Système immunitaire

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection d'anticorps, trois expositions intranasales à la bléomycine et une trachéotomie sous anesthésie sans réveil, pour provoquer une fibrose pulmonaire et mesurer la toxicité de nouveaux conjugués anticorps-médicament anticancéreux. Le porteur indique que le modèle entraîne une perte de poids et des difficultés respiratoires liées à la fibrose induite. Il présente ces études comme "essentielles" pour sélectionner le candidat le moins toxique avant une première administration chez l'humain, les bénéfices annoncés pour la santé humaine restant à moyen terme.

Objectifs

Les modèles animaux permettent l’étude des effets positifs et négatifs de drogues anticancéreuses à l’échelle de l’organisme. Ces études précliniques sur l’animal permettent la validation de thérapies anticancéreuses plus efficaces et moins toxiques pour le traitement des patients. Les études proposées visent à évaluer l’induction d’une fibrose pulmonaire chez l’animal par de nouvelles molécules développées pour être des traitements anticancéreux. Connaître ce paramètre pour un composé permet de prédire l’apparition de toxicités pulmonaires observées chez l’Homme avec ce type de traitements. Les études proposées portent sur différents variants d’un anticancéreux en développement et visent à déterminer lequel des composés présente le profil de toxicité le plus favorable, afin de le qualifier pour un développement préclinique plus poussé

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra d’étudier l’impact du design du conjugué anticorps-médicament sur la toxicité pulmonaire. Ces études sont essentielles pour la sélection du ou des ADC (anticorps-drogue conjugué) induisant le moins de toxicité pulmonaire, et de sélectionner le candidat médicament pour les études précliniques réglementaires avant une première administration chez l’homme.

Procédures

Injection d'anticorps : nombre 1 durée : quelques secondes Exposition intra nasale a la bléomycine : nombre 3 durée : quelques secondes. Trachéotomie : nombre 1 : Durée 30 minutes sans réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles inherentes au modèle telles qu'une perte de poids, une apprition d'une fibrose induisant des difficultées respiratoire

Devenir

Toutes les souris seront mise a mort en fin de procédure pour analyses. Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 8 souris par groupes. De ce fait nous utiliserons les tests de Mann-Whitney si la comparaison se fera entre 2 groupes ou Wilcoxon si le nombre de groupes à comparer est supérieur à 2. Ces tests reposent sur l’analyse de données non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ce test nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.

Remplacement

Cette étude vise à évaluer l’induction d’une toxicité pulmonaire par un composé, nécessitant ainsi l’utilisation d’un modèle animal. Des études in vitro et in vivo ont été réalisées en amont afin de sélectionner uniquement les molécules ayant le plus grand intérêt thérapeutique pour l’étude de toxicité pulmonaire.

Réduction

Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 8 souris par groupes.

Raffinement

Avant le début des procédures, les souris seront habituées aux expérimentateurs de l’étude par une observation quotidienne, afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur stress et leur détresse. Des points limites adaptés comme une surveillance quotidienne, des pesées régulières (1 fois par semaine) ont été définis pour détecter et minimiser toute souffrance, toute douleur et tout stress des animaux.Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les animaux seront hébergés 4 femelles par cage (cages : hauteur supérieure à 15cm, surface de 500cm2) dans un environnement enrichi pour limiter le stress. L’enrichissement choisi consiste en la présence d'un dome et de frissotis.

Choix des espèces

La modélisation de la toxicité pulmonaire par la bléomycine est une méthode très répandue chez la souris. Pour cette procédure, nous avons besoin d’utiliser des souris de 6 semaines ayant un système immuniatire mature.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie, puis une plongée simulée en caisson hyperbare suivie d'une heure d'observation pendant laquelle un accident de décompression peut provoquer des symptômes douloureux. Le porteur indique que les rats seront tués dès l'apparition des premiers symptômes, et qu'ils sont tous mis à mort pour prélever sang et organes. Il justifie le recours à l'animal par l'absence de biomarqueur fiable et par l'étude sur "l'organisme entier".

Objectifs

L’accident de décompression (ADD) est un syndrome systémique survenant suite à la formation de bulles dans la circulation sanguine et dans les tissus lors d’une diminution de la pression environnementale. Les mécanismes de l’ADD sont encore aujourd’hui assez peu connus et cet accident est décelé uniquement sur la base des symptômes qu’il déclenche. Dans le but d’approfondir les connaissances sur le rôle de l’inflammation et de la coagulation dans la mise en place et la susceptibilité à l’ADD, nous allons étudier les réponses cellulaires de globules blancs et de plaquettes lorsque ces dernières sont exposées à différents stress rencontrés en plongée. L’objectif de ce projet est donc double : (i) confirmer/infirmer l’existence d’une relation entre la résistance à l’ADD et des modifications fonctionnelles des globules blancs et des plaquettes, (ii) étudier les différences liées au sexe dans les mécanismes de résistance à l’ADD.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes de résistance à l’accident de décompression (ADD) ainsi que les mécanismes physiologiques impliqués dans la mise en place de ce syndrome. Ces travaux pourront être bénéfiques en santé humaine et plus particulièrement dans un cadre de prévention de l’ADD. A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur la compréhension de la sensibilité à l’ADD. Plus particulièrement, sur l’implication des réponses leucocytaires et plaquettaires face à une modification de la pression hydrostatique et de la pression de l’air. A moyen terme, l’intégration de ces réponses au niveau physiologique et la caractérisation du type de stress ayant eu un impact plus marqué sur les réactions cellulaires permettra d’orienter nos recherches futures. A plus long terme, la mise en évidence de facteurs de risque permettrait de prévenir l’ADD avant une plongée. La perspective d’avoir une meilleure approche sur les mécanismes de l’ADD permettrait de mettre en place des protocoles de décompression toujours plus fiables afin de mieux prévenir l’accident.

Procédures

Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin par voie rétro-orbitaire réalisé sous anesthésie / analgésie. Si cela est nécessaire, les animaux de l'étude préliminaire pourront être soumis à un deuxième prélèvement sanguin dans les mêmes conditions. Les deux prélèvements seront séparés d'une période de 3 semaines. Au minimum 4 semaines après le dernier prélèvement retro-orbitaire, les animaux seront soumis à un protocole hyperbare de 60 minutes au total suivi d'une période d'observation d'1 heure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : - Le stress lié à la préhension et à l’injection d'asnesthésiques / analgésiques. Ces nuisances légères ne durent que le temps de l’injection (1 – 2 minutes). - Une possible diminution de la température corporelle au cours de l’anesthésie. Cette nuisance est légère et dure environ 20 minutes. - Le prélèvement sanguin au niveau du sinus rétro-orbitaire entraine un stress. Ces nuisances ne durent que le temps du prélèvement (1 – 2 minutes). - L’angoisse lors de la plongée simulée. Cette nuisance est légère et dure 2h30 (temps de l’exposition hyperbare et temps d’observation). - La douleur induite par l’apparition de symptômes de l’ADD lors de la période d’observation. Ces nuisances seront modérées et très brèves (moins de 1 minutes).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de cette procédure car nous avons besoin de prélever du sang et des organes afin de réaliser des analyses multiples (Cultures primaires, dosages sanguins (facteurs inflammatoires, facteurs de coagulation), histologie…).

Remplacement

Notre travail porte sur l’étude de la sensibilité à l’accident de décompression (ADD). Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler uniquement sur le modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité accrue à l’accident. De plus, l’accident de décompression est un syndrome systémique impliquant de nombreuses réponses autres que l’inflammation et la coagulation comme le stress oxydant et la dysfonction vasculaire par exemple. L’analyse des tissus post exposition hyperbare nous permettra de confronter nos résultats obtenus au niveau des globules et des plaquettes sanguines à ce que l’on observe sur l'organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et de permettre la réalisation d’une mise au point de la culture primaire (déterminer la quantité de cellules que nous pouvons mettre en culture suite au premier prélèvement, viabilité cellulaire…). Les tests statistiques utilisés intègreront 2 facteurs à étudier : susceptibilité à l’accident de décompression et sexe. De plus, après mise à mort des animaux, les prélèvements tissulaires vont nous permettre d’approfondir nos résultats de manière intégrée en sortie de plongée.

Raffinement

Tout au long du protocole, les conditions de stabulation sont réalisées dans un souci de bien-être de l’animal et les animaux sont suivis quotidiennement. Toute la procédure expérimentale est réalisée par des personnes formées et habituées à travailler avec des animaux de laboratoire. Pour réduire au maximum la douleur du prélèvement sanguin, l’animal sera ponctionné sous anesthésie/antalgie. L’induction de l’anesthésie sera réalisée par voie gazeuse afin de réduire au maximum le stress lié à la préhension et à l’injection. L’animal sera placé sur tapis chauffant et sa température corporelle sera monitorée jusqu’au réveil. Après le prélèvement sanguin, un suivi quotidien des animaux est réalisé avec une grille de score adaptée. Avant de démarrer le protocole d’exposition hyperbare, les animaux sont maintenus pendant 30 minutes dans le caisson hyperbare afin de les habituer à l’environnement et de réduire le stress. Le protocole de plongée utilisé limite au maximum l’apparition d’ADD sévère et les animaux seront mis à mort dès l’apparition des premiers symptômes pour réduire au maximum la souffrance.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De ce fait, nous disposons d’un certain nombre de données, en particulier sur la souche Wistar qui est couramment utilisé au laboratoire afin de caractériser les mécanismes de résistances à l’accident de décompression. Nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Nos travaux précédents ont été effectués sur des animaux matures sexuellement. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement. Lors de l’étude préliminaire, le prélèvement sanguin sera réalisé à l’âge de 8 et 11 semaines et la plongée simulée dans le caisson hyperbare à l’âge de 15 semaines. Lors de l’étude définitive, le prélèvement sanguin sera réalisé à l’âge de 10 semaines et la plongée simulée dans le caisson hyperbare à l’âge de 14 semaines.

780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections dans le muscle de la patte et des prélèvements de sang au niveau de l'oeil, avant la mise à mort et le prélèvement d'organes, pour comparer des candidats vaccins contre le SARS-CoV-2 et la grippe. Le porteur affirme n'attendre aucune souffrance, tout en prévoyant l'exclusion et la mise à mort immédiate des souris montrant prostration ou perte de poids. Sur le remplacement, il indique que le modèle souris est adapté mais aussi "imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques".

Objectifs

Les épidémies de coronavirus et de grippe posent un problème majeur de santé publique. Ces 2 virus sont soumis à de nombreuses modifications génétiques limitant l’efficacité des vaccins actuels. Le virus SARS-Cov2 possède, entre autres, une protéine permettant l’entrée du virus dans les cellules. C’est la cible des vaccins actuels qui génèrent une réponse immunitaire générant de nombreux anticorps de courte durée de vie. Le virus possède également la nucléocapside (N) contenue à l’intérieur du virus, qui est la protéine qui mute le moins entre les différentes souches de coronavirus. Pour le virus de la grippe, il existe également une protéine très conservée, la nucléoprotéine (NP), faisant d’elles des cibles pertinentes pour l’efficacité des vaccins sur le long terme. La technologie mise au point permet aux candidats vaccins d’être très accessible aux cellules du système immunitaire pour protéger des infections. Un partenariat avec une entreprise de biotechnologie permet l’obtention de nouveaux candidats contre la Grippe ou le SARS Cov2 contenant cette technologie. Il est intéressant d’étudier si ces nouvelles formulations vaccinales sont capables de produire des anticorps permettant de lutter contre les virus, mais également de stimuler le système immunitaire afin d’obtenir une protection longue dans le temps. Plus précisément, pour le projet SARS Cov2 les réponses immunitaires sont étudiées suite à l'injection de différents candidats vaccins contenant la protéine permettant l’entrée du virus et/ou la nucléocapside. Pour le projet grippe, des formulations vaccinales avec NP sont caractérisées dans la lutte contre les épidémies saisonnières. Ces études seront réalisées chez le modèle souris. Techniquement, les formulations vaccinales à tester sont injectées dans le muscle de la patte qui est une voie utilisée pour étudier de nombreux phénomènes immunologiques. Des prélèvements de sang réalisés permettront de quantifier les anticorps générés chez les animaux, et des prélèvements d’organes, post mortem, seront étudiés pour valider si les candidats vaccins sont efficaces.

Bénéfices attendus

Les nouveaux condidats vaccins sont très prometteurs pour la santé humaine. Les vaccins récemment développés contre le SARS-CoV-2 ou produits chaque année contre la grippe saisonnière, sont majoritairement destinés à générer une réponse anticorps vis-à-vis de protéines du virus présent à sa surface. Avec l’apparition de nombreuses mutations et donc l’apparition de nouveaux variants, des formulations vaccinales, visant à développer une réponse immunitaire à long terme, pourrait permettre de pallier les problèmes des vaccins actuels. Cela permettrait de mieux traiter les patients avec un vaccin capable d’induire une protection contre différentes souches de SARS-CoV-2 et de la grippe. Selon les résultats obtenus, il pourra être envisagé de porter ce projet à plus grande échelle avec la possibilité de phases cliniques.

Procédures

Tous les animaux du projet vont recevoir 2 injections dans le muscle de la patte sans anesthésie préalable. Ces injections sont espacées de 21 ou 28 jours selon la procédure utilisée et dureront environ 5 à 10 secondes par souris. Pour 30% des animaux, 2 prélèvements de sang seront réalisés, le premier durant les phases d'immunisations, et le second au jour de sa mise à mort. 100ul de sang seront prélevés au niveau de l'oeil sur animaux vigiles. Pour 70% des animaux, seul un prélèvement de sang sera réalisé au jour de la mise à mort de l'animal. Avant chaque prélèvement de sang, une goutte d'un collyre anesthésique local (Tétracaïne) sera appliqué. Chaque prélevement durera 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Pour l'ensemble du projet aucune souffrance des animaux n'est attendue. Toutefois, si une souris présente des signes de souffrance tel que la prostration, l'absence de réponse aux stimuli extérieurs ou la perte de poids, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort.

Devenir

L'ensemble des animaux du projet sont mise à mort lors de chaque procédure.

Remplacement

La vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes et des différents tissus ciblés. Le choix du modèle souris est donc adapté, et également imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit à minima sans compromettre les objectifs du projet. Pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, des groupes de 6 souris sont nécessaires. L'analyse de puissance et l'estimation de la taille de l’échantillon se font en amont de l’expérimentation. Test d’hypothèse: est-ce que la moyenne de la population traitée avec une constructions X est différente de la moyenne de la population contrôle et de la moyenne des autres groupes immunisés. Pour les analyses des résultats et les comparaisons de plusieurs échantillons nous utilisons les Analyses de variance ou ANOVA (one-way analyses of variance) qui va consister à chercher le rapport entre la variance entre les groupes et la variance à l'intérieur des groupes. Également les tests statistiques comme des tests de comparaison de moyennes de Student, ou non paramétrique (Mann Whitney) avec un seuil minimal du risque alpha fixé à 5% peuvent être utilisés selon les comparaisons souhaitées.

Raffinement

Les souris seront acclimatées durant une semaine. L'immunisation est réalisée dans le muscle. C'est une voie permettant l'obtention d'une bonne réponse immunitaire et étant le peu invasif pour l’animal. Enfin, avant chaque prélèvement de sang, un collyre anesthésique local (Tétracaïne, une goutte) sera appliqué.

Choix des espèces

La réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro

756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite leur est induite, avec injections intra-articulaires et prélèvements de sang sous anesthésie, pour évaluer une protéine et repositionner des médicaments existants. Le porteur indique que l'arthrite provoque une douleur et fixe un point limite au score maximal aux quatre pattes ou à 20 % de perte de poids, seuil déclenchant la mise à mort. Il affirme que la complexité de la maladie ne peut être étudiée qu'au niveau d'un "organisme entier", les rubriques réduction et raffinement se réduisant à quelques lignes.

Objectifs

1)-Evaluation du rôle de la protéine QKI5 dans l'inflammation de l'arthrite et dans l'érosion osseuse. 2)-Evaluation de médicaments qui induisent QKI5 ou de lentivirus-QKI5 dans l'inflammation de l'arthrite et dans l'érosion osseuse (Repositionnement de médicaments déjà existants sur le marché).

Bénéfices attendus

Compréhension du rôle de QKI5 dans l'arthrite et l'inflammation. Repositionnement de médicaments qui induisent QKI5 pour une application anti-inflammatoire et anti-érosion osseuse.

Procédures

Aucun prélèvement sur animaux vigiles, aucune procédure chirurgicale. Prélèvements de sang sous anesthésie. Injections IP de serum ou de médicament Injections intra-articulaires sous anesthésie. Durée de la procédure pour chaque souris : 5 minutes.

Impact sur les animaux

L'arthrite induite par les différents modèles provoquera une douleur dont l'intensité sera examinée suivant le codage suivant : Le point limite est atteint lorsque le score de l’arthrite est de 12 (3 à chaque patte) et le score total (apparence générale, apparence des orbites, apparence des oreilles, prise alimentaire ou boisson) est > 15 ou lorsque la perte de poids est de 20 % . Les modèles présentés ici ne sont pas nouveaux et ont été décrits de façon extensive dans la littérature par d'autres auteurs.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux justifiée par l'impossibilité de réutilisation.

Remplacement

la complexité de la maladie ne peut être étudiée qu’au niveau d’un organisme entier. Cependant, chaque fois que cela sera possible, les analyses seront effectuées sur des cellules en culture. Réduire : Raffiner : La douleur des animaux sera réduite au maximum par l’utilisation des anesthésiques et l’euthanasie si cela est nécessaire.

Réduction

Le nombre de souris sera limité au strict nombre nécessaire pour une signification statistique des résultats. Six à 8 souris par groupe d’expériences seront utilisées. Les tests statistiques Mann-Whitney et t de Student seront utilisés.

Raffinement

La douleur des animaux sera réduite au maximum par l’utilisation des anesthésiques et l’euthanasie si cela est nécessaire.

Choix des espèces

Les souris possèdent des articulations dont l’inflammation reproduit l’arthrite humaine. Seule l’espèce Mus Musculus possède les souches nécessaires (Transgéniques, KO, KI) Age adulte : 8 à 16 semaines pour l'expérimentation car le système immunitaire est mature. A partir de 8 semaines pour les prélèvements de souris K/BxN car elles sont adultes et que l'arthrite est bien établie.

250 lamas vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des anticorps par immunisations suivies de prélèvements sanguins. Le porteur indique que la plupart sont gardés vivants et réutilisés d'une étude à l'autre, une minorité étant tuée pour prélever la quasi-totalité du sang. Les effets décrits se limitent au stress de la contention, des injections et des prélèvements, répartis sur environ vingt-cinq études par an pendant cinq ans. Il affirme qu'il n'existe "aucune méthode substitutive" et que cette production animale est "indispensable" à la recherche.

Objectifs

Les lamas sont aujourd'hui des animaux très utilisés dans la recherche basée sur les anticorps, les biotechnologies... En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, le plus faible coût de production, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de lamas. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic…

Bénéfices attendus

1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements.

Devenir

Dans certains cas (très rares chez le lama), les animaux inclus pourront être mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité de volume sanguin circulant. Dans le cas où le prélèvement terminal de la quasi-totalité du volume sanguin circulant n'est pas nécessaire (très souvent le cas), les animaux inclus pourront être gardés en vie et maintenus sur le site avec leurs congénères. Ils pourront ensuite être réutilisés dans d'autres études après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser.

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux nécessite une immunisation de l'animal et donc son utlisation. Il n'existe aucune méthode substitutive pour cette production qui est indispensable à l'avancement de la recherche, de la médecine, du développement de test de diagnostic...

Réduction

Le nombre d'animaux est choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Le lama permet d'obtenir des quantités de sérum suffisantes à l'atteinte des objectifs du projet, sans porter atteinte au bien-être animal. Ainsi, 1 ou 2 lamas seront immunisés par étude permettant ainsi d'obtenir une quantité suffisante de sérum. Le nombre de 2 lamas pour une étude sera choisi dans le cas de certaines études où il y a besoin de prendre en compte le facteur diversité/variation génétique qu'il peut y avoir entre 2 animaux. Un nombre de 25 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 250 lamas sur 5 ans. Sur ces 250 lamas, il y aura des possibilités de réutilisation de lamas d'une étude pour une autre étude, après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser. Dès que le caractère naïf des lamas n'est pas demandé et n'est pas utile pour l'étude, des lamas issus d'études précédentes seront utilisés dans le respect de leur bien-être et si leur état de santé le permet. Ainsi, cela permettra de réduire le nombre de lamas différents utilisés.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : pâture extérieure, litière de paille, brosse à vache, objects à manipuler...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lama sera ici utilisé pour la production d’anticorps. En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. Les animaux sélectionnés seront de jeunes adultes (entre environ 9 mois et environ 6 ans) car c'est à ce stade qu'ils sont entièrement immunocompétents.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de tétrachlorure de carbone tous les deux jours pendant huit semaines pour induire une fibrose du foie, avant une mise à mort par ponction cardiaque et prélèvement d'organes. Le porteur affirme que la fibrose ne provoque aucune douleur et vise à comprendre le rôle de cellules souches et l'effet de la metformine sur cette pathologie. Il indique que le modèle cellulaire ne suffit pas et conclut que le passage par l'animal est inévitable pour cette étude.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche destiné à étudier le rôle des cellules stromales mésenchymateuses et à identifier l’expression des micro-ARN (miARN) lors du développement de la fibrose hépatique. La fibrose hépatique est caractérisée par l'accumulation excessive des constituants de la matrice extracellulaire dans le parenchyme hépatique. Cette pathologie est la complication majeure de toutes les maladies chroniques du foie induites par une infection virale, des perturbations métaboliques, l'abus d'alcool. Une fibrose hépatique non contrôlée peut entrainer in fine une cirrhose du foie, un dysfonctionnement hépatique et un carcinome. A ce jour, il n’existe aucun traitement ni moyen de diagnostic précoce. Aussi, plusieurs voies de recherche et de développement sont en cours pour palier à ce déficit. Notamment la metformine, un traitement du diabète de type 2 qui présenterait des effets anti-fibrotiques intéressants. Dans le foie, comme dans les autres organes, les cellules effectrices de la fibrose sont les myofibroblastes. D’origine encore largement débattue, les myofibroblastes dériveraient principalement des cellules stromales mésenchymateuses (MSC). Lors de leur différenciation en myofibroblastes, les MSC expriment une combinaison spécifique de cytokines, facteurs de croissance, hormones ainsi que des miARN et pourraient par ce biais réguler les phénomènes de fibrose. Il existe plusieurs méthodes pour induire expérimentalement une fibrose hépatique chez l’animal de laboratoire. Nous utiliserons le modèle de fibrose induite par l’injection intrapéritonéale de tétrachlorure de carbone (CCl4) chez les souris C57BL/6. Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée et seront réalisées dans les conditions les moins stressantes possibles pour les animaux. Ce projet engagera des souris dans un nombre estimé à 50 individus pour la durée que couvrira ce projet. L’objectif de notre étude est de comprendre le rôle des MSC dans le développement de la fibrose hépatique, d’identifier des miARN susceptibles d’intervenir dans la pathogenèse de la fibrose hépatique et d’étudier la capacité de la metformine à moduler l’expression de ces miARN et à induire une régression de la fibrose hépatique. Permettant ainsi une prise en charge plus précoce de cette pathologie.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre le rôle des cellules souches mésenchymateuses dans le développement de la fibrose, d’identifier les miARN biomarqueurs du développement de la fibrose, permettant ainsi une prise en charge plus précoce de cette pathologie et étudier la capacité de la metformine à induire une régression de la fibrose hépatique.

Procédures

Les souris subiront une injection intrapéritonéale tous les 2 jours pendant 8 semaines (n=50). L'injection durera à chaque fois en moyenne 5 secondes.

Impact sur les animaux

Les injections se feront avec une bonne contention de l'animal. Pour respecter le bien-être animal une application de crème analagésique (Lidocaïne) et une désinfection de la zone à l'aide d'une compresse alcoolique seront réalisées avant les injections. La fibrose hépatique ne provoque aucune douleur. La ponction cardiaque (1 mL) sera précédée d’une anesthésie volatile par isoflurane (1,5 à 2%) et suivie d'une dislocation cervicale, puis ses différents organes seront prélevés. L’évaluation de la qualité de l’anesthésie se fera en vérifiant les 4 étapes suivantes : -l’absence de douleur et/ou de réponse réflexe en exerçant une pression au niveau des doigts de l’animal -L’immobilisation de l’animal -La relaxation musculaire -L’état d’inconscience en vérifiant les mouvements respiratoires.

Devenir

Après l'injection sous cutanée, les souris seront maintenues en vie jusqu'à la fin de l'étude. Les indivisus seront mis à mort à la fin de l'étude par ponction cardiaque précédée d’une anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%). Les organes prélevés seront scindés en 5 : 1/5 protéine (analyse par western blot), 1/5 ARN, 1/5 miARN (quantification, qRTPCR), 1/5 isopentane, 1/5 paraffine (analyse immunohistologique).

Remplacement

Remplacement: Nos études in vitro avec les cellules souches mésenchymateuses hépatiques apportent quelques résultats sur leur capacité de différenciation en myofibroblastes, ainsi que sur les miARN impliqués dans cette pathologie. Néanmoins, ce modèle cellulaire ne suffit pas à modéliser le processus de fibrose dans son ensemble. Le passage par l'in vivo est inévitable pour comprendre le rôle des cellules souches mésenchymateuses dans le développement de la fibrose hépatique, identifier des miARN susceptibles d’intervenir dans cette pathogenèse et étudier la capacité de la metformine à moduler l’expression de ces miARN et à induire une régression de la fibrose hépatique.

Réduction

Réduction du nombre : Le développement d’une fibrose par le CCL4 ayant déjà été publié, nous n’avons pas besoin de réaliser une étude pilote et le nombre d’animaux a de ce fait pu être réduit. Pour chaque condition testée, nous utiliserons un nombre minimal de souris pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Nous utiliserons pour l’étude statistique le test one way ANOVA suivi d’un un test de Bonferroni pour comparer les groupes d'animaux entre eux.

Raffinement

Les souris seront dans des cages adaptées à 5 individus, avec une litière adaptée, de la nourriture et de l’eau en continue, de quoi se cacher et de quoi ronger, en quantité suffisante pour ne pas générer de comportements agressifs. En cas d’agressivité la taille des groupes d’animaux sera ramenée à trois individus par cage. Les souris seront observées quotidiennement, pour suivre leur état clinique et déceler d’éventuels problèmes (prostration, température trop élevée, perte de poids, …). Ceci sera basé sur une grille de scoring définie. Chaque situation d’animal montrant des signes d’inconfort ou de souffrance liés ou non à l’expérience sera rapporté au vétérinaire responsable de l’animalerie pour que l’animal soit pris en charge de manière individuelle afin d’améliorer son bien-être. Si l'état ne s'améliore pas au-delà de 24h, il sera euthanasié par ponction cardiaque (1mL) sous anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d'une dislocation cervicale, puis ses différents organes seront prélevés. Les injections se feront avec une bonne contention de l’animal par du personnels formés et entrainés. Pour respecter le bien-être animal une application de crème analgésique (Lidocaïne) et une désinfection de la zone à l'aide d'une compresse alcoolique seront réalisées avant les injections.

Choix des espèces

Les C57BL/6 sont des souris robustes, et sont largement utilisées comme modèle pour la formation de fibrose hépatique induite par le CCl4. Par de nombreux aspects, ce modèle reproduit la maladie chronique du foie humaine. Il reproduit la phase aigüe de la maladie humaine caractérisée par l’induction d’une réponse inflammatoire suivie par le développement de la fibrose hépatique chronique. Souris adultes de 6 à 8 semaines