Système immunitaire
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Etude du rôle d’un peptide antimicrobien dans le système nerveux central chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie crânienne pour injecter un adénovirus dans le cerveau, une induction d'encéphalomyélite auto-immune provoquant une paralysie progressive des membres, puis une mise à mort par perfusion intracardiaque, pour étudier le rôle d'un peptide antimicrobien dans la sclérose en plaques. Le porteur mentionne des "tests comportementaux" sans préciser lesquels, et indique que la paralysie culmine quinze jours après l'induction avant de devenir chronique. Il affirme que les tests de comportement et l'étude de la neuroinflammation nécessitent des modèles in vivo.
Objectifs
Les peptides antimicrobiens sont des acteurs majeurs de l’immunité dans tous les organismes vivants. Largement produits au niveau des surfaces épithéliales, la première fonction décrite de ces peptides est de protéger contre l'exposition continue aux micro-organismes environnementaux de part leur fonction microbicide. De plus, ces peptides sont des molécules immuno-régulatrices dont l’implication dans de nombreuses maladies auto-immunes a été démontrée (diabète de type 1, arthrite rhumatoïde, lupus...). Enfin les peptides antimicrobiens modulent aussi directement la fonction de cellules non immunitaires telles que les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale ou cutanée. Un peptide antimicrobien est exprimé dans le système nerveux central à la fois en condition basale et inflammatoire. Ce projet a pour but de comprendre le rôle de ce peptide antimicrobien à la fois dans le fonctionnement normal du système nerveux et dans le dévelopment de la slérose en plaque, une maladie autoimmune affectant le système nerveux central. Pour cela, nous inhiberons l’expression de ce peptide dans des souris sauvages au moyen de l’injection d’adénovirus. Nous étudierons le comportement de ces animaux à l’aide de différents tests comportementaux et le dévelopment de la sclérose en plaque dans un modèle induit de la maladie (encéphalomyélie autoimmune expérimentale).
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de comprendre le rôle d'un peptide antimicrobien exprimé dans le système nerveux central aussi bien en condition basale (comportement) qu’en condition inflammatoire (encéphalomyélie autoimmune expérimentale). Ce projet pourrait ainsi mettre à jour une nouvelle cible thérapeutique pour des troubles du comportement, de la mémoire ou de la concentration et pour la sclérose en plaque.
Procédures
-Procédure chirurgicale de 30min pour l'injection intracebrale des AAV. -Injection intrapéritonéale , tests comportementaux, mise à mort par perfusion intracardique. -induction d'encéphalomyélie autoimmune expérimentale
Impact sur les animaux
-Procédure chirurgicale de 30min sous anésthésie générale. -Injection intrapéritonéale d'anesthésiques induit (douleur de quelques secondes), tests comportementaux peuvent induire un stress, mise à mort par perfusion intracardique sous anésthésie générale. -induction d'encéphalomyélie autoimmune expérimentale est caractérisée par une paralysie progressive des membres inférieurs qui culmine 15 jours après induction de la maladie et diminue partiellement pour ensuite devenir chronique.
Devenir
-Mise à mort à la fin de la procédure pour collecte des tissus post-mortem.
Remplacement
Pour réaliser les tests de comportement et évaluer le développement de la neuroinflammation, nous devons utiliser des modèles in vivo. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques.
Réduction
L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Pour la robustesse de l’analyse statistique des expériences, chaque groupe comparé deux à deux doit comporter un minimum de 20 animaux par expérience pour effectuer un test statistique.
Raffinement
-nombre d’individus par cage : entre 3 et 5 pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Selon le plan d’action défini, par les expérimentateurs : gestion de l’analgésie; Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique. Concernant spécifiquement les souris atteintes d'encéphalomyélie autoimmune expérimentale: nourriture humide (gel nutritif) en fond de cage. La perfusion intracardiaque est réalisée sous anesthésie générale et analgésie.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Les souris C57BL/6 seront utilisées à l’âge de 8 semaines quand le développement du système nerveux central est terminé.
Etude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’induction d’une immunité protectrice suite à un traitement par anticorps monoclonaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Dès huit jours après leur naissance, et jusqu'à trente jours, des souris sont infectées par un virus que le résumé ne nomme pas, puis traitées par anticorps monoclonaux, avec des injections dans l'abdomen aux jours 0, 2 et 5. 216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objectif est de comprendre comment ce traitement induit une immunité antivirale durable, en vue d'immunothérapies futures, et une partie des souris porte une modification génétique qui inactive le récepteur étudié. Le porteur justifie l'emploi de souris si jeunes par la reproductibilité de la propagation virale, et classe la procédure en souffrance légère parce qu'elle est arrêtée avant l'apparition des symptômes.
Objectifs
Les anticorps monoclonaux (AcM) sont des molécules dérivées du système immunitaire qui ont un fort potentiel thérapeutique (thérapies ciblées). Une quarantaine sont utilisés pour traiter le cancer et les maladies inflammatoires et plus de 300 sont en cours de test clinique. Ils sont maintenant aussi considérés avec un intérêt grandissant pour traiter les infections virales graves comme celles par le VIH (virus de l’immunodéfience humaine), Virus de la grippe, Ebola, Zika, .... Cependant, leurs conditions d’utilisation ne sont pas encore optimisées. L’amélioration des immunothérapies par des AcM est donc un enjeu médical majeur. L'une des découvertes importantes de ces dernières années a été la mise en évidence que le traitement par des AcM des animaux infectés et/ou développant des tumeurs, peut induire une immunité protectrice à long-terme. En d'autres termes, les animaux infectés, ou présentant des tumeurs, et traités par AcM survivent sans signes pathologiques grâce à l'induction d'une forte réponse immunitaire protectrice dirigée contre le virus et/ou la cellule tumorale. Dans ce cadre, il est maintenant important d’idéntifier les mecanismes impliqués afin d'optimiser, à terme, l’efficacité thérapeutique des futures immunothérapies par AcM. Ceci, qui est le but principal de l’ensemble de nos recherches, n’est pas réalisable chez l'Homme. Pour progresser dans cette perspective, les expérimentations animales sont donc indispensables.
Bénéfices attendus
Le projet dévrait permettre d'identifier un rôle clé des IFN-I dans l'induction d'une réponse immunitaire antivirale. Ceci pourrait permettre le développement d'immunothérapies antivirales améliorées basées sur les IFN-I.
Procédures
La procédure inclut des injections à jour 0, jour 2 et jour 5, et des prélèvements terminaux. La durée des injections est de moins de 5 secondes chacune.
Impact sur les animaux
Le projet inclut seulement une procédure de degré léger. On ne s'attend pas à des effets indésirables particuliers sur les animaux car la procédure est arrêtée avant le dévelopement de la pathologie et l’apparation des symptômes. Les seuls effets indésirables potentiels se limitent aux conséquences d'une piqûre d'aiguille au niveau de l'abdomen (irritation très locale et temporaire).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever les organes d'intérêt.
Remplacement
Le but du projet est d’identifier les mécanismes impliqués dans l’induction d’une immunité antivirale protectrice suite à un traitement par anticorps monoclonaux (AcM) afin d'optimiser, à terme, l’efficacité thérapeutique des futures immunothérapies par AcM. Ceci nécessite un modèle expérimental doté d’un système immunitaire complexe (et complet) et permettant l’étude intégrée de la réponse immunitaire dans un véritable contexte pathologique. Ceci étant difficilement possible chez l'Homme, afin de progresser dans cette perspective les expérimentations animales sont indispensables. Des méthodes alternatives (études in vitro) peuvent être complementaires mais ne peuvent pas se substituer à l’utilisation des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux a été défini grâce à un logiciel spéifique pour réduire au maximum leur nombre : 12 souris par condition de traitement sont nécessaires pour atteindre une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Toutes les expériences seront réalisées à des temps précoces après infection et traitement, dans la phase pendant laquelle les animaux ne présentent aucun signe pathologique. Les actes techniques réalisés (injections) sont peu invasifs et conformes aux récommendations des textes de référence. Aucun signe de souffrance (changement de comportement, poil hérissé, perte de poids,….) n’est observé après la réalisation de ces actes. Des mesures destinées à réduire la contrainte des animaux ont été prévues : enrichissement du milieu (carrés de cellulose, cabanes, …). Tout au long des expériences, une observation régulière du bien être des souris sera effectuée. Tout animal présentant un événtuel signe de souffrance sera soigné ou euthanasié.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris pour lesquels des données scientifiques de la réponse immunitaire sont bien établies et des nombreux outils sont disponibles pour étudier de façon approfondie la réponse immunitaire. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire complet ainsi qu’une souche dérivée dont les animaux ont été génétiquement modifiés pour l’inactivation du récepteur étudiét. A noter que cette dernière ne présente pas un phenotype dommageable et ne nécessite pas un hébergement protégé. Le choix de ces souches est justifié par leur système immunitaire compétent et pour leur susceptibilité à l’infection dans le modèle choisi. Le animaux seront utilisés à partir de 8 jours post-naissance jusqu'à 30 jours post-naissance. Plus précisement, les animaux doivent être infectés à cette âge pour avoir des résultats reproductibles en ce qui concerne la propagation virale ainsi que l’initiation et le développement de la pathologie.
Evaluation de la réponse T CD8 contre le virus de la dengue induite par un vaccin peptidique chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
180 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections intramusculaires d'un candidat vaccin peptidique contre la dengue sous anesthésie, ainsi qu'une à deux prises de sang par voie rétro-orbitale, avant d'être tuées pour prélèvement des organes. Le porteur indique qu'aucun signe clinique n'est attendu, le vaccin étant "faiblement immunogène", et que les mâles sont écartés pour éviter le stress lié à un dominant. Il conclut que la réponse immunitaire antivirale ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
La dengue ou « grippe tropicale » est une maladie virale transmise par piqûre de moustique. Chaque année, on rapporte 400 millions de cas de dengue dont 500 000 cas sont associés à des fièvres hémorragiques. A l’heure actuelle, il n’existe pas de vaccin efficace sur le marché. L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité d’un candidat vaccin à induire une réponse immunitaire protectrice de type cellulaire contre le virus de la dengue. Pour cela, des souris recevront deux injections intramusculaires du candidat vaccin (Une immunisation et un rappel 21 jours après). Trois adjuvants différents seront comparés afin de choisir celui permettant d’induire la meilleure réponse cellulaire. Les animaux seront mis à mort à 7 jours ou 28 jours post-rappel afin de permettre la mesure de la réponse cellulaire. Ce projet nécessite l’utilisation de 180 animaux.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin permettant l’induction d’une protection efficace contre le virus de la dengue. Ce projet permettrat de démontrer l’efficacité d'un candidat vaccin à induire une réponse immunitaire cellulaire contre le virus de la dengue.
Procédures
2 injection intramusculaires ( 50 uL) à jours 0 et 21 sur animaux anesthésiés à l'isofluorane. 1 à 2 prélèvements sanguins (150 uL) par voie retro-orbitale sur animaux anesthésiés à l'isofluorane.
Impact sur les animaux
Le candidat vaccin est un vaccin de type peptidique, donc faiblement immunogènes. Ainsi, aucun signe clinique (fièvre, perte de poids…) n’est attendu suite à la vaccination. Les adjuvants sélectionnés sont des adjuvants de type liposomes, couramment utilisés pour l’évaluation de l’immunogénicité de candidats vaccin chez la souris. Les composants de ces adjuvants permettent l’induction d’une inflammation locale modérée au niveau du muscle et du ganglion drainant le muscle, nécessaire à l’initiation de la réponse immunitaire. Cependant, ces adjuvants sont très bien tolérés et aucune réaction locale ou systémique n’est observée après une ou deux injections.
Devenir
Mis à mort pour prélèvement des organes (mesure des paramètres immunologiques)
Remplacement
La réponse immunitaire antivirale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différentes localisations (muscle, ganglions drainants, rate …). La procédure ne peut donc être reproduite in vitro.
Réduction
Nous utiliserons 5 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Un test de Mann-Whitney sera réalisé́ car la comparaison porte sur 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée. En considérant des différences de moyenne d'au moins 20% avec une déviation standard inférieure à 5% et un seuil minimal du risque alpha à 5%, un groupe de 5 animaux permet d’obtenir une puissance de test d'environ 0.8. Les expériences seront répétées une fois pour vérifier la reproductibilité́ et la validité des résultats (Giles, J. The trouble with replication. Nature 442, 344–347 (2006)). La procédure sera réalisée avec des femelles. En effet, les souris mâles sont à écarter dans les expériences longues (> 3 semaines) afin d’éviter le stress éventuel généré par la présence d'un mâle dominant dans la cage. Si aucune réponse CD8 n’est observée 7 jours après rappel, le projet s’arrêtera et la réponse à jour 28 ne sera pas évaluée.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sont administrés sous PSM II afin de prévenir tout risque d’infection opportuniste. Précautions particulières : - Immunisation par le candidat vaccin : Les injections intramusculaires sont réalisées sous brève anesthésie à l’isofluorane. Aucun signe clinique, local (douleur à la patte) ou systémique (fièvre, perte de poids…) n’est attendu suite à l’immunisation. Les animaux feront néanmoins l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’injection, le lendemain, puis chaque semaine afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé. Une attention particulière sera portée au boitillement évocateur d’un douleur à la patte ayant reçue l’injection. Si une souris présente des signes de souffrance tel que le pelage hérissé, la prostration ou l'absence de réponse aux stimuli extérieurs, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort par dislocation cervicale. - Prélèvements de sang : un collyre anesthésique est appliqué à l’œil avant la procédure pour réduire toute douleur. Les prélèvements de sang sont réalisés sous brève anesthésie à l’isofluorane. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique (Framycétine).
Choix des espèces
Les éléments immunogènes du candidat vaccin sont capable d'être reconnu par le système immunitaire de la souris. Les souris seront âgées de 8-12 semaines au démarrage de l’expérience, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.
Nouvelle approche d’immunothérapie dans le contrôle du développement d’un carcinome ovarien chez la souris femelle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
285 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un poinçon à l'oreille, six prises de sang dans la veine faciale espacées de quatorze jours et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, pour tester une immunothérapie fondée sur le parasite Neospora caninum contre le carcinome ovarien. Le porteur indique qu'une ascite peut se développer au-delà de 45 jours et provoquer des douleurs, les souris dépassant 20 % de gain de poids étant alors mises à mort. Sur le remplacement, il conclut que les approches in vitro et les organoïdes ne reproduisent pas le "modèle de régulation complexe" recherché.
Objectifs
Le projet, basé sur l’efficacité d’un microorganismee en immunothérapie antitumorale, a déjà montré sa pertinence et son efficacité dans un modèle d’étude de tumeur solide et dans des modèles précliniques murins de cancers de mauvais pronostics. Plusieurs stratégies ont été développées au sein de notre laboratoire afin de contrôler le développement de tumeurs solides, ici appliquées au carcinome ovarien chez la souris. Des premières données ont été obtenues démontrant la capacité du microorganisme à réduire le développement tumoral par différents mécanismes ayant des actions complémentaires. L’objectif du présent projet est d’optimiser cette nouvelle approche d’immunothérapie notamment dans le but de se rapprocher de ce qui est observer en clinique en termes de délai de prise en charge des patients mais également d’améliorer son efficacité. Nous avons d’ores et déjà obtenus au sein de l’équipe des microorganismes capables de sécréter des molécules d’intérêt en immunothérapie qui doivent maintenant démontrer leur supériorité en termes de protection en modèles précliniques murins dont le carcinome ovarien.
Bénéfices attendus
Nous espérons obtenir une inhibition totale du développement tumoral en faisant sécréter par Neospora caninum une ou plusieurs molécules immunothérapeutiques d’intérêt contre le carcinome ovarien. Le but ultime étant de démontrer également son efficacité lors d’une prise en charge tardive ce qui laisserait envisager une nouvelle issue thérapeutique pour les femmes atteintes de cancer ovarien.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à une identification individuelle par poinçon à l'oreille (moins d'une minute / animal), six prises de sang espacées de 14 jours dans la veine faciale (environ 1 minute / animal), de une à cinq injections par voie intrapéritonéale espacées de 14 jours (moins d'une minute / animal).
Impact sur les animaux
La souris, tout comme l’homme, n’est pas un hôte naturel de ce protozoaire (WTNEO) et y est résistant avec une prise en charge rapide par son système immunitaire. Jusqu’à présent, les recombinants testés ont sans exception montré une virulence comparable, c’est-à-dire le plus souvent sans aucun signe clinique. Il peut parfois être observé une légère asthénie pendant 2 à 3 jours. Cependant, si des signes cliniques devaient survenir à la suite de l’infection (5 à 10 jours après), ceux-ci seraient les suivants : asthénie prolongée, prostration, hyporéactivité, piloérection, perte de poids supérieure à 15%. Concernant le développement tumoral, d’après les données bibliographiques, aucun signe de douleur particulier n’est détecté au cours des 45 premiers jours du protocole expérimental. Au-delà de ce temps, une ascite peut se développer reflétant le développement d’une tumeur solide sur les ovaires, ce qui peut entrainer des douleurs ou de la souffrance inutile pour les animaux.
Devenir
A l'issu des procédures les animaux seront mis à mort afin d'étudier la protection conférée en termes de croissance tumorale (nécessité de prélever la tumeur située sur les ovaires et l'omemtum) et également d'étudier la réponse immunitaire associée à cette protection ( prélèvement des rates, ganglions mésentériques, ganglions inguinaux, tumeur).
Remplacement
Une approche in vitro a été développée en amont afin de valider notre hypothèse de travail et l’utilisation de tachyzoïtes sur des cellules immunitaires impliquées dans le contrôle de la tumeur mais cela ne reproduit pas un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie. Des modèles d’organoïdes sont également en cours de développement dans le laboratoire afin d’étudier certains mécanismes.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et nos données préliminaires. L’étude statistique des résultats entre les lots de souris implantées traitées ou non (les lots contrôles ne sont pas intégrer dans les études statistiques, ce sont des animaux utilisés comme référence interne à titre indicatif mais cependant nécessaire dans les dosages effectués) sera réalisée avec le test non paramétrique pour l’étude de la réponse immunitaire cellulaire (dosage de cytokines) ainsi que pour l’étude de protection liée du développement tumoral qui est notre critère d’étude principal.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Le modèle de développement tumoral a été choisi est pour être le moins lourd en termes de procédures pour l’animal (injection intrapéritonéale et non chirurgie orthotopique des cellules tumorales). Un enrichissement positif sera mis en place en introduisant un enrichissement permanent de type igloo dès la semaine d’adaptation des animaux. Ainsi que d’un enrichissement ponctuel, à leur entrée dans la structure puis après chaque procédure, de type carré en kraft pendant 48h pouvant être dépouillé et permettant la confection d’un nid. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique des points limites. L’apparition d’une ascite liée au développement tumoral est possible à partir de 45 à 60 jours, dès lors un suivi journalier et une pesée 3 fois par semaine seront effectués pour détecter aux plus tôt l’apparition de signes cliniques modérés à sévères (absence de toilettage, apparition de poils hérissés, hyporéactivité, dos voûtés et un gain de poids rapide, supérieur à 20%, associé à une dilatation visible de l’abdomen) qui conduira à la mise à mort sans délai des animaux (si un signe sévère ou plusieurs signes modérés cumulés). Concernant le traitement par Neospora caninum, celui-ci n’est pas reconnu ni dans la littérature ni par notre expérience pour induire de symptômes chez la souris. Jusqu’à présent, les recombinants testés ont sans exception montré une virulence comparable, c’est-à-dire le plus souvent sans aucun signe clinique. Il peut parfois être observé une légère asthénie pendant 2 à 3 jours. Cependant, si des signes cliniques devaient survenir à la suite de l’infection (5 à 10 jours après), ceux-ci seraient les suivants : asthénie prolongée, prostration, hyporéactivité, piloérection, perte de poids supérieure à 15% et conduiront à la mise à mort sans délai des animaux. Tout type de médication pouvant interférer avec l’étude de la réponse immunitaire et/ou la multiplication parasitaire est proscrit.
Choix des espèces
Le modèle d’implantation de tumeur est déjà établi et maîtrisé chez la souris qui est un modèle adapté à la greffe de cellules tumorales syngéniques. De plus, tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire chez la souris. Ce modèle de cancer ovarien reproduit avec fidélité le développement du cancer humain. Adulte. Il n’y a pas la nécessité d’utiliser des animaux plus jeunes ou gestants
Etude chez la souris de la toxicité pulmonaire de nouveaux conjugués Anticorps/Drogue
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent de la bléomycine par voie nasale et une injection d'un conjugué anticorps-médicament, pour comparer la toxicité pulmonaire de plusieurs variants d'un anticancéreux en développement. Le porteur indique que l'induction d'une toxicité pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, une baisse d'activité et une perte de poids, les souris étant tuées pour analyse des poumons. Il présente ces études sur animaux comme "essentielles" avant une première administration chez l'humain.
Objectifs
Les modèles animaux permettent l’étude des effets positifs et négatifs de drogues anticancéreuses à l’échelle de l’organisme. Ces études précliniques sur l’animal permettent la validation de thérapies anticancéreuses plus efficaces et moins toxiques pour le traitement des patients. Les études proposées visent à évaluer l’induction d’une toxicité pulmonaire chez l’animal par de nouvelles molécules développées pour être des traitements anticancéreux. Connaître ce paramètre pour un composé permet de prédire l’apparition de toxicités pulmonaires observées chez l’Homme avec ce type de traitements. Les études proposées portent sur différents variants d’un anticancéreux en développement et visent à déterminer lequel des composés présente le profil de toxicité le plus favorable, afin de le qualifier pour un développement préclinique plus poussé.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra d’étudier l’impact du design du conjugué anticorps-médicament (ADC) sur la toxicité pulmonaire. Ces études sont essentielles pour la sélection du ou des ADC induisant le moins de toxicité pulmonaire, et de sélectionner le candidat médicament pour les études précliniques réglementaires avant une première administration chez l’homme.
Procédures
Exposition intra nasale a la bléomycine : nombre 3, durée: quelques secondes. Injection intraperitonéale de conjugués anticorps/médicament : nombre 1, durée : quelques secondes
Impact sur les animaux
L'étude de toxicité porte sur des lésions visibles en anatomopathologie et non des lésions symptomatiques: les doses selectionnées étant 10 fois plus faibles que les MTD (doses maximum tolérée) une perte de poids n'est pas attendue (partie A: avant le go/ no go). L'induction d'une toxicité pulmonaire (partie B: si go) peut entrainer des difficultées respiratoires pendant la durée de l'étude qui peuvent être caractérisées par du stress, une diminution de l'activité et une légère perte de poids. La procédure comporte de l'anesthésie en boite à induction (3 fois) et injection en intraperitoneal (1 fois). Ces manipulations peuvent entrainer du stress et une douleurs lors que l'injection de 2H maximum.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort en fin de procédure pour analyse des poumons.
Remplacement
Cette étude vise à évaluer la toxicité pulmonaire d'un composé anticancéreux, nécessitant ainsi l’utilisation d’un modèle animal. Des études in vitro et in vivo ont été réalisées en amont afin de sélectionner uniquement les molécules ayant le plus grand intérêt thérapeutique.
Réduction
Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 10 souris par groupes.
Raffinement
Avant le début des procédures, les souris seront habituées aux expérimentateurs de l’étude, afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur stress et leur détresse. Des points limites adaptés comme une surveillance biquotidienne, des pesées régulières, des aliments en fond de cage, ou un traitement antalgique, ont été définis pour détecter et minimiser toute souffrance, toute douleur et tout stress des animaux.
Choix des espèces
La modélisation de la toxicité pulmonaire par la bléomycine est une méthode très répandue chez la souris qui permet une quatification précise de l'infiltrat immunitaire sur des coupes d'immunohistochimie. Pour cette procédure, nous avons besoin d’utiliser des souris de 6 semaines ayant un système immunitaire mature pour pouvoir étudier l'inflammation pulmonaire.
Test de nouvelles associations thérapeutiques dans un modèle de contamination interne au plutonium chez le rat.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
212 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une instillation de plutonium dans la trachée sous anesthésie, provoquant une irradiation pulmonaire chronique, puis des traitements par inhalation, injection ou gavage et des séjours en cage métabolique, pour tester des associations destinées à éliminer le radioélément. Le porteur indique que des signes précurseurs de fibrose devraient apparaître et que les animaux sont tués après six semaines ou trois mois pour prélever leurs organes. Il justifie le recours à un "organisme entier" par la biocinétique complexe du plutonium, difficile à reproduire in vitro.
Objectifs
L’objectif de ce projet de recherche est d’améliorer la prise en charge thérapeutique suite à une contamination interne avec du plutonium (Pu). Ces situations peuvent se rencontrer dans les domaines civil et militaire (travailleur du nucléaire, accident, acte de malveillance etc.). Les traitements utilisés actuellement consistent à favoriser l’élimination du radioélément (décorporation) avec une molécule capable de le piéger (chélateur), tel que l’acide diéthylène triamine penta acétique (DTPA) dans le cas du plutonium. Cependant, ce traitement a une efficacité limitée sur les formes peu solubles de plutonium et son effet sur les conséquences biologiques induites à long terme par la contamination n’a pas été étudié à ce jour. Notre approche innovante consistera donc à combiner ce traitement de référence avec des molécules possédant des mécanismes d’action complémentaires afin de favoriser l’élimination du plutonium et de limiter ses effets biologiques. Deux molécules candidates ont été retenues pour ce projet : un anti-inflammatoire, qui devrait permettre de limiter l’inflammation résultant de la contamination et les pathologies associées (fibrose pulmonaire notamment) et un mucolytique, qui devrait favoriser l’élimination du plutonium en fluidifiant les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux. L’association de ces molécules avec le DTPA permettra, en cas de libération de Pu à partir des lésions inflammatoires par exemple, de favoriser son élimination sous forme de complexe Pu-DTPA et d’empêcher sa fixation à d’autres organes. Des expériences préliminaires prometteuses avec ces associations thérapeutiques ont été réalisées sur des modèles cellulaires in vitro. Dans ce projet, nous étudierons l’influence de ces associations thérapeutiques sur la biodistribution du plutonium dans l’organisme et sur les effets biologiques induits, tels que l’apparition de fibroses pulmonaires dans le cas de contaminations pulmonaires.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu suite à ce projet porte sur l’amélioration de la prise en charge thérapeutique en cas de contamination pulmonaire par du plutonium. Cette nouvelle stratégie thérapeutique aura pour objectif de limiter les conséquences biologiques de la contamination à moyen et long terme, au premier rang desquelles l’apparition de fibroses pulmonaires. Les résultats obtenus pourront, à terme, contribuer à l’élaboration de nouvelles recommandations thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront contaminés, sous anesthésie, par une instillation intra-trachéale unique (durée maximale 5 secondes). Les traitements seront délivrés par inhalation (bi-hebdomadaire, durée 15 minutes) et/ou injection (hebdomadaire, durée maximale 5 secondes) et/ou gavage gastrique (administration unique après la contamination, durée maximale 10 secondes) après induction d’une anesthésie générale puis per os (dans l’eau de boisson) durant 6 semaines ou 3 mois.
Impact sur les animaux
Les séjours en cage à métabolisme, d’une durée de 1 à 5 jours maximum, génèreront du stress et de l’inconfort pour les animaux. Les cages à métabolisme sont des hébergements individuels permettant le recueil des excrétas (urines et selles) des animaux en vue d’analyses futures (mesures de la radioactivité par exemple). Les animaux sont placés sur des grilles sous lesquelles un système de séparation et de collecte des excrétas est installé. Ces effets indésirables seront temporaires et disparaitront lors du retour des animaux en hébergement classique. Le plutonium possède une toxicité radiologique, mais pas de toxicité chimique. Il induira une irradiation pulmonaire chronique durant 3 mois au maximum. Ce délai est trop court pour donner lieu à l’apparition de pathologies cancéreuses ou des fibroses pulmonaires déclarées. Des signes biologiques précurseurs devraient néanmoins être observés (lésions préfibrotiques, sécrétion de certaines cytokines, accumulation de collagène, etc.).
Devenir
Tous les animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés 6 semaines ou 3 mois après la contamination afin de prélever différents organes et tissus. Ces prélèvements seront nécessaires pour étudier la biodistribution du plutonium dans l’organisme et l’apparition de phénomènes inflammatoires ou fibrotiques en présence des différents traitements.
Remplacement
La contamination interne par des radioéléments résulte principalement d’une exposition accidentelle par inhalation ou via une blessure. Cette contamination interne implique un passage à travers plusieurs barrières physiologiques indicatives d’un système complexe et intégré. Les approches de décorporation doivent agir à la fois localement (au niveau du site d’entrée) et de façon globale dans l’organisme afin de diminuer la rétention des radioéléments dans les organes cibles (foie et os notamment), et de faciliter leur élimination par les voies naturelles. En raison de la biocinétique complexe des radioéléments dans l’organisme, l’évaluation de l’efficacité des traitements ne peut se limiter à étudier leurs effets sur un type cellulaire particulier ou sur un modèle in vitro non intégré. De même, les anti-inflammatoires sont des molécules agissant sur plusieurs cibles et les mucolytiques fluidifient les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux, phénomène qui ne peut être obtenu sur des modèles in vitro. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier (in vivo). Des expériences préliminaires à ce projet ont par ailleurs été menées in vitro afin de confirmer la pertinence des traitements envisagés en amont du recours à l’expérimentation animale.
Réduction
La stratégie adoptée s’appuie sur les données du laboratoire. L’expérience suggère que des groupes de 5 à 7 animaux sont suffisants pour démontrer une efficacité thérapeutique du DTPA ou d’autres traitements par voie veineuse, par voie pulmonaire ou par voie orale chez le rat après analyse statistique. Un effectif de 6 animaux par groupe a donc été retenu pour la conduite de notre projet. Pour des raisons réglementaires inhérentes au travail en installation nucléaire il n’est pas possible de réaliser une campagne de contamination sur plus de 30 animaux simultanément. Ces contraintes justifient la conduite de plusieurs campagnes de contamination. Par ailleurs, en raison de la variabilité inhérente à la préparation des solutions de plutonium et à la contamination, chaque campagne devra inclure un groupe contrôle contaminé non traité ainsi que les traitements simples avec une seule molécule (6 animaux par groupe). L’analyse statistique comparera chaque groupe traité au groupe non traité et au groupe traité avec une seule molécule (dans le cas des associations de traitements) au sein d’une même campagne.
Raffinement
Après contamination les animaux sont hébergés individuellement dans des cages à métabolisme (5 jours maximum) en plastique transparent à travers desquelles les rats peuvent se voir les uns les autres, s’entendre et se sentir. Un enrichissement de type jouet à ronger est ajouté dans les cages à métabolisme. Par la suite, les animaux sont hébergés en groupe (3 animaux par cage) avec des enrichissements matériels et nutritionnels (tunnel ou boule en plastique, bâtonnets en bois, papier, grosse croquette etc..). La contamination et le gavage des animaux seront réalisés après induction d’une anesthésie générale afin de limiter le stress et l’inconfort lié à ces actes. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 fois par semaine minimum (ou plus si besoin pour expérimentation ou surveillance accrue). Mise en place de points limites identifiés pour ce projet et l’utilisation d’analgésique pour soulager l’animal en cas de souffrance. Une vigilance particulière sera également portée à l’apparition de potentiels symptômes respiratoires (dyspnées, essoufflements, éternuements et toux), une réponse inflammatoire pulmonaire pouvant faire suite à la contamination.
Choix des espèces
Le rat est l'espèce animale retenue pour nos études du fait de la richesse des données issues de la littérature sur la contamination par les radioéléments de la même famille que le plutonium, d'un point de vue de la biocinétique et des tests de traitements de décorporation des radioéléments. En effet, le rat est un modèle pertinent pour la contamination interne pulmonaire : sa taille, supérieure à celle de la souris, permet de réaliser des prélèvements biologiques suffisamment conséquents pour obtenir des niveaux de radioactivité mesurables et des informations exploitables sur un certain nombre de paramètres biologiques. De plus, de nombreuses données historiques obtenues sur cette espèce sont disponibles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront âgés de 4 à 6 semaines au moment de la réception car les risques de contamination interne avec des radioéléments concernent principalement les travailleurs jeunes adultes et adultes). Les rats présenteront initialement des poids allant de 150 à 200 g, de façon à faciliter leur hébergement en groupe et leur assurer un meilleur confort lors du séjour en cage à métabolisme.
Effets combinés de la génétique et du microbiote intestinal sur la réponse vaccinale chez la poule pondeuse.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
400 poules pondeuses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des gavages d'antibiotiques et des prises de sang sur animal vigile, pour mesurer l'effet combiné de la génétique et du microbiote intestinal sur la réponse vaccinale. Le porteur décrit le gavage et la contention comme des sources de stress, et les animaux sont tués à 5, 13 ou 24 semaines pour prélever leur microbiote caecal. Il annonce des retombées directes pour l'industrie avicole, les résultats devant être partagés avec ses représentants.
Objectifs
Deux lignées génétiques de poule pondeuse seront élevées durant 24 semaines pour cette expérimentation. Tous les animaux seront vaccinés suivant le plan de prophylaxie classique de poules pondeuses élevées en plein air. La moitié des animaux élevés seront soumis à un traitement antibiotique, démarrant 3 jours avant la vaccination et durant 3 jours, de façon à altérer la composition du microbiote intestinal. Nous souhaitons de cette manière étudier l’effet combiné d’une altération du microbiote intestinal et de variations génétiques sur la réponse vaccinale. Les animaux seront aussi séparés en deux lots de même taille. L’un aura accès à un parcours extérieur, et l'autre restera confiné dans le bâtiment d'élevage. Nous étudierons ainsi : - 2 lignées différentes - 2 conditions (traités ou non aux antibiotiques) - 2 modes d'élevage (avec accès ou non à l'éxtérieur) Nous suivrons sur ces animaux les variations de différents paramètres immunitaires, du microbiote caecal et de la réponse vaccinale au cours du temps, afin de mesurer l’effet d’une ingestion d’antibiotiques. En plus de la vaccination, nous effectuerons donc des prélèvements peu ou pas invasifs durant la vie des animaux (prises de sang). Enfin nous donnerons les antibiotiques aux animaux par gavage pour nous assurer que tous les animaux ingèrent la même dose.
Bénéfices attendus
La vaccination est la stratégie la plus efficace pour la prévention des maladies infectieuses des animaux d’élevage. Le rôle de la génétique sur la réponse vaccinale est connu mais reste à préciser, tandis que celui du microbiote est suspecté du fait de son rôle sur la régulation de l’immunité, mais reste à prouver. Combiner la sélection génétique pour une meilleure réponse vaccinale avec une stratégie nutritionnelle modulant favorablement le microbiote intestinal pourrait être très efficace. De plus, l’élevage à l’extérieur étant souvent considéré comme l’avenir de l’élevage animal, il est essentiel d’étudier ses effets sur les phénotypes d’intérêt. Dans ce projet nous allons étudier les effets combinés des variations génétiques de l’hôte et de la composition du microbiote caecal sur les réponses vaccinales et le comportement de poules pondeuses afin d’identifier des biomarqueurs génétiques et physiologiques associés avec la magnitude des réponses à plusieurs vaccins. Pour ce faire nous créerons une altération du microbiote soit forte via un traitement antibiotique soit plus modérée via la fourniture d’un accès extérieur aux animaux. Nous étudierons d’une part l’effet du mode d’élevage sur le microbiote, la réponse vaccinale et le comportement des animaux. Nous étudierons d’autre part les liens entre composition du microbiote intestinal et réponse vaccinale et comprotement. En bref, ce projet fournira des biomarqueurs génétiques et physiologiques associés aux réponses vaccinales et au comportement chez la poule pondeuse, et il estimera l’effet d’un accès extérieur sur ces caractères. Il sera conduit sur des lignées commerciales chez qui l’intérêt de la sélection pour tous ces caractères sera directement estimé, assurant une application directe de nos résultats. Les résultats seront partagés avec des représentants de l’industrie avicole pour assurer leur transfert efficace.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu’à deux types d’intervention : des gavages toutes les 24 heures pendant les 3 jours précédant la sortie, et des prises de sangs sur animaux vigiles réalisées par des personnels qualifiés.
Impact sur les animaux
Le gavage est une procédure stressante pour les animaux. Les prises de sang pourront également être une source de stress, en raison de la contention nécessaire et de la piqûre.
Devenir
Il est prévu d’utiliser 400 animaux de 2 lignées de poules commerciales. Ils seront tous utilisés pour des prises de sang et la moitié d'entre eux seront soumis à un gavage . Ils seront tous mis à mort soit au cours de l'élevage à 5 semaines ( 72 animaux) , à 13 semaines (72 animaux) à la fin de l’expérience ( 256) afin de récupérer leurs microbiotes caecaux.
Remplacement
Pour évaluer l’effet des variations génétiques et du microbiote intestinal sur la réponse vaccinale il faut disposer de mesures individuelles sur les animaux. Par ailleurs le statut immunitaire et la réponse vaccinale impliquent des voies physiologiques dans l’organisme entier. Enfin le comportement ne peut être évalué que sur l’animal lui mêm. Le modèle le plus adapté pour évaluer les effets sus-mentionnés sur le poulet est donc le poulet lui-même.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de cette expérience a été déterminé suite à des estimations basées sur la littérature publiée sur l’effet de l’ingestion d’antibiotiques sur la composition du microbiote et sur les résultats de nos propres expérimentations visant à étudier le microbiote intestinal. Les mesures effectuées sur des lots de 24 animaux ont confirmé l’existence d’une large variabilité pour les paramètres immunitaires et la réponse vaccinale, et donc la nécessité de continuer à étudier des lots d’au moins 24 animaux. Au cours du projet actuel, nous prévoyons 50 animaux par lot car 18 seront sacrifiés avant la fin de l’expérience, si bien que les analyses statistiques seront finalement menées sur 32 animaux. Ce nombre est nécessaire pour nous autoriser à utiliser des méthodes statistiques telles que analyses de variance (ANOVA) et pour nous donner un peu de marge pour explorer la variabilité de la réponse vaccinale à des vaccins jusqu’à présent non étudiés par notre groupe . Nous testerons le contraste de différentes variables (dosages d’anticorps, paramètres immunitaires, composition du microbiote intestinal) entre groupes d’animaux traités aux antibiotiques (8 lots de 12 animaux), et non traités (4 lots de 24 animaux), et entre lignées génétiques pour un même traitement (24 animaux sans traitement, 12 avec) par analysees de variance.
Raffinement
Les poussins sont élevés en parquets collectifs, avec des enrichissements du type ficelles, balles en plastique, bloc à piquer. Ils seront visités 2 fois par jour et toute manifestation de symptômes persistants tels que définis dans le point limite engendrera la mise à mort des animaux par le personnel qualifié. A l’extérieur les parcours seront enrichis avec des palettes, pour diminuer l’anxiété des animaux et faciliter leur sortie. Les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées, notamment pour les prises de sang et le gavage.
Choix des espèces
Notre étude vise, à terme, à réduire l’incidence de maladies chez la poule d’élevage par une approche préventive combinant vaccination et nutrition. Il est donc nécessaire d’effectuer nos expérimentations chez la poule domestique (Gallus gallus), qui a des réponses spécifiques que nous devons prendre en compte. Ces animaux seront élevés de leur éclosion à 24 semaines d’âge, temps nécessaire pour s’assurer que tous les animaux aient commencé à pondre afin de pouvoir collecter différentes données individuelles de production pour tous les animaux Par ailleurs nous souhaitons évaluer la persistence dans le temps de la réponse vaccinale et cette durée d’élevage est un bon compromis entre coût de l’expérience et réalisme des données obtenues par rapport à la durée réelle de l’élevage commercial (qui est supérieure à 24 semaines).
Analyse de la réponse immunitaire innée mise en place lors d’infections respiratoires chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
5 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus de la grippe ou le pneumocoque par voie nasale sous sédation, à des doses conçues pour reproduire une infection sévère qui, non contrôlée, entraîne la mort des animaux en quelques jours. Le porteur indique que les souris perdant 25 % de leur poids ou devenues léthargiques sont tuées, et que toutes sont euthanasiées pour prélever poumons et rate. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de la réponse immunitaire d'un "organisme entier".
Objectifs
Les pathologies respiratoires ont un impact médical et socio-économique très important. L’organisation mondiale de la santé classe ainsi les pneumonies et la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) parmi les dix principales causes de décès au niveau mondial. En particulier, les infections respiratoires représentent plus de 2 millions de décès par an. Ces chiffres soulignent la limite des traitements anti-infectieux actuels, comme l’absence de traitement efficace sur la plupart des virus respiratoires ainsi que la résistance aux antibiotiques des bactéries qui atteint désormais des proportions dangereuses dans toutes les régions du monde. Par exemple, l’efficacité du vaccin contre le virus influenza a été démontrée depuis de nombreuses années mais les perpétuelles mutations de ce virus obligent une nouvelle vaccination chaque année. Ainsi, le virus de la grippe provoque toujours des épidémies saisonnières avec une forte morbidité et plus occasionnellement des pandémies de grande envergure. Un autre exemple est la recrudescence de pneumonies dues à la bactérie Streptococcus pneumoniae. L’immunité innée joue un rôle clé dans la réponse de l’hôte contre le pneumocoque permettant le confinement de l’infection et la destruction de la bactérie. Néanmoins, dans certains cas, le système immunitaire peut être dépassé aboutissant à une pneumonie, une méningite et/ou une septicémie. Bien que des traitements aient été développés (vaccins polysaccharidiques multivalents, antibiotiques), les pneumonies à pneumocoques restent à très forts risques de mortalité. Ainsi, les infections respiratoires ne sont actuellement en aucun cas sous contrôle. Ces données soulignent donc le besoin urgent de développer une recherche innovante visant à mieux comprendre la physiopathologie des pathologies respiratoires. Les progrès dans les années à venir devront venir de la découverte de nouvelles cibles et/ou de molécules anti-infectieuses mais également par une régulation des réponses immunitaires de l’hôte. Cette dernière approche présentant l’avantage de ne pas cibler directement l’agent infectieux et donc de s’affranchir des problèmes de variabilité des pathogènes décrits ci-dessus. L’objectif des projets de recherche que nous développons est ainsi de caractériser le rôle et les mécanismes d’activation des cellules du système immunitaire inné au cours des infections pulmonaires afin de permettre le développement de molécules immunomodulatrices ciblant ces cellules.
Bénéfices attendus
Comme décrit précédemment, d’autant plus souligné par la récente pandémie lié au pathogène respiratoire SARS-COV2, les pathologies respiratoires infectieuses sont une préoccupation majeure mondiale. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc essentielles pour améliorer le pronostic vital des personnes infectées. Une des pistes est de pouvoir optimiser notre système de défense, mais cela nécessite une meilleure connaissance de ce dernier. Dans ce contexte, notre objectif vise à mieux comprendre le rôle du système immunitaire inné dans les mécanismes de défense liés à ces infections respiratoires afin de pouvoir envisager de nouveaux traitements. Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur la mise en place de la réponse immunitaire pulmonaire suite à des infections d’origine virale et microbienne. Plus particulièrement, nous travaillons sur des populations de cellules découvertes récemment et résidentes dans le poumon. Cette localisation leur permet de s’activer très rapidement lors de l’arrivée d’un pathogène dans le tissu pulmonaire. Une meilleure connaissance de ces cellules pourrait permettre de 1) comprendre des différences de susceptibilité de certains patients aux infections respiratoires, 2) identifier des biomarqueurs cellulaires ou moléculaires de susceptibilité et 3) identifier des cibles thérapeutiques afin de moduler la réponse immunitaire de l’hôte et non pas en ciblant le pathogène.
Procédures
Toutes les hypothèses, issues de la littérature, seront évaluées, au préalable, sur des modèles in vitro (culture cellulaire) et ex vivo (cellules issues de donneurs de sang humains). Seuls les paramètres d’intérêts seront sélectionnés afin d’être testés in vivo chez la souris. En effet, il n’existe pas de modèles in vitro ou ex vivo capables de reproduire la complexité d’une réponse immunitaire d’un organisme vivant. Afin de reproduire les infections par des pathogènes respiratoires, les souris seront infectées par des suspensions contenant soit le virus de la grippe soit la bactérie pneumocoque. Pour cela, les souris seront sédatées par une injection intrapéritonéale d’un mélange Kétamine/Xylazine puis quelques gouttes (40µL) de la suspension contenant l’agent pathogène ou de la solution contrôle seront déposées sur les narines des animaux afin qu’ils les respirent. Cette intervention dure quelques secondes puis les souris seront surveillées jusqu’à leur réveil (15-20 min). Ainsi les pathogènes se déposent dans les voies aériennes supérieures et peuvent infecter les cellules pulmonaires, à l’image d’une infection chez l’homme lorsque les microbes sont transmis dans des gouttelettes projetées lors d’un éternuement ou d’une toux. Deux différentes doses seront testées : une dose modérée mimant une infection modérée et une dose forte permettant de reproduire une infection sévère. Sur les animaux de la procédure 1, trois prélèvements sanguins seront réalisés en submandibulaire (1 avant l’infection et 2 à différents temps après l’infection) afin de suivre certains paramètres inflammatoires systémiques. Cette procédure dure quelques secondes. Les souris seront toujours anesthésiées avant de procéder au prélèvement sanguin. Tout au long des expériences, les souris seront soigneusement surveillées quotidiennement pour détecter les changements physiques ou comportementaux. Ainsi, le poids et les comportements, seront relevés chaque jour. La réponse immunitaire pulmonaire sera analysée à différents temps : deux temps (précoce et tardif) lors des infections par le virus de la grippe et par le pneumocoque. Pour cela, les animaux seront euthanasiés par une injection intrapéritonéale létale de pentobarbital (doléthal). Après la mort de l’animal, différents fluides biologiques (sang et lavage broncho-alvéolaire) et organes (poumons et rate) seront collectés pour analyser les réponses immunitaires mises en place.
Impact sur les animaux
Dans les cas les plus graves, la mort d’un patient suite à une infection respiratoire est la conséquence soit d’un défaut de contrôle du pathogène, soit d’une inflammation massive des voies respiratoires induite par le pathogène, provoquant un syndrome de détresse respiratoire aiguë. Notre modèle d’infection par le pneumocoque chez la souris est représentatif de la 1ere catégorie. En effet, il provoque une infection très aiguë et rapide qui, s’il n’est pas contrôlé, aboutit à la mort des animaux en quelques jours. A l’inverse, le modèle d’infection grippale reproduit très bien la seconde catégorie où les mécanismes inflammatoires sont dérégulés et aboutissent à la mort des animaux à des temps plus tardifs. Ces infections entrainent donc des dégâts pulmonaires qui peuvent fragiliser l’animal et provoquer des troubles respiratoires, une perte de poids et une réduction de l’activité. Afin de mimer une infection pulmonaire par voie aérienne, les souris seront infectées par voie intranasale. Cette procédure nécessite une anesthésie générale qui peut provoquer une nuisance à l’animal (refroidissement, stress). Cette instillation pulmonaire des pathogènes entraine également l’arrivée de liquides dans les poumons. Cette procédure provoque un stress pulmonaire qui se caractérise par une respiration saccadée et accélérée pendant 1 ou 2 minutes. Le liquide est ensuite rapidement absorbé par les tissus et lors du réveil de la souris, la respiration est revenue à la normale. Par ailleurs, chaque injection intrapéritonéale pour réaliser les anesthésies provoque un stress et une douleur au point d’injection (piqûre).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. En effet, concernant la procédure 1, l’ensemble des animaux auront été euthanasiés lors de la procédure afin de collecter la rate et les poumons pour analyser les réponses immunitaires se développant dans ces organes. Il ne restera donc pas d’animaux vivants en fin de procédure. Concernant la procédure 2, les animaux qui survivront à l’infection seront conservés jusqu’à ce qu’ils aient récupérés entièrement leur poids. Les animaux seront alors euthanasiés car ils ne peuvent être ni replacés ni adoptés car ce sont des animaux transgéniques infectés en confinement A2. De plus, la réutilisation de ces animaux n’est pas possible car la procédure subie pourrait drastiquement modifier les résultats d’une étude ultérieure.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de mimer la complexité des réponses immunitaires à l’échelle d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que le modèle murin d’infection par le virus de la grippe et par le pneumocoque est bien établi et maîtrisé par les expérimentateurs. Cependant, nous utilisons au laboratoire, des systèmes de culture in vitro (hybridomes de cellules immunitaires), pour étudier certains paramètres avant de réaliser des expériences in vivo. De plus, nous avons développé des modèles d’analyses des cellules humaines issues de donneurs sains ou de patients atteints par des infections respiratoires et hospitalisés dans des services de pneumologie (pathologie modérée) et dans des services de réanimation (pathologie sévère). Ces modèles nous permettent d’analyser et d’affiner certaines hypothèses avant de les tester in vivo chez la souris. Ils permettent également de confirmer chez l’Homme, les résultats obtenus chez la souris.
Réduction
Tout d’abord, nous tenons à souligner que les expériences in vitro et ex vivo chez l’Homme, limiteront le nombre d’hypothèses et donc le nombre de souris à utiliser. De plus, les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, mais suffisant pour pouvoir réaliser les tests statistiques adaptés. Lors de nos expérimentations, nous comparerons les souris traitées aux souris non traitées, en utilisant un test statistique pour échantillons indépendants. Nous estimons à 15 % minimum la différence de nos moyennes et nous souhaitons une puissance de test de 90% minimum. Pour chaque condition, 16 souris infectées (8 mâles et 8 femelles) et 16 souris non infectées (8 mâles et 8 femelles) seront nécessaires. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …).
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée de façon pluriquotidienne par toujours les mêmes expérimentateurs afin d’habituer les animaux et pour détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. De plus, une pesée quotidienne des animaux sera effectuée. Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi les points limites suivants: - Perte de 25% de leur poids initial -Etat général indiquant une douleur (animal léthargique, ne répondant plus aux stimuli externes, prostré, fermeture totale ou partielle des yeux). Les souris présentant un de ces critères seront euthanasiées.
Choix des espèces
Lors de ce projet, nous utiliserons des souris consanguines. Nous avons choisi la souris (Mus musculus), car elle offre les avantages suivants : - La souris est l’espèce la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires limitant de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. - Les pathogènes utilisés dans ce projet sont identiques à ceux infectant l’Homme. Les résultats obtenus ex vivo sur les cellules humaines pourront être mieux extrapolés aux expérimentations in vivo. - Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. - Notre laboratoire dispose de différentes lignées de souris transgéniques adaptées à l’analyse de la réponse pulmonaire anti-infectieuse. De plus, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 à 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant.
Implication du MIcrobiote dans les maladies CARdiométaboliques (MICAR)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des transferts de microbiote humain par gavage puis des prélèvements de sang, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans les maladies cardiométaboliques. Le porteur précise qu'une souris en inconfort sera sortie du protocole et tuée plutôt que soignée, un traitement pharmacologique risquant de fausser le microbiote étudié. Il qualifie la compréhension du microbiote d'"indispensable" et juge le modèle murin "incontournable" pour ce transfert fécal.
Objectifs
Nos objectifs sont de déchiffrer (i) le rôle physiopathologique du microbiote intestinal dans les pathologies cardiométaboliques, (ii) de découvrir des biomarqueurs liés au microbiote intestinal dans ces maladies (qui pourraient être utilisés soit pour la prédiction ou le pronostique) et enfin (iii) d'effectuer des études sur la preuve du concept de développement thérapeutique pour modifier la dysbiose dans ces maladies et améliorer ainsi la santé de tous. Le premier objectif est de mieux comprendre comment le microbiote intestinal est impliqué dans les maladies cardiométaboliques. À cette fin, nous utilisons l'approche suivante : nous identifions les différences de microbiote intestinal en termes de composition, de fonction ou de production de métabolites chez des cohortes de patients humains à différents stades de gravité de la maladie pour identifier la signature de cibles bactériennes potentielles d'une maladie. Ensuite nous confirmons plus spécifiquement les cibles dans des modèles de souris humanisées dans lesquels nous pouvons transférer les selles de patients bien phénotypes et évaluer le phénotype clinique induit de façon différenciée (la glycémie, la cholestérolémie, la prise de poids, la stéatose, l'inflammation et l'athérosclérose). Ces transferts fécaux chez la souris compareront les patients avec ou sans les maladies ou à différents stades de gravité ou encore avec ou sans un médicament spécifique (en évaluant si le médicament a un impact sur le microbiote intestinal et par la suite sur la santé métabolique ou si le médicament est plus actif chez les patients avec une composition spécifique en microbiote intestinal).
Bénéfices attendus
Les travaux menés depuis 15 ans positionnent le microbiote à l’interface entre organismes vivants et leurs environnements et démontrent son influence considérable sur le fonctionnement de multiples voies métaboliques et d’un grand nombre d’organes, intestin, foie, système immunitaire, cerveau, mais aussi poumons, système cardiovasculaire, rein, os. 50% des métabolites circulants seraient issus du métabolisme bactérien. Le microbiote apparaît ainsi comme un déterminant clé au carrefour de la physiologie et de multiples pathologies en attente de progrès thérapeutiques. Il émerge aussi comme une puissante courroie de transmission des changements environnementaux et ceci en interface directe avec notre horloge biologique. En effet, sa composition en bactéries mais aussi la synthèse des multiples molécules issues du métabolisme bactérien varient en fonction du rythme nycthéméral, de l’alimentation, de la prise d’antibiotiques et de l’exposition aux agents infectieux comme aux polluants. Les modifications du microbiote induites par les changements récents de l’environnement humain semblent ainsi un acteur majeur non seulement dans l’épidémie actuelle de maladies métaboliques et inflammatoires chroniques de cancers, mais également dans la survenue de certains cancers et maladies auto-immunes. La compréhension par une approche ‘holistique’ des effets du microbiote comme des mécanismes qui contrôlent sa composition et son activité métabolique, se révèle donc aujourd’hui indispensable pour mieux appréhender la physiopathogénie de nombreuses maladies, améliorer leur prise en charge et leur prévention. Ce projet permettra de mieux comprendre les interactions entre le microbiote humain et les organes cibles des différents facteur de risque cardiovasculaires afin de pouvoir par la suite, élaborer une thérapie efficace et moins contraignante pour les patients.
Procédures
Les animaux seront tous soumis a 3 gavages de microbiote 3 jours de suite (1800 souris) et de FITC-dextran (max 360). Pour le gavage les animaux doivent être maintenu par contention douce et ferme sur animal vigile afin de ne pas les blesser et ajuster le geste de gavage à leur déglutition/respiration et à tout signe potentiel de douleur. Le gavage dure 4-5 secondes environ. Toutes les prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse (3 maximum par animal sur une période de 114 jours). Une prise de sang dure environ 10-15 secondes. La récolte des fèces sera réalisée sur des animaux vigile qui sont maintenus en cages individuelles environ 30 mn le temps de récolter des fèces fraiches au fond de la cage.
Impact sur les animaux
Les animaux pourrait souffrir d'inconfort (poils hérissés, dos vouté, hypothermie (froid au toucher) ou de comportements anormaux: immobilité, hyperactivité, diarrhée prolongée.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux à la fin des procédures
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l'impact du microbiote humain sur la physiologie de l'hôte ce qui est impossible in vitro, ni possible chez l'homme in vivo. Toutes les expérimentations sur l'animal seront conduites en respectant la règle des 3R.
Réduction
Pour les analyses statistiques, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance permetant une interprétation fiable des résultats. Une visite quotidienne des animaux sera effectuée pour vérifier leur état général et ne pas atteindre un des points limites. Un nombre maximale de 1800 animaux sera utilisé sur une periode de 5 ans. Chaque groupe d'animaux fera l'objet d'une analyse complete et détaillée : suivi de la prise de poids, ramassage des feces fraiche et en fin d'étude les souris seront euthanasiés. Une analyse phenotypique complête sera réalisée sur chaque animal (tissus et contenus intestinaux). Ces analyses exhaustives évitent de multiplier les groupes experimentaux.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Si les animaux devaient souffrir d'inconfort (poils hérissés, dos vouté, hypothermie (froide au toucher) ou comportements anormal immobilité, hyperactivité, diarrhée prolongée, ils seraient alors sortis du protocole et euthanasiés car tout traitement pharmacologique visant à prévenir l'inconfort pourrait affecter le microbiote et créer un biais dans les phénotypes recherchés. Les prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse après application d'un gel ophtalmique.
Choix des espèces
Le besoin d’avoir recours à des modèles expérimentaux permettant d'évaluer des changements de microbiote et leur impact sur la sante après transfert fécal spécifique de matériel fécal humain rend le modèle murin incontournable. De même l'accès aux contenus intestinaux et aux tissus murins ayant cohabité avec un microbiote humain représente un outil de comparaison avec l'homme avant de concevoir des études cliniques plus spécifiques. Ces modèles animaux sont de plus des modèles génétiques de prédisposition aux pathologies cardiométaboliques. Nos études requièrent que les animaux soient transplantés au moment du sevrage (3 semaines) lorsque la fenêtre de transférabilité du microbiote est la plus opportune en raison de l'adaptabilité du système immunitaire. Dans les deux procédures nous devons attendre environ 3 mois pour que les phénotypes cardiovasculaires (athérosclérose) se manifestent. Entre le gavage des fèces et le sacrifice, 13 semaines s'écouleront le temps qu’un équilibre se fasse chez la souris receveuse en termes de stabilité de l’écosystème bactérien en équilibre avec le système immunitaire de l’hôte.
Interet thérapeutique d’un inhibiteur de la MMP9 (JNJ0966) pour le traitement topique du vitiligo en combinaison ou non avec un inhibiteur de JAK
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 78 réutilisées ensuite et les autres tuées pour prélever la queue et la rate. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections sous les coussinets des pattes puis dans la queue, avant l'application d'une crème sur la zone dépigmentée, pour tester un inhibiteur contre le vitiligo. Le porteur reconnaît que l'injection dans le tarse peut entraîner une perte partielle de mobilité ou une infection de la plaie. Il indique qu'aucun système de co-culture in vitro ne reconstitue l'ensemble des réponses de la dépigmentation, ce qui rend selon lui le modèle souris "essentiel".
Objectifs
Le vitiligo est une pathologie de la peau qui provoque l’apparition de taches blanches de taille plus ou moins importantes et peut toucher l’ensemble du corps, y compris le visage. Ces macules blanches sont la résultante d’une altération des mélanocytes de l’épiderme qui sont les cellules responsables de la pigmentation cutanée. Environ 1% de la population mondiale souffre de cette pathologie qui affecte significativement la qualité de vie des patients. A ce jour, aucun traitement efficace et spécifique n’est disponible du fait de la complexité de cette pathologie et dont la compréhension et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques restent un enjeu majeur. L’origine de cette pathologie reste à ce jour mal définie mais l’implication de plusieurs facteurs (génétiques, environnementaux ou encore une altération du système immunitaire chez les patients) sont identifiés. Afin d’expliquer la perte des mélanocytes au cours du vitiligo, il a été récemment montré chez les patients atteints de vitiligo un défaut dans le système d’adhésion des mélanocytes au niveau de la peau, entrainant leur perte et ainsi la dépigmentation. Nos travaux ont montré qu’une protéine, la métalloprotéase MMP9, était impliquée dans ce défaut d’adhésion. De plus, la MMP9 a un rôle dans l’activation du système immunitaire, notre système de défense. Nous pensons donc un inhibiteur de MMP-9, seul ou en association avec des traitements en cours d’essais cliniques chez l’homme, représente une stratégie prometteuse pour bloquer la réponse inflammatoire et stabiliser le mélanocyte à la membrane basale de l’épiderme.
Bénéfices attendus
La validation de la métalloprotéinase matricielle MMP-9 comme une cible thérapeutique d’intérêt majeur dans le vitiligo et autres dépigmentations post-inflammatoires et le développement d’un inhibiteur de la MMP9 pour application topique. De plus, une association d’un inhibiteur de MMP-9 avec un inhibiteur de Janus Kinase (JAK) semble également une stratégie prometteuse pour bloquer la réponse inflammatoire et stabiliser le mélanocyte à la membrane basale de l’épiderme. Le projet pourrait permettre d’utiliser un inhibiteur de MMP-9 en application topique dans le vitiligo, une maladie dont les besoins thérapeutiques sont majeurs.
Procédures
Les souris auront à subir deux injections en sous cutanée sous les coussinets des pattes postérieures à une semaine d'intervalle et ensuite deux injections en sous cutanée au niveau de la queue à une semaine d'intervalle également. Le traitement des souris consistera à une application par massage de la crème au niveau de la queue (zone de dépigmentation).
Impact sur les animaux
Nous avons déjà validé le modèle de souris vitiligo par immunisation sans observer de signe indésirable. Bien que non observés, des erythémes au niveau du sites d'injection de la queue peuvent être observés. L’application en topique des inhibiteurs ne devrait pas engendrer d’effets nocifs sur les souris. Cependant,l’injection dans le tarse peut engendrer une perte partielle de mobilité de l’animal ou l’infection de la plaie
Devenir
A l'issue des procédures les souris seront mis à mort et nous prélèveront les queues et les rates pour analyses.
Remplacement
Au préalable nous avons évalué l’impact d’un inhibiteur de MMP-9 associé ou non au Ruxolitinib en application topique in vitro dans notre modèle 3D de dépigmentation induite en condition inflammatoire. Il n’existe malheureusement aucun système de co culture in vitro reconstituant l’ensemble des réponses cellulaires impliquées dans la dépigmentation de la peau. Le modèle de souris est donc une étape essentielle pour évaluer l’intérêt thérapeutique d’un inhibiteur de MMP-9 associé ou non à un inhibiteur de JAK tel que le Ruxolitinib.
Réduction
L’étude in vitro au préalable permet de choisir les doses optimales des inhibiteurs à tester sur l’animal et donc de réduire la quantité totale de souris. Nous allons dans un premier temps valider la dépigmentation des souris puis nous identifierons dans la seconde procédure la dose adéquate de JNJ0966 pour réduire cette dépigmentation. Dans un troisième temps l’association avec le Ruxolitinib sera étudier puis nous évaluerons l’intérêt d’une thérapie prévisionnelle. Ces 4 procédures sont importantes pour réduire au mieux le nombre minimal d’animaux afin d’obtenir des analyses comparatives et statistiques suffisantes à la démonstration de l’effet des traitements inhibiteurs utilisés.
Raffinement
Le développement d’un érythème au niveau de la zone d’injection et le comportement des animaux seront évalués quotidiennement au cours de la procédure. Les animaux seront hébergés à raison de 5 souris/cage dans un environnement propice à leur bien-être (litière en copeaux de peuplier, tunnels en polycarbonate). Si un impact environnemental est observé (bagarre des mâles entre eux, signes de stéréotypie, prostration, isolement d’un animal...), l’animal sera soigné et mis en isolement. La durée de l’isolement dépendra du comportement de l’animal, en cas de plaie le vétérinaire suivra la guérison et jugera de l’état de l’animal. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie : l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont ceux de Lloyd et al.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris transgénique B6.Cg-Tg(KRT14-Kitl*)4XTG2Bjl/J de 4 semaines. Ces souris ont un phénotype noir car elles présentent des mélanocytes au niveau de l’épiderme sur tout le tégument (l’expression du ligand de Kit au niveau du promoteur épidermique kératine-14 permet la rétention des mélanocytes au niveau épidermique) ce qui permet de mieux observer la dépigmentation. De plus, par la persistance des mélanocytes, ces souris ont la capacité à repigmenter. Nous utilisons des souris jeunes de 4 semaines pour s'assurer que le système immunitaire n'est pas altéré du fait du vieillissement de la souris.
Mise en évidence de l’implication de l’Interleukin-34 dans le diabète chez la souris C57BL/6J sauvages et KO pour l’IL-34 dans le pancreas
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont soumises à un régime riche en graisse et en sucre pour induire un diabète de type 2, puis à des injections intrapéritonéales répétées de glucose et d'insuline et à des prélèvements de sang à la queue. Le porteur décrit une douleur légère possible liée au modèle et annonce une mise à mort finale pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux est "indispensable" pour démontrer in vivo l'implication d'une protéine avant d'en faire une cible thérapeutique.
Objectifs
L’obésité est une maladie chronique que consiste à un excès de masse grasse et à une modification du tissu adipeux. Elle est due à différents facteurs, tel que l’alimentation, la prédisposition génétique et aussi à facteurs environnementaux. Une des consequences métaboliques majeures de l’obesité est le développement du diabète de type 2. Afin de pouvoir traiter le diabète, une meilleure compréhension du dialogue entre les cellules est nécessaire. L’implication du système immunitaire dans la physiopathologie du diabète de type 2 n’est pas connue, ainsi, nous souhaitons ici comprendre l’interaction du système immunitaire avec le pancréas dans l’installation et le maintien de la pathologie. Nous avons mis en évidence la présence de la cytokine IL34 chez l’homme et la souris au niveau des îlots pancréatiques. Son expression se trouve augmentée dans des pancréas issus de patients atteints de diabète de type 2. Suite à ces observations, nous avons créé une lignée de souris déficientes en IL34 au niveau du pancréas. Le modèle a été mis en place par croisement entre une lignée IL34LoxP et PdxCre. Ainsi, nous cherchons à comprendre l’impact de l’inhibition de la cytokine au niveau du pancréas dans des conditions physiologiques et pathologiques de diabète de type 2 en comparant les souris IL34 KO avec les souris IL34 contrôles issues du croisement.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre d’identifier la cytokine d’intérêt comme un nouveau biomarqueur ou une nouvelle cible thérapeutique dans le diabète de type 2. Il aiderait également à mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans la pathologie au niveau du pancréas et plus particulièrement des îlots de Langerhans.
Procédures
Le test de tolerance au glucose et à l'insuline (GTT et ITT) nécessitent des injections intra péritonéales de glucose et insuline (10 ip par souris, 1ip de glucose et 1ip d’insuline 1 fois par mois, durée environ 3 seconds). Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu Des prélèvements de gouttes de sang à niveau de la veine caudale pour mesurer la glycémie des animaux. Il y aura 8 prélèvements d’une goutte de sang par souris pour un même test. Pour chaque prélèvement, les animaux sont anesthésiés localement au niveau de la queue (lidocaïne, sous forme de pommade). Ces tests seront effectués au début du protocole, après 1, 2, 3 et 4 mois de regime.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une régime alimentaire riche en graisse et sucre afin d’induire le diabète de type 2 lié à l’obésité. Les souris pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La réaction attendue dans le modèle de diabète peut être de douleur légère. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline nécessitent des injections intra péritonéales de glucose et insuline (10 ip par souris). Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. Des prélèvements de gouttes de sang à niveau de la veine caudale pour mesurer la glycémie des animaux seront aussi nécessaires. Il y aura 8 prélèvements d’une goutte de sang par souris pour un même test. Le prélèvement sanguin à niveau de la veine caudale, sous anesthésie locale, permet de récupérer des quantités minimes de sang pour l’évaluation répétée des paramètres circulants, sans traumatisme et sans douleur. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procedure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.
Remplacement
L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer cette protéine comme cible thérapeutique, nous devons démontrer son implication in vivo. En effet, seule la suppression de celle-ci dans un modèle in vivo nous assure de son implication dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.
Réduction
Les modèles seront réalisés sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (120 souris). Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce avec un enrichissement du milieu. Le protocole expérimental comprend un suivi quotidien des animaux, des indicateurs comportementaux et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, suivi pondéral de l’animal) seront évalués quotidiennement, et constitueront les points limites de l’expérience (mise à mort de l’animal). Pour éviter toute souffrance de l’animal au cours du protocole expérimental des analgésiques seront donnés. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
Les modèles de diabete de type 2 chez la souris sont connus et utilisés dans la littérature chez la C57BL/6J et les souris KO pour IL34 au niveau du pancréas sont de fond génétique C57BL/6J. Des souris de 4 semaines environ seront utilisées. A cet âge les animaux peuvent être nourris avec un régime riche en graisse sans risque de compromettre leur développement.
Impact du stress in utero sur l’infection bactérienne
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 856 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 016 dans des procédures de souffrance sévère. Des femelles gestantes sont enfermées dans un tube de contention sous lumière vive trois fois par jour pendant six jours, et leur descendance est infectée par gavage bactérien puis soumise à une distension colorectale par électrodes implantées sous chirurgie et à un test d'anxiété en labyrinthe surélevé. Le porteur indique que l'infection provoque une colite avec diarrhée et sang dans les selles, et que les petits développent des comportements anxieux et dépressifs durables. Il affirme que la douleur, le stress et l'infection sont des réactions de l'"organisme entier" impossibles à reproduire in vitro.
Objectifs
Les maladies inflammatoires et/ou douloureuses chroniques (comme les maladies auto-immunes et allergiques) représentent un problème majeur de santé publique et les approches thérapeutiques utilisées aujourd’hui ne donnent pas entière satisfaction. Il est donc important de comprendre la physiopathologie de ces maladies au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. De nombreux facteurs environnementaux ont été décrits comme participant à la genèse de ces pathologies ou comme facteurs facilitateurs de la mise en place de ces maladies chroniques. Parmi ces facteurs environnementaux, de nombreuses études épidémiologiques placent le stress et les infections bactériennes comme les facteurs majeurs impliqués dans la régulation de la douleur et de l'immunité. L'objectif de notre projet est de comprendre l'association qui pourrait exister entre le stress et l'infection dans la mise en place du système immunitaire intestinal et de la sensibilité viscérale.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche devrait nous permettre de mettre en évidence le rôle du stress et de l'infection au cours de la gestation sur le développement de maladie chronique chez la descendance. Il s'inscrit dans le concept beaucoup plus large des 1000 premiers jours de vie. En effet, beaucoup de grands systèmes (nerveux, immunitaires, intestinaux…) s’établissent au cours des 1000 premiers jours de vie de l’enfant en parallèle et de façon interdépendante de l’établissement du microbiote intestinal. Le stress et les infections bactériennes interagissent avec tous ces systèmes et peuvent donc avoir des conséquences à long terme sur la santé de l’individu. Les retombées immédiates de ce projet seront une meilleure connaissance de l'implantation du microbiote intestinal en lien avec la maturation du système immunitaire, de l'infection chez l'enfant, de l'impact du stress lors de la grossesse et de l’impact de ces perturbations sur la mise en place de maladie chronique à l’âge adulte. Nos analyses biologiques devraient permettre de déterminer des biomarqueurs permettant une prise en charge ciblée de ces pathologies.
Procédures
Pour générer des souris F1 issues de mères stressées, 84 femelles seront placées dans un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour, pendant 6 jours, du 13ème jour au 18ème jour de gestation. Pour une étude, sur les 576 souris F1, la moitié sera soumise à une simple infection par citrobacter rodentium par gavage sur animaux vigiles à la 3ième semaine de vie. Sur la moitié des souris infectées ou non infectées, soit 288 souris, la douleur viscérale sera déterminée par distension colorectale suite à l’implantation d’électrodes sous anesthésie chirurgicale (environ 1h) à la 8ième semaine de vie. La perméabilité paracellulaire sera évaluée soit à la 5ième semaine de vie, soit à la 8ième semaine de vie, avec un gavage oral de Dextran-FITC sur animaux vigiles et un prélèvement sanguin mandibulaire après anesthésie gazeuse. Pour une deuxième étude, sur les 576 souris F1, la moitié des souris sera soumise à une simple infection par citrobacter rodentium par gavage sur animaux vigiles à la 3ième semaine de vie. Sur l’ensemble des 576 animaux, le comportement anxieux sera évalué par le test du labyrinthe en croix surélevé sur animaux vigiles à la 5ième semaine de vie (288 souris) ou à la 8ième semaine de vie (288 souris). La perméabilité paracellulaire sera évaluée soit la 5ième semaine de vie (288 souris) ou à la 8ième semaine de vie (288 souris) avec un gavage oral de Dextran-FITC sur animaux vigiles et un prélèvement sanguin mandibulaire après anesthésie gazeuse. Dans une dernière partie de l’étude, sur les 864 souris, 288 des souris F1 seront soumis à une simple infection par citrobacter rodentium par gavage sur animaux vigiles à la 8ième semaine de vie alors que 288 souris seront soumises à une double infection par 2 gavages, un gavage à la 3ième semaine de vie et un gavage à la 8ième semaine de vie sur animaux vigiles. Sur la moitié des souris soit 432, la douleur viscérale sera déterminée par distension colorectale suite à l’implantation d’électrodes sous anesthésie chirurgicale (environ 1h) à la 10ième semaine de vie sur l’ensemble. Sur l’autre moitié des souris soit 432, le comportement anxieux sera évalué par le test du labyrinthe en croix surélevé sur animaux vigiles à la 10ième semaine de vie. La perméabilité paracellulaire sera évaluée à la 10ième semaine de vie avec un gavage oral de Dextran-FITC sur animaux vigiles et un prélèvement sanguin mandibulaire après anesthésie gazeuse pour tous les animaux.
Impact sur les animaux
Ce modèle de stress prénatal n'induit pas de douleur spontanée chez la souris. Nous attendons le premier jour de la procédure de stress une stabilisation du poids ou une perte de moins de 3.5% du poids des mères gestantes en comparaison avec les mères gestantes non stréssées. Dès le deuxième jour de la procédure de stress les mères gestantes doivent reprendre du poids. Le stress réalisé sur les mères gestantes ne comporte pas d'effet visible comportemental. Le stress prénatal entraine chez la descendance des comportements anxieux et dépressifs observés tout au long de la vie et révélés à l’aide de test comme le labyrinthe en croix surélevé. Ces comportements n’ont cependant pas d’impact sur la prise alimentaire ou la croissance des animaux. L’infection par citrobacter rodentium entraine une réponse inflammatoire colique transitoire (entre le 5ème et le 15ème jours post gavage). Lors de la colite, les souris souffrent de diarrhée, de présence de sang dans les selles et d’une perte de poids. La bactérie n’est plus détectée dans les selles 21 jours après le gavage. Trente jours après le gavage, les souris ne présentent plus de signes macroscopiques d’inflammation. Au niveau microscopique, elles présentent un épaississement de la muqueuse et de la musculeuse du colon. De nombreuses études ont utilisé l’infection par citrobacter rodentium, les doses que nous allons utiliser dans notre étude ont été décrites comme n’ayant pas d’impact sur la survie. Après la chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle pendant 4 jours au maximum afin d'éviter qu'ils ne se mangent les électrodes. Nous ne pouvons pas replacer les animaux ensemble, car sans les électrodes nous ne pouvons pas enregistrer l'activité musculaire au cours de la distension colorectale.
Devenir
Les animaux ayant servi à générer la descendance F1 seront mis à mort après le sevrage des F1 et des prelèvements d'organes seront réalisés. Les souris F1 après simple infection seront euthanasiées à différents âges : soit à 5 semaines de vie soit à 8 semaines de vie. Les souris F1 après double infection seront euthanasiées à 10 semaines de vie. Des prélèvements tissulaires seront collectés pour différentes études au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut immunitaire et douloureux de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. De plus, la douleur, le stress, l'infection et l'inflammation sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.
Réduction
Pour ce modèle, les animaux seront suivis régulièrement au cours du temps par des techniques non invasives comme le suivi du poids, la consistance des fèces et la présence de sang dans les fèces évaluée par le test HémoccultII® et de façon plus spécifique par l'analyse des scores cliniques pour l'infection. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude, permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. Le nombre de 12 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées. Nous utiliserons des analyses non paramétriques, le test Kruskal-wallis suivie d'un test post-hoc de Dunn pour les analyses multi-groupes et le test de Wilcoxon-Mann-Whitney pour les analyses concernant deux groupes.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, dans un premier temps, des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Selon la durée de l’étude, un deuxième enrichissement pourra être introduit dans l’environnement, tel que des aspen Brick, des tunnels en polycarbonate ou des igloos. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Une veille bibliographique sera effectuée pour déterminer si des méthodes de remplacement ont été mise en place. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure.
Choix des espèces
La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine. Nous disposons également de souris déficientes pour l'expression de certains gènes cibles. Ces souris déficientes pourront, si ce projet aboutit, faire l'objet d'une nouvelle demande. Les mères seront stressées du 13 au 18 éme jours de gestation. C'est la période décrite dans la littérature pour ce modèle. Ensuite les souris F1 seront utilisées soit à 5 semaines de vie pour évaluer l'impact direct su stress et de l'infection avant le sevrage, soit à 8 semaines de vie pour évaluer l'impact du stress et de l'infection sur des animaux adultes et matures. D'autres souris F1, infectées ou non par citrobacter rodentium à la 3ième semaine de vie et ré-infectées à la 8ième semaine de vie pour évaluer l'éducation du système immunitaire vis-à-vis ce cette bactérie pathogène, seront utilisées à la 10ième semaine de vie.