Système immunitaire

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un allergène leur est appliqué sur les oreilles sous anesthésie gazeuse, provoquant un eczéma, avant mise à mort pour prélèvement des oreilles et des ganglions. Le porteur décrit un léger épaississement et des rougeurs avec démangeaisons lors de la phase allergique. L'étude porte sur des molécules impliquées dans la dermatite atopique et vise l'identification de cibles thérapeutiques.

Objectifs

La dermatite atopique est une maladie de la peau pouvant être associée à d'autres affections telles que l'asthme ou la rhinite allergique. La dermatite atopique, caractérisée par l'apparition d'eczéma, affecte 20% des enfants et 3% des adultes. Un allergène est une molécule inoffensive contre laquelle l'organisme déclenche une réponse immunitaire disproportionnée menant à la mise en place d'une inflammation localisé au niveau du point de contact (la peau dans le cas de la dermatite atopique). La mise en place de la réponse immunitaire allergique induit l'activation des cellules immunitaires et la production d'anticorps spécifique de l'allergène. Si l'animal est réexposé à l'allergène, les anticorps reconnaissant spécifiquement l'allergène vont engendrer la mise en place d'une réponse immunitaire rapide provoquant l'inflammation de la peau caractérisée par des rougeurs et démangeaisons. En utilisant un protocole permettant d'induire une allergie à un allergène expérimental connu, nous pensons montrer que deux molécules (IL-3 et TSLP) produitent par les cellules de la peau jouent un rôle important dans la mise en place de la production d'anticorps spécifiques de l'allergène et donc dans la mise en place de l'allergie. En effet des données préliminaires du laboratoire montrent que ces deux molécules jouent un rôle clef dans le recrutement au niveau de la peau des cellules immunitaires (tel que les basophiles) impliquées dans la mise en place de la réponse inflammatoire lors d'une allergie cutanée. D'autres données préliminaires du laboratoire suggèrent qu'une nouvelle population de cellules dendritiques activées par TSLP est impliquée dans l'induction de lymphocyte T régulateur ayant un rôle anti-inflammatoire, représentant ainsi une potentielle cible thérapeutique de choix pour traiter les maladies inflammatoires de la peau. Nous souhaitons identifier les réseaux cellulaires et moléculaires à l'oeuvre dans ce modèle.

Bénéfices attendus

La charactérisation d'une voie de signalisation impliqué dans le recrutements des cellules pro-inflammatoires au niveau de la peau dans le contexte de l'allergie constituerais une nouvelle cible thérapeutique de choix pour traiter la dermatie atopique affectant 20% des enfants et 3% des adultes. L'identification d'une population de cellule immunitaire induisant des lymphocytes anti-inflammatoires constituerait également une nouvelle cible thérapeutique de premier choix dans le traitement de la dermatitie atopique, et aussi d'autres pathologies impliquant le système immunitaire (maladie autoimmune et cancer). En effet, cibler ces cellules pourrait permettre de moduler la réponse immunitaire à notre convenance, à savoir de la limiter dans le cas des maladies allergiques ou auto-immunes, ou à l'inverse, de la favoriser dans le cas du cancer.

Procédures

Aucun prélévement sur animaux vigiles ou procédures chirurgicales ne sont prévues dans le cadre de cette demande de projet. Pour la procédure d'application topique d'un allergène : l'application de l'allergène au niveau de l'oreille gauche des animaux durant trois jours (jour 0, 1 et 2) permettra de mimer la phase de sensibilisation à l'allergène. Quatre jours plus tard, au jour 6, une application d'allergène sera effectuée au niveau de l'oreille droite afin de mimer la phase effectrice de l'allergie. Cette application est réalisée sous anesthésie gazeuse légére. Chaque application d'allergène dure 30 secondes, soit 4 traitements de 30 sec chacun = 2 min au total). Pour la procédure d'application topique de l'allergène et application d'un dérivé de la vitamine A : En plus du traitement avec l'allergène décrit ci-dessus, nous appliquerons un dérivé de la vitamine A sur l'oreille droite. Cette application, réalisée sous anesthésie gazeuse est effectuée 2 heures avant le dernier traitements avec l'allergène (correspondant au jour 6 du protocole d'application de l'allergène). Chaque application de ce dérivé de la vitamine A dure 30 secondes, soit 1 traitements de 30 sec chacun = 30 sec au total).

Impact sur les animaux

Les trois premiers traitements avec l'allergène vont induires la sensibilisation des animaux à l'allergène, aucun effet indésirable n'est attendu à ce moment la. Les animaux développeront un léger eczéma au niveau du site d'application de l'allergène lors du dernier traitement avec l'allergène correspondant à la phase de "challenge" allergique.

Devenir

A l'issue des procédures "application topique de FITC/DBP" et "application topique de FITC/DBP et application topique d'acide rétinoique" les animaux seront mis à mort pour dose croissante de CO2 puis les oreilles ainsi que les ganglions lymphatiques drainants la peau seront prélevés pour des analyses histologiques, de cytométrie en flux, de rt-qPCR et ELISA.

Remplacement

Les cibles (cellules et récepteurs) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe ou par d'autres laboratoires. Les phénomènes à l'oeuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et confirmer les résultats obtenus précédemment.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un total de 8 lignées de souris génétiquement modifiées afin d'identifier les rôles de différentes molécules et cellules de la réponse immunitaire. Chaque lignée sera constituée de quatre groupes de 6 animaux, pour un total de 24 animaux au maximum. Deux groupes serviront à l'analyse de l'expression des gènes dans les ganglions lymphatiques et au niveau des oreilles des animaux. Ces animaux permettront également d'effectuer une analyse histologique de la peau. Les deux autres groupes seront utilisés pour caractériser les populations de cellules présentes dans ces organes. Dans le cas de IL3-KO, une seconde cohorte de 24 animaux est prévu pour étudier le rôle de l'acide rétinoique. L’effectif de 24 animaux par lignée est l’effectif minimal qui nous permettra d’avoir des résultats statistiquement interprétables pour les différents paramètres mesurés. De plus le challenge allergique au niveau de l'oreille droite des souris nous permettra d'utiliser l'oreille gauche non challengé en tant que contrôle (contrôle sans inflammation de la peau). (Suite à un test statistique de normalité, nous effectuerons des test ANOVA à 2 voies afin de comparer deux génotypes (contrôle et mutant) traité au FITC/DBP ou non.)

Raffinement

Les souris seront maintenus en groupe pendant toute la durée des expériences. L'application de du mélange FITC/DBP se fait par application cutanée, ce qui nécessite une anesthésie gazeuse légère. Lors du challenger allergique au FITC au jour 6 on observe un léger épaississement et une rougeur des oreilles. Cela peut être accompagné de légères démangeaisons, mais qui ne modifient pas le comportement des souris (toilettage, posture et activités normales). Néanmoins, si une souris dépasse les points limites fixées par la grille de score propre à chaque procédure expérimentale, elle sera retirée de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave, l'animal sera euthanasié immédiatement.

Choix des espèces

Les phénomènes à l'oeuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Le système immunitaire de la souris est relativement similaire à celui de l'être humain, avec notamment la présence d'un système immunitaire adaptatif. Le fonctionnement du systéme immunitaire de la souris étant très proche de celui de l'Homme. De plus, la peau des souris au niveau des oreilles est très similaire à la peau humaine. Ce modèle est donc pertient pour étudier des pathologies inflammatoires de la peau, dans le cas présent la dermatite atopique, qui touche 20% des enfants et 3% des adultes. Les animaux seront utilisés à partir de 10 semaines après la naissance afin d'étudier le système immunitaire mature à l'âge adulte.

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont isolées quinze jours puis placées en cages métaboliques, le porteur reconnaissant que l'isolement et le passage en analyseur de masse corporelle provoquent un stress modéré. L'étude vise à caractériser le comportement alimentaire et la dépense énergétique de souris porteuses d'une mutation liée à l'obésité. Le porteur affirme que l'exploration du métabolisme énergétique ne peut se faire que sur un "organisme entier".

Objectifs

Lors des dernières décennies, l'obésité et le surpoids ont atteint les proportions d’une épidémie mondiale impactant 1.9 milliard d’adultes en surpoids et plus de 650 millions d’obèses en 2016. Plusieurs études ont clairement montré que les voies de l’immunité innée sont impliquées, notamment via leur activation par les bactéries du microbiote intestinal, dans la mise en place de l’obésité et des maladies métaboliques qui y sont associées. Récemment une nouvelle voie de l’immunité innée a été identifiée. Cette voie implique un récepteur intestinal. Chez l’homme, des mutations du gène de ce récepteur ont été associées à l’obésité, à la prise de poids et au diabète de type 2. Une lignée de souris mutées pour ce récepteur a donc été développée afin de mieux caractériser les effets de cette voie de signalisation sur la mise en place de l'obésité et afin de comprendre les mécanismes sous-jacents liant cette voie à l’obésité. Par rapport à des souris contrôles issues de la même fratrie, la prise de poids de ces souris en réponse à un régime riche en lipides est réduite de 20%. Cependant aucune mesure de la structure détaillée des repas ainsi que des données sur la balance énergétique ne sont disponibles à ce jour. Or il a clairement été montré que la structure des repas (quantités d'aliments ingérés, taille, heure et fréquence des repas) ainsi que le statut de la balance énergétique sont déterminants dans la prise de poids. Afin d’identifier les mécanismes liant ce récepteur et la prise de poids il est nécessaire de caractériser précisément la structure des repas, de même que la dépense énergétique des animaux et leur composition corporelle précise. L’ensemble de ces paramètres peuvent être obtenus de manière non invasive via l’utilisation de cages métaboliques et d'un analyseur de la composition de la masse corporelle.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les mécanismes régulant le comportement alimentaire et la dépense énergétique est essentiel dans le cadre de la lutte contre les maladies métaboliques telles que l’obésité. En effet l’obésité, pandémie mondiale aux conséquences médicales et économiques multiples et dévastatrices, est une pathologie résultant d'une dérégulation de la balance énergétique et implique notamment une dérégulation de la prise alimentaire et/ou de la dépense énergétique. Le modèle de souris portant une modification du recepteur intestinal, compte tenu de la résistance à l'obésité qu'elles développent indique que l'étude de cette voie de signalisation et de son lien avec le comportement alimentaire et/ou la dépense énergétique peut permettre la découverte de nouvelles cibles therapeutiques utiles dans la lutte contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à un isolement durant 15 jours. L’analyse métabolique ( 8 jours) n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne necessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Aucun prélévement n'auront lieu sur animal vigile. Les animaux seront monitorés tous les jours, ils seront pesés: 1 fois/ jours (2 minutes/animal) lors de l'individualisation, puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition coporelle analysée (3 minutes/animal) de maniére non invasive 1 fois au debut de l'individualisation puis à l'entrée, lors du changement de régime et à la sortie des cages calorimétriques, soit 4 fois durant l'expérience.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré susceptible d'apparaitre durant la totalité de l'expérimentation. La durée totale de l'isolement des animaux est de 15 jours. De même les souris seront placées pendant 2 minutes dans un analyseur de masse corporelle. Cette technique bien qu'étant non invasive peut entrainer un stress modéré durant le temps de l'analyse. Aucune douleur n'est attendue durant le protocole. Le poids et la prise alimentaire de ces animaux sera surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 10% du poids initial. L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal.

Devenir

Aprés que les animaux sont retirés des cages métaboliques, leurs poids et leurs composition corporelle évaluées. Il n 'y a pas de nécéssité de conserver les animaux, ainsi les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les interactions entre immunité innée/régime alimentaire et comportement alimentaire/dépense énergétique/composition corporelle. Enfin, l’exploration du métabolisme énergétique et des comportements attenants ne peut se faire que sur un organisme entier, en raison de l’organisation et de la coopération des tissus métaboliques actifs.

Réduction

Afin de réduire de nombre d'animaux nous proposons dans cette étude d'étudier le comportement alimentaire, la dépense énergétique et le composition corporelle sur les mêmes animaux. D’après les études de comportement déjà menées en laboratoire, nous estimons que 8 souris par groupe expérimental sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80% ) compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. La lecture métabolique effectuée sur plusieurs jours permettra de réduire la variabilité intrinsèque de l’animal et inter animal, et limite le nombre d’animaux utilisés. Enfin le changement de régime au cours de l'analyse et sur les mêmes animaux permettra aussi d'évaluer les capacités adaptatives de l'animal lors d'un changement de régime.

Raffinement

L'analyse calorimétrique et la mesure de la composition corporelle sont deux analyses non invasives. -L’animal est hébergé dans une cage d’hébergement classique (500 cm2) dans le système de calorimétrie indirecte. -Les animaux bénéficieront d’un enrichissement, un abri en propylène rouge ainsi que deux carrés de coton et une nacelle pour faire leur nid. -les capteurs sont encastrés dans le couvercle de la cage et ne gênent pas l’animal, -l’air des cages est renouvelé à un taux de 2litres/min (débit calibré pour une mesure précise de la consommation de O2 et la production de CO2). Le mal-être a des conséquences directes sur les paramètres de la balance énergétique (prise alimentaire, activité locomotrice, dépense énergétique) et in fine sur la qualité et la validité des données obtenues. Pour cela, les animaux seront surveillés quotidiennement (surveillance visuelle plus suivi de la prise alimentaire et hydrique et du gain de poids). Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés et calculés quotidiennement au moyen du système de calorimétrie, le tout est effectué de manière automatique, de jour comme de nuit et sans intervention de l’opérateur. Des points limites et des critères d'arrêt de l'expérience ont été prévu en cas d'anomalie de comportement ou d'alimentation. Si un de ces paramètres affiche une valeur anormale, l'opérateur/responsable en recherchera l'origine.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est le seul modèle de souris transgéniques disponible qui permet d’étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude du métabolisme et est largement utilisé pour les recherches sur les maladies liées à l’alimentation. de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris et du transport intestinal du fructose sont un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les animaux adultes (entre 10-12 semaines) seront utilisés. c'est à dire à l’âge adulte : (1) lorsque toutes les structures cérébrales sont stabilisées pour ne pas impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au cours du temps ; (2) la masse de l’animal est plus stable à l’âge adulte ce qui permet une analyse fiable et robuste durant le temps de l’expérimentation.

616 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par voie intranasale, sous anesthésie, par les bactéries Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus, puis tuées par dislocation cervicale six à quarante-huit heures plus tard pour prélèvement d'organes, afin d'étudier le rôle d'une protéine, la cochline, dans la réponse immunitaire. Le porteur indique que l'infection provoque douleur, fièvre et perte de poids pendant la durée de l'expérience. Il juge l'utilisation d'animaux "essentielle" car l'étude ne peut être menée sur des lignées cellulaires.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques est un enjeu mondial majeur dans le traitement contre les infections bactériennes. Stimuler le système immunitaire de l'hôte représente une alternative prometteuse afin de diminuer l'antibiorésistance. Les mécanismes endogènes contrôlant l'immunité antibactérienne restent insuffisamment compris, en partie parce que les protéines potentiellement impliquées dans une telle régulation restent peu étudiées. Un exemple est la cochline, protéine de la matrice extracellulaire. Il a récemment été décrit que la protéine circulante cochline (codée par le gène Coch) augmente la réponse innée de l'hôte contre deux bactéries Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. L’absence de cochline entraîne un défaut de contrôle de la propagation bactérienne au site d’infection (poumon) et sa dissémination dans l’organisme (sang, rate), et une diminution de la survie des souris à ces modèles infectieux. L’absence de cochline est associée à une diminution du recrutement de cellules immunitaires innées. Il a aussi été montré que l'administration de cochline recombinante limite la colonisation bactérienne de lésions cutanées dans un modèle murin d’épidermolyse bulleuse. Ainsi, le ciblage de la « voie cochline » présente un fort potentiel thérapeutique contre les infections bactériennes dans le contexte de l’accroissement des antibiorésistances.

Bénéfices attendus

A court terme, le projet consiste à décrire de façon très complète les défauts de la réponse immunitaire dans les souris transgénique n’exprimant pas la cochline suites aux infections bactériennes. Ce projet permettra donc la caractérisation complète et détaillée de « la voie cochline ». A plus long terme, le ciblage de la voie cochline pourra apporter une option thérapeutique innovante visant à augmenter la réponse de l’hote notamment lors d’infections bacteriennes résistantes aux antibiotiques.

Procédures

Les animaux seront pesés (vigile), identifiées par marquage caudal au feutre (vigile) puis traités pour limiter la souffrance avec du paracétamol dans l’eau de boisson 12h avant infection puis pendant tout le temps de l’expérience (vigile). Les animaux seront alors anestésiés par injection intrapéritonéal (vigile) pendant une dizaine de minutes au cours desquelles ils seront infectés en intranasal avec les bactéries Pseudomonas Aeruginosa ou Staphylococcus Aureus Newman. Après 6h-48h suivant les expériences, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale (vigile) ou injection intrapéritonéale (vigile) pour prélèvement de différents organes et échantillons post-mortem

Impact sur les animaux

Douleur induite par une infection bactérienne pulmonaire, fièvre, perte de poids, activité et mobilité réduite. Ces effets dureront au maximum 48h (temps d’expérince le plus long avant mise à mort)

Devenir

Chaque procédure nécéssitant l’analyse sur des organes vitaux (poumon, rate) les souris devront être mises à mort à la fin de chaques procédures.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l'analyse du système immunitaire et d'un point de vue mécanistique, l'étude ne peut être conduite sur des lignées cellulaires immortalisées.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été réduit au maximum afin que la taille de l'échantillon permette de dégager des résultats statistiquement fiables sur des souris mâles et femelles. Ainsi pour limiter le nombre de souris utilisées, nous réaliserons les procédures expérimentales préliminaires avec 4 souris par groupes pour déterminer, à l’aide d’un calcul de puissance, le nombre adéquat de souris pour les autres procédures. Pour les procédures expérimentales de détermination de la dose infectieuse , nous ne testerons pas toutes les doses proposées en même temps mais testerons en premier 2 doses et testerons ensuite des doses à la hausses ou à la baisse parmi celles proposées en fonction des résultats préliminaires obtenus. Pour les procédures d'expérimentations les nombres indiqués correspondent au maximum. Les nombres de souris par groupe seront revus à la baisse en fonction des résultats des procédures préliminaires permettant des calculs de puissance. De plus les résultats des groupes contrôles négatifs (sans infection) pourront être utilisés pour les différentes procédures.

Raffinement

Nous avons optimisé les procédures expérimentales pour réduire au maximum l'inconfort et le stress subis par les animaux. En particulier, nous avons mis en place une surveillance adaptée lors des procédures afin de ne jamais induire un dépassement de point limite de souffrance. Afin de limiter la douleur lors de l’infection intranasale, nous anesthésierons les souris par injection intrapéritonéale (dans l’abdomen). Pour limiter la douleur post-infection nous administrons par voie orale via l’eau de boisson du paracétamol (doliprane 2.4% à 0.6mL/L) qui sera maintenu pendant toute la durée de l'expérimentation. Afin de limiter le mal-être et l'angoisse des animaux, nous mettrons en œuvre des mesures d'acclimatation de 5 jours après leur arrivée en zone d'hébergement, et nous maintiendrons au maximum les groupes sociaux.

Choix des espèces

Le rôle de cochline dans la réponse immune a été établi par 4 publications utilisant la souris. Utiliser le modèle souris nous permettra donc de ne pas répéter des expériences inutiles en étudiant la littérature existante, et de comparer aisément nos résultats avec ceux de nos confrères afin de progresser plus rapidement. De nombreux anticorps spécifiques reconnaissant les marqueurs du système immunitaire murins nous permettent de faire des études sur ce modèle. Les animaux auront entre 5 et 8 semaines de vie à leur arrivée en zone expérimentale. Après une semaine d'acclimatation, ils entreront en procédure. Nous travaillons avec des souris adultes pour nous affranchir d'éventuels problèmes d'immaturité du système immunitaire lié au développement.

6 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie, cinq gavages, quatre injections et des prélèvements de sang, puis est tuée pour analyse des tumeurs et organes, afin d'étudier le rôle du microbiote intestinal dans la réponse aux traitements anticancéreux. Le porteur renvoie au développement de médicaments à base de bactéries comme bénéfice attendu, tandis que des tumeurs sont induites chez chaque souris. Il affirme la "nécessité d'un organisme entier" porteur de tumeur et juge ces modèles "indispensables".

Objectifs

L’efficacité des traitements anticancéreux ciblant le système immunitaire fait actuellement l’objet de nombreuses études cliniques. Ces traitements permettent une réinduction de la réponse immunitaire qui se trouve supprimée par les cellules cancéreuses. Cependant, certains patients développent une résistance à ce traitement. Des résultats obtenus au sein de notre laboratoire ont démontré le rôle crucial du microbiote intestinal dans l’activation du système immunitaire permettant d’améliorer l’effet de thérapies anticancéreuses. Chez les patients atteints d’un cancer, de nombreux facteurs entraînent un déséquilibre du microbiote qui pourrait être impliqué dans la résistance aux traitements. En effet, des données publiées ont démontré que la prise de traitements antibiotiques impacte l’efficacité des traitements utilisés chez des patients atteints de cancer. Par ailleurs, des données générées par des études cliniques chez des patients atteints de cancer ont identifié certaines bactéries associées à l'efficacité des traitements anticancéreux. En conséquence, ce projet a pour but de caractériser le rôle des bactéries isolées du tube digestif des patients atteints de cancer (et de leurs produits actifs (métabolites)) et d'évaluer leur capacité à moduler la réponse aux thérapies anticancéreuses chez des souris porteuses de tumeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment certaines bactéries améliorent l’efficacité des traitements utilisés chez des patients atteints de cancer. Il permettra de développer de nouveaux médicaments contenant des bactéries pour améliorer les réponses aux traitements anticancéreux chez les patients atteints de cancer. En effet, beaucoup de patients développent des résistances à ces thérapies. Des essais cliniques utilisant des bactéries vivantes sont en cours de réalisation.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection de cellules tumorales durant toute la durée de l’expérience (sous anesthésie, durée: 5 minutes ). Ces injections se feront après anesthésie générale gazeuse. 5 gavages oraux espacés à intervalle de 3 jours seront effectués (durée: quelques secondes). 4 injections sous anesthésie locale seront pratiquées (durée 20 minutes, incluant l'anesthésie locale). Du sang pourra être prélevé au niveau submandibulaire après anesthésie générale sous anesthésie gazeuse (1 fois par semaine), durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Croissances tumorales. Nuisances limitées liées à la présence d'une tumeur par animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses sur les tumeurs et organes.

Remplacement

Les procédures expérimentales mises en jeu ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants (nécessité d’un organisme entier, vivant, avec un système immunitaire complexe, proche de l’homme, porteur de tumeur). Les modèles de souris traitées par antibiotiques nous sont indispensables pour étudier les interactions avec le microbiote intestinal et les mécanismes qui régissent l'efficacité des thérapies anticancéreuses. Les modèles in vitro de lignées cellulaires testés ne permettent pas de récapituler la complexité des interactions entre l’hôte, le cancer, son microbiote intestinal, son système immunitaire et des thérapies anticancéreuses.

Réduction

Les groupes seront constitués d’un minimum d’animaux assurant la fiabilité des résultats en termes de statistiques. Le nombre de prélèvements pré- et post-mortem seront optimisés dans le souci du confort de l’animal afin d’étudier le plus de paramètres possibles et ainsi d’éviter la répétition d’expérimentation. Deux bactéries ou selles de volontaires sains seront testés simultanément pour limiter le nombre de groupes contrôle et référence.

Raffinement

Le milieu sera enrichi afin de réduire le stress des animaux. L’inoculation des cellules tumorales se fera sous anesthésie générale. L’injection intra-péritonéale des traitements anticancéreux ainsi que les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Une surveillance accrue du comportement des animaux sera effectuée et mis au regard de points limites.

Choix des espèces

La souris est un mammifère et un modèle décrit, validé, facile à mettre en œuvre et admis dans la communauté scientifique. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’efficacité des traitements utilisés chez des patients atteints de cancer. Des femelles seront utilisées car les modèles de tumeur ont été obtenus à partir de souris femelles. Les précédentes expériences publiées ont été validées à l’aide de souris femelles ayant atteint l'âge de maturité sexuelle. Les souris seront donc utilisées à partir de l’âge de 7 semaines, période à laquelle la maturité sexuelle est atteinte chez les souris.

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des bactéries par gavage cinq jours par semaine et une application répétée d'un produit sur les oreilles pour provoquer une inflammation de type dermatite atopique, afin de tester l'effet anti-inflammatoire de deux bactéries intestinales. Le porteur affirme que l'induction ne génère pas de douleur apparente ni de grattage. Les animaux sont tués et leurs oreilles prélevées pour analyser la réponse inflammatoire.

Objectifs

Les maladies atopiques telles que la dermatite atopique (DA), l’asthme ou la rhinite allergique touche environ 30% des personnes dans les pays développés. La dermatite atopique se caractérise par des lésions de la peau et est dues à une réaction allergique. Sa cause est complexe et reste mal comprise à ce jour. Elle serait associée à des défauts génétiques de la peau, et/ou autres anomalies immunologiques, qui favoriseraient la pénétration d’allergènes au sein de l’organisme, et le développement de l’allergie chez les individus. Le microbiote intestinal joue egalement un rôle important dans les maladies allergiques, y compris la DA. Les probiotiques contribuent à l’amélioration de l’environnement intestinal, l’équilibre des réponses immunitaires et la régulation du métabolisme. La plupart des études suggèrent que les suppléments probiotiques peuvent être une alternative pour la prévention et le traitement de la DA. C'est donc dans ce contexte que les proprietés anti-inflammatoires de 2 bactéries intestinales seront testée dans un modèle de dermatite atopique chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer la capacité de deux bactéries, connues pour leurs propriétés anti-inflammatoires dans des modèles d’inflammation intestinales, à réguler l’inflammation cutanée de type DA dans un modèle murin induit par l’application répétée de calcipotriol

Procédures

Le traitement à base de bactéries intestinales sera réalisée par gavage sur animaux vigile, 5 fois par semaine pendant 24jours. L'application du calcipotriol servant à induire la dermatite atopique, sera appliquée sur les oreilles des animaux anesthésiés avec de l'isofluorane. Le traitement corticoide utilisé en control sera appliqué sur l'oreille des souris 6h aprés l'application du calcipotriol, et sur des souris anesthésiées à l'isofluorane. La mesure de la réponse clinique (mesure de l'epaisseur de l'oreille) sera réalisée sous isofluorane.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux, toutefois les animaux sont surveillés 5 jours par semaine et tout animal qui présenterait des signes physiologiques anormaux (souris prostrées, poils hérissés ou encore apparition de nécrose cutanée) suite à l’application cutanée des composés, serait mis à mort. A noter que l'induction de dermatite atopique chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente et ne conduit pas les souris à se gratter.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, et les oreilles sont prélévées afin d'analyser la réponse inflammatoire et le pouvoir anti inflammatoire des bactéries testées.

Remplacement

L’objectif de cette étude est d'évaluer l'impact de candidat médicament, sur une inflammation de type dermatite atopique. Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de cette pathologie. Celle-ci ne peut donc être conduite qu’in vivo.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 9 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes (tests non paramétriques de Kruskal-Wallis pour comparer l’ensemble des groupes ainsi que tests de Mann-Whitney en comparaison deux à deux). Une seule dose de bactérie sera testée, celle çi ayant deja été validé dans une précedente procédure et pour une autre pathologie.

Raffinement

Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress pour l’animal. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceuxci. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié.

Choix des espèces

L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie et autres inflammation cutanée en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires ou encore l’induction de des différentes populations de lymphocytes mémoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, elles reçoivent dans la bouche un fil de soie imprégné de bactéries maintenu contre les molaires, renouvelé tous les trois à quatre jours pendant 28 jours pour provoquer une destruction des tissus de soutien des dents. Le porteur affirme n'observer aucune perte de poids ni changement de comportement et administre des antalgiques. Les animaux sont tués par saignée du cœur pour prélever les tissus, la souris étant présentée comme l'espèce la plus utilisée pour ce modèle.

Objectifs

La parodontite est une maladie inflammatoire chronique très fréquente (47% de la population adulte américaine). Elle entraine une destruction des tissus de soutien des dents, générant des édentements précoces et une difficulté à la réhabilitation orale. Elle est déclenchée par un déséquilibre du micobiote dentaire (plaque dentaire) avec une infection par des bactéries spécifiques. Les parodontites sont une source chronique de passage de bactéries dans le sang et d'une inflammation généralisée de faible intensité, favorisant des maladies inflammatoires à distance (ex : maladies cardiovasculaires). Il n'existe pas de cibles thérapeutiques de l'inflammation pour le traitement des parodontites, ni de biomarqueurs pour évaluer précocement et mieux suivre des malades, notamment ceux atteints d'autres maladies inflammatoires chroniques. Les neutrophiles sont les leucocytes (globules blancs) les plus abondants dans les lésions parodontales et semblent clés dans le développement des parodontites. Récemment, il apparait qu’il existe des sous types de neutrophiles aux fonction pro-inflammatoires ou pro-résolutives de l'inflammation. Parmi ceux-ci, certains neutrophiles se distinguent par l’expression d’une enzyme protéolytique au cours de l’apoptose (mort celullaire programmée), ce qui module leur élimination par les macrophages. Notre objectif est de déterminer si ce mécanisme interfère avec l’inflammation et la résorption osseuse dans un modèle de parodontite expérimentale chez la souris. La parodontite sera induite pendant 4 semaines, selon un protocole validé, chez des souris surexprimant l’enzyme protéolytique et présentant un activité modifiée des neutrophiles. Nous caractériserons la destruction du parodonte chez ces souris en comparaison de souris contrôles (souris du même fond génétique, et pour lesquelles le meme modèle de parodontite expérimental est appliqué).

Bénéfices attendus

Notre projet est le premier à tester les conséquences d’une régulation de l’inflammation chez des souris surexprimant une enzyme protéolytique dans la pathogénie de la parodontite. Il permet d’accroitre les connaissances dans le développement de cette maladie. Ce projet participe à l’identification de pistes thérapeutiques régulant l’inflammation de la parodontite pour laquelle plus de 30% des situations échappent au traitement conventionnel (traitement qui repose actuellement exclusivement sur le contrôle de l’infection). De plus, les conséquences systémiques seront recherchées, l’inflammation parodontale influant sur des processus pathogéniques à distance, tels que l’athérosclérose. Enfin, la parodontite est un modèle parfait de maladies inflammatoires choniques au cours de laquelle la régulation des neutrophiles est primordiale. Elle partage des mécanismes pathogéniques communs avec, par exemple, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la polyarthrite rhumatoïde : les résultats de ces travaux permtteraient d’ouvrir des perspectives dans l’étude de la pathogénie et de stratégies thérapeutiques d’autres maladies inflammatoires chroniques.

Procédures

Avant chaque expérimentation, les souris sont anesthésiées par une anesthésie générale par voie intra-péritonéale de Kétamine 180mg/kg-Xylazine 20mg/kg en solution injectable dans du sérum physiologique. L'intervention chirurgicale sera effectuée selon une procédure qui dure environ 10 min/souris. La procédure est la suivante: a. Zone d’intervention: Intra-buccale sur les faces palatines de 1ère et 2nde molaires droite et gauche de l'animal. b. Incision superficielle d’environ 0,5 mm de longueur à l’aide d’un bistouri stérile au niveau de la face palatine de la première molaire droite. c. Implantation en sous gingival du côté droit au niveau de la première molaire d’une suture de soie chirurgicale 6-0 imprégnée d’une solution de bactéries. d. Dépose d’un matériau adhésif collé (ciment verre ionomère) pour maintenir le fil en place. Après chaque pose de ligature, les souris sont placées dans un environnement chauffé et surveillées jusqu’à leur réveil. Cette procédure est répétée tous les 3-4 jours pendant 28 jours pour induire une inflammation chronique locale et une destruction du parodonte. Dès la seconde intervention, il n'est pas nécessaire de répéter l'incision superficielle ni d’ajouter le matériau ciment verre ionomère car l'inflammation générée permet de plus aisément glisser et d’assurer le maintien du fil dans le sillon gingivo dentaire. Entre chaque renouvellement, les souris seront maintenues dans des cages dans un environnement enrichi avec nourriture et eau ad libidum. Au bout de 14 jours, une destruction parodontale peut etre observée du coté ligature +/- P gingivalis pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Une anesthésie profonde est réalisée pour prévenir la souffrance des souris lors de la pose et du renouvellement des ligatures. Après réveil des animaux et suivi dans le temps, nous administrons des antalgiques. Notre expérience ne nous montre aucune modification observable de l’état de santé des souris (pas de perte de poids, pas de modifications comportementales, apparence physique normale). Une prise de poids en accord avec les conditions d’élevage est observée démontrant que les souris se nourrissent correctement.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux sont mis à mort par exsanguination cardiaque sous anesthésie et analgésie profonde, permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.

Remplacement

Nous développons une recherche sur modèle expérimental chez le petit animal, car c'est le seul moyen à l'heure actuelle d’étudier les différents aspects de notre projet. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives (in vitro, in silico) pour l’étude des parodontites, et la souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de cette maladie.

Réduction

Une publication sur la comparaison des modèles de parodontite expérimentale avec ligature +/- P gingivalis chez la souris montre une différence significative sur la perte osseuse et l'inflammation parodontale avec 6 souris/groupe. Le suivi longitudinal par micro-CT (imagerie radiologique de précision et en 3 dimensions) sur souris vivante de la perte osseuse induite nous permet aussi de rationaliser le nombre de souris. Le nombre d’animaux estimé et les tests statistiques sont également basés sur notre expérience pour ce type d’étude. Ce nombre minimum nous permettra d’être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet et de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes.

Raffinement

L'expérimentation ne conduit pas à des altérations évidentes des souris. Le suivi quotidien des animaux et la mise en place de points limites permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par des antalgiques et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi pour minimiser leur stress.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de la parodontite et tout particulièrement pour l’approche moléculaire et histologique. De nombreux outils d’analyses sont développés et adaptés à ce modèle. 3 mois – âge adulte avec croissance des maxillaires achevée

402 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées dans d'autres protocoles au sein de leur établissement d'origine. Elles reçoivent une implantation de tumeur cérébrale sous anesthésie puis une irradiation de 20 Gy fractionnée en deux séances par jour sur quatre jours, avec prélèvement de sang, pour comparer protonthérapie et rayons X sur la réponse immunitaire. Le porteur indique que les séances répétées peuvent baisser la fréquence respiratoire et entraîner une perte de poids, et que la chirurgie tumorale peut être douloureuse. Il affirme que l'étude du système immunitaire lié à une tumeur cérébrale ne se fait pas in vitro et qu'aucune espèce moins évoluée que la souris ne convient.

Objectifs

« La radiothérapie (RT) fait partie des traitements les plus utilisés chez les patients atteints de cancer. A l’heure actuelle, en France, 60% des patients diagnostiqués pour un cancer sont traités par RT. Pour les tumeurs du cerveau, la RT fait partie du traitement standardisé. Nous avons précédemment montré que l’irradiation aux rayons-X pouvait modifier le système immunitaire dans le cas des tumeurs du cerveau, notamment en augmentant la proportion de cellules associées à une progression tumorale et en diminuant la quantité de cellules anti-tumorales dans le sang. Contrairement à la RT conventionnelle qui utilise des rayons-X, la protonthérapie utilise des particules chargées plus lourdes et de haute énergie. Parce qu’elle peut déposer de façon précise des doses d’irradiation dans le tissu, la protonthérapie peut être utilisée pour : i) limiter les risques de toxicité en réduisant l’exposition du tissu sain, et ii) augmenter la dose déposée à la cible pour accroître le contrôle tumoral. Le premier objectif de cette étude est d’appréhender si la protonthérapie pourrait présenter des avantages par rapport aux rayons-X au niveau du système immunitaire anti-tumorale dans le cas d’une irradiation cérébrale. Le second objectif est de déterminer si la combinaison de la protonthérapie et de stratégies thérapeutiques ciblant le système immunitaire serait bénéfique pour le traitement des tumeurs du cerveau. »

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’améliorer les connaissances scientifiques sur les effets de la protonthérapie sur l’inflammation. De plus, cela permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinant la protonthérapie et l’immunothérapie (dont les tumeurs cérébrales sont très résistantes). Le projet scientifique global présente également une partie clinique dont le comité de proection des personnes a été accepté en décembre 2021. Les résultats du projet ci présent pourront ainsi être comparés aux données cliniques. Ainsi, l’ensemble de ces résultats pourra rapidement être adapté à la clinique dans le but d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de tumeurs cérébrales. Plus généralement, ce projet permettra d’appréhender en détail les relations entre la protonthérapie et les immunothérapies.

Procédures

Les animaux subiront plusieurs types d’interventions (irradiations, prélèvements sanguins, …). Les interventions spécifiques, leurs fréquences et leurs durées pour chaque animal sont détaillées en Annexe I. -Initiation du développement de la tumeur : L’implantation des tumeurs est réalisée sous anesthésies L’implantation dure quelques minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. -L’irradiation du cerveau : alors qu’ils sont anesthésiés. L’irradiation est réalisée sous anesthésie générale. Lors de l’irradiation, une dose totale de 20Gy sera délivrée de manière fractionnée comme en clinique : 2.5Gy/séance avec deux séances par jour (espacées de 6h) sur 4 jours consécutifs. - Le prélèvement sanguin sera réalisée sur souris éveillée Ce prélèvement dure une minute et n’est réalisé qu’une seule fois/souris.

Impact sur les animaux

L’irradiation par elle-même n’induit pas de douleurs mais peut induire une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations/min. Les répétitions bijournalières et ce sur 4 jours consécutifs peuvent également induire une perte de poids des animaux jusqu’à 10 jours après irradiation. Le prélèvement sanguin ne provoque pas de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale peut induire des douleurs. Le transport des animaux peut induire un stress surtout que cette étude.

Devenir

Tous les animaux de l'étude qui seront transportés dans notre EU pour les protocoles d'irradiation retournenront dans leur EU d'origine pour la poursuite des protocoles

Remplacement

L’évolution du système immunitaire et ce en lien avec la circulation sanguine cérébrale après un traitement ainsi que la formation et l’évolution de l’inflammation tumorale ne peuvent pas être évaluées in vitro. Les expériences in vivo sont absolument nécessaires pour étudier l’impact d’un traitement et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient être transposées à la clinique, on ne peut pas utiliser d’espèces moins évoluées que la souris. La souris présente un système immunitaire similaire à l’homme et nous disposons d’un modèle in vivo de tumeur cérébrale bien maitrisé dans le laboratoire qui récapitule plusieurs caractéristiques retrouvées chez les patients.

Réduction

Afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour les analyses, le nombre d’animaux nécessaires / groupe prend en compte la variabilité entre les individus basée sur des expériences antérieures et des expériences préliminaires. Ce nombre d’animaux a été déterminé mathématiquement grâce à des logiciels statistiques adaptés afin de réduire au maximum tout en assurant une puissance statistique satisfaisante. Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, à chaque fin de protocole, les tissus (cerveaux, rates et ganglions lymphatiques) seront prélevés pour des études post-mortem.L’imagerie nous permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en évitant des euthanasies à tous temps. »

Raffinement

Les animaux subiront une période d’habituation, d’acclimatation avant la radiothérapie. Les animaux subissent une anesthésie pendant l’irradiation. Les animaux sont surveillés tous les jours pendant toute la durée du protocole, weekend compris. Le poids des souris est suivi tous les 2-3 jours avant, pendant et deux semaines après l’irradiation. Pendant l’irradiation et la semaine suivante, les animaux disposent de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter la perte de poid. Pour le modèle de tumeur, les animaux sont anesthésiés pendant la chirurgie. Après la chirurgie, les animaux sont surveillés tous les jours pendant le protocol, weekend compris. Les souris sont hébergées dans des cages avec 5 souris/cage dans un environnement enrichi (roues/cartons/bâtons à ronger). Le transport des animaux sera pris en charge par un transporteur agréé.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux chez l’animal sont indispensables pour récapituler au mieux l’environnement des tumeurs qui se développent chez les patients. Nous utiliserons une souche de souris qui présente toutes les populations de cellules immunitaires et parce que le modèle de tumeur cérébral utilisé repose sur l’injection de cellules tumorales issues de cette souche. De plus, pour cette espèce et pour les cellules étudiées, tous les outils de caractérisation sont déjà validés. Les animaux seront agés de 7 semaines. Ce stade correspond à de jeunes adultes et est parfaitement adapté en termes de physiologie aux pathologies ciblées.