Système immunitaire

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements sanguins sur animal vigile, une irradiation destinée à les rendre aplasiques, des greffes de cellules souches, des injections intraveineuses, sous-cutanées et intrapéritonéales, et une induction de lymphome par des globules rouges de mouton et du tamoxifène, les animaux étant tués dès une perte de poids de 20 % ou un gonflement abdominal. Le projet cherche à comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans un cancer du sang humain et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le porteur affirme que la souris est un modèle "irremplaçable" et qu'"aucun autre système" ne peut s'y substituer.

Objectifs

Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) est un groupe de cancers du sang qui se disséminent dans les organes lymphoïdes. Il est très agressif et la survie du patient atteint de DLBCL se compte en nombre de mois en absence de traitement. Malgré des traitements standards efficaces, environ 30 à 40 % des patients atteints de DLBCL meurent de leur maladie. Ce manque d'efficacité thérapeutique contre le DLBCL a été attribué entre autres par la présence de cellules immunitaires d’origine myéloïde. Ces cellules myéloïdes pourraient participer à la survie et au maintien des cellules tumorales chez des patients atteints de DLBCL, et pourraient aider les cellules tumorales à échapper à la reconnaissance immunitaire, donc pourraient contrecarrer les bénéfices des thérapies administrées aux patients. Jusqu’à présent, toutes les études visant à comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans le DLBCL portaient sur des échantillons prélevés sur des patients atteints de DLBCL. Cependant, les accès aux biopsies sont limités : les biopsies ne sont pas fréquentes, et pour celles qui nous parviennent, elles ne contiennent que peu très peu de cellules myéloïdes et tumorales, et ne nous permettent pas de poursuivre des analyses expérimentales poussées. Ainsi, ce projet vise à développer des modèles de DLBCL chez la souris afin de déterminer comment, au cours de la progression tumorale, les cellules myéloïdes alimentent l’expansion des cellules tumorales. Les objectifs de ce projet sont : 1) Analyser les populations de cellules myéloïdes infiltrant les organes atteints par les cellules tumorales ; 2) Déterminer le rôle des populations myéloïdes dans le maintien de la survie des cellules tumorales ; 3) Identifier des cibles thérapeutiques exprimées par les cellules myéloïdes, et les valider expérimentalement. Ce projet en expérimentation animale est critique pour avancer sur notre compréhension du lymphome agressif DLBCL chez l’homme, contre lequel les traitements actuels ne sont pas efficaces à 100%.

Bénéfices attendus

Ce projet en expérimentation animale est essentiel pour plusieurs raisons : - il permet de mieux comprendre comment les cellules myéloïdes favorisent la persistance des cellules tumorales, et la résistance des patients atteints de DLBCL aux thérapies anti tumorales utilisées actuellement en clinique. - il participe à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques présentes sur ces cellules myéloïdes, qui pourraient être spécifiquement ciblées et/ou neutralisées en clinique pour améliorer les traitements actuellement appliqués, et qui restent sans effet chez des patients DLBCL. - il permet de valider l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements de DLBCL sur des modèles précliniques murins.

Procédures

En ce qui concerne les interventions, aucune intervention chirurgicale n’est prévue dans ce projet. Des prélèvements sanguins via la veine sous maxillaire sont effectués sur animaux vigiles (540 animaux). 560 animaux seront irradiés. Quant aux gestes techniques, le projet comprend des injections intraveineuses et sous-cutanées sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane et oxygène) (972 animaux), des injections par voie intrapéritonéale (772) sur animaux vigils selon la réglementation en vigueur.

Impact sur les animaux

Dans ce projet d’expérimentation animale, nous réalisons plusieurs gestes techniques nous amenant à : 1) administrer de cellules de lymphome d’origine murine; 2) irradier des animaux pour les rendre aplasiques et pouvoir reconstituer leur système immunitaire avec des cellules souches hématopoïétiques modifiés; 3) effectuer des administrations par voie intraveineuse de cellules immunitaires purifiées; 4) administrer un inhibiteur du développement des cellules myéloïdes par la voie intra-péritonéale, ou administrer des inhibiteurs de la vascularisation des tumeurs par la voie sous-cutanée; 5) induire des lymphomes B par administration de globules rouges de mouton et de tamoxifène. Toutes ces procédures nécessitent de la contention à l’origine d’un stress passager de l’animal (5 minutes). Les procédures impliquant l’administration d’un traitement par voie intrapéritonéale sur animaux vigils entrainent une douleur locale de 2 secondes causée par la piqure de la seringue. Toute autre administration (voie intraveineuse ou sous-cutanée, prélèvements sanguins) se réalise sur animaux anesthésiés et ne provoque pas d’inconfort le temps de la manipulation. Les injections intraveineuses et les prélèvements sanguins par voie rétro-orbitales entrainent un inconfort passager (5 minutes) de l’oeil qui est soignée par l’application d’un gel oculaire dès la fin de la procédure. L’irradiation n’entraine aucun effet indésirable dès lors que les animaux reçoivent une greffe de cellules souches hématopoïétiques suivie d’un traitement antibiotique continu de 4 semaines. L’immunisation par des globules rouges de mouton et le transfert adoptif n’entraine aucun effet indésirable sur le long terme. L’administration de tamoxifène peut entrainer une perte de poids de 10% le temps du traitement (ici, 9 jours). La croissance tumorale du lymphome peut entrainer une perte de poids dans 10% des cas ou un gonflement abdominal. La mise à mort des animaux concernés sera appliquée dès lors que la perte de poids atteindra 20% du poids total, ou qu’un gonflement abdominal est observé.

Devenir

Les animaux (mus musculus) sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements de plusieurs organes, et effectuer des analyses biologiques en laboratoire.

Remplacement

Il nous est à ce jour impossible de recréer grâce à des modèles informatiques ou des modèles de culture cellulaire tous les facteurs physiologiques et environnementaux permettant à une tumeur de se développer, d’être irriguée par le sang, drainée par la lymphe, de modifier son environnement, et d’interagir avec les cellules du système immunitaire. Ainsi aucun autre système ou modèle actuellement disponible ne peut se substituer au modèle murin, modèle animal irremplaçable pour notre projet.

Réduction

Des résultats fiables sont obtenus avec 5 animaux par groupe expérimental, et pour des expériences répétées deux fois. Tous les animaux ont un fond génétique uniforme pour limiter les variations entre les individus et assurer la reproductibilité des résultats. Nous appliquons des analyses statistiques spécifiques à chaque expérience pour déterminer si les différences que nous observons entre nos groupes d’animaux sont exactes et suffisamment fiables pour conclure sur les effets observés, établir de nouvelles hypothèses et avancer dans notre recherche de potentielles molécules candidates pouvant être ciblées dans les lymphomes de type DLBCL.

Raffinement

Les animaux sont gardés en groupes sociaux, avec nids et dômes protecteurs, et suivis quotidiennement. Les analgésiques administrés régulièrement en systémique modifiant les réponses immunitaires étudiées, leur utilisation n’est pas recommandée. La totalité des animaux utilisés dans ce projet et porteurs de cellules tumorales sont mis à mort avant l’apparition de signe de stress ou de souffrance. Cependant, un animal présentant des signes de trouble du comportement et/ou de douleur fera l’objet d’une surveillance accrue, disposera de nourriture humidifiée au fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire, et sera mis à mort dès lors qu’il présente simultanément une perte de poids, des troubles du comportement, une déshydratation, et une baisse d’activité. Dans les expériences nécessitant des injections sous-cutanée, intraveineuse et des prélèvements sanguins, les souris sont anesthésiées par voie gazeuse (un mélange oxygène/isoflurane), ou chimiquement.

Choix des espèces

La physiopathologie de la souris est proche de celle de l’homme : une étude de la souris nous permet de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire chez l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle d’étude le plus simple et le mieux approprié pour 1) Analyser l’impact des mutations génétiques à l’origine des pathologies des lymphomes agressifs de type DLBCL chez les patients, et 2) Visualiser et analyser des cellules myéloïdes qui participent à l’émergence et à la persistance des cellules tumorales dans les tissus tels que la rate, la moelle osseuse et les ganglions grâce à des techniques d’imagerie de pointe (cytométrie, microscopie). Dans ce projet, les animaux utilisés ont atteint l'âge adulte (> 8 semaines d’âge).

3 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en fer, une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie et, pour certaines, des injections d'un anticorps d'immunothérapie, les tumeurs étant laissées à croître jusqu'à un point limite de taille. Le porteur met à mort toutes les souris deux à treize semaines après la greffe, quand ce point limite est atteint. Il affirme que la complexité du microenvironnement tumoral ne peut pas être reproduite in vitro, ce qui obligerait à recourir à l'expérimentation animale.

Objectifs

Le développement de tumeurs chez des individus immunocompétents reste un paradoxe. En effet, chez les patients atteints de cancer, on détecte fréquemment des réponses immunologiques spontanées dirigées contre la tumeur mais qui malheureusement ne se traduisent que trop rarement par des réponses cliniques efficaces (destruction de la tumeur/guérison). Le principal frein est l’existence de points de contrôles négatifs du système immunitaire correspondant entre autres à l’expression par certains acteurs de l’immunité de molécules inhibitrices bloquant leurs fonctions. Pour remédier à ce problème, des protocoles “d’immunothérapies” anti-tumorale se sont développés avec succès permettant de réactiver la réponse immunitaire anti-tumorale. Cependant, seule une fraction des patients répond au traitement et développe une réponse anti-tumorale efficace. Nos résultats préliminaires montrent que le fer augmente significativement les réponses des lymphocytes T in vivo et in vitro. Cet effet “adjuvant” se traduit par un fort ralentissement de la croissance de lignées tumorales transplantées chez la souris. Au regard de ces résultats, nous souhaitons poursuivre et approfondir notre étude en associant notamment supplémentation en fer et immunothérapie anti-tumorale.

Bénéfices attendus

Au terme de ce projet, nous pourrons déterminer si l’association d’une supplémentation en fer aux stratégies d'immunothérapie actuelle pourrait être bénéfique pour la mise en place de réponses immunitaires anti-tumorales efficaces. Chaque traitement, séparément, augmente les réponses immunes anti-tumorales, provoquant un ralentissement voire un arrêt de la croissance tumorale. Nous espérons que les effets de ces 2 traitements, non seulement s’additionnent, mais également qu’une synergie puisse être observée, càd que l’effet anti-tumoral des 2 traitements ensemble soit supérieur à la somme des effets des 2 traitements appliqués séparément. En conclusion, ce projet vise à montrer l’effet bénéfique d’une supplémentation en fer pour la mise en place de réponses anti-tumorales plus efficaces et devrait confirmer le bénéfice de l’associer aux immunothérapies actuelles.

Procédures

-Régimes alimentaire contrôle ou enrichie en fer (de l'âge de 8 semaines jusqu'à la fin de l'expérimentation) -Injection sous-cutanée de cellules tumorales, sous anesthésie générale par isoflurane (10-15min par souris) - Certains animaux seront également injectés à 5 reprises par voie intra-péritonéale avec un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse (30secondes/injections/souris). Les injections seront toutes espacées de 3 jours.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées pour ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Le régime enrichi en fer peut induire au cours de la première semaine une perte de poids des animaux n'excédant pas 10%. Cependant, celui-ci n'induit pas de pathologies sur la durée des procédures de ce projet. Le stress et les douleurs pouvant être occasionnés lors des injections sous-cutanées et intra-péritonéales sont à proprement parlé légers. La croissance tumorale peut occasionner encore une fois un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux.

Devenir

Toutes les souris seront mise à mort 2 à 13 semaines après l’injection sous-cutanée en fonction de la vitesse de croissance des différentes lignées tumorales car le point limite de taille de la tumeur sera atteint.

Remplacement

La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro pour évaluer nos hypothèses. Ces expériences nous ont permis, par exemple, de confirmer que le fer permet l'activation, la prolifération et la différenciation de certaines cellules du système immunitaire, cruciales pour la mise en place de réponses anti-tumorales.

Réduction

Des lots d’un nombre adapté d’animaux seront utilisés en anticipant la validité statistique des données obtenues. Les tumeurs transplantées sont très majoritairement de type “mâle”. Nous utiliserons donc des souris mâles pour notre étude. De plus, les expériences de la première procédure nous permettrons de réduire le nombre d'animaux utilisés lors de la seconde.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en cartons. Nous nous efforçons de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux au cours de chaque procédure grâce à l’utilisation d’anesthésie générale sous isoflurane lors des injections sous-cutanées et grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. En effet, il est important de maintenir les animaux immobiles pour pouvoir les raser et procéder aux injections sous-cutanées sans risque de les blesser. Nous avons défini des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie. A partir du 4eme jour suivant l’injection de cellules tumorales les animaux seront suivi 4 à 5 jours par semaine par le responsable du projet pour notamment mesurer la croissance des tumeurs. Les souris seront également pesées une fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en oeuvre (mise à mort et analyse des animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral car de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques, déficientes pour l'expression de tel ou tel gène, nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques comme le fer in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 20 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral et l’effet du fer sur celui-ci.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réparties entre quatre variants du SARS-CoV-2, elles reçoivent deux injections de virus inactivés et subissent des prélèvements de sang à la queue faits au scalpel, pour évaluer une méthode d'inactivation virale mise au point au laboratoire. Le porteur indique que les souris perdant plus de 20 % de leur poids seront mises à mort, les autres l'étant pour récupérer le sérum. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ne permet d'induire une réponse immunitaire complète.

Objectifs

Notre étude s’inscrit dans une démarche de recherche de nouveaux vaccins pour lutter contre la pandémie de COVID19. Elle cherche à évaluer chez la souris l'efficacité de la réponse immunitaire vis-à-vis de virus SARS-CoV-2 inactivés et rendus inoffensifs par une nouvelle méthode développée dans notre laboratoire. Les vaccins actuels contre le SARS-CoV-2 visent tous à préparer le système immunitaire à se défendre, en utilisant un élément de l'enveloppe du virus : la protéine virale "Spike". Le systéme immunitaire identifie cette protéine "Spike" comme un antigène, puis réagit en fabriquant des anticorps. Cette réponse immunitaire permet au corps de se préparer à lutter contre le virus. Parmi les stratégies vaccinales, on retrouve des stratégies classuques (virus iactivés, protéines "Spike" seules ou présentées par des vecteurs viraux, comme le vaccin Astra Zeneca) et plus modernes (vaccin ARNm, vaccin ADN). Les virus inactivés peuvent être produits rapidement dans un contexte épidémique. Ils engendrent peu de problèmes de tolérance (exemlpe du Sinovac, Chine). Notre laboratoire a établi qu’un traitement chimique nouveau, basé sur un détergent, permet de détruire des virus SARS-CoV-2 et de les rendre inoffensifs. Après ce traitement, les virus apparaissent comme des particules cassées, avec une membrane déchirée, mais qui contient toujours les protéines virales majeures : "Spike", "Membrane" et "Enveloppe". L’innocuité chez la souris et l’efficacité de cette nouvelle méthode dite de ‘fractionnement’ viral ont été démontrées auparavant avec le virus de la grippe, induisant une production importante d’anticorps après injection. Cette nouvelle méthode présente de gros avantages : rapidité, facilité de mise en œuvre et application à tous les variants du SARS-CoV-2. Notre objectif est de développer de nouvelles applications de cette formulation adaptée à la prévention de la COVID19. Dans ce cadre, l’étude de l’efficacité de cette formulation nécessite une approche in vivo, chez un modèle murin très bien caractérisé pour identifier la réponse immunitaire après l'injection des coronavirus inactivés par notre détergent. Nous souhaitons vérifier que cette nouvelle méthode générant des SARS-CoV-2 inactivés mais potentiellement immunogènes permettra d'améliorer l'intensité et la qualité de la réponse immunitaire induite chez la souris. Nous réaliserons ces essais sur les quatre variants les plus importants du SARS-CoV-2.

Bénéfices attendus

Dans le cas du SARS-CoV-2, le développement de vaccins repose aujourd'hui principalement sur la reconnaissance de la protéine "Spike" par le système immunitaire. Cette stratégie a montré ses limites avec l’apparition de variants viraux présentant des mutations sur la protéine "Spike", qui permettent aux variants viraux de s'échapper en partie de la réponse immunitaire. Deux autres protéines membranaires, E (enveloppe) et M (glycoprotéine membranaire), elles aussi immunogènes, sont présentées par le coronavirus. Notre méthode permet de produire des particules virales inoffensives (non infectieuses) enrichies des protéines Spikes et des protéines membranaires "Enveloppe" et "Membrane", lesquelles présentent très peu de mutations chez les variants du coronavirus. Cette stratégie apparaît plus pertinente pour contrôler précocement l’infection virale en multipliant les cibles protéiques immunogènes, dans le cadre de la lutte urgente à mettre en place contre la COVID19.

Procédures

Dans le cadre du projet, les types et durée d'intervention auxquels seront soumis les animaux sont : - Juste avant inoculation (J0) : prélèvement de 10µl de sang (45 secondes y compris contention); - Injections (J0 et J21) de 100µl de suspension virale (5 à 6 secondes, y compris contention). Le nombre total d’animaux s’élèvera à 144 au maximum soit 36 souris par virus inactivé testé (Wuhan, Beta, Delta et Omicron). En fin d'expérimentation, une anesthésie sera utilisée afin de permettre une sédation complète de l’animal avant prélèvement sanguin puis mise à mort par du personnel formé (2-3 minutes de l'injection d'anesthésique à la mort de l'animal)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues peuvent concerner : - Les injections réalisées au niveau du péritoine, qui induisent une douleur légère au moment de l’injection et/ou un léger inconfort très limité dans le temps. - Le prélèvement de sang à la queue réalisé le même jour sur les animaux ce qui induit une douleur de très courte durée au moment de l’incision avec la lame de scalpel. - L’injection de virus inactivés (immunogène) devrait induire chez la souris une réponse immunitaire pouvant conduire à un léger inconfort (limité dans le temps) résultant de la stimulation du système immunitaire, à une éventuelle diminution de l’activité de l’animal ainsi qu’à une légère perte de poids les premiers jours post-injection.

Devenir

Tout animal inclus dans la procédure sera euthanansié soit parce qu'il aura atteint l'un des points limites de l'étude, soit pour récupération du sang en vue de l'analyse de la réponse immunitaire dans le sérum.

Remplacement

L’objectif du projet est d’induire une réponse immunitaire, principalement une réponse en anticorps neutralisant. L’utilisation de modèle in vitro ne permet pas d’induire une réponse immunitaire complète. Aucune alternative à l’utilisation des animaux n’est possible pour ce projet. Nous utiliserons un modèle de souris C57/Bl6, communément utilisé pour l’évaluation de composés immuno- thérapeutiques et de la réponse immunitaire suite à l’injection de virus inactivés. Des études in vitro ont été réalisées en amont et le seront en aval de cette étude afin de limiter au strict minimum les étapes sur animal vivant.

Réduction

Le nombre de souris a été déterminé en utilisant des outils statistiques adaptés permettant de démontrer ou non une différence significative entre le groupe de souris traité et le groupe de souris contrôle. Nous obtenons un nombre de 6 souris par groupe pour cette étude. Un total de 12 souris est donc nécessaire pour chaque type d'étude.

Raffinement

Durant ce projet, les souris seront suivies quotidiennement et une grille de scoring permettra de déterminer si un analgésique est nécessaire pour assurer le bien-être animal. De plus une euthanasie sera programmée dès que l’un des point limite sera atteint. Les points limites principalement retenus sont : - Perte de poids supérieure à 20% du poids initial - Réaction inflammatoire sévère et irréversible au point d’injection - Diminution d’activité prolongée ou difficultés à se nourrir ou à boire

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est la souris car elle est l’espèce qui est la mieux définie génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence sont nombreuses. Les animaux nécessaires à cette étude devront être des adultes de 8 à 10 semaines afin de garantir un système immunitaire mature.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

2444 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux et des adultes reçoivent des vaccins, des injections d’anticorps et une infection nasale par un grand nombre de bactéries de la coqueluche, avant le prélèvement de leur nez, de leurs poumons et de leurs organes lymphoïdes, pour identifier des anticorps maternels protecteurs. Le porteur indique que l’infection peut tuer l’animal, souiller son pelage et gêner sa respiration, la perte de poids survenant juste avant la mort. Il précise que les mères sont tuées au sevrage et affirme qu’aucun modèle in vitro ne peut remplacer cette étude.

Objectifs

Prévenir les maladies infectieuses chez l’enfant par l’immunisation maternelle et l’immunisation de l’enfant s’avère être une nécessité pour les maladies à taux infectieux (R0) élevé. Le nombre de maladies que l’on peut prévenir par la vaccination a considérablement chuté ces dix dernières années. Néanmoins, les maladies infectieuses constituent la première cause de mortalité chez les enfants de moins de 5 ans, en particulier dans les pays en voie de développement. Le développement de nouveaux vaccins fondés sur l’identification d’anticorps protecteurs est nécessaire pour parvenir à réduire la mortalité infantile. La coqueluche figure parmi les maladies avec un R0 très élevé et pour lesquelles le taux de mortalité infantile est élevé. Les formes graves de la coqueluche touchant les nouveau-nés sont associées à une augmentation du nombre de globules blancs dans le sang (hyperleucocytose) entraînant une hypertension artérielle pulmonaire, conditionnant le pronostic vital notamment lorsqu’une défaillance cardiovasculaire apparaît. Par le passé la mise en place d’un modèle d’hyperleucocytose chez le souriceau a permis de montrer le rôle de la toxine pertussique (PT) dans ce phénomène. Les objectifs de ce projet sont les suivant : - Objectif 1 : Identification d’anticorps anti-PT conférant une immunité contre la coqueluche. - Objectif 2 : Etude du passage sélectif des anticorps de la mère à la progéniture et de la contribution des anticorps à la clairance du pathogène chez la progéniture infectée. - Objectif 3 : Immuno-modulation de la réponse immune de la progéniture par les anticorps maternels.

Bénéfices attendus

Les bénéfices apportés par ce projet seront multiples. Nous caractériseront les anticorps anti-PT protecteurs contre la coqueluche et contribuant à la clairance du pathogène. Nous déterminerons l’impact du transfert d’anticorps anti-PT sur la réponse immune des souriceaux à une vaccination contre la coqueluche ou à un challenge infectieux. Dans cette optique, nous étudierons l’effet de différents vaccins anticoquelucheux dans le but d’identifier la meilleure stratégie vaccinale et de concevoir des vaccins plus performants.

Procédures

Les vaccinations seront réalisées sur animaux vigiles, par injection sous-cutanée, qui est l'injection la plus indolore ayant prouvée son efficacité. L'injection en sous-cutané dure 1 à 2 minutes/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection). Deux séries de vaccinations à 4 semaines d'interval sont réalisées. Cela concerne 174 animaux. Les injections d'anticorps sont réalisées sur des souriceaux vigiles, en intrapéritonéal et dans un volume minimal de 50 uL ou bien à des souris adultes endormies, en retroorbital, dans un volume minimal de 100 uL de façon à limiter la douleur de l'animal. L'injection dure 1 à 2 minutes/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection) Une seule injection par animal est réalisée. Cela concerne 1860 animaux. Les infections en intranasal sont réalisées sur des souris endormies et dans des volumes minimaux pour éviter que l'animal se noie. L'injection en intranasal des bactéries prend 2 minutes/animal (temps de la contension et du maintien de l'animal après inoculation pour éviter qu'il se noie et vérifier son rythme cardiaque). Un animal est infecté une seule fois au cours des expériences. Cela concerne 2444 animaux. Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sur des animaux euthanasiés à l'issu des expériences. L'euthanasie dure 1 à 2 min/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection et le temps que le produit fasse effet). Cela engage la totalité des animaux inclus dans les expériences (2444).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, seule l'infection est susceptible d'induire de fortes nuisssances aux animaux. En effet, pour induire une hyperleucocytose chez les souris nous devrons inoculer un nombre élevé de bactéries virulentes ce qui peut causer la mort de l’animal. Les souris malades ont le pelage souillé et des difficultés à respirer et elles perdent du poids.

Devenir

Pour évaluer la protection des anticorps glycosylés anti-PT contre la coqueluche dans le modèle murin nous devons euthanasier l'animal et prélever son sang afin de mesurer l'augmentation du nombre de leucocytes circulants, symptôme le plus précoce associé à la maladie dans le modèle murin. La perte de poids apparaît tardivement et quasi de façon concommitente avec la mort de l'animal. De plus, nous récolterons le nez et les poumons des animaux euthanasiés pour mesurer la charge bactérienne ou la réponse immune locale. Des organes lymphoides primaires ou secondaires tels que la rate et le thymus seront également prélevés pour étudier la réponse immune en périphérie. Les mères sont euthanasiées au moment du sevrage (4 semaines) et leur sang est collecté pour mesurer le taux d'anticorps circulant et les caractériser.

Remplacement

L’étude des effets de la vaccination maternelle sur la réponse immune de la progéniture ne peut être substituée par des modèles in vitro.

Réduction

Différentes mises au point seront réalisées afin d’identifier les conditions optimales pour répondre aux problématiques posées; ce qui permettra de réaliser les expériences de grande échelle (telle que le criblage d’une banque d’anticorps glycosylés) sur un nombre minimal d’animaux.

Raffinement

Des points limites ont été définis, qui seront surveillés quotidiennement tels que le comportement apathique des souris, leur pelage souillé, leur difficulté à respirer et la perte de poids. Les souris gestantes ne seront pas transportées pour limiter le stress à l’animal. Les souris gestantes auront un régime alimentaire adapté (croquettes enrichies). Du coton sera mis dans les cages pour permettre aux souris de faire un nid.

Choix des espèces

Dans un but d'étude de potentialité vaccinale et d'immunorégulation induite par les anticorps, il n'existe pas d'autres possibilités que le recours à l'In vivo, et donc aux souris dans notre cas puisqu'elles représentent un bon modèle adapté à nos études. Il est connu que la coqueluche touche tous les âges de la population et elle est mortelle chez les nourrissons non encore correctement protégés par la vaccination. Pour faire le parallèle avec le modèle murin, nous travaillerons sur des souriceaux de 7 à 9 jours, âges auquels le système immunitaire des souris est comparable à celui d'un nouveau-né. Nous emploierons des souris de 4 semaines, âge auquel le système immunitaire des souris est comparable à celui d'un enfant pour étudier l'effet des anticorps maternels sur la réponse immune des souriceaux à une vaccination. Des souris adultes de 7 semaines, au système immunitaire mature, seront également employées comme outil de criblage, la reproductibilité et la faisabilité des expériences étant meilleure comparé au modèle d'infection néonatale.

1064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par voie nasale avec des mycobactéries de la tuberculose, une partie recevant en plus des molécules immunomodulatrices, avant le prélèvement de leurs organes, pour étudier la réponse immunitaire à l’infection. Le porteur indique que certaines lignées perdent rapidement du poids et se prostrent, et précise qu’aucun antidouleur ni anti-inflammatoire n’est administré afin de suivre l’évolution de la maladie. Il affirme qu’aucun système in vitro ne reproduit l’infection du poumon.

Objectifs

La tuberculose est une pathologie majeure en santé humaine et en santé animale (bovins). L’agent pathogène principal de la tuberculose chez l’homme est Mycobacterium tuberculosis (Mtb) et Mycobacterium bovis (Mb) pour les bovins. Le BCG est le seul vaccin actuellement commercialisé contre la tuberculose chez l'homme mais son utilisation chez les bovins n’est pas autorisée en Europe. Les traitements antibiotiques chez l’hommes sont lourds, et l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques rend les traitements conventionnels inefficaces. Une alternative aux antibiotiques pourrait être l’amélioration des compétences immunitaires, grâce au développement de stratégies d’immunomodulation, préventives ou thérapeutiques, complémentaires des moyens de lutte classiques. Pour cela, il est nécessaire d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes inflammatoires et de la réponse immunitaire de l’hôte (homme, bovin) lors de la tuberculose. Notre objectif est, grâce au modèle murin, d’améliorer nos connaissances des manifestations de la maladie et des fonctions des cellules de l’immunité innée (macrophages, neutrophiles) ainsi que leurs interactions avec l’immunité adaptative (lymphocytes) et d'identifier des facteurs de l’hôte pouvant être immunomodulés afin de mieux lutter contre l’infection.

Bénéfices attendus

Nous espérons, grâce à ce projet, mieux comprendre les rôles de neutrophiles dans la physiopathologie de la tuberculose et de comprendre les interactions de ces cellules avec l’immunité adaptative (Lymphocytes). Ces travaux permettront également d'expliquer les différences de virulence et de dissémination des différentes souches mycobactériennes. Ces travaux, très fondamentaux, pourront permettre développer des stratégies d'immunomodulation en ciblant les facteurs de l’immunité, afin de mieux lutter contre la tuberculose.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale et seront ensuite infectées par voie intranasale (durée de l'intervention 15min/animal) . 288 de ces animaux recevront par voie intrapéritonéale des molécules (anticorps ou inhibiteurs) permettant de moduler l'expression de molécules cibles (durée de l'intervention 5 min/animal)

Impact sur les animaux

Nous savons par expérience que les souris C3HeB/FeJ sont beaucoup plus sensibles que les souris C57Bl/6 aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec les souches M.tuberculosis HN878 (souche clinique humaine) et M.bovis (souche référence bovine). Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire

Devenir

L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, ganglion médiastinal, sang). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Jusqu’à présent, aucun système in vitro ne permet de reproduire les caractéristiques d’infections du poumon et le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test Mann-Whitney. Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs de type Mann-Whitney ou Bonferroni. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Aucun traitement (antidouleur ou anti-inflammatoire) n'est prévu afin de pouvoir suivre l'évolution de la maladie et comprendre le rôle du système immunitaire inné dans les mécanismes de défense liés à ces infections mammaires.

Choix des espèces

Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexite de la reponse immunitaire d'un organisme entier . De plus les modeles murins d'infections mycobacteriennes sont tres bien etablis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. Nous utiliserons des souris adultes agées entre 6 et 12 semaines. Poiur ce projet il nous faut des animaux ayant un systeme mature competent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop agées. De plus nous utilisons un modele validé par la communaute scientifique

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un transfert de cellules d’une souris donneuse puis des injections et des prélèvements de sang répétés, souvent par voie rétro-orbitaire, avant le prélèvement de leur sang et de leur rate, pour tester deux immunosuppresseurs contre un rejet de greffe médié par les lymphocytes NK. Le porteur fixe un point limite de mise à mort à 20 % de perte de poids et mentionne un risque rare d’embolie lors des injections. Il affirme que l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme ne peut être appréhendé par des modèles in vitro seuls.

Objectifs

La meilleure option thérapeutique pour les patients au stade terminal d'une défaillance d'organe vital est la transplantation, qui consiste à substituer chirurgicalement l'organe défectueux par un greffon fonctionnel prélevé chez un donneur. La principale complication de la greffe d’organe est le phénomène de « rejet » qui demeure la cause majeure d’échec en transplantation. En effet, bien que de la même espèce, les individus sont génétiquement différents. Le système immunitaire du receveur va alors reconnaître des antigènes présents à la surface du greffon comme étrangers, au même titre qu’il reconnaît un agent infectieux. On distingue différents mécanismes conduisant au rejet de greffe, en particulier l’un d’eux découvert récemment fait intervenir des cellules de l’immunité du receveur appelé « lymphocytes NK ». C’est donc autour de la compréhension des mécanismes immunologiques de ce nouveau type de rejet, appelé « rejet NK » que ce projet s’articule, grâce à l’utilisation d’un modèle murin de transplantation simplifié. Dans ce modèle la transplantation sera modélisée par le transfert de cellules de souris dites « donneuses » à des souris « receveuses » issues d’un fond génétique différent, permettant de recréer un rejet NK de manière moins invasive qu’une transplantation chirurgicale. Les patients transplantés sont contraints de prendre toute leur vie un traitement immunosuppresseur qui permet de diminuer la réactivité de leur système immunitaire vis-à-vis du greffon, afin de limiter le phénomène de rejet. Ces traitements, actuellement validés pour d’autres types de rejets, n’ont à ce jour jamais été testés sur le rejet NK. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de 2 familles d’immunosuppresseurs sur ce rejet NK in vivo chez la souris, afin de pouvoir proposer ces traitements aux patients qui en sont atteints. Tout au long du projet, les conditions d'élevage, d'hébergement et de soins seront adaptées aux besoins des animaux. Les procédures utilisées dans ce projet n’occasionnent qu’une douleur et une angoisse minimes pour les animaux. Des points limites précis ont cependant été définis afin d’intervenir si besoin. Les prélèvements sanguins et injections seront réalisés sous anesthésie afin de limiter toute souffrance ou stress chez les animaux. Ce projet nécessite le recours à 116 souris, nombre calculé à visée de réduction par des méthodes biostatistiques nécessaire pour répondre à la problématique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider un nouveau modèle murin de rejet NK grâce à une technique de transfert de cellules, beaucoup moins invasif que le modèle chirurgical par transplantation cardiaque. Grâce à ce modèle murin, l’efficacité de 2 familles de traitement immunosuppresseurs (déjà disponibles en clinique) pourra être évaluer spécifiquement dans ce nouveau type de rejet NK. De manière plus concrète, la validation de l’efficacité de ces traitements chez la souris pourra permettre aux patients atteints de ce rejet particulier de bénéficier de ces médicaments pour limiter la perte de leur greffon

Procédures

Deux à 3 prélèvements sanguins (chaque prélèvement sanguin dure environ 30 secondes), et 2 à 10 injections (la durée d’une injection est inférieure à une minute) seront réalisés au cours de l’expérimentation. Ces gestes seront réalisés après anesthésie gazeuse et de manière alternée gauche/droite pour les prélèvements, afin de limiter le stress des animaux. Les procédures dureront entre 5 et 18 jours. L’ensemble de gestes seront réalisés par un opérateur expérimenté de manière à veiller à engendrer le moins de stress possible sur les animaux.

Impact sur les animaux

Au vu de la durée des procédures (maximum 18 jours) et de la dose d’immunosuppresseurs administrée (concentrations thérapeutiques déjà testées dans un précédent projet et évaluées dans la littérature comme inférieures aux concentrations toxiques), il n'y a pas d'effets indésirables attendus imputables aux substances injectées. Les principales nuisances attendues sont le stress et la douleur liés aux prélèvements et injections répétées de façon rapprochée. Les animaux seront anesthésiés par inhalation avant de procéder aux injections, ou aux prélèvements sanguins. Un collyre anesthésiant, sera administré aux souris avant de procéder à une injection intra veineuse par voie rétro-orbitaire ou à un prélèvement sanguin rétro-orbitaire pour limiter au maximum le stress et la douleur liés à ces gestes. L’ensemble des manipulations et gestes seront réalisées par un opérateur expérimenté afin de limiter les nuisances pour les animaux. Les souris seront surveillées dans les minutes suivants leur réveil après anesthésie afin de contrôler leur état et comportement.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont mises à mort après anesthésie gazeuse afin de prélever le sang et les rates des animaux, et procéder à l’analyse des cellules d’intérêt

Remplacement

Le but de cette étude est d'évaluer l'efficacité de 2 traitements immunosuppresseurs dans le traitement du rejet de greffe induit par les lymphocytes NK du receveur. Nous avons précédemment mis en évidence l'effet bénéfique de ces traitements in vitro grâce à un modèle de coculture cellulaire entre des lymphocytes NK de volontaires sains et une lignée de cellules endothéliales. Néanmoins, la complexité des mécanismes immunologiques en jeu, de même que l'effet des traitements immunosuppresseurs à l'échelle de l'organisme entier ne peuvent être appréhendés par des modèles in vitro seuls. C'est pourquoi ce projet nécessite l'emploi d'un modèle in vivo de rejet NK, permettant de confirmer les données que nous avons obtenu in vitro. Par ailleurs ce modèle de rejet NK utilise une méthode simplifiée par transfert de cellules d’une souris donneuse à une souris receveuse, beaucoup moins invasif pour les animaux que la chirurgie pour transplantation d’organe solide.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupes dans chaque procédure expérimentale a été calculé à minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables, basée sur notre expérience passée. Les paramètres de réponse immunitaire étant relativement homogène chez les souris contrôles, nous avons pris le parti de diminuer le nombre d'animaux contrôles à 5 plutôt que 8. En cas d'échec de l'une des expérimentations dû à problème technique, nous gardons la possibilité de renouveler une fois les procédures.

Raffinement

Au vu de la durée des procédures et de la dose d’immunosuppresseurs administrée (concentrations thérapeutiques déjà testées dans un précédent projet et évaluées dans la littérature comme inférieures aux concentrations toxiques), il n'y a pas d'effets indésirables attendus imputables aux substances injectées. Un collyre anesthésiant, sera administré aux souris anesthésiées par inhalation avant de procéder à une injection ou un prélèvement sanguin. Les gestes d'injection et les prélèvements seront réalisés par un opérateur expérimenté afin de limiter les nuisances liées au geste. Les côtés seront alternés afin de limiter les conséquences de ces prélèvements et dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera rincé quotidiennement par sérum physiologique. Un point de compression sera réalisé au site de ponction après chaque prélèvement. Une hémorragie non contrôlée conduira à la mise à mort de l’animal. Les animaux seront surveillés dans les 15 minutes suivants leur réveil après anesthésie, afin de contrôler leur état et comportement. De plus une surveillance du comportement des animaux sera observée de manière très régulière, avant chaque geste et le lendemain des transferts de cellules. Dans de très rares cas, l’injection intraveineuse peut se compliquer d’une embolie. Les points limites suivants conduiront à la mise à mort de l’animal : coma, convulsions. Si des signes de souffrance ou des modifications de comportement tels qu’une prostration, des yeux mi-clos, un pelage hérissé, un dos vouté ou encore une absence d’interaction avec ses congénères sont observés, cela conduira à une nouvelle surveillance de l’animal le lendemain. En cas de persistance de ces signes de souffrance un antalgique de palier 1 (paracétamol) pourra être administré à l’animal. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera sorti du protocole et sera mis à mort. La perte de poids étant un indicateur clé de l’état de souffrance ressentie par les souris, ces dernières seront pesées 2 fois par semaine durant le déroulé de la procédure. Une perte de poids supérieure à 10% du poids maximum atteint par l’animal conduira à sa réhydratation avec de l’eau gélifiée durant 48h ainsi que la mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage pour favoriser l’alimentation. Une perte de poids supérieur à 20% du poids maximum de l’animal, constitue un point limite à cette procédure. L’animal sera alors mis à mort.

Choix des espèces

Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude du rejet de greffe. Afin de reproduire la différence génétique entre un donneur et un receveur d’organe conduisant au rejet, deux lignées de souris de fonds génétiques différents seront utilisées. Les cellules de souris donneuses, qui expriment à leur surface des antigènes différents de celles des souris receveuses, seront reconnues comme « étrangères » par les lymphocytes NK des receveuses, conduisant ainsi à leur destruction. Des souris adultes entre 8 et 15 semaines seront utilisées dans ce projet. Nous avons choisi cette fenêtre afin de laisser le temps au système immunitaire de se développer et d’atteindre sa maturité afin de répondre aux antigènes administrés.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime gras qui les rend obèses et diabétiques, des mises à jeun de douze heures, des gavages de glucose et, pour la moitié d’entre eux, un traitement antibiotique destiné à perturber leur flore intestinale, avant le prélèvement de leurs organes, pour étudier le lien entre microbiote et diabète. Le porteur indique que le gavage et la contention constituent un stress modéré et que les antibiotiques peuvent provoquer des diarrhées. Il affirme qu’aucun modèle in vitro ou in silico ne rend compte des liens entre alimentation, microbiote et régulation de la glycémie.

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte et une grande diversité de microorganismes. Les bactéries y jouent un rôle crucial pour le développement et le maintien d'un système immunitaire sain. Ainsi un déséquilibre de la composition du microbiote a été montré chez les patients atteints de maladies métaboliques comme l’obésité dont l’une des principales conséquences est le diabète. Ces 35 dernières années la prévalence du diabète a été multipliée par quatre avec 9.3% de la population mondiale souffrant de cette pathologie. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et le rôle que ces interactions pourraient avoir dans des maladies métaboliques telles que le diabète. En cas d'obésité, de nombreux changements se produisent dans l’intestin. Ces modifications intestinales sont maintenant reconnues comme participant à l'auto-aggravation de l'obésité. Parmi les changements qui s’opèrent, la densité des cellules de l'immunité, qui sont nombreuses dans l’intestin, augmentent chez les personnes obèses et leur activation va notamment modifier la régulation de la glycémie. Les mêmes mécanismes sont à l’œuvre dans les modèle de rats rendus obèses par l’alimentation. De nombreuses études suggèrent que les bactéries de l’intestin, dont la composition est perturbée par l‘obésité, sont en partie responsables des changements de fonction des cellules immunitaires. Cette triade (microbiote-cellules immunitaires intestinales-régulation de la glycémie) constitue donc une cible intéressante pour mieux comprendre la mise en place du diabète. Nous souhaitons dans un premier temps caractériser les populations de cellules immunitaires et leurs (dys)-fonctions dans différentes régions de l’intestin chez des rats obèses en comparaison avec des rats non obèses et ceci en présence ou non d’une perturbation majeure du microbiote intestinal. Sur les mêmes animaux un suivi de la glycémie sera réalisé ainsi qu’une analyse fine du microbiote intestinal et des populations et fonction de l’intestin. Des outils de bio-informatique nous permettant de faire des études de corrélation entre ces différents paramètres seront par la suite utilisés dans les analyses.

Bénéfices attendus

Les perspectives de ce travail sont d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques intestinales, donc accessibles par voie orale afin de prévenir ou limiter les effets néfastes de l’obésité sur le diabète. Le diabète est une maladie évolutive qui se caractérise par une hyperglycémie chronique liée à une réponse altérée à l’insuline. Ce déséquilibre du métabolisme glucidique est notamment lié aux déséquilibres nutritionnels et à l’obésité. Le système immunitaire a aussi un rôle dans la mise en place du diabète qui est souvent associé à une inflammation élevée chez les sujets obèses. Le diabète entraine des complications vasculaires graves à long terme et une surmortalité. Son impact sur le budget santé, qui peut atteindre 5 à 20% des dépenses de santé de nombreux pays, est évalué à la hausse pour les décennies à venir. Il est donc important de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie.

Procédures

Les animaux recevront un régime riche graisses induisant une prise poids et un diabète. Les animaux seront mis à jeun deux fois pour une durée de 12h durant l'ensemble de la procédure. Ils recevront également un gavage de glucose (entrainant une contention de 10 secondes). Un test de tolérance au glucose (appelé OGTT) visant à mesurer la glycémie (via une seule petite piqure à la queue) sera réalisé sur l'ensemble des animaux. Ce test sera réalisé deux fois à 3 semaines d’intervalle durant la procédure. La moitié des animaux recevra un traitement antibiotique pendant deux semaines afin de perturber la flore intestinale. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine en étant placés durant quelques secondes dans un pot individuel. Deux pesés sur l'ensemble du projet nécessiteront une pesée plus longue (de quelques minutes) afin de laisser le temps aux rats d'expulser une crotte qui sera ensuite récoltée dans le pot.

Impact sur les animaux

Le gavage lors de l’OGTT constitue un stress modéré notamment dû à la contention (d'une durée < 10 secondes). La contention et le gavage seront réalisés par un experimentateur expérimenté. Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. la procédure de prélèvement de sang nécessaire à la lecture de la glycémie ne présente qu’une douleur très faible car il est réalisé via une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'espérimentateur lors du premier prélèvement du test. Par la suite un simple massage permet de prélever du sang sans avoir à recouper la queue. Le traitement antibiotique pourra éventuellement entrainer des diarrhées.

Devenir

Dans ce projet la mise à mort est nécessaire pour le prélèvement des organes.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les liens entre l’alimentation, la composition du microbiote, les fonctions immunitaires de l’intestin et la régulation de la glycémie.

Réduction

D’après les études déjà menées, nous estimons que 15 rats par groupe expérimental sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux hébergés 2 par cage bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront entrainés à la manipulation (notamment à la contention). Afin de limiter le stress lors des mesures de glycémie qui se feront dans une autre salle que la salle d'hébergement, les animaux seront transférés dans la salle expérimentale 1h avant. Un anesthésique local sera appliqué sur la queue avant les prélèvements de sang réalisés pour les mesures de glycémie. Des points limites, décrits dans les procédures expérimentales, seront également mis en place.

Choix des espèces

Les rats utilisés seront des rats wistar RjHan:WI. Cette espèce est choisie car cette étude fait partie d’un projet collaboratif réunissant 2 autres équipes de recherche et nécessitant une harmonisation du modèle rongeur. De plus ce projet repose sur de nombreux travaux préliminaires ayant utilisé des rats wistar RjHan:WI. Ce projet étudie le rôle du microbiote sur le développement du diabète chez l’adulte. Le modèle de rat utilisé est donc un modèle adulte qui aura 7 semaines en début d’expérimentation (le microbiote des rats est stabilisé à partir de 5-7 semaines) et 21 semaines en fin d’expérimentation. 3 mois de régime riche en graisses correspond au temps nécessaire pour rendre les animaux obèses avec une perturbation des fonctions immunitaires et de la régulation de la glycémie.