Système immunitaire

564 souris, dont des souris génétiquement modifiées, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont greffées sous la peau du flanc sans anesthésie, puis elles reçoivent sous anesthésie de moins de cinq minutes une à trois injections d'un agent que le porteur dit "non douloureux". Selon les groupes, leurs macrophages sont éliminés, ce qui peut provoquer diarrhées, déshydratation et perte de poids pendant six jours dans l'un des protocoles, et une nécrose peut apparaître sur la tumeur en fin d'expérience. Le porteur écrit avoir "besoin impérativement" d'expériences in vivo, et prévoit que certaines n'auront lieu que si les premières donnent des "résultats intéressants", ce qui fait de l'effectif de 564 un plafond.

Objectifs

Au cours de la tumorigénèse, la matrice extracellulaire, qui constitue l’architecture de tout tissu, est profondément modifiée, contribuant à la progression tumorale en limitant l’accès des cellules immunitaires à l’intérieur de la tumeur, et en favorisant les métastases. Les macrophages sont des cellules immunitaires qui peuvent avoir des effets pro- ou anti-tumoraux, et sont capables de modifier la matrice extracellulaire. Notre projet étudie dans un premier temps le rôle des macrophages dans la modification de la matrice tumorale, pour évaluer, à terme, leurs effets sur la réponse immunitaire naturelle et sous immunothérapie. En particulier, notre projet vise à comprendre comment les propriétés physiques de la matrice influencent l’infiltration des cellules immunitaires, et le rôle que jouent les macrophages dans ce processus.

Bénéfices attendus

Ce projet va contribuer à une meilleure compréhension du dialogue entre cellules tumorales, cellules immunitaires et matrice extracellulaire, 3 acteurs centraux de la tumorigénèse. Les modèles expérimentaux choisis permettront d’obtenir des connaissances fondamentales sur les tumeurs solides et la réponse immunitaire contre celles-ci. Ce projet pourrait permettre à terme d’améliorer les stratégies d’immunothérapies par anticorps ou cellules CAR-T.

Procédures

1-Greffe de cellules tumorales en sous cutanée : 1 seule fois par animal, sur animal vigile, puis injections d’un agent non douloureux par voie intra-péritonéale sous anesthésie. 3 injections par animal (durée de l'anesthésie inférieure à 5 min) 2- Greffe de cellules tumorales en sous cutanée : 1 seule fois par animal, sur animal vigile, puis injection d’un agent non douloureux par voie intraveineuse sur animal anesthésié. 1 injection par animal (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes)

Impact sur les animaux

Nous injectons au niveau du flanc des souris des tumeurs sous-cutanées plus ou moins résistantes aux immunothérapies, puis déplétons ou non les macrophages. L’expérience dure entre 9 et 15 jours. Nos observations se font à des temps précoces de la tumorigénèse, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Le traitement pour la déplétion des macrophages peut provoquer des diarrhées et une déshydratation, pouvant entrainer une perte de poids pendant la durée de la déplétion dans un des modèles (6 jours)

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Des études in vitro ont montré l’importance de la matrice extracellulaire dans la tumorigénèse. Afin d’évaluer l’effet des macrophages et de la matrice extracellulaire sur la réponse immunitaire, nous avons besoin impérativement de réaliser des expériences in vivo pour avoir une tumeur, un stroma et un système immunitaire complets.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cela permet également de corréler les résultats des différentes analyses pour chaque tumeur et de pouvoir mieux analyser les raisons potentielles d’hétérogénéité inter-souris. Par ailleurs, certaines expériences ne seront réalisées que si les expériences précédentes donnent des résultats intéressants (différences de matrice extracellulaire et / ou d’infiltrat immunitaire).

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement (mesure de la tumeur, poids, aspect et comportement) afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Les animaux seront sacrifiés en cas d’atteinte des points limites. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés par les traitements pour la déplétion des macrophages. En cas de déshydratation, une réhydratation parentérale sera réalisée. En cas d’inflammation cutanée ou de nécrose superficielle des tumeurs, de la crème hydratante et cicatrisante sera appliquée.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie et recherche en thérapeutique anti-cancéreuse. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.

153 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie auto-inflammatoire rare, elles développent une vasculopathie et un déficit immunitaire avec une survie réduite, subissent l'ablation d'une phalange pour le génotypage puis un prélèvement sanguin sous anesthésie sans réveil. Elles sont tuées pour prélever les organes immunitaires, tout animal atteignant un score de souffrance donné étant mis à mort. Le porteur affirme que ces analyses exigent un modèle mammifère in vivo, la souris étant selon lui appropriée.

Objectifs

Le SAVI (STING-associated vasculopathy with infancy-onset) est une maladie auto-inflammatoire rare. Elle se caractérise par une inflammation systémique dès l’enfance (fièvre et syndrome inflammatoire), induisant notamment une vasculopathie cutanée sévère (engelures et ulcérations aux joues et aux extrémités comme nez, doigts, orteils), et une pneumopathie interstitielle. Le SAVI est dû à une mutation de gain-de-fonction (= suractivation) de STING, un facteur clé de la réponse immunitaire. Nous avons créé un modèle murin portant la mutation majeure (STING V154M) et reproduisant les signes de la maladie humaine. Les souris présentent un déficit immunitaire avec baisse des lymphocytes, et une survie diminuée à 6 mois. STIM1 est un interacteur connu de STING, et il a été démontré que cette interaction est cruciale pour la régulation de l’activité de STING. Le but du projet est de valider l’hypothèse scientifique selon laquelle une modulation de STIM1 pourrait réduire la suractivation de STING et ainsi améliorer le phénotype des souris SAVI.

Bénéfices attendus

Le projet vise à fournir la preuve de concept que la modulation de STIM1 peut améliorer l’auto-inflammation des souris STING V154M. Ceci pourrait conduire au développement d'approches thérapeutique pour les patients atteints de SAVI.

Procédures

A 10 jours : prélèvement d’un échantillon de phalange (acte de 10 secondes) pour extraction d’ADN et génotypage (= vérification de la présence/absence des mutations STING et STIM1). A 2-3 mois : anesthésie pour prélèvement de sang (acte de 5 minutes), puis mise à mort pour prélèvement des organes du système immunitaire.

Impact sur les animaux

Les souris STING V154M présentent un phénotype dommageable avec notamment un déficit immunitaire. Bien qu’une amélioration de ce phénotype soit attendue suite à la modulation de STIM1, il est possible qu’il n’y ait pas d’effet bénéfique. Nous proposons donc une surveillance hebdomadaire avec une procédure de suivi utilisant une grille de score tenant compte de plusieurs critères sur l’aspect général et le comportement des souris. Par ailleurs, les souris seront soumises à une phalagectomie (génotypage), ainsi qu'une prise de sang (sous anesthésie et sans réveil).

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement des organes du système immunitaire.

Remplacement

Notre projet vise à étudier les réponses immunitaires dans un système complexe qui met en jeu des coopérations des organes lymphoïdes tels que la rate et les ganglions. Ces analyses nécessitent un modèle in vivo de mammifère, et nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. Par ailleurs, les connaissances du système immunitaire sont très développées chez la souris, qui représente de ce fait un modèle approprié pour étudier la physiopathologie de SAVI et établir des approches thérapeutiques qui pourraient être transférées aux patients dans l’avenir.

Réduction

Un nombre de 15 souris maximum/groupe (8 groupes au total) sera utilisé pour s’assurer que l’étude soit statistiquement et scientifiquement valable. Le test d’Agostino-Pearson sera réalisé afin de vérifier que les données suivent une loi Normale. Si la loi Normale est respectée, le test d'ANOVA sera appliqué. Si toutefois les données expérimentales ne respectent pas la loi Normale, un test non paramétrique (Kruskal-Wallis) sera appliqué. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées chez les mêmes souris, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Par ailleurs, nous allons utiliser des souris mâles et femelles afin de réduire d’avantage le nombre de souris utilisées pour les procédures expérimentales.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, dans des cages enrichies (barreau à ronger, matériel de nidification). Une grille de suivi permettra d’appliquer un point limite prédictif et adapté. Afin d'évaluer les points limites, cette grille prend en compte les points des catégories suivants : 1) L'aspect général de l'animal (hérissement des poils, yeux clos, flancs creusés...) : 2) Le comportement de l'animal (mobilité́, prostration, dos vouté́, isolement par rapport aux autres animaux). Ce suivi sera réalisé de manière hebdomadaire sur toute souris portant la mutation STING V154M à partir du sevrage et jusqu’à la mise à mort pour expérimentation. Chaque animal ayant une somme totale de scores ≥ 3 doit être mis à mort. Si un animal atteint le score de 2 dans une seule catégorie, celui-ci doit être également mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et courant en immunologie. Son système immunitaire est bien étudié, de nombreux réactifs (notamment les anticorps) sont disponibles, et de nombreuses techniques d’analyse sont établies afin de mener à bien les analyses. L’expérimentation se fera à partir d’un âge adulte (2-3 mois) afin de pouvoir analyser les organes lymphoïdes matures (après mise à mort).

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines sont irradiées pour une greffe de moelle osseuse, toutes suivent un régime gras de douze semaines avec prélèvements sanguins répétés, pour étudier l'inflammation des artères dans les maladies cardio-métaboliques. Elles sont tuées par dislocation cervicale, surdosage d'anesthésique ou CO2 selon les expérimentateurs. Le porteur affirme que ces pathologies complexes rendent l'approche in vivo "indispensable" et que le dépôt de cholestérol ne peut s'étudier in vitro.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de décès dans le monde. Récemment, l'inflammation (réponse de l'organisme à une agression) est apparue comme une composante centrale dans l'apparition de ces maladies mais les mécanismes restent encore inconnus. Le dérèglement des cellules du système immunitaire est souvent associé à l'inflammation et à la progression des maladies cardiovasculaires dites cardio-métaboliques, dans lesquelles un dysfonctionnement du métabolisme cellulaire (utilisation des matières nutritives pour fabriquer de l'énergie) aboutit au développement de ces maladies. Plus précisément, au sein des vaisseaux sanguins, un type particulier de cellules immunitaires, appelé les macrophages, joue un rôle important dans l'élimination des déchets pour éviter l'encrassement des vaisseaux qui provoque une inflammation et le développement de plaques d'athérome (plaques de gras bouchant les artères). Cependant, une surcharge en déchets et en cholestérol sanguin dérégule le métabolisme des macrophages qui ne sont plus capables d'exercer leur rôle d'"éboueurs" des vaisseaux. Le métabolisme cellulaire dépend d'une organelle qu'on appelle la mitochondrie qui permet de transformer les nutriments en énergie. De récentes publications ont montré l'importance de la dérégulation des mitochondries dans le développement de l'inflammation. En particulier, une modification de la structure des membranes des mitochondries entraine des perturbations quantitatives et qualitatives de ces organelles. Les membranes mitochondriales ont une structure spécifique qui dépend de lipides spécifiques appelés phospholipies mais leurs rôles dans la fonction mitochondriale des cellules immunitaores restent inconnus. Néanmoins, leur quantité dans le sang est souvent associé aux maladies cardio-métaboliques. Ce projet vise donc à identifier le rôle de la synthèse des phospholipides dans les macrophages. Pour cela, des approches génétiques d'invalidation de gène seront réalisées. Cela permettra de mieux comprendre l'origine de l'inflammation dans les maladies cardio-métaboliques afin de développer de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement visant à mieux contrôler la fonction des cellules immunitaires et ceci dans les maladies cardio-métaboliques. L’ensemble des procédures proposées dans ce projet sont connues comme non remplaçables par des procédures ne faisant pas intervenir directement l’animal.

Procédures

Groupe 1 (Procédure1) : Prélèvements de sang à la joue sur animaux vigiles (toutes les 2-3 semaines) à partir de l'âge de 6 semaines. 12 semaines de régime riche en graisse. 48h en cage métabolique pour étudier les variations métaboliques (1 souris par cage) puis injection de glucose par voie intra-péritonéale (une injection) puis détermination de la glycémie (taux de sucre sanguin) par prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue (1 goutte). Groupe 2 (Procédure 1) : Injection de Tamoxifen en intra-péritonéal sur souris vigiles à l’âge de 6 semaines tous les deux jours pendant une semaine (soit 3 injections). Pour ce groupe de souris, le Tamoxifen est nécessaire pour invalider, indirectement, le gène cible. Prélèvements de sang à la joue sur animaux vigiles (toutes les 2-3 semaines) à partir de l'âge de 6 semaines. 12 semaines de régime riche en graisse. 48h en cage métabolique pour étudier les variations métaboliques (1 souris par cage) puis injection de glucose par voie intra-péritonéale (une injection) puis détermination de la glycémie (taux de sucre sanguin) par prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue (1 goutte). Dans le cadre de la Procédure 2 (greffe de moelle osseuse), les souris receveuses, âgées de 10 semaines, seront irradiées (pour éliminer les cellules de la moelle osseuse) dans un irradiateur prévu à cet effet pendant 6min30sec. Ces souris recevront une solution contenant des cellules de moelle osseuse par voie intra-veineuse au niveau de la veine de la queue. Ces souris seront ensuite soumises aux interventions citées ci-dessus selon leur groupe. Par ailleurs, une grille de score a été établie afin de limiter la douleur, et déterminer les mesures à prendre si besoin (antalgique (anti-douleur), désinfection ou mise à mort).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont une douleur légère lors du prélèvement à la joue et lors des injections intra-péritonéales et intra-veineuses. Lors du changement de cage, les animaux peuvent être légèrement stressés mais ce stress diminue au bout des 24h d'acclimatation à la cage métabolique. Il peut également survenir une perte de poids et une prostration suivant l’irradiation, ainsi que, très rarement, une respiration perturbée et une mobilité réduite avec le régime riche en graisses.

Devenir

A la fin des expériences, toutes les souris seront mises à mort par dislocation cervicale, surdosage d’anesthésiant ou asphyxie au CO2 (selon les expérimentateurs).

Remplacement

Les maladies cardio-métaboliques sont des pathologies complexes dans lesquelles de multiples voies métaboliques et physiologiques interviennent. De ce fait, une approche in vivo reproduisant ces interactions nous est indispensable pour répondre à notre problématique. De plus, l'étude du dépôt de cholestérol dans les artères ne peut être réalisé in vitro. Des modèles murins capable de développer de l'athérosclérose ont donc été développés et validés par la communauté scientifique comme outils d’études précliniques.

Réduction

Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Dans le cadre de cette étude, et pour chaque groupe, nous utiliserons des souris mâles et femelles. Ceci permettra d’utiliser l’ensemble des animaux générés dans les élevages. De plus, les résultats pourront ainsi être appliqués à la fois aux hommes et aux femmes. Ce projet prévoit l’utilisation de 560 souris sur 5 ans.

Raffinement

La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés à chaque procédure et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger).

Choix des espèces

1) Nous avons choisi le modèle murin car c’est un modèle standard bien reconnu dans le domaine scientifique pour l’investigation de manipulations génétiques liées aux maladies cardio-métaboliques. 2) Nous avons également des souris déficientes pour le gène ApoE ou LDLR connues pour leurs différents facteurs de risque liés au développement de l’athérosclérose et donc à l’apparition des maladies cardio-métaboliques après un régime riche en graisse. 3) Des souris déficientes pour la protéine Cardiolipin synthase 1 spécifiquement au niveau des macrophages nous permettront de déterminer l’importance de cette enzyme sur la dynamique mitochondriale et le métabolisme des macrophages. 4) De plus, le modèle murin présente plusieurs avantages par rapport à d’autres espèces : cycle de vie court, natalité importante. A partir de l’âge de 6 semaines (âge à partir duquel les souris sont considérées comme suffisamment matures), les souris nécessitant une induction au Tamoxifen seront injectées. La greffe de moelle osseuse est réalisée sur des souris plus âgées (10 semaines). A l’âge de 8 ou 17 semaines toutes les souris seront soumises à un régime riche en graisse durant une période de 12 semaines afin de permettre la formation des plaques d’athérome. Pendant cette période, les expériences de calorimétrie et de tolérance au glucose seront réalisées afin d’étudier les variations des voies métaboliques. A la fin des expériences, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale, par surdosage d’anesthésiant ou par asphyxie au CO2 (selon les expérimentateurs) à 29 semaines ou moins selon les procédures.

2800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales sont injectées dans leur patte puis une bithérapie anticancéreuse administrée, la croissance de la tumeur pouvant provoquer perte de poids et nécroses cutanées relevant du point limite. Les souris sont tuées par dislocation cervicale pour prélever tumeurs, rate et ganglions. Le porteur affirme que la complexité du cancer ne peut être appréhendée in vitro et que la souris est la seule espèce disponible pour ces modèles.

Objectifs

Ces dix dernières années, l’immunothérapie a suscité un engouement dans le monde de la cancérologie. Cette dernière consiste à mobiliser le système immunitaire des patients pour cibler et éliminer les cellules tumorales. Dans certains cancers, les cellules tumorales sont capables d’inhiber certains mécanismes du système immunitaire. Par exemple, certaines cellules tumorales expriment la protéine PD-L1 qui est le ligand du récepteur PD-1 présent à la surface des lymphocytes T (LT) activés. Cette liaison, entre PD-1 et PD-L1, entraîne un épuisement des LT. L’une des approches de l’immunothérapie est d’empêcher l’épuisement des lymphocytes T en utilisant des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI). Ces inhibiteurs sont des anticorps monoclonaux dirigés, par exemple, contre PD-1 et PD-L1. Cet outil thérapeutique a montré des effets puissants et durables seulement sur un faible pourcentage de patients (20 à 25%). L’une des raisons pouvant expliquer ces résultats pourrait être un manque d’infiltration des LT au sein de la tumeur. Une des manières permettant de rétablir un infiltrat lymphocytaire dans la tumeur est de cibler l’angiogenèse. L’angiogenèse correspond à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants et est nécessaire pour assurer le transport des nutriments et de l’oxygène dans la tumeur. Ce processus implique de nombreuses molécules, notamment le VEGF qui en est l’inducteur principal. L’inhibition de l’angiogenèse favorise la réponse anti-tumorale en réduisant l’environnement immunosuppresseur et en augmentant l’infiltration immunitaire. La combinaison thérapeutique des ICI et des anti-angiogéniques est aujourd’hui approuvée dans plusieurs cancers solides. En dépit d’une réelle avancée dans l’étude de cette bithérapie, une compréhension plus approfondie des mécanismes d’action de cette combinaison est nécessaire pour mieux cibler les patients répondeurs et apporter des réponses quant à son efficacité. De ce fait, l’objectif de ce projet est d’identifier les acteurs de la réponse immunitaire après une bithérapie αPD-1 et αVEGFR-2. Nous avons montré que cette bithérapie améliore les réponses anti-tumorales dans deux modèles de cancers colorectaux : MC38 et CT26 et dans un modèle de cancer du pancréas KPC. Au regard de ces résultats, nous souhaitons comprendre comment la réponse immunitaire se met en place dans ces modèles.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est d’explorer l’effet de la combinaison αPD-1 et αVEGR-2 dans plusieurs modèles pour déterminer les acteurs clés permettant d’améliorer l’efficacité des thérapies. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont injectés en sous-cutané dans la patte sous anesthésie à l’isoflurane avec les cellules tumorales (5 minutes pour l’anesthésie et 30 secondes pour l’injection). Par la suite, un suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine : les souris seront traitées en IP (30 secondes). 1,3,7,10 et 14 jours après le premier traitement par αPD-1, les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l’isoflurane (5 minutes pour l’anesthésie et 10 secondes pour le sacrifice). Par la suite, les tumeurs, ganglions drainants et rates sont récupérés (2 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection des tumeurs en sous-cutané dans la patte des souris pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. De ce fait, il est possible qu’un effet indésirable de cette expérimentation soit une perte de poids. Pour y remédier, des croquettes seront mises à disposition directement dans la cage après observation de la perte de mobilité. En réalisant des injections en sous-cutané, il est possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Ces nécroses seront prises en compte dans le score limite et pourra mener à la mise à mort de l’animal si nécessaire. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections SC (cellules tumorales) et IP (traitements) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendu. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation. De plus, diverses souches de souris immunocompétentes sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, telles que les souris C57Bl/6 (TC-1, MC38, KPC, LLC-1,) et les Balb/c (CT26, TS/A et 4T1). Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

268 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un analogue de la vitamine D est appliqué sur leurs oreilles pour déclencher un eczéma avec rougeurs et croûtes, et certaines lignées reçoivent des injections répétées pour dépléter des cellules immunitaires. Elles sont mises à mort pour analyser la réponse immunitaire de la peau et des ganglions. Le porteur affirme que la complexité de la réaction immunitaire rend nécessaire le recours à l'expérimentation in vivo pour confirmer des résultats déjà obtenus in vitro.

Objectifs

La dermatite atopique est une maladie de la peau pouvant être associée à d'autres affections telles que l'asthme ou la rhinite allergique. La dermatite atopique, caractérisée par du prurit et de l'eczéma, affecte 10% à 20% des enfants et 1% à 3% des adultes. Les patients présentent une inflammation de la peau avec notamment une infiltration de cellules immunitaires. Nous utilisons un modèle murin de dermatite atopique, générée par l'application d'un analogue à la vitamine D, le calcipotriol (MC903), directement sur la peau. La dermatite atopique générée dans ce modèle est due à l'induction de la cytokine TSLP au niveau des kératinocytes de l'épiderme. Nous avons démontré que les cellules dendritiques activées par TSLP expriment OX40L et que cette molécule est impliqué dans l'induction de lymphocyte T régulateur (Treg) capable de limiter réponse inflammatoire causant l'eczéma (non publié). Dans ce projet, nous souhaitons poursuivre l'utilisation de ce modèle murin de dermatite atopique afin d'étudier plus particulièrement le rôle des cellules dendritiques exprimant OX40L induisant les Treg.

Bénéfices attendus

L'identification et la caractérisation d'une population de cellule dendritique capable d'induire des lymphocytes T régulateurs anti-inflammatoire permettant de limiter la réponse immunitaire de la peau permettrais de définir une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement de la dermatitie atopique, et aussi dans d'autres pathologies impliquant le systéme immunitaire (maladies autoimmunes, cancer). En effet, cibler ces cellules pourrait permettre de moduler la réponse immunitaire à notre convenance, à savoir de la limiter dans le cas des maladies allergiques ou autoimmunes, ou à l'inverse, de la favoriser dans le cas du cancer.

Procédures

Une application d'un analogue de la vitamine D sera réalisé sous anesthésie légére au niveau des oreilles. Les souris seront traitées tous les deux jours pour un maximun de 6 traitements de 1 minute chacun (6 x 1 min = 6 min). Lors des traitements 5 et 6, les animaux développeront un eczéma localisé au niveau des oreilles, ce qui entrainera l'apparition de rougeur et d'éventuelles petites croutes. Afin de dépléter une population de cellule immunitaire, une lignée de souris sera soumise à deux injections une semaine avant de débuter la procédure d'application de l'analogue de la vitamine D. La déplétion sera ensuite maintenu lors du traitement avec l'analogue de la vitamine D via une injection au jour 0 puis au jour 5 du traitement avec l'analogue de la vitamine D. (4 injections au total d'une durée de 2 secondes chacune). Pour induire la délétion de notre gène d'intérêt, les animaux de la lignée concernée recevront une injection par jour pendant 5 jours. Des injections permettant de maintenir la délétion du gène d'intérêt seront ensuite effectuées tout les 3 jours pendant la procédure d'application de l'analogue de la vitamine D (9 injections d'une durée de 2 secondes chacune). Les sites d'injection seront alternés entre les différentes injections. Aucun prélévement sur animal vigile et aucune procédure chirurgicale ne sont prévues.

Impact sur les animaux

Les animaux developperont un eczèma au niveau du site d'application de l'analogue de la vitamine D, à savoir les oreilles, qui pourront engendrer de légéres démangeaisons, rougeurs et formation de croute. Aucun effet secondaire notable n'est attendu suite aux injections.

Devenir

A la fin de chaque procédure tous les animaux traités seront mis à mort à la fin du traitement pour analyser la réponse immunitaire au niveau des ganglions lymphatiques et de la peau.

Remplacement

Les cibles (cellules et récepteurs) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe ou par d'autres laboratoires. Les phénomènes mis en oeuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et confirmer les résultats obtenus précédemment.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un total de 8 lignées de souris génétiquement modifiées et 2 lignées de souris sauvages afin d'identifier les rôles de différentes molécules et cellules de la réponse immunitaire. Chaque lignée sera constituée de quatre groupes de 6 animaux, pour un total de 24 animaux au maximum. Deux groupes (1 groupe mutant comparé à 1 groupe contôle) serviront à l'analyse de l'expression des gènes dans les ganglions lymphatiques et au niveau des oreilles des animaux. Ces animaux permettront également d'effectuer une analyse histologique de la peau. Les deux autres groupes (1 groupe mutant comparé à 1 groupe contôle) seront utilisés pour caractériser les populations de cellules présentes dans ces organes. L’effectif de 24 animaux par lignée est l’effectif minimal qui nous permettra d’avoir des résultats statistiquement interprétables pour les différents paramètres mesurés. De plus le traitement au niveau de l'oreille droite des souris nous permettra d'utiliser l'oreille gauche en tant que contrôle non traité. (Suite à un test statistique de normalité, nous effectuerons des test ANOVA à 2 voies afin de comparer deux génotypes (contrôle et mutant) traités ou non avec l'analogue de la vitamine D.)

Raffinement

L'application de l'analogue à la vitamine D sur les oreilles ne nécessite qu'une anesthésie légère. A partir du jour 9 jusqu'au jour 11 on observe un épaississement et une rougeur des oreilles. Cela peut être accompagné de légères démangeaisons, mais qui ne modifient pas le comportement des souris (toilettage, posture et activités normales). Néanmoins, si une souris présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactive après stimulation, ou si des lésions au niveau des sites de traitement apparaissent, elle sera retirée de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Certaines lignées nécessiteront l'emploi d'injections. Les sites d'injections seront alternés et attentivement surveillés. En cas d'inflammation au niveau d'un site d'injection, l'animal sera retiré de l'étude et bénéficiera de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave, l'animal sera euthanasié immédiatement.

Choix des espèces

Les phénomènes mis en oeuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu différents organes et réseaux cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Le fonctionnement du systéme immunitaire de la souris est très proche de celui de l'Homme, de plus la peau des souris au niveau des oreilles est très similaire à la peau humaine. Ce modèle est donc pertient pour étudier des pathologies inflammatoires de la peau, dans le cas présent la dermatite atopique, qui touche 20% des enfants et 3% des adultes. Les animaux seront utilisés à partir de 10 semaines après la naissance afin d'étudier le système immunitaire mature à l'âge adulte.

1080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une section chirurgicale du nerf vague puis, pour certaines, un régime gras induisant une stéatohépatite, avant des prélèvements post-mortem, pour étudier le lien entre foie, nerf vague et inflammation de la rétine. Le porteur affirme à plusieurs reprises que ces chirurgies n'entraînent ni douleur ni détresse et un rétablissement complet, sur la foi de ses projets antérieurs. Il conclut que l'étude dans un "organisme entier" ne peut être reproduite sur cultures cellulaires.

Objectifs

Nous avons précédemment démontré comment l'inflammation pathogène est un moteur important de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et la stéatohépatite non alcoolique (NASH). Nos données préliminaires montrent que l'innervation vagale a un impact profond sur l’inflammation, et que des vagotomies expérimentales augmentent considérablement l'accumulation de macrophages pathogènes dans un modèle de DMLA. Une aggravation similaire des vagotomies est observée dans le modèle NASH et il a été démontré que l'innervation vagale contrôle le métabolisme hépatique, qui influence la libération de macrophages de la moelle osseuse et probablement du réservoir des monocytes spléniques. Dans l'ensemble, l'image d'un mécanisme de la voie anti-inflammatoire du nerf vague, relie le métabolisme hépatique et la régulation des populations de monocytes et macrophages. L’influence du foie, et en particulier de la NASH, sur l’état inflammatoire systémique et son impact sur une maladie inflammatoire comme la DMLA reste mal connue. Nous proposons d'analyser ces interactions en utilisant des approches chirurgicales et génétiques, des techniques de séquençage d'ARN en masse et unicellulaires. Notre projet aidera à déchiffrer les rôles joués par le foie, la moelle osseuse et la rate dans la voie anti-inflammatoire du nerf vague.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'évaluer le rôle du nerf vague et du foie dans la réponse inflammatoire systémique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra d’établir des stratégies anti- inflammatoires qui pourront bénéficiées aux patients atteints de la DMLA et de NASH. De plus ce projet pourra éclaircir un rôle potentiel de la NASH dans la pathologie de la DMLA.

Procédures

Les souris seront soumises à des chirurgies : vagotomies cervicales gauche et des branches hépatiques du nerf vague ou des chirurgies sham (contrôles). Chaque souris subira une seule opération qui dure 15-20 min sous anesthésie et analgésie. Elles auront ensuite une période de récupération de 3 semaines. Ce type de chirurgie est bien connue de notre équipe ; les souris se rétablissent complètement et rapidement et on n'observe généralement ni douleur ni détresse. Les souris seront ensuite soumises à une diète standard ou à une diète riche en lipide induisant le Nash, qui n'induit pas de détresse particulière. Nous étudierons l’impact de ce régime sur 2 temps : un temps court (4 semaines) et un temps long (12 semaines). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie par méthode réglementaire de l’animal.

Impact sur les animaux

Avec ce projet les nuisances attendues sont celles des chirurgies. Ces chirurgies sont bien connues de notre équipe et on observe généralement un rétablissement complet et rapide sans douleur ni détresse particulière. Toutefois, en cas d’infection et non cicatrisation de la plaie (ce que nous n’avons jamais observé sur ce type de chirurgie dans nos projets passés ou en cours) l’animal sera sorti de l’étude. Le régime WD n’entraîne pas de douleur ou de détresse perceptible (pas de changement du comportement de la souris), seulement une prise de poids qui sera surveillée.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’études des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.

Réduction

Nous devons induire plusieurs expériences en raison de la variabilité entre les souris d'un même lot et en raison du nombre d'analyses différentes post-mortem (FACS, biologie moléculaire et histologie) pour lesquelles les techniques recquièrent l'intégralité des tissus. Nous aurons donc besoin de 10 animaux par lots pour un total de 1080 souris. Le nombre de 10 animaux par groupe est basé sur les résultats de nos expériences dans notre laboratoire afin de permettre la réalisation des analyses statistiques adéquates pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Les animaux auront une période d'une semaine d'acclimatation avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux sont identifiés par bagues numérotées. Tous signes d’inconfort ou de détresse, tels que l'apparence (poil ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) et un comportement anormal (agressivité soudaine, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit), feront l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les critères absolus (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires) entraîneront l’euthanasie. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées. Pour les chirurgies, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale par injection intrapéritonéale d'un mélange de kétamine et de Xylazine. En prévention de la douleur, nous administrerons de la buprénorphine en sous cutanée. Une nouvelle injection sera administrée à l’animal le lendemain matin. Un gel ophtalmologique (LUBRITHAL) est appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant l'anesthésie. Les animaux qui ont subi une chirurgie sont observés quotidiennement avec attention particulièrement les 3 premiers jours qui suivent la chirurgie par l’expérimentateur et par le personnel qualifié de l’animalerie. On observe généralement un rétablissement complet après les chirurgies sans douleur ou détresse particulière.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour le NASH et la vagotomie. En outre, il est relativement simple d'examiner le système visuel et d'autres tissus chez la souris, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. Les animaux seront utilisés entre 2 et 4 mois, âges auquels ils sont succeptibles de développer la pathologie.

25 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois doses d'un peptide viral greffé à des nanoparticules d'or et subissent deux prélèvements sanguins rétro-orbitaux puis une ponction cardiaque terminale, pour évaluer l'effet-dose d'un candidat vaccin contre le SARS-CoV-2. Le porteur n'attend pas d'effet indésirable au-delà d'une surveillance accrue des doses élevées. Il affirme que la comparaison des réponses immunitaires ne peut se faire que sur un "organisme entier".

Objectifs

L’immunisation contre les antigènes majeurs du SARS-CoV-2 est la stratégie développée par les vaccins anti-COVID19 avec les plateformes mRNA et Adénovirus. L'effet attendu de la vaccination contre l’infection par les coronavirus y compris le SARS-CoV-2 est la montée d’une immunité adaptative protectrice chez l’individu vacciné qui est validée principalement par la présence d’anticorps dirigés contre la protéine S. La limitation de cette stratégie vaccinale est un risque de générer des mutations chez le virus pouvant le rendre résistant. Ceci peut s’avérer être le cas si la protection contre l’infection virale n’est pas optimale parmi certains groupes de population incluant les sujets ayant un système immunitaire moins efficace due à des désordres du métabolisme comme le diabète. Il est donc important de proposer une stratégie vaccinale alternative qui ciblerait plus particulièrement cette catégorie d’individus. La stratégie proposée ici repose sur la délivrance d'un peptide viral issu d'un antigène majeur du SARS-CoV-2 et greffés à des nanoparticules d’or dans la cellule immunocompétente afin d’initier une réponse humorale spécifique contre le pathogène. Une étude précédente nous a permis de sélectionner un peptide issu de la protéine S comme candidat vaccin en raison de son immunogénicité plus importante. L’étude qui sera réalisée permettra d’évaluer l’effet-dose de ce candidat vaccin sur la réponse humorale de souris et d'affiner le protocole de vaccination.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer l'effet-dose du candidat vaccin et d'affiner le protocole de cette nouvelle stratégie vaccinale.

Procédures

Chaque animal : - recevra 3 doses de 100 µl de peptides répartis en 2 points de 50 µl ; - sera soumis à 2 prélèvements sanguins rétro-orbitaux de 150 µl et 1 prélèvement sanguin par ponction cardiaque terminale pour prélever un volume maximal de sang. Les injections et les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale et la ponction cardiaque terminale sera suivi d'une dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Lors d’un projet précédent, une dose d’environ 5 µg de peptides couplés aux nanoparticules a été injecté à plusieurs souris et aucun effet indésirable n’a été observé. En augmentant les doses injectées, des effets indésirables ne sont pas attendus mais une attention particulière sera portée aux souris recevant des doses d’antigènes supérieures à 5 µg.

Devenir

Les 25 souris du projet seront sacrifiées suite au dernier prélèvement par ponction cardique terminale.

Remplacement

La comparaison des réponses immunitaires induites par les différentes doses de vaccin ne peut se faire que sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé grâce au logiciel GPower 3.1 en prenant en considération qu’une ANOVA serait réalisée sur les résultats obtenus avec une puissance de 0.8. Les résultats obtenus précédemment avec une dose de 5 µg de peptides conjugués aux nanoparticules ont permis de déterminer ce nombre, prenant en considération que la réponse immunitaire évolue de façon linéaire avec la dose de vaccin.

Raffinement

Toutes les injections d’antigènes et les prélèvements seront réalisées sous anesthésie générale par du personnel expérimenté. Suite aux prélèvements rétro-orbitaux, de l’ocrygel sera appliqué sur les yeux des souris pour limiter tout risque d’irritation. Les souris seront observées et pesées régulièrement afin de suivre leur état de santé. Une attention particulère sera accordée aux groupes recevant des doses d’antigènes supérieures à 5 µg.

Choix des espèces

La lignée murine BALB/c sera utilisée car ces souris sont considérées comme bonnes répondeuses immunologiques suite à l’injection répétée d’un antigène considéré. Des souris de 6 semaines seront utilisées pour ce projet (animaux sevrés et système immunitaire mature)