Système immunitaire

1064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par voie nasale avec des mycobactéries de la tuberculose, une partie recevant en plus des molécules immunomodulatrices, avant le prélèvement de leurs organes, pour étudier la réponse immunitaire à l’infection. Le porteur indique que certaines lignées perdent rapidement du poids et se prostrent, et précise qu’aucun antidouleur ni anti-inflammatoire n’est administré afin de suivre l’évolution de la maladie. Il affirme qu’aucun système in vitro ne reproduit l’infection du poumon.

Objectifs

La tuberculose est une pathologie majeure en santé humaine et en santé animale (bovins). L’agent pathogène principal de la tuberculose chez l’homme est Mycobacterium tuberculosis (Mtb) et Mycobacterium bovis (Mb) pour les bovins. Le BCG est le seul vaccin actuellement commercialisé contre la tuberculose chez l'homme mais son utilisation chez les bovins n’est pas autorisée en Europe. Les traitements antibiotiques chez l’hommes sont lourds, et l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques rend les traitements conventionnels inefficaces. Une alternative aux antibiotiques pourrait être l’amélioration des compétences immunitaires, grâce au développement de stratégies d’immunomodulation, préventives ou thérapeutiques, complémentaires des moyens de lutte classiques. Pour cela, il est nécessaire d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes inflammatoires et de la réponse immunitaire de l’hôte (homme, bovin) lors de la tuberculose. Notre objectif est, grâce au modèle murin, d’améliorer nos connaissances des manifestations de la maladie et des fonctions des cellules de l’immunité innée (macrophages, neutrophiles) ainsi que leurs interactions avec l’immunité adaptative (lymphocytes) et d'identifier des facteurs de l’hôte pouvant être immunomodulés afin de mieux lutter contre l’infection.

Bénéfices attendus

Nous espérons, grâce à ce projet, mieux comprendre les rôles de neutrophiles dans la physiopathologie de la tuberculose et de comprendre les interactions de ces cellules avec l’immunité adaptative (Lymphocytes). Ces travaux permettront également d'expliquer les différences de virulence et de dissémination des différentes souches mycobactériennes. Ces travaux, très fondamentaux, pourront permettre développer des stratégies d'immunomodulation en ciblant les facteurs de l’immunité, afin de mieux lutter contre la tuberculose.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale et seront ensuite infectées par voie intranasale (durée de l'intervention 15min/animal) . 288 de ces animaux recevront par voie intrapéritonéale des molécules (anticorps ou inhibiteurs) permettant de moduler l'expression de molécules cibles (durée de l'intervention 5 min/animal)

Impact sur les animaux

Nous savons par expérience que les souris C3HeB/FeJ sont beaucoup plus sensibles que les souris C57Bl/6 aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec les souches M.tuberculosis HN878 (souche clinique humaine) et M.bovis (souche référence bovine). Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire

Devenir

L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, ganglion médiastinal, sang). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Jusqu’à présent, aucun système in vitro ne permet de reproduire les caractéristiques d’infections du poumon et le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test Mann-Whitney. Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs de type Mann-Whitney ou Bonferroni. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Aucun traitement (antidouleur ou anti-inflammatoire) n'est prévu afin de pouvoir suivre l'évolution de la maladie et comprendre le rôle du système immunitaire inné dans les mécanismes de défense liés à ces infections mammaires.

Choix des espèces

Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexite de la reponse immunitaire d'un organisme entier . De plus les modeles murins d'infections mycobacteriennes sont tres bien etablis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. Nous utiliserons des souris adultes agées entre 6 et 12 semaines. Poiur ce projet il nous faut des animaux ayant un systeme mature competent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop agées. De plus nous utilisons un modele validé par la communaute scientifique

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un transfert de cellules d’une souris donneuse puis des injections et des prélèvements de sang répétés, souvent par voie rétro-orbitaire, avant le prélèvement de leur sang et de leur rate, pour tester deux immunosuppresseurs contre un rejet de greffe médié par les lymphocytes NK. Le porteur fixe un point limite de mise à mort à 20 % de perte de poids et mentionne un risque rare d’embolie lors des injections. Il affirme que l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme ne peut être appréhendé par des modèles in vitro seuls.

Objectifs

La meilleure option thérapeutique pour les patients au stade terminal d'une défaillance d'organe vital est la transplantation, qui consiste à substituer chirurgicalement l'organe défectueux par un greffon fonctionnel prélevé chez un donneur. La principale complication de la greffe d’organe est le phénomène de « rejet » qui demeure la cause majeure d’échec en transplantation. En effet, bien que de la même espèce, les individus sont génétiquement différents. Le système immunitaire du receveur va alors reconnaître des antigènes présents à la surface du greffon comme étrangers, au même titre qu’il reconnaît un agent infectieux. On distingue différents mécanismes conduisant au rejet de greffe, en particulier l’un d’eux découvert récemment fait intervenir des cellules de l’immunité du receveur appelé « lymphocytes NK ». C’est donc autour de la compréhension des mécanismes immunologiques de ce nouveau type de rejet, appelé « rejet NK » que ce projet s’articule, grâce à l’utilisation d’un modèle murin de transplantation simplifié. Dans ce modèle la transplantation sera modélisée par le transfert de cellules de souris dites « donneuses » à des souris « receveuses » issues d’un fond génétique différent, permettant de recréer un rejet NK de manière moins invasive qu’une transplantation chirurgicale. Les patients transplantés sont contraints de prendre toute leur vie un traitement immunosuppresseur qui permet de diminuer la réactivité de leur système immunitaire vis-à-vis du greffon, afin de limiter le phénomène de rejet. Ces traitements, actuellement validés pour d’autres types de rejets, n’ont à ce jour jamais été testés sur le rejet NK. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de 2 familles d’immunosuppresseurs sur ce rejet NK in vivo chez la souris, afin de pouvoir proposer ces traitements aux patients qui en sont atteints. Tout au long du projet, les conditions d'élevage, d'hébergement et de soins seront adaptées aux besoins des animaux. Les procédures utilisées dans ce projet n’occasionnent qu’une douleur et une angoisse minimes pour les animaux. Des points limites précis ont cependant été définis afin d’intervenir si besoin. Les prélèvements sanguins et injections seront réalisés sous anesthésie afin de limiter toute souffrance ou stress chez les animaux. Ce projet nécessite le recours à 116 souris, nombre calculé à visée de réduction par des méthodes biostatistiques nécessaire pour répondre à la problématique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider un nouveau modèle murin de rejet NK grâce à une technique de transfert de cellules, beaucoup moins invasif que le modèle chirurgical par transplantation cardiaque. Grâce à ce modèle murin, l’efficacité de 2 familles de traitement immunosuppresseurs (déjà disponibles en clinique) pourra être évaluer spécifiquement dans ce nouveau type de rejet NK. De manière plus concrète, la validation de l’efficacité de ces traitements chez la souris pourra permettre aux patients atteints de ce rejet particulier de bénéficier de ces médicaments pour limiter la perte de leur greffon

Procédures

Deux à 3 prélèvements sanguins (chaque prélèvement sanguin dure environ 30 secondes), et 2 à 10 injections (la durée d’une injection est inférieure à une minute) seront réalisés au cours de l’expérimentation. Ces gestes seront réalisés après anesthésie gazeuse et de manière alternée gauche/droite pour les prélèvements, afin de limiter le stress des animaux. Les procédures dureront entre 5 et 18 jours. L’ensemble de gestes seront réalisés par un opérateur expérimenté de manière à veiller à engendrer le moins de stress possible sur les animaux.

Impact sur les animaux

Au vu de la durée des procédures (maximum 18 jours) et de la dose d’immunosuppresseurs administrée (concentrations thérapeutiques déjà testées dans un précédent projet et évaluées dans la littérature comme inférieures aux concentrations toxiques), il n'y a pas d'effets indésirables attendus imputables aux substances injectées. Les principales nuisances attendues sont le stress et la douleur liés aux prélèvements et injections répétées de façon rapprochée. Les animaux seront anesthésiés par inhalation avant de procéder aux injections, ou aux prélèvements sanguins. Un collyre anesthésiant, sera administré aux souris avant de procéder à une injection intra veineuse par voie rétro-orbitaire ou à un prélèvement sanguin rétro-orbitaire pour limiter au maximum le stress et la douleur liés à ces gestes. L’ensemble des manipulations et gestes seront réalisées par un opérateur expérimenté afin de limiter les nuisances pour les animaux. Les souris seront surveillées dans les minutes suivants leur réveil après anesthésie afin de contrôler leur état et comportement.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont mises à mort après anesthésie gazeuse afin de prélever le sang et les rates des animaux, et procéder à l’analyse des cellules d’intérêt

Remplacement

Le but de cette étude est d'évaluer l'efficacité de 2 traitements immunosuppresseurs dans le traitement du rejet de greffe induit par les lymphocytes NK du receveur. Nous avons précédemment mis en évidence l'effet bénéfique de ces traitements in vitro grâce à un modèle de coculture cellulaire entre des lymphocytes NK de volontaires sains et une lignée de cellules endothéliales. Néanmoins, la complexité des mécanismes immunologiques en jeu, de même que l'effet des traitements immunosuppresseurs à l'échelle de l'organisme entier ne peuvent être appréhendés par des modèles in vitro seuls. C'est pourquoi ce projet nécessite l'emploi d'un modèle in vivo de rejet NK, permettant de confirmer les données que nous avons obtenu in vitro. Par ailleurs ce modèle de rejet NK utilise une méthode simplifiée par transfert de cellules d’une souris donneuse à une souris receveuse, beaucoup moins invasif pour les animaux que la chirurgie pour transplantation d’organe solide.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupes dans chaque procédure expérimentale a été calculé à minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables, basée sur notre expérience passée. Les paramètres de réponse immunitaire étant relativement homogène chez les souris contrôles, nous avons pris le parti de diminuer le nombre d'animaux contrôles à 5 plutôt que 8. En cas d'échec de l'une des expérimentations dû à problème technique, nous gardons la possibilité de renouveler une fois les procédures.

Raffinement

Au vu de la durée des procédures et de la dose d’immunosuppresseurs administrée (concentrations thérapeutiques déjà testées dans un précédent projet et évaluées dans la littérature comme inférieures aux concentrations toxiques), il n'y a pas d'effets indésirables attendus imputables aux substances injectées. Un collyre anesthésiant, sera administré aux souris anesthésiées par inhalation avant de procéder à une injection ou un prélèvement sanguin. Les gestes d'injection et les prélèvements seront réalisés par un opérateur expérimenté afin de limiter les nuisances liées au geste. Les côtés seront alternés afin de limiter les conséquences de ces prélèvements et dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera rincé quotidiennement par sérum physiologique. Un point de compression sera réalisé au site de ponction après chaque prélèvement. Une hémorragie non contrôlée conduira à la mise à mort de l’animal. Les animaux seront surveillés dans les 15 minutes suivants leur réveil après anesthésie, afin de contrôler leur état et comportement. De plus une surveillance du comportement des animaux sera observée de manière très régulière, avant chaque geste et le lendemain des transferts de cellules. Dans de très rares cas, l’injection intraveineuse peut se compliquer d’une embolie. Les points limites suivants conduiront à la mise à mort de l’animal : coma, convulsions. Si des signes de souffrance ou des modifications de comportement tels qu’une prostration, des yeux mi-clos, un pelage hérissé, un dos vouté ou encore une absence d’interaction avec ses congénères sont observés, cela conduira à une nouvelle surveillance de l’animal le lendemain. En cas de persistance de ces signes de souffrance un antalgique de palier 1 (paracétamol) pourra être administré à l’animal. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera sorti du protocole et sera mis à mort. La perte de poids étant un indicateur clé de l’état de souffrance ressentie par les souris, ces dernières seront pesées 2 fois par semaine durant le déroulé de la procédure. Une perte de poids supérieure à 10% du poids maximum atteint par l’animal conduira à sa réhydratation avec de l’eau gélifiée durant 48h ainsi que la mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage pour favoriser l’alimentation. Une perte de poids supérieur à 20% du poids maximum de l’animal, constitue un point limite à cette procédure. L’animal sera alors mis à mort.

Choix des espèces

Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude du rejet de greffe. Afin de reproduire la différence génétique entre un donneur et un receveur d’organe conduisant au rejet, deux lignées de souris de fonds génétiques différents seront utilisées. Les cellules de souris donneuses, qui expriment à leur surface des antigènes différents de celles des souris receveuses, seront reconnues comme « étrangères » par les lymphocytes NK des receveuses, conduisant ainsi à leur destruction. Des souris adultes entre 8 et 15 semaines seront utilisées dans ce projet. Nous avons choisi cette fenêtre afin de laisser le temps au système immunitaire de se développer et d’atteindre sa maturité afin de répondre aux antigènes administrés.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime gras qui les rend obèses et diabétiques, des mises à jeun de douze heures, des gavages de glucose et, pour la moitié d’entre eux, un traitement antibiotique destiné à perturber leur flore intestinale, avant le prélèvement de leurs organes, pour étudier le lien entre microbiote et diabète. Le porteur indique que le gavage et la contention constituent un stress modéré et que les antibiotiques peuvent provoquer des diarrhées. Il affirme qu’aucun modèle in vitro ou in silico ne rend compte des liens entre alimentation, microbiote et régulation de la glycémie.

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte et une grande diversité de microorganismes. Les bactéries y jouent un rôle crucial pour le développement et le maintien d'un système immunitaire sain. Ainsi un déséquilibre de la composition du microbiote a été montré chez les patients atteints de maladies métaboliques comme l’obésité dont l’une des principales conséquences est le diabète. Ces 35 dernières années la prévalence du diabète a été multipliée par quatre avec 9.3% de la population mondiale souffrant de cette pathologie. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et le rôle que ces interactions pourraient avoir dans des maladies métaboliques telles que le diabète. En cas d'obésité, de nombreux changements se produisent dans l’intestin. Ces modifications intestinales sont maintenant reconnues comme participant à l'auto-aggravation de l'obésité. Parmi les changements qui s’opèrent, la densité des cellules de l'immunité, qui sont nombreuses dans l’intestin, augmentent chez les personnes obèses et leur activation va notamment modifier la régulation de la glycémie. Les mêmes mécanismes sont à l’œuvre dans les modèle de rats rendus obèses par l’alimentation. De nombreuses études suggèrent que les bactéries de l’intestin, dont la composition est perturbée par l‘obésité, sont en partie responsables des changements de fonction des cellules immunitaires. Cette triade (microbiote-cellules immunitaires intestinales-régulation de la glycémie) constitue donc une cible intéressante pour mieux comprendre la mise en place du diabète. Nous souhaitons dans un premier temps caractériser les populations de cellules immunitaires et leurs (dys)-fonctions dans différentes régions de l’intestin chez des rats obèses en comparaison avec des rats non obèses et ceci en présence ou non d’une perturbation majeure du microbiote intestinal. Sur les mêmes animaux un suivi de la glycémie sera réalisé ainsi qu’une analyse fine du microbiote intestinal et des populations et fonction de l’intestin. Des outils de bio-informatique nous permettant de faire des études de corrélation entre ces différents paramètres seront par la suite utilisés dans les analyses.

Bénéfices attendus

Les perspectives de ce travail sont d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques intestinales, donc accessibles par voie orale afin de prévenir ou limiter les effets néfastes de l’obésité sur le diabète. Le diabète est une maladie évolutive qui se caractérise par une hyperglycémie chronique liée à une réponse altérée à l’insuline. Ce déséquilibre du métabolisme glucidique est notamment lié aux déséquilibres nutritionnels et à l’obésité. Le système immunitaire a aussi un rôle dans la mise en place du diabète qui est souvent associé à une inflammation élevée chez les sujets obèses. Le diabète entraine des complications vasculaires graves à long terme et une surmortalité. Son impact sur le budget santé, qui peut atteindre 5 à 20% des dépenses de santé de nombreux pays, est évalué à la hausse pour les décennies à venir. Il est donc important de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie.

Procédures

Les animaux recevront un régime riche graisses induisant une prise poids et un diabète. Les animaux seront mis à jeun deux fois pour une durée de 12h durant l'ensemble de la procédure. Ils recevront également un gavage de glucose (entrainant une contention de 10 secondes). Un test de tolérance au glucose (appelé OGTT) visant à mesurer la glycémie (via une seule petite piqure à la queue) sera réalisé sur l'ensemble des animaux. Ce test sera réalisé deux fois à 3 semaines d’intervalle durant la procédure. La moitié des animaux recevra un traitement antibiotique pendant deux semaines afin de perturber la flore intestinale. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine en étant placés durant quelques secondes dans un pot individuel. Deux pesés sur l'ensemble du projet nécessiteront une pesée plus longue (de quelques minutes) afin de laisser le temps aux rats d'expulser une crotte qui sera ensuite récoltée dans le pot.

Impact sur les animaux

Le gavage lors de l’OGTT constitue un stress modéré notamment dû à la contention (d'une durée < 10 secondes). La contention et le gavage seront réalisés par un experimentateur expérimenté. Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. la procédure de prélèvement de sang nécessaire à la lecture de la glycémie ne présente qu’une douleur très faible car il est réalisé via une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'espérimentateur lors du premier prélèvement du test. Par la suite un simple massage permet de prélever du sang sans avoir à recouper la queue. Le traitement antibiotique pourra éventuellement entrainer des diarrhées.

Devenir

Dans ce projet la mise à mort est nécessaire pour le prélèvement des organes.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les liens entre l’alimentation, la composition du microbiote, les fonctions immunitaires de l’intestin et la régulation de la glycémie.

Réduction

D’après les études déjà menées, nous estimons que 15 rats par groupe expérimental sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux hébergés 2 par cage bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront entrainés à la manipulation (notamment à la contention). Afin de limiter le stress lors des mesures de glycémie qui se feront dans une autre salle que la salle d'hébergement, les animaux seront transférés dans la salle expérimentale 1h avant. Un anesthésique local sera appliqué sur la queue avant les prélèvements de sang réalisés pour les mesures de glycémie. Des points limites, décrits dans les procédures expérimentales, seront également mis en place.

Choix des espèces

Les rats utilisés seront des rats wistar RjHan:WI. Cette espèce est choisie car cette étude fait partie d’un projet collaboratif réunissant 2 autres équipes de recherche et nécessitant une harmonisation du modèle rongeur. De plus ce projet repose sur de nombreux travaux préliminaires ayant utilisé des rats wistar RjHan:WI. Ce projet étudie le rôle du microbiote sur le développement du diabète chez l’adulte. Le modèle de rat utilisé est donc un modèle adulte qui aura 7 semaines en début d’expérimentation (le microbiote des rats est stabilisé à partir de 5-7 semaines) et 21 semaines en fin d’expérimentation. 3 mois de régime riche en graisses correspond au temps nécessaire pour rendre les animaux obèses avec une perturbation des fonctions immunitaires et de la régulation de la glycémie.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une polyarthrite leur est provoquée par une injection de collagène, puis ils reçoivent un anticorps trois fois par semaine pendant deux semaines, avant d'être tués pour prélever sang, rate, ganglions et une patte, afin de tester une immunothérapie contre la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que ce modèle entraîne une inflammation des articulations puis une atteinte du cartilage et des os. Il affirme que le produit n'a jamais provoqué d'effet dommageable chez le rat et que la phase préclinique sur l'animal est nécessaire avant un essai clinique.

Objectifs

L'objectif du projet est, dans un premier temps, d'identifier une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde ; puis de tester l'efficacité d'un traitement par injection d'anticorps anti-CD45RC et enfin d'optimiser ce protocle de traitement dans l'objectif finale de réaliser une étude pré-clinique chez le rat pouvant aboutir sur un essai clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait mettre en évidence le potentiel d'un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde et découler sur un essai clinique dont un grand nombre de patients pourrait bénéficier.

Procédures

Les animaux vont d'abord subir sous anesthésie une injection sous-cutanée au niveau de la base de la queue pour induire l'arthrite (10min de procédure de l'endormissement au réveil). Par la suite, les rats (vigiles) receveront un traitement par injection intrapéritonéale 3 fois par semaines pendant 2 semaines (pour chaque injection, 2min de procédure de la prise en contention à la fin de l'injection) . Deux fois au cours de la procédure, les animaux seront anesthésiés pour effectuer le prélèvement d'une petite quantité de sang dans la veine caudale après anesthésie locale (10min de procédure de l'endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat est déjà utilisé depuis plusieurs années. Celui-ci se caractérise par une inflammation des articulations avec, sur le long terme, une atteinte du cartilage, des os et l'installation d'une fibrose.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvement (sang, rate, ganglions et patte) et réaliser une analyse immunologique et anatomopathologique.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'étude pré-clinique réalisée chez l'animal lorsque le modèle expérimental existe. Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. L'utilisation de celui-ci est nécessaire pour évaluer de manière exhaustive les effets ciblés, et potentiellement systémiques, du traitement sur les différents organes et fonctions de l'organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été détermineé de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur l'efficacité ou non du traitement. Par ailleurs, la réalisation d'une première étude pilote sur un faible nombre d'animaux permettra de s'assurer de l'intérêt et de la bio-sécurité du projet avant de faire entrer un plus grand nombre d'individus dans la procédure.

Raffinement

Avant même le début de la procédure les animaux seront entrainés à la contention de manière à ce que les injections répétés de traitement puissent se dérouler sans créer de stress supplémentaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et les symptômes seront évalués 3 fois par semaine par les personnes responsables de la procédure. Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (rouleau en carton, batôn de bois,...).

Choix des espèces

Le rat a été choisi car il est utilisé dans le modèle d'arthrite induite par injection de collagène depuis de nombreuses années. Ce modèle animal s'avère pertinent car il reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. De plus, nous avons déjà testé notre traitement dans d'autres modèles expérimentaux chez le rat, ainsi nous savons que notre produit n'a jamais induit d'effets dommageable chez cette espèce. Les rats seront utilisés au stade adulte (environ 8 semaines) qui est le stade le plus couramment utilisé pour le modèle d'arthrite induite par injection de collagène.

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de vessie est greffée dans leur flanc, puis elles reçoivent deux injections par semaine pendant six semaines et deux prélèvements de sang dans l'œil, avant une exsanguination terminale sous anesthésie, pour comparer deux candidats médicaments en doses croissantes. Le porteur indique que la pousse tumorale peut gêner les déplacements et qu'aucun anti-inflammatoire ne peut être administré car l'inflammation participe au mécanisme testé. Il affirme que ces expériences sur petit animal ne peuvent être remplacées par des cultures in vitro.

Objectifs

La cible du candidat médicament est un récepteur l’immunité et est exprimé par les cellules normales mais aussi dans de très nombreuses cellules tumorales. L’activation de ce récepteur par certaines molécules entraîne une mort spécifique des cellules cancéreuses (mais pas des cellules normales), ainsi qu’une activation de l’immunité ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes induit une vaccination à long terme contre la tumeur empêchant ainsi les récidives cancéreuses. Des études précédentes (utilisant le même modèle de cancer de la vessie que celui de ce protocole) ont démontré l’ensemble des effets cités ci-dessus (guérisons complète de 45% des souris traitées et vaccination à vie des souris guéries contre les récidives dans 66% des cas). Ces résultats ont été obtenus lors d’injections intratumorales de d’une toute nouvelle famille de molécules activant ce récepteur (spécifique, utilisable en clinique et bien tolérée). Dans la présente étude, deux candidats médicaments (CM1 et CM2) adaptées à une injection dans le système veineux (ici une injection intrapéritonéale) vont être comparées en doses croissantes pour leur : (1) efficacité antitumorale, (2) tolérance et (3) mécanismes d’action (dont leur action sur le système immunitaire). Pour ce faire, le modèle de cancer de la vessie sera utilisé pour que l’activité de ces candidats médicaments puisse être directement comparables aux études précédentes et à venir. Sept doses croissantes de chacun des deux candidats médicament seront testées sur des groupes de 12 souris rentrant en protocole. Ajouté au groupe contrôle, cela donne 15 groupes de 12 souris en traitement. Pour ce faire, 225 souris seront injectées avec des cellules cancéreuses de vessie. Sachant que 80% des souris injectées développent des tumeurs pouvant entrer protocole, cela donne 180 souris qui intègreront les 15 groupes de traitement. Les molécules seules (sans autre molécules ajoutées), seront administré deux fois par semaine pendant 6 semaines.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’effectuer un choix/classement entre deux molécules lors d’une injection par voie sanguine. Elle permettra d’affiner les doses à utiliser dans les futures études ainsi qu’en clinique. Il s’agit d’une étude de recherche à la fois fondamentale et translationnelle en vue de définir les fondements d’une étude clinique chez l’homme en injection par voie sanguine.

Procédures

Cette étude nécessite : - Une injection de cellules tumorales dans le flanc de la souris (sous anesthésie) - Des traitements injectés par voie sanguine (piqure d’aiguille sur souris vigiles). - Deux prises de sang intermédiaires de petits volumes (100µl - 3 à 4 minutes anesthésie incluse), espacés de deux semaines (sous anesthésie) - Une exsanguination terminale pouvant induire un arrêt cardiaque (sous anesthésie générale - environ 4 min anesthésie incluse), immédiatement suivie d’une mise à mort par dislocation cervicale (toujours sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

225 souris C3H/HeN (de phénotype non dommageable), sont acclimatées pendant une semaine à daté de leur réception. Les animaux subiront un stress lors des contentions, préparations, greffes, traitements, suivis et prélèvements ainsi que lors de leurs anesthésies : 1/ Anesthésie par voie gazeuse (isoflurane) pour permettre : (i) leur numérotation par poinçonnage auriculaire, (ii) la tonte pour préparer (iii) la greffe tumorale. 2/ Stress à la contention et à la piqure lors des traitements par injections sanguine sur souris vigiles (2 fois par semaine). 3/ Stress à la contention lors des pesées et mesures de la croissance tumorale par pied-à-coulisse sur souris vigiles. 4/ Les deux prélèvements de sang intermédiaire rétro-orbitaux de 100µl de sang après le premier et le 5eme traitement peuvent générer de la douleur au niveau de l’œil prélevé c’est pourquoi chaque œil sera prélevé une fois. Les volumes et fréquences de ces prélèvements sont adéquats pour ne pas engendrer de stress volémique chez ces souris. 5/ La pousse tumorale peut engendrer une gêne dans la locomotion (pris en compte dans la grille de score => Mise à Mort). 6/ Exsanguination intracardiaque terminale sous anesthésie générale (kétamine/Xylazine), immédiatement suivie d’une mise à mort par dislocation cervicale.

Devenir

A la fin de l'unique procédure, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie (pour permettre des analyses d’efficacité et de mécanismes d’action post-mortem).

Remplacement

De nombreuses expériences in vitro ont déjà permis de mettre en évidence l’activité et les mécanismes d’action de ces deux candidats médicaments. A présent, seules des études sur le petit animal permettront d’étudier les interrelations complexes des facteurs physiologiques susceptibles d’influencer l’effet de la molécule testée, et surtout le système immunitaire complet qui permettra d’étudier l'effet vaccinal contre le cancer de ces deux candidats médicaments. Ces expériences sur petits animaux ne peuvent donc pas être Remplacées. Ces expériences s'inscrivent dans le cadre du développement d'une application thérapeutique et fournira des données précliniques précieuses pour la conception d'un essai clinique.

Réduction

Les expériences menées lors de précédentes études démontrent que le nombre de souris par groupe (12 souris par groupe), prévu pour cette expérience est adapté sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats, tout en utilisant les méthodes statistiques adaptées aux petits nombres.

Raffinement

Le « Raffinement » sera respecté par la mise en place d’une définition précise de points limites précoces et prédictifs, sur la base d'une grille de score validée sur ce modèle et sur ce type de traitement. Une surveillance adaptée des animaux 3 fois par semaine permettra d'éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 puis avec nourriture et de l’eau ad-libitum avec des bâtonnets à ronger et du coton comme enrichissement en excès. Les prélèvements seront réduits au maximum en quantité et en durée grâce à nos méthodes d’analyses. Les deux prélèvements intermédiaires rétro-orbitaux de 100µl de sang s’effectueront sous anesthésie, respectivement après le premier et le cinquième traitement (J0 et J14). Une goutte de tétracaïne sera déposée sur l’œil 1 min avant le prélèvement afin de réduire la douleur au réveil. Les prélèvements terminaux pratiqués sous anesthésie et antalgie, suivis d'une mise à mort sans réveil. Le maximum d’analyses sur les différents prélèvements intermédiaires et finaux seront effectuées afin de tirer le plus d’informations possibles. Des traitements antiseptiques et cicatrisants sont prévus en cas de plaies. cf. grille de score. Note : Les anti-inflammatoires ne peuvent être utilisés, le processus inflammatoire étant important pour notre mécanisme d'action.

Choix des espèces

Des souris possédant un système immunitaire complet seront utilisée. La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques et immunologiques : (1) En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé, avec des grilles de comparaison entre la souris et l'homme très bien définis pour les injections sanguines. (2) La réponse immunitaire chez cette espèce est également très bien définie. Or, seul le modèle animal possédant un système immunitaire complet permet l'étude de l'effet vaccinal contre le cancer. Les expériences s’effectueront sur des souris de 9 à 11 semaines après 7 jours d'acclimatation dans l’établissement utilisateur. A ce stade de développement, la croissance tumorale est plus reproductible et bien tolérée, de plus, le système immunitaire est suffisamment mature pour induire une réponse vaccinale. Les souris utilisées seront toutes des femelles afin de limiter le risque d’agressivité inter-individu par rapport aux mâles. De plus, les études précédentes ayant été faites sur des souris femelles, cela nous permettra de comparer les résultats de cette étude.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, qui produisent des IgA humaines dans le sang, subissent un prélèvement d'oreille pour le génotypage, des prises de sang, des gavages et des injections, et certaines une infection des muqueuses par Salmonella, qui peut provoquer diarrhées et amaigrissement. Les expériences visent à reproduire chez la souris une maladie rénale humaine, la néphropathie à IgA, et à mesurer le rôle du facteur de croissance APRIL dans sa sévérité, mais le résumé ne donne que la durée de chaque geste, sans leur nombre ni leur fréquence. Sur le remplacement, le porteur s'en tient à une phrase : "aucun remplacement n'est possible dans cette situation multifactorielle".

Objectifs

Le but du projet est le développement d'un modèle de maladie rénale : la néphropathie à immunoglobuline A, chez la souris. Cette maladie rénale humaine est responsable d'une évolution vers l'insuffisance rénale terminale (dialyse ou transplantation rénale) chez 30% des patients qui en sont atteints, alors que la fréquence de la maladie est autour de 0,5% de la population. Il s'agit d'une maladie à plusieurs facteurs, génétique en partie, et faisant également intervenir le système immunitaire des muqueuses (intestin, bronches) via la production d’un type d’anticorps, nommées IgA, au niveau de ces muqueuses. Une des anomalies au cours de cette maladie est le fait que ces anticorps soient déversés anormalement dans le sang. Parmi les facteurs impliqués dans cette anomalie, le rôle d’un facteur de croissance de globules blancs produisant cet anticorps semble être très important. En effet, les patients atteints de cette maladie présentent des concentrations de ce facteur de croissance plus élevées que les volontaires sains et d’autre part une particularité génétique portant sur la production de ce facteur est plus souvent présente chez les patients. Nous disposons d'un modèle de souris produisant des IgA humain dans le sang mais aucune production de cet anticorps dans les muqueuses. Ces souris présentent des dépôts d'IgA humain dans leurs reins avec un début d'inflammation. Il s'agit au cours de ce projet, d’étudier les souris mutantes afin d'évaluer l'impact du facteur de croissance sur l’apparition d’une maladie plus sévère.

Bénéfices attendus

Si le rôle d'APRIL sur la sévérité de la néphropathie à IgA se confirme dans ce modèle, cette cytokine ainsi que ses récepteurs deviendront une cible thérapeutique évidente dans cette maladie. Des molécules visant cette voie sont déjà disponibles (ex: belimumab) pour le traitement d'autres pathologies inflammatoires (lupus). Elle permettra de mieux comprendre le rôle de l'immunité muqueuse au cours de la maladie.

Procédures

Prélèvement d'oreille pour génotypage : 30sec par animal Prélèvement sanguin: 1 mn par animal Gavage par tubage gastrique: 2mn par animal Injection: 30sec par animal

Impact sur les animaux

Possibles douleurs liées aux prélèvements sanguins et prélèvements d'oreille, classe légère, pratique courante en laboratoire Possible douleur et inconfort lié au gavage Possible troubles digestifs dont diarrhées et amaigrissements dans la procédure de challenge muqueux par Salmonella, points limites définis

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements de sang et d'organes afin d'analyser les données et obtenir les résultats.

Remplacement

Il s'agit d'un modèle physiopathologique, nécessitant un environnement in vivo, aucun remplacement n'est possible dans cette situation multifactorielle

Réduction

Le nombre d'individus utilisés par génotype est le minimum d’individus indispensable pour effectuer la procédure d’expérimentation et obtenir des résultats pertinents interprétables. Le nombre d'animaux par génotype est le nombre minimal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs. Afin de minimiser le nombre d’individus nécessaires, un test statistique a permis à partir d’une hypothèse réaliste de prévoir le nombre de souris le plus pertinent.

Raffinement

Toutes les expérimentations sont réalisées dans une animalerie certifiée qui possède tous les éléments du raffinement. Toutes les mesures de réduction de l’inconfort animal sont prévues, à savoir la mise en place d’une anesthésie générale avant tout geste invasif, une analgésie lors des interventions potentiellement douloureuses et la mise en œuvre de points limite adaptés, conduisant à la mise à mort en cas de souffrance. Des observations quotidiennes seront mises en place tout au long du projet, et adaptées pour chaque individu.

Choix des espèces

L'expérimentation sur animaux de petite taille apporte des éléments de connaissance physiopathologique impossible à atteindre en expérimentation in vitro seule ou en clinique humaine car: - elle permet d'être à l'initiation de la maladie ce qui n'est pas possible chez l'homme (maladie peu symptomatique, souvent diagnostiquée après de longues années d'évolution). La mécanistique pathogénique ne peut donc être appréhendée qu'en expérimentation animale dans le cas de cette maladie. - le développement d'un modèle animal permettra d'identifier des cibles thérapeutiques, de tester des interventions thérapeutiques chez l'animal en vue de dégager des traitements candidats transférables en clinique humaine. - Les souris utilisées dans ce projet auront 3 mois: cet âge choisi est optimal pour l’étude de la réponse de l'anticorps (IgA) car il correspond à la phase de développement du répertoire immunologique muqueux.

4 896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales et des injections abdominales quotidiennes, une partie étant irradiée avant une injection de moelle osseuse, pour tester deux molécules censées stimuler la migration des cellules dendritiques et l'immunité anti-tumorale. Le porteur indique que les tumeurs restent de taille modérée et que l'irradiation peut provoquer diarrhée et perte de poids. Sur la réduction, il écrit qu'"aucune approche statistique n'a été réalisée" pour justifier ce nombre de près de 4 900 souris, tout en affirmant que le modèle murin reste "indispensable".

Objectifs

Les cellules dendritiques véhiculent des informations provenant de tissus périphériques, qui sont souvent exposés à des menaces microbiennes, ou au développement de tumeurs, vers les ganglions lymphatiques dans lesquels les lymphocytes T nichent. Au stade immature, les cellules dendritiques échantillonnent les tissus, arborant une migration lente associé à l'internalisation de leur environnement. Lorsqu'elles rencontrent un signal de danger, elles maturent, ce qui induit la baisse de l’activité d’échantillonnage et induit la migration rapide vers les ganglions lymphatiques pour l'activation des lymphocytes T. Ce processus migratoire est strictement nécessaire pour la mise en place de réponses immunitaires adaptatives, notamment contre les tumeurs. Nous avons identifié une protéine qui est activée lors de la maturation des cellules dendritiques et qui augmente la migration des cellules dendritiques in vitro et in vivo. Cette protéine peut être activée par des molécules spécifiques. Nos résultats préliminaires utilisant l’activateur « A1 » de cette protéine ont montré que A1 stimule la migration des cellules dendritiques in vitro sans affecter les fonctions d’échantillonnage, qu’A1 n’est pas toxique in vivo, et que l’utilisation de A1 permet d’augmenter la sensibilité de certaines tumeurs aux traitements par inhibiteur de points de contrôle (immunothérapie par anti-PD1). Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’activateur A1, mais aussi d’une version modifiée de ce composant, A5, sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse, seuls ou en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, et ce dans différents modèles tumoraux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si les deux molécules A1 et A5 peuvent être utilisées pour améliorer la réponse aux traitements d'immunothérapie dans les tumeurs solides qui ne répondent actuellement pas ou peu à ces traitements. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminant dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

Dans une première procédure visant à évaluer l’effet d’un traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée aux animaux anesthésié (1 fois au cours de l’expérience – durée de l’anesthésie

Impact sur les animaux

Les effets indésirables observés sont ceux liés au développement de tumeurs en sous-cutanée sur le flanc des animaux. Etant donné que nos observations se font à des temps précoces de la croissance tumorale, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids chez les souris pendant quelques semaines. Les différents traitements ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nos résultats in vitro ont démontré le potentiel du composé A1 pour stimuler la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes associés. Pour analyser les effets sur la réponse immunitaire anti-tumorale de ce composé et de son dérivé, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu, entre deux tissus (par exemple la tumeur et les ganglions), et les effets sur la croissance tumorale et sur la réponse immunitaire, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, la première procédure servira à déterminer la dose de A1 e A5 montrant le meilleur effet. Les procédures suivantes seront alors réalisées avec ces doses optimales. De même seuls les modèles ayant donné des résultats prometteurs seront utilisés dans la suite du projet Aucune approche statistique n’a été réalisée

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement tous les deux jours (mesure de la tumeur, poids, aspect et comportement) afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score permettra de d’évaluer de manière objective l’état des animaux. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études en immunologie anti-cancéreuse, de part la proximité de son système immunitaire avec le système immunitaire humain. C’est également dans ce modèle murin que nous avons à notre disposition les modèles génétiques indispensables à ce projet (souris déficientes pour la protéine d’intérêt, cible de A1 et A5). Stade adulte entre 8 et 24 semaines Nous souhaitons travailler sur un système immunitaire adulte.