en garantissant des résultats fiables. Au total, le projet prévoit l’utilisation de 560 souris sur une période de 5 ans. Des tests préliminaires ont permis de sélectionner uniquement les formulations les plus prometteuses, ce qui réduit fortement le nombre d’animaux nécessaires. Les formulations seront évaluées et comparées progressivement. Celles ne donnant pas de résultats satisfaisants seront écartées, afin de concentrer les études sur un nombre restreints de candidats. A terme, seules quatre formulations seront retenues pour les étapes finales. De plus, un schéma vaccinal optimisé sera sélectionné afin de réduire davantage le nombre d’animaux utilisés. Cette approche progressive et sélective permettra de limiter au maximum le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans l’ensemble du projet, des mesures seront appliquées afin de limiter la souffrance et le stress des animaux tels que l’ajout d’enrichissement dans le milieu en cas de stress, une mise à jeun de jour ce qui correspond à une période où les animaux sont moins actifs et ont l'habitude de moins manger, des administrations réalisées sous anesthésie générale, des prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale et locale et un suivi accru des souris après chaque manipulation. Des points limites sont définis afin de repérer rapidement tout signe de souffrance ou de problème chez les animaux. Si l’un de ces critères est atteint, des mesures seront prises immédiatement, et si nécessaire, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé dans le développement de vaccin. Dans ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées afin d’analyser la réponse immunitaire induire par des nanoparticules. Des souris de plus de 8 semaines seront utilisées afin d’assurer un système immunitaire mature.

1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser tumeurs et cellules immunitaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules tumorales sous la peau, elles reçoivent de trois à onze injections d'un composé oncolytique associé à des hydrogels de chitosan, et leurs tumeurs sont mesurées au pied à coulisse tous les deux ou trois jours. Les tumeurs peuvent provoquer des douleurs locales, les traitements une perte d'appétit et de poids, pour des retombées cliniques que le porteur renvoie au "plus long terme". Il juge "indispensable" de confirmer in vivo des données obtenues in vitro, et affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier l'activation immunitaire.

Objectifs

Les approches d’immunothérapie anticancéreuse ont profondément modifié la prise en charge de certains cancers. Néanmoins, seule une fraction des patients présente une réponse durable, en particulier lorsque les tumeurs sont peu infiltrées par les cellules immunitaires. Notre composé est un composé oncolytique membranolytique conçu pour induire localement la mort des cellules tumorales. Cette lyse provoque la libération simultanée d’antigènes tumoraux et de signaux de danger, susceptibles d’activer le système immunitaire. Le projet vise à optimiser cette stratégie en combinant notre composé à différents hydrogels de chitosan. Le chitosan présente un double intérêt scientifique : il augmente la rétention intratumorale du composé grâce à ses propriétés de gel visqueux et mucoadhésif, et il possède des propriétés immunostimulantes/adjuvantes susceptibles de « primer » le microenvironnement tumoral en faveur d’une immunité anticancéreuse. Il existe différentes formulations de Chitosan qui influencent la viscosité, la libération locale du composé et l’immunomodulation. Nous commencerons par déterminer les formulations les plus aptes à potentialiser l’effet antitumoral de notre composé. Puis, les procédures suivantes nous permettront de définir les paramètres les plus favorables à l’obtention d’une réponse antitumorale durable. Nous utiliserons d’abord une approche vaccinale qui pourrait permettre d’exploiter l’effet oncolytique et immunogène de de notre composé sans dépendre uniquement d’une injection intratumorale directe, ce qui serait pertinent pour les lésions non injectables ou les maladies disséminées/métastatiques. Nous vérifierons ensuite si le blocage du point de contrôle immunitaire PD-1 améliore l’effet antitumoral du composé avec son chitosan et définirons plus précisément quels types de cellules immunitaires (Cellules T et/ou cellules dendritiques) sont à l’origine de cet effet.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra d’identifier les formulations de chitosan les plus aptes à potentialiser l’activité antitumorale de notre composé. L’étude fournira des informations importantes sur l’impact des propriétés physicochimiques du Chitosan, son efficacité thérapeutique et sa capacité à induire une réponse immunitaire antitumorale. Elle permettra également de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés à cette combinaison. Ces connaissances contribueront à optimiser l’utilisation de notre molécule et à définir les paramètres les plus favorables à l’obtention d’une réponse antitumorale durable. À plus long terme, les résultats pourraient soutenir le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques à visée translationnelle, notamment l’optimisation d’une formulation locale de notre composé destinée au traitement de tumeurs accessibles à une injection intratumorale, avec l’objectif d’améliorer l’efficacité clinique tout en limitant les administrations répétées.

Procédures

Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis trois à onze injections sous anesthésie locale (vigile,

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection de cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements, par contention de l’animal avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse tous les deux ou trois jours. Ces différentes manipulations pouvant entraîner du stress chez l’animal. Les croissances tumorales en sous-cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Les traitements médicamenteux peuvent entraîner une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée chez la souris ainsi qu’un possible changement léger de température.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse des tumeurs et des cellules immunitaires après traitement.

Remplacement

Il est indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du système immunitaire et son effet sur la croissance tumorale.

Réduction

Chaque groupe comprendra 10 souris, soit 9 animaux nécessaires définis par un logiciel de statistique spécifique et 1 animal supplémentaire pour tenir compte des exclusions possibles (tumeurs hétérogènes au moment du traitement, problème comportemental, atteinte précoce d’un point limite ou mortalité non liée au traitement). Les deux sexes seront utilisés, avec des lots non mixtes, afin de détecter d’éventuelles différences liées au sexe sans risque d’accouplement ni agressivité liée au mélange des animaux. Les expériences seront conduites de manière séquentielle : seules les meilleures formulations identifiées dans les procédures initiales seront poursuivies dans les procédures mécanistiques ultérieures, ce qui limite le nombre d’animaux exposés. Les contrôles seront mutualisés lorsque cela est possible et l’étude sera arrêtée si les premières expériences ne soutiennent pas l’hypothèse scientifique.

Raffinement

Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Par ailleurs, il s’agit d’un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

7 806 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Réparties en sept lots, elles reçoivent une injection de cellules tumorales sous anesthésie, puis des injections quotidiennes dans l'abdomen quatre jours par semaine pendant deux à trois semaines, un lot étant d'abord irradié sept minutes trente avant de recevoir une greffe de moelle osseuse. Le porteur affirme que les traitements ne sont pas toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables, et écrit que le raffinement de ces protocoles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché, alors qu'il signale une nécrose possible de la tumeur en fin d'expérience, et une diarrhée avec perte de poids pendant quelques semaines après l'irradiation. Sur les 7 806 souris demandées, la rubrique consacrée à la réduction n'avance aucun calcul d'effectif, seulement le principe de couper chaque tumeur en deux échantillons et d'arrêter une étape si la précédente ne donne rien.

Objectifs

Les cellules dendritiques sont les sentinelles du système immunitaire. Elles patrouillent dans les tissus qu’elles échantillonnent à la recherche de signaux de danger (infection, tumeur), et sonnent l’alerte en activant dans les ganglions lymphatiques les lymphocytes T spécifiques de l’origine du danger. La mise en place d’une réponse des lymphocytes T est essentielle à la lutte contre les tumeurs, Une réponse immunitaire efficace et les stratégies actuelles d’immunothérapies visant à augmenter la réponse T reposent donc sur deux fonctions essentielles des cellules dendritiques : la migration et l’échantillonnage. Nous avons identifié une protéine qui est naturellement activée par les signaux de danger dans les cellules dendritiques au cours d’une réponse immunitaire, et qui augmente leur migration in vitro et in vivo. Cette protéine peut être activée chimiquement par des molécules spécifiques. Nos résultats préliminaires utilisant l’activateur « A1 » de cette protéine ont montré que A1 stimule la migration des cellules dendritiques in vitro sans affecter les fonctions d’échantillonnage, qu’A1 n’est pas toxique in vivo, et que l’utilisation de A1 permet d’augmenter la sensibilité de certaines tumeurs aux traitements par inhibiteur de points de contrôle (thérapies qui stimulent le système immunitaire afin d'éliminer la tumeur). . Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’activateur A1, sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse, seul ou en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, et ce dans différents modèles tumoraux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si la molécule A1 peut être utilisée pour améliorer la réponse aux traitements d'immunothérapie dans les tumeurs solides qui ne répondent actuellement pas ou peu à ces traitements. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminants dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

Dans un premier lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 3 semaines au maximum. Dans un second lot, des souris vigiles seront irradiées pendant 7min30. Les souris seront anesthésiées pour recevoir une injection de cellules de moelle osseuse (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois au– durée anesthésie inf 5 min) Puis les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 2 semaines. Dans un 3ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour pendant 2 jours. Un prélèvement de sang par la sera effectué juste avant la mise à mort des souris. Dans un 4ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules fluorescentes seront injectés aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 5ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 6ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie

Impact sur les animaux

Les effets indésirables observés sont ceux liés au développement de tumeurs en sous-cutanée sur le flanc des animaux. Etant donné que nos observations se font à des temps précoces de la croissance tumorale, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids chez les souris pendant quelques semaines. Les différents traitements sont non toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris. Leur administration entrainera une légère douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même.

Devenir

Dans toues les procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nos résultats in vitro ont démontré le potentiel du composé A1 pour stimuler la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes moléculaires associés. Pour analyser les effets sur la réponse immunitaire anti-tumorale de ce composé, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu, entre deux tissus (par exemple la tumeur et les ganglions), et les effets sur la croissance tumorale et sur la réponse immunitaire, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre projet est basé sur une suite d’étapes expérimentales dont les résultats conditionnent le passage à l’étape suivante. Nous ne procéderons à l'étude de la manière dont la réponse immunitaire est précisément affectée par le traitement que dans le groupe de souris traitées pour lesquelles nous observons un effet positif du traitement sur la croissance de la tumeur. Les résultats seront analysés par des approches statistiques.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement tous les deux jours (poids, aspect et comportement). En effet, conformément aux guides de la Commission Européenne et aux recommandations internationales en cancérologie expérimentale, le raffinement de ces modèles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché pour déterminer des points d’arrêt les plus précoces possibles. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de mettre en place des points-limite adaptés. L’atteinte d’un point-limite conduira à la mise en place de soins de support voire à la mise à mort de l’animal si la souffrance ne peut être soulagée. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation. Un apport de fluide injectable sera également assuré pour en cas de déshydratation. Les gestes nécessitant une immobilisation de l’animal seront effectués sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études en immunologie anti-cancéreuse, de par la proximité de son système immunitaire avec le système immunitaire humain. C’est également dans ce modèle murin que nous avons à notre disposition les modèles génétiques indispensables à ce projet (souris déficientes pour la protéine d’intérêt, cible de A1). Stade adulte entre 8 et 24 semaines Nous souhaitons travailler sur un système immunitaire adulte.

Pour comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire, 640 souris reçoivent une injection de cellules tumorales, parfois au cours d'une chirurgie de quinze à vingt minutes sous anesthésie générale. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour prélever la tumeur, les ganglions lymphatiques drainants, le foie, la rate et le sang. Entre-temps, elles reçoivent des injections de traitements expérimentaux une à deux fois par semaine pendant deux à quatre semaines, leur tumeur étant mesurée deux fois par semaine. Le porteur indique que les souris dont la perte de poids devient importante, dont le comportement s'altère ou dont la tumeur grossit trop seront mises à mort immédiatement.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire. Dans certains cas, les défenses de l’organisme ne reconnaissent pas ou n’attaquent pas efficacement les cellules cancéreuses. L’objectif est de comprendre les mécanismes responsables de cette perte d’efficacité du système immunitaire et d’identifier des moyens de le réactiver. À terme, ce projet vise à améliorer l’efficacité des traitements existants, notamment l’immunothérapie, et à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les cancers du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire et le rôle des ganglions lymphatiques proches de la tumeur dans ce phénomène. Les résultats devraient : • identifier les mécanismes qui empêchent le système immunitaire d’attaquer efficacement les cellules tumorales ; • comprendre comment les tumeurs modifient leur environnement pour favoriser leur développement ; • déterminer si certaines approches thérapeutiques peuvent améliorer l’efficacité des immunothérapies en réactivant les défenses immunitaires. À terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des principaux cancers du foie.

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales afin de provoquer le développement d’une tumeur. Dans certains cas, cette injection pourra être réalisée lors d’une intervention chirurgicale courte sous anesthésie générale. Les animaux seront ensuite suivis régulièrement, avec des mesures de la taille de la tumeur deux fois par semaine lorsque cela est possible. Ils recevront également des injections de traitements expérimentaux, généralement 1 à 2 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume pourront être réalisés, au maximum une fois par semaine. Chaque injection dure quelques minutes. Les interventions chirurgicales durent environ 15 à 20 minutes et sont réalisées sous anesthésie avec prise en charge de la douleur. À la fin de l’expérience, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront des tumeurs au cours de l’étude, pouvant entraîner une gêne progressive et une altération de leur état général. Les principales nuisances attendues sont : - le développement de la tumeur, - le stress lié aux manipulations, - les injections répétées, - et, dans certains cas, les suites d’une intervention chirurgicale. L’état des animaux sera surveillé régulièrement. Des critères stricts d’arrêt seront appliqués afin d’éviter toute souffrance, notamment en cas de perte de poids importante, d’altération du comportement ou d’augmentation excessive de la taille tumorale. Dans ces situations, les animaux seront euthanasiés immédiatement.

Devenir

La mise à mort de l’ensemble des animaux est nécessaire afin de réaliser les prélèvements terminaux indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Les analyses nécessitent notamment le prélèvement de la tumeur, des ganglions lymphatiques drainants et d’autres tissus et organes impliqués dans la réponse immunitaire, tels que le foie, la rate et le sang. Ces prélèvements permettent de caractériser conjointement la tumeur et la réponse immunitaire locale, ganglionnaire et systémique et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. Les animaux ne pourront donc pas être réutilisés à l’issue des procédures.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, nous avons recours autant que possible à des méthodes alternatives, comme des études sur des cellules en laboratoire ou l’analyse de données humaines. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre une tumeur et le système immunitaire dans un organisme vivant. L’utilisation de modèles animaux reste donc nécessaire pour répondre aux questions posées dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Les expériences sont soigneusement planifiées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant la validité scientifique. Plusieurs analyses sont réalisées à partir d’un même animal afin de maximiser les informations obtenues. De plus, certaines expériences ne sont réalisées que lorsque cela est nécessaire, ce qui permet d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Toutes les mesures sont prises pour limiter la douleur et le stress des animaux. Ils sont hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Leur état de santé est surveillé régulièrement tout au long de l’étude. Les interventions sont réalisées par du personnel formé, sous anesthésie lorsque cela est nécessaire, avec une prise en charge de la douleur. Des critères stricts sont définis pour arrêter l’expérience dès qu’un animal présente des signes de souffrance.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été retenue comme espèce modèle pour ce projet en raison de sa pertinence largement démontrée dans l’étude de l’immunologie tumorale et des cancers du foie. Les modèles murins permettent d’étudier dans un organisme immunocompétent les interactions complexes entre la tumeur, le système immunitaire et les organes lymphoïdes secondaires, notamment les ganglions lymphatiques drainants, qui ne peuvent être reproduites de manière fiable par des systèmes in vitro. Les lignées tumorales murines utilisées sont bien caractérisées et permettent de reproduire différents phénotypes immunitaires observés chez l’homme, notamment des tumeurs pauvrement infiltrées par les cellules immunitaires. Par ailleurs, la disponibilité d’outils génétiques, immunologiques et thérapeutiques adaptés chez la souris permet d’explorer de manière contrôlée les mécanismes d’immunotolérance et d’évaluer des stratégies immunothérapeutiques pertinentes pour les cancers primitifs du foie. Des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux présentent une physiologie stable et un système immunitaire mature, ce qui est nécessaire pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection sous anesthésie générale puis dix injections sur animal vigile, et celles portant la tumeur TC-1 quatorze anesthésies générales de plus pour le suivi par imagerie, la croissance tumorale et l'immunothérapie pouvant entraîner une perte d'appétit et de poids. L'objet est de reproduire par une combinaison d'anticorps les signaux qu'émettent les cellules tumorales mourantes, afin de renforcer une immunothérapie déjà employée en clinique. Les retombées annoncées contre le cancer du poumon sont placées à long terme, quand le porteur affirme dans le même résumé qu'aucune technologie ne permet de reconstruire un système immunitaire fonctionnel hors de l'animal, et que le recours à "un organisme complet fonctionnel (la souris)" est "indispensable".

Objectifs

Certaines thérapies anticancéreuses induisent une mort cellulaire immunogène (immunogenic cell death, ICD), une forme de mort cellulaire régulée capable de déclencher une réponse immunitaire antitumorale durable grâce à l’émission coordonnée de signaux de danger (damage-associated molecular patterns, DAMPs. Nous avons démontré, dans un projet précédent, qu’une reconstitution de ces signaux de danger grâce à des lignées cellulaires génétiquement modifiées est suffisante pour induire une mémoire immunitaire durable et renforcer la sensibilité des tumeurs au blocage du point de contrôle immunitaire PD-1. Fort de ces résultats mécanistiques, nous développerons une stratégie thérapeutique visant à reproduire pharmacologiquement les fonctions immunostimulatrices de ces signaux. Nous évaluerons une combinaison d’anticorps monoclonaux anti-CD47 et anti-CD39 associée à un agoniste de HMGB1 (RS-09) afin de reproduire in vivo les principales conséquences immunologiques induites par les DAMPs. Cette approche sera systématiquement combinée au blocage du point de contrôle immunitaire PD-1, dans un contexte thérapeutique directement compatible avec la pratique clinique et présentant ainsi un potentiel translationnel nettement supérieur à celui d’approches reposant sur des cellules tumorales génétiquement modifiées (projet précédent). Démontrer l’efficacité de cette combinaison sur la croissance tumorale constituera ainsi une validation préclinique robuste de notre stratégie thérapeutique.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de valider, dans des modèles précliniques, une nouvelle stratégie pharmacologique antitumorale efficace avec l’utilisation de combinaison d’anticorps et d’agoniste. Nous pourrons mettre aussi en évidence que cette stratégie sera possiblement applicable contre plusieurs types de cancer. À long terme, cela permettra le développement de nouvelles immunothérapies combinatoires contre le cancer du poumon, plus adaptées aux patients et beaucoup mieux tolérées.

Procédures

Les souris seront manipulées régulièrement (

Impact sur les animaux

Diverses procédures (immobilisations et injections) peuvent provoquer du stress chez l'animal et une légère douleur transitoire au point d'injection. La croissance tumorale et l'immunothérapie peuvent entraîner une perte d'appétit modérée, qui peut à son tour entraîner une perte de poids modérée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter divers organes pour des analyses immunologiques.

Remplacement

L'utilisation d'animaux vivants est indispensable car ce projet vise à tester l'efficacité des traitements par l'activation du système immunitaire. De nos jours, il est impossible de reconstruire un système immunitaire fonctionnel in vitro/ex vivo ou in silico à cause de la limite des technologies actuelles. Il n’y a, en effet, aucune technologie existante qui le permette. C’est pourquoi le recours à un projet sur un organisme complet fonctionnel (la souris) est indispensable.

Réduction

Une analyse statistique a été réalisée pour calculer le nombre d'animaux requis. Plusieurs paramètres seront suivis sur chaque animal (croissance tumorale, survie) et plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) afin d'extraire un maximum de données pour cette expérience. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Nous avons établi une grille de score regroupant les critères relatifs au bien-être de l’animal, elle sera utilisée tout au long du projet, les points limites précoces y ont été définis et seront strictement appliqués. Par ailleurs, des mesures seront prises pour limiter le stress : plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme et disposant de nids et de tunnels en carton. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale ou non selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Les points d’injections pour les traitements seront alternés d’une fois à l’autre.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons: - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - La souris est un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 semaines pour s'assurer que l'organisme a terminé son processus de développement et que le système immunitaire est pleinement fonctionnel.