Système immunitaire

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris NSG immunodéficientes reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections hebdomadaires de lymphocytes T, une grosseur tumorale se développant dans le flanc. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem, ou plus tôt si trois signes cliniques notables ou un signe sévère apparaissent. Le porteur reconnaît que davantage d'animaux par lot serait préférable statistiquement mais retient cinq souris pour des raisons éthiques, et affirme que les cellules tumorales se comportent différemment in vitro et in vivo.

Objectifs

L’immunothérapie, devenue une thérapie de référence pour certains cancers métastatiques, consiste à améliorer les mécanismes de défenses spécifiques du patient pour éliminer la tumeur. Parmi les différentes stratégies, l'immunothérapie passive par transfert adoptif repose sur l’administration à un patient de cellules du système immunitaire reconnaissant un antigène tumoral spécifiquement exprimé par les cellules à éliminer. Des essais cliniques d’injection de lymphocytes ont déjà été réalisés et, s’ils ont montré une bonne tolérance, ils ont eu une efficacité anti-tumorale encore trop limitée. Ce programme de recherche préclinique vise à évaluer la faisabilité et l’efficacité thérapeutique, dans le traitement des cancers, de nouvelles approches d’immunothérapie passive par transfert adoptif de différents types d’effecteurs lymphocytaires T anti-tumoraux. Afin que cette étude soit la plus représentative possible de la pathologie humaine, un modèle de développement de xénogreffes de cellules tumorales et d’administration d’effecteurs lymphocytaires T humains optimisés sera établi dans les souris immunodéficientes NOD-SCID-IL-2Rγ [NSG]. Compte-tenu de la diversité importante des cancers, les différentes stratégies thérapeutiques pourront être testées dans deux modèles de cancers humains hautement immunogènes : le mélanome et le cancer colorectal. Les effecteurs lymphocytaires T humains utilisés seront des : - lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'antigènes tumoraux. - lymphocytes T modifiés génétiquement pour inactiver l'expression des gènes codant pour des Immune Checkpoint (IC), dont les ligands sont exprimés par les cellules tumorales préalablement injectées.

Bénéfices attendus

En conclusion, l’objectif principal de ce programme est d’obtenir, à l’aide de modèles "in vivo", des preuves de concept précliniques pouvant justifier la mise en place d’immunothérapies par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés par modification génétique visant à inactiver un ou plusieurs IC, dans le traitement des cancers. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront aussi permettre de prioriser le ciblage de certains de ces IC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée de 50µL de tampon PBS stérile (avec ou sans cellules) dans le flanc à J0 dans chaque procédure. Dans les procédures 2, 3 et 4, les animaux seront également soumis à des injections hebdomadaires (à partir de J7) en intraveineuse de 100µL de PBS stérile (avec sous sans cellules) pendant 3 semaines. Ces injections en elles-mêmes sont de l’ordre de la minute. La procédure d’injection des cellules tumorales dans le flanc sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé pour induction puis 2%/air comprimé pour le maintien).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis aux nuisances ou effets indésirables suivants : - une douleur intrisèque à l’injection (piqûre) dans le flanc, de cellules dans un volume donné (50 à 100µL) de tampon phosphate salin. - un refroidissement des souris lors de l’anesthésie gazeuse. - le développement d’une grosseur tumorale dans le flanc est attendu.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le protocole seront mis à mort, car des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem effectués sur les animaux.

Remplacement

Remplacement : Les paramètres observés dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures "in vitro". L'évaluation chez l'homme du bénéfice thérapeutique de l’administration d’effecteurs immunitaires, nécessite le développement d'études précliniques permettant de vérifier la faisabilité de ces thérapies et de détecter la survenue de premiers effets secondaires délétères. Concernant l’immunothérapie anti-tumorale, il est établi que les cellules tumorales se comportent différemment "in vitro" et "in vivo", en terme de croissance, de résistance à la lyse et de capacité à instaurer un environnement délétère pour le système immunitaire. Notre étude permet d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration de lymphocytes T injectés sur le site tumoral), et de définir les modalités optimales d’administration des effecteurs lymphocytaires. Compte-tenu de la difficulté de mise en place d’essais cliniques et de recrutement de patients éligibles, il paraît clair que les informations obtenues suite à ces travaux précliniques, couplées aux données obtenues "in vitro", auront une importance capitale lors du transfert en clinique.

Réduction

Réduction : Le nombre d'animaux a été réduit à des lots de 5 souris et les résultats seront analysés statistiquement par des tests de comparaison : test de Wilcoxon ou Mann -Whitney. D'un point de vue statistique, l'utilisation de plus d'animaux par lot semble préférable mais d'un point de vue éthique, le nombre d'animaux utilisé est réduit au minimum. Plusieurs études publiées dans notre domaine de recherche avec des modèles animaux similaires décrivent l'utilisation de 5 animaux par lot.

Raffinement

Raffinement : Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées (groupe de 5 souris par cage maximum), avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. De façon à diminuer le stress, les différentes procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l'étude avec une évaluation des signaux généraux (visite 3 fois par semaine en présence d’un signe clinique notable et visite quotidienne s’il y a présence de signes cliniques notables (cf annexe « gestion de la douleur »)). De plus, en présence de trois signes notables ou un signe sévère : les animaux seront mis à mort, après une anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé) par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Les souris sont des modèles d'étude pertinents, notamment en immunothérapie anti-tumorale, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, ...). Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de sujets immunodéficients (évite le rejet de greffe) tels que les souris NSG qui sont dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK. Ces souris permettent la croissance de nombreuses lignées tumorales humaines et l'utilisation d'effecteurs T d'origine humaine. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-10 semaines) pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux, facilitant non seulement le geste lié aux greffes de cellules tumorales et de lymphocytes T mais renforçant aussi la pertinence des effets thérapeutiques (transfert clinique chez des patients adultes).

1 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souriceaux de trois jours et adultes reçoivent le parasite Cryptosporidium par voie orale puis des immunostimulants par injection intrapéritonéale, avant une mise à mort pour prélèvement de tissus. Le projet évalue des immunostimulants contre cette infection responsable de diarrhées. Le porteur signale que le stress de certaines lignées favorise le cannibalisme des portées, et affirme que l'étude de l'immunité intestinale ne peut se faire sans animaux, les modèles in vitro ignorant selon lui la complexité de l'environnement intestinal.

Objectifs

Les infections par le protozoaire Cryptosporidium sont très fréquentes à travers le monde. Elles conduisent à des pertes économiques importantes en santé vétérinaire puisque cette maladie provoque des diarrhées sévères chez les ruminants dès la naissance et affectent aussi la santé humaine (notamment les enfants de moins de 5 ans - 2ème cause de mortalité due aux diarrhées dans les pays en voie de développement). En absence de vaccins ou de traitements autorisés et efficaces, l’objectif du projet est d’évaluer l’effet protecteur de différents immunostimulants de l’immunité innée et de décrire les mécanismes immunologiques mis en jeu lors de ces traitements.

Bénéfices attendus

En l’absence de vaccin ou de traitements efficaces qui pourraient induire des résistances, l'utilisation d’immunostimulants pour stimuler de manière non spécifique les cellules de l’immunité est une approche très prometteuse qui pourrait être bénéfique pour toute autre infection en période néonatale puisqu’elle n’est pas basée sur une réponse spécifique vers l’agent pathogène (comme les vaccins).

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite, (une fois à l’âge de 3 jours pour les souriceaux, et une fois entre 7-12 semaines pour les adultes) puis à une administration intra-péritonéale des immunostimulants (5 jours après l’infection) (introduction aiguille) sur animaux vigiles sous contention.

Impact sur les animaux

Il est possible que la conjonction des traitements : infection et déficience génétique, immunostimulation et traitement antibiotique, puisse altérer l’état général de l‘animal.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.

Remplacement

L’étude de l’immunologie et de la muqueuse intestinale ne peut être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement intestinal (flore bactérienne et antigènes alimentaires).

Réduction

Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par la PFIE). Du point de vue statistique, nous utilisons des tests non paramétriques adaptés pour les petits échantillons mais 6 animaux par lots au minimum sont requis. Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. Pour analyser les données (charge parasitaire ; cytokines ; % cellules immunitaires), nous utiliserons des modèles statistiques mixtes qui tiennent compte à la fois des facteurs à effet fixe (exemple Infection ou déficience génétique de l’animal ou traitement immunostimulant) et des facteurs à effet aléatoire (répétition des expériences). D'après nos expérimentations précédentes et dans ces conditions, ces effectifs et répétitions sont suffisants pour conclure du point de vue significatif ET biologique sur nos données (ex : pour la charge parasitaire avec un effet protecteur des immunostimulants d’environ 40% (faible) : puissance estimée à 95% avec un risque de 0.05% avec 6 animaux par lots). Deux animaux supplémentaires sont ajoutés dans chaque lot car de la mortalité est parfois observée dans les portées (très jeunes animaux) (indépendamment de l’infection ou d’un traitement).

Raffinement

Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé en tant que modèle expérimental pour étudier la cryptosporidiose. Le souriceau est représentatif de l’infection chez les jeunes ruminants. Dans les élevages, les jeunes ruminants se contaminent rapidement dès la naissance et éliminent le parasite en 3 semaines environ. Le souriceau inoculé avec le parasite entre 3 et 7 jours de vie élimine le parasite comme le jeune ruminant en 3 semaines environ. La souris adulte immunodéficiente, notamment lorsqu’elle est génétiquement modifiée pour un gène de l’immunité, est également utilisée dans la présente demande pour comprendre la spécificité du mécanisme de protection chez le jeune. Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra de décortiquer très précisément les mécanismes de protection. Notre établissement élève de nombreuses lignées de souris transgéniques (gènes rapporteurs, déficientes, invalidation fonctionnelle etc.) pour parvenir à cet objectif. Les souriceaux sont inoculés par le parasite lorsqu’ils auront 3 jours. Les souris adultes seront également utilisées et âgées entre 7-12 semaines.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un immunomodulateur appliqué chaque jour sur le dos et les oreilles provoque des lésions de psoriasis, puis des molécules candidates sont administrées avant une mise à mort par ponction intracardiaque et dislocation cervicale. Le porteur indique que l'induction s'accompagne d'une perte de poids pouvant atteindre 15 pour cent, d'excoriations et de plaies liées au léchage et au grattage, avec une mise à mort au-delà de 20 pour cent de perte de poids. Il affirme qu'il est "indispensable" de tester ces molécules sur ce modèle, aucun système in vitro ne remplaçant selon lui complètement la peau.

Objectifs

Ce projet est nécessaire pour l’évaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques ayant une activité sur le psoriasis. Ces tests sont requis pour permettre le choix des meilleures molécules ou traitements thérapeutiques avant essai chez l’homme (tests cliniques).

Bénéfices attendus

Ce projet s’effectuera chez la souris (Mus musculus). Dans cette espèce, l’administration topique d’un immuno-modulateur comme l’imiquimod permet d’induire très rapidement en moins d’une semaine des lésions de psoriasis similaires à celles observées chez l’homme: érythème, desquamation et épaississement de la peau. Ce projet utilisera donc cette molécule, l’imiquimod, sous forme de crème, comme agent inducteur du psoriasis qui sera appliqué quotidiennement sur le dos et l’oreille des animaux sur une période de 7 jours. Les symptômes de psoriasis seront évalués cliniquement par enregistrement du score d’érythème, de désquamation, d'excoriations et d’épaississement de la peau du dos et des oreilles au pied à coulisse. Un suivi longitudinal par imagerie non invasive optique (Tomographie par Cohérence Optique ou OCT) permettra une évaluation supplémentaire des symptômes liés à la pathologie. Suite à l’induction, mais aussi lors de l’induction, des traitements thérapeutiques seront administrés, par voie orale, topique, intrapéritonéale ou intraveineuse, aux animaux afin d’en évaluer leur efficacité thérapeutique ou prophylactique. Cette efficacité sera évaluée cliniquement par suivi quotidien du score d’érythème, de désquamation, d'excoriations et d’épaississement de la peau du dos et des oreilles au pied à coulisse, ainsi que par un suivi longitudinal par imagerie non invasive optique (Tomographie par Cohérence Optique ou OCT). Lorsque les procédures sont terminées, tous les animaux sont mis à mort et des échantillons de tissus sont prélevés pour analyses complémentaires (dosages de cytokines inflammatoires dans le plasma, histologie...).

Procédures

Les animaux seront administrés topiquement sur la peau du dos et des oreilles avec un immunomodulateur afin d'induire des lésions de psoriasis. Cette administration sera effectuée une fois par jour, pendant 7 jours. Des traitements seront administés quotidiennement aux animaux par voie orale, topique, intrapéritonéale ou intraveineuse afin d'évaluer leur efficacité dans le cadre du psoriasis. Une évaluation clinique des sympômes de psoriasis sera effectuée quotidiennement : scoring (erythème, desquamation, excoriations) et mesures de l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles au pied à coulisse. Un suivi par imagerie non invasive OCT sous anesthésie sera réalisé. Le sang des animaux sera prélevé une fois en cours d'étude à la veine mandibulaire à l'aide de lancettes dédiées à ce type de prélèvement. Ces prélèvements se feront sous anesthésie à l'isoflurane. Le volume maximal deprélèvment sanguin est de 0.1mL. En fin de procédure un prélèvement sanguin total sera réalisé sous anesthésie générale (isoflurane).

Impact sur les animaux

Les effests indésirables observés sur les animaux sont souvent liés à l'induction de la pathologie chez les animaux. Nous observons généralement une forte perte de poids (jusqu'à -15% ) ainsi qu'une légère déshydratration des animaux pendant les 3 premiers jours. Les animaux présentent des symptomes du psoriasis (érythème, desquamation, excoriation) pouvant entrainer l'apparition de plaies suite à du léchage ou grattage intensif. Les autres effets indésirables observés peuvent etre attribués à l'administration des molécules thérapeutiques : mauvaise tolérance, irritation en cas d'application topique...

Devenir

A l'issu des procédures tous les animaux seront mis à mort selon la méthode de ponction intracardiaque suivie d'une dislocation cervicale le tout sous anesthésie générale (isoflurane).

Remplacement

Afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de psoriasis pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux appliqués directement sur la peau en application externe (voie dermique / topique). - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’homme). Ce projet s’effectuera chez la souris (Mus musculus).

Réduction

La stratégie d'expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d'imagerie. Cette approche expérimentale permet d'appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANAOVA; seuil de significativité alpha de 5% dont le critère principal sera l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles en fonction du temps) et permet d'avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d'initier les phases de traitement. Le nombre d'animaux sera de 8 par groupe (groupe d'animaux traités avec excipient de la molécule à tester, la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence commercialisé type bétaméthasone). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15%, une puissance de 70% et une différence à souligner de 20% entre groupes témoins et tersts comparativement à l'approche classique. Cette approche permet donc de réduire le nombre d'animaux de 50% au moins. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie/ immunohistologie/ PCR/ cytométrie et approches "omiques") afin d'obtenir le plus d'informations possibles relatives à l'efficacité des molécules administrées sur les animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par l’expérimentateur afin de s'assurer de leur bien-être (alimentation, boisson...). Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, igloo, cotons, bâtonnets de bois) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Leur poids sera évalué au minimum tous les 2 jours, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse. De la nourriture humidifiée ou du gel diététique sera ajouté dans leur cage. Au moindre signe de déshydratation, les animaux recevront une injection intra-péritonéale de sérum physiologique (20mL/kg). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative ; En cas de dépassement, les animaux seront euthanasiés selon la méthode prévue. (anesthésie à l'isoflurane, prélèvement sanguin terminal et dislocation cervicale).

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris immunocompétentes type CD1, C57Bl6 ou Balb/c) sont d'excellents modèles de psoriasis. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l'évaluation du psoriasis induit dans ces espèces. Ces animaux développent des symptomes de psoriasis très semblables à ceux observés chez l'humain. De plus, ces modèles présentent certains intérêts pratiques indéniables : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Tous les animaux auront le même âge. Les résultats publiés avec ce modèle utilisent des animaux de cet âge.

360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en trois groupes, ils reçoivent des injections destinées à provoquer une pancréatite, une inflammation pulmonaire ou une inflammation rénale, puis un agent de contraste avant un passage à l'IRM, et sont euthanasiés sans réveil pour prélèvement des organes. Le porteur indique que ces modèles inflammatoires peuvent atteindre la respiration, la mobilité et l'alimentation, avec une mise à mort déclenchée dès une perte de poids de 15 pour cent. Il conclut qu'il est "indispensable" de recourir aux animaux, ces pathologies n'étant pas selon lui reproductibles in vitro.

Objectifs

Ce projet ouvre une nouvelle voie en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) en initiant le concept d’« imagerie enzymatique » in vivo pour une meilleure compréhension de la physiologie humaine, la détection précoce et le pronostic des maladies, et le suivi de traitements thérapeutiques. L'objectif principal est de dépasser les frontières actuelles en permettant de visualiser directement l'activité d'une enzyme dans un tissu pathologique.

Bénéfices attendus

1-De nouveaux agents de contraste possédant une forte spécificité d’action au niveau tumoral, seront développés et permettront de suivre l’activité enzymatique tumorale 2- Ceci permettra la détection de façon précoce de maladies inflammatoires chroniques pulmonaires : en effet par exemple actuellement les pathologies chroniques pulmonaires ne sont détectées que lorsque les destructions du tissu pulmonaire sont irréversibles (Bronchopneumopathie chronique obstructive (COPD), mucoviscidose). Pour les pancréatites chroniques, aucun test n’est fiable pour le moment. 3- Ce projet permettra aussi de valider l'utilité de l'IRM à champ terrestre, en termes de coût, de facilité de transport et de consommation énergétique.

Procédures

Toutes les procédures décrites dans ce document seront réalisées sous anesthésie générale. Cent vingt animaux recevront 10 injections (une par heure) d'une modécule pro-inlfammatoire pour créer une inflammation du pancréas (pancréatite) puis une injection d'agents de contraste avant leur passage à l'IRM, puis, sans réveil préalable, seront euthanasiés. Cent vingt animaux recevront une injection de membranes bactériennes pour créer une inflammation pulmonaire puis une injection d’un agent de contraste avant leur passage à l'IRM, puis, sans réveil préalable, seront euthanasiés. Cent vingt animaux recevront une injection d'une molécule pro-inflammatoire pour créer une inflammation rénale puis une injection d'un agent de contraste avant leur passage à l'IRM, puis, sans réveil préalable, seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Des nouveaux agents de contrastes seront injectés dans les animaux. Du fait de leur haute spécificité d’action au niveau tumoral, ceux-ci ne devraient pas entrainer de nuisance ou d'effets secondaires. Cependant, en théorie une baisse de tension est possible due à leur présence. Selon notre expérience elle n’entraine jamais de séquelle ou de perte d’animaux. Cependant, les modèles inflammatoires peuvent atteindre le bien-être animal en terme de respiration, mobilité, alimentation. Il est important de noter que l’examen IRM n’a jamais montré de nuisance.

Devenir

Cette euthanasie est nécessaire pour extraire les organes et réaliser des coupes histologiques pour détecter la présence des neutrophiles dans les sites inflammatoires et ainsi corréler avec le signal IRM obtenu.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé des tests de validation de la méthode in vitro où seulement l’enzyme et l’agent de contraste étaient présents. Il est désormais indispensable d’utiliser des animaux, car nous souhaitons détecter une activité enzymatique, liée à une inflammation ou une pancréatite, dans un système complexe. Ces pathologies ne sont pas reproductibles in vitro car elles nécessitent soit un système immunitaire complet soit un organe fonctionnel dans lequel une situation pathologique doit être provoquée. De plus, nous souhaitons évaluer l’efficacité de détection de nouveaux agents de contraste, qui dépend de leur bio-distribution, du temps de demi-vie dans le sang, de la localisation de l’inflammation, de la voie d’injection, etc.. Ceci ne peut être évalué qu’en condition in vivo. Cette étude ne peut pas être réalisée chez l’homme car la technologie nécessaire à la fabrication d’une IRM à champs terrestre n’existe pas pour des études humaines. De plus, les agents de contrastes sont encore expérimentaux et donc ne peuvent pas être injectés directement chez l’homme.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser pour ce projet, des expérimentations in vitro ont été réalisées en amont, pour étudier l'effet des agents de contraste sur des neutrophiles en culture. De plus la méthode a été déjà évaluée à 0.2 tesla. Le nombre d'animaux a été évalué à 10 rats par agent de contraste, afin d'avoir un nombre suffisant pour obtenir des résultats significatifs. Ces résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi par des objets (bâtonnets de bois à ronger, matériaux de construction de nid, coton, maisonnette, tubes en carton) contenant de la paille, de la nourriture et de l’eau à volonté. L'utilisation d'anesthésie gazeuse, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et un ballonnet pour le contrôle de la respiration pendant les procédures permettent d'assurer un réveil rapide des animaux et donc de pratiquer plusieurs anesthésies par animal. Du gel olphtalmique sera appliqué sur les yeux afin de compenser la sécheresse oculaire lors des anesthésies. Pour limiter la souffrance des animaux développant les modèles inflammatoires, ils seront euthanasiés dès que l’examen IRM sera terminé, sans réveil préalable. Entre la mise en place des modèles inflammatoires et l’examen IRM, des points limites terminaux ont été instaurés pour surveiller la santé et le bien-être des animaux : modification de la respiration (respiration orale/abdominale, respiration difficile/pénible et de forte amplitude), atteinte de la mobilité (marche sur la pointe des pieds, titubation, léthargie), gonflement abdominal, perte de poids de plus de 15% en 2-3 jours (pour le modèle inflammatoire rénal). Pour cela, les animaux seront pesés tous les jours. De la nourriture sous forme de gel sera déposée dans la cage si les animaux sont affaiblis ou si une perte de poids de 10% en 2-3 jours est constatée (pour les modèles inflammatoires rénaux). Lors du développement de la pancréatite, les animaux seront pris en charge par un analgésique (en pré- et post-injection), et ce, jusqu’à la fin du protocole. Pour les autres pathologies, dès les premiers signes de souffrance détectée par des signes cliniques (poil hérissé, prostration, difficulté respiratoire..), les animaux recevront un analgésique. Si les signes perdurent plus de 12h dans le cas de l’inflammation pulmonaire ou 2 jours pour l’inflammation rénale, les animaux seront immédiatement transférés pour un examen IRM avant leur euthanasie. Les animaux seront surveillés au minimum 1 fois par jour par le porteur du projet, ou le zootechnicien ou les doctorants et post-doctorants formés.

Choix des espèces

Nous débuterons le projet sur des rats car leur taille est plus importante que les souris et permet donc d'obtenir plus de signal. L’IRM à champs terrestre est en effet beaucoup moins sensible que l’IRM à hauts champs. De plus, le développement instrumental est moins difficile pour des rats que pour des souris. De plus, de nombreuses pathologies bien connues dans la littérature inflammatoires pourront y être développées. Les rats seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), car le développement des organes est terminé. De plus, plus les animaux sont gros, plus la sensibilité de l’IRM augmente. Cependant, les rats ne seront utilisés que jusqu’à 4 mois (environ 300g), car ensuite ils deviennent trop imposants pour rentrer dans l’antenne sans être trop serrés et le vieillissement pourrait interférer avec les résultats.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire leur est greffée à partir de cellules cancéreuses, puis elles reçoivent jusqu'à huit injections d'un anticorps, avant mise à mort au plus tard trente jours après. Le porteur décrit une perte de poids et des difficultés respiratoires possibles liées au développement de métastases. Il annonce espérer démontrer l'efficacité d'une immunothérapie et juge le modèle animal seul capable de reproduire ces mécanismes tumoraux.

Objectifs

Un des cancers du sein les plus agressifs, qui représente 15 à 20% des cancers du sein, présente un taux élevé de rechute. L’absence de thérapies spécifiques le rende difficile à traiter. Nos données montrent que les cellules de cancer du sein triple négatif résistant à une irradiation présentent de façon plus abondante une protéine particulière appelée Gal9. Cette protéine pourrait servir de cible thérapeutique pour lutter plus efficacement contre cette maladie. L’objectif scientifique de ce projet est de tester l’efficacité thérapeutique d’un anticorps ciblant Gal9 dans un modèle de cancer du sein triple négatif chez la souris. Notre projet consistera dans un premier temps à faire pousser des tumeurs à partir de cellules irradiées in vitro. Les cellules seront irradiées puis injectées dans la glande amammaire. La croissance des tumeurs sera suivie et comparée à des tumeurs issues de cellules non irradiées. La deuxième phase de notre projet dépendra de l’efficacité de notre première procédure. Elle consistera à injecter des cellules irradiées ou non irradiées à des souris et de traiter immédiatement ces souris avec un anticorps ciblant Gal9. Ce traitement devrait permettre de minimiser le développement du cancer, en particulier chez les souris dont les tumeurs expriment fortement Gal9.

Bénéfices attendus

Nous espérons démontrer l'efficacité d'une thérapie ciblant Gal9 dans ce cancer particulièrement agressif. Les patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif et soumises à de la radiothérapie pourraient être particulièrement éligibles à cette thérapie.

Procédures

1 Injection sous-cutanées sous anesthésie gazeuse (10 minutes) Injections intra-péritonéales sur animaux vigiles (jusqu’à 8, à raison de 2 par semaine)

Impact sur les animaux

Le développement des tumeurs pourrait s'accompagner d'une perte de poids en plus d'une gêne physique pour les animaux. Des effets indésirables liés à la présence de métastases sont envisageables ; ils se traduiraient par des difficultés respiratoires plus ou moins prononcées. La grille de points limites que nous proposons permettra de tenir compte de ces potentiels effets indésirables. En ce qui concerne l'injection d'anticorps anti-(gal9), plusieurs papiers ont déjà été publiés à ce sujet et ne montrent pas d'effets indésirables particuliers.

Devenir

Les animaux seront systématiquement mis à mort à la fin de chaque procédure, au maximum 30 jours après le début du traitement. Les raisons sont les suivantes: - le score maximum de points limites sera atteint, - les souris n'auront pas de tumeur primaire mais seront susceptibles d'avoir développé des métastases pulmonaires - les souris auront bien répondu à l’immunothérapie et l’analyse des réponses immuno-inflammatoires sera nécessaire pour l'expliquer.

Remplacement

Nous avons accumulé de nombreuses expériences sur modèles cellulaires mais nous devons maintenant tester l’utilité de notre traitement sur l’animal puisqu’il n’existe pas de modèle non animal permettant de reproduire les mécanismes complexes impliqués dans le développement tumoral et les réponses immunitaires associées.

Réduction

Un test statistique adapté a été utilisé pour calculer le nombre nécéssaire et suffisant de souris. Pour chaque condition expérimentale, un nombre de 10 souris par groupe pour un total de 70 souris.

Raffinement

L’état général des souris sera contrôlé visuellement quotidiennement en ouvrant chaque cage. Les tumeurs seront mesurées tous les 2 jours (lundi au vendredi). La grille sera également utilisée tous les 2 jours. La souffrance des animaux ne devrait pas dépasser un niveau de contrainte équivalent à l’introduction d’une aiguille. Cependant, une grille d’évaluation de la douleur, adaptée à ce projet, a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence et son comportement, révélateurs du niveau de douleur. En cas d’atteinte d’un niveau défini de points limites, la mise à mort de l’animal sera anticipée.

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études réalisée dans des modèles développés in vitro et vise à valider la pertinence de notre travail dans le cancer du sein triple négatif. Il est essentiel de tester la pertinence de notre cible thérapeurique dans un modèle beaucoup plus complexe que des cultures cellulaires et de tester son action anti-cancéreuse. La souris est une espèce qui permet de récapituler assez fidèlement les étapes du développement du cancer du sein en intégrant les réponses des cellules de l'immunité observées chez l'humain. Le cancer mammaire est majoritairement présent chez l'adulte. Pour cette raison, nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines.

884 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées d'une étape à l'autre puis mises à mort pour prélever leurs organes. 52 femelles gestantes sont immobilisées dans un tube de contention sous lumière vive trente minutes, trois fois par jour pendant six jours, pour induire un stress prénatal, et leur descendance subit des tests de tolérance au glucose avec gavage et prises de sang à la queue. Le porteur décrit ce protocole comme un modèle de stress psychologique humain transposé à la souris. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes alternatives sont peu représentatives des pathologies humaines et rend le recours à l'animal "incontournable", le stress et les désordres métaboliques étant des réactions de l'"organisme entier".

Objectifs

La prévalence mondiale du développement de maladies métaboliques est en perpétuelle augmentation à travers le monde. L’objectif de notre projet est d'étudier les mécanismes du stress sur le développement de ces pathologies dans la descendance.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact d'un stress prénatal se rapprochant d'un modèle de stress psychologique chez l'humain, chez la souris. Ce projet apportera des connaissances sur la physiopathologie des désordres métaboliques altérés par le stress au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Pour générer des souris F1 issues de mères stressées, 52 femelles seront placées dans un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour, pendant 6 jours, du 13ème jour au 18ème jour de gestation. L'ensemble des souris F1, soit 624 sera soumis à un test de tolérance oral au glucose avec gavage sur animaux vigiles et avec prélèvement de sang à la queue. Parmi ces animaux, la moitié, soit 312 animaux seront soumis à deux tests de tolérance oral au glucose avec prélèvement de sang à la queue 3 mois après. Ces expériences seront réalisées sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Ce modèle n'induit pas de douleur spontanée chez la souris. Nous attendons le premier jour de la procédure de stress une stabilisation du poids ou une perte de moins de 3.5% du poids des mères gestantes en comparaison avec les mères gestantes non stréssées. Dès le deuxième jour de la procédure de stress les mères gestantes doivent reprendre du poids. Le stress réalisé sur les mères gestantes ne comporte pas d'effet visible comportemental. Nous attendons un stress léger sur la génération F1 qui pourrait se manifester sur les différents paramètres mesurés, notamment une augmentation de la glycémie à jeun ou en réponse à l'administration de glucose.

Devenir

Les animaux ayant servi à générer la descendance F1 seront mis à mort et des prelèvements d'organes seront réalisés. Les souris F1 sous régime normal ou sous régime particulier seront euthanasiées à différents âges : adulte jeune ou adulte mature après la procédure du test de tolérance oral au glucose. Différentes expériences seront réalisées ex-vivo et des prélèvements tissulaires seront collectés pour différentes études au niveau cellulaire et moléculaire.

Remplacement

Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut métabolique au cours du temps de la descendance suite à un stress gestationnel sont peu représentatives des pathologies humaines. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin d'étudier les mécanismes engagés entre l'effet du stress in utéro et les désordres métaboliques observés chez la descendance. De plus, le stress et les désordres métaboliques sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.

Réduction

Le nombre de 8 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées. L'ensemble des procédures seront réalisé lors de 3 expériences indépendantes.

Raffinement

Le suivi expérimental repose sur des techniques non-invasives : suivi du poids, observation du bien etre animal. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux.

Choix des espèces

La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine.

364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée deux plaies dorsales par chirurgie sous anesthésie, on leur pose une puce télémétrique et on les traite au plasma froid une à deux fois par jour, pour mettre au point un modèle de plaie chronique infectée par des bactéries résistantes. Le porteur reconnaît une douleur et une gêne aux déplacements au réveil, et prévoit des prélèvements de peau et de rate après la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale et qu'aucun modèle in vitro ne représenterait un cas clinique.

Objectifs

L’objectif est à la fois d’optimiser les technologies plasmatiques existantes et de développer de nouvelles technologies pour éliminer les bactéries résistantes responsables d’infections nosocomiales. Les sources de plasma sont testées dans différents contextes pour leur efficacité antimicrobienne in vitro et in vivo en utilisant un modèle murin de plaie infectée. Des études mécanistiques sur la destruction bactérienne médiée par le plasma froid sont effectuées tandis que des échantillons de plaies provenant de patients facilement disponibles sont utilisés pour fournir du matériel réaliste pour étudier l’efficacité de cette nouvelle approche. Enfin, le traitement de plaies colonisées par des bactéries résistantes aux antibiotiques fourniront les données d’une preuve de concept. Les résultats du projet ne serviront pas uniquement à rendre prometteur l’utilisation du plasma froid contre les plaies infectées, mais également d’améliorer la cicatrisation de plaies afin de lutter contre le développement de l’antibiorésistance résistantes en médecine humaine et vétérinaire.

Bénéfices attendus

Au sein du projet global, il est attendu que l’utilisation du kINPen ou du Multijet avec un nouveau mélange de gaz soi efficace pour lutter contre l’infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques et pour améliorer la cicatrisation des plaies d'animaux présentant un déficit cicatriciel. Cela se traduira notamment par une baisse significative de la colonisation bactérienne sur la plaie, et une éventuelle accélération de la cicatrisation des plaies. Un nouveau dispositif à plasma, le multijet, sera également utilisé. Il est attendu que ce nouvel outil soit aussi efficace , sinon plus, que le premier quant à la désinfection et la cicatrisation des plaies, permettant ainsi de traiter une surface de plaie plus importante et d’augmenter l’efficacité de la réponse immunitaire. A plus long terme, cela pourrait permettre de généraliser l’utilisation de divers dispositifs à plasma à l'être humain, chez des patients souffrant de troubles de la cicatrisation (diabète, immunodépression, etc.) ; mais aussi de lutter contre l’antibiorésistance s’installant notamment sur ces plaies dans le cas d’infections nosocomiales. Cela pourrait également offrir des opportunités de traitement dans divers domaines (chirurgie, ophtalmologie, oncologie, etc.). La généralisation de l’utilisation de ce système pour entièrement décontaminer du matérial médical en milieu hospitalier pourrait être envisagée.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie général, suivi d'un protocole de gestion de la douleur post-opératoire (injection en intra-péritonéale des immunostimulants (introduction aiguille) une à deux fois par jour durant 3 jours. Les animaux auront une prise de sang à veine sub-mandibullaire (introduction aiguille) une fois tous les 5 à 7 jours pendant quelques secondes. Les animaux seront équipés d'une puce télémétrique (introduction aiguille) en début d'expérimentation (1 fois) pendant quelques secondes. Les animaux seront traités par le plasma à froid 1 ou 2 fois par jour pendant quelques minutes (non invasif).

Impact sur les animaux

Suite à la création des deux plaies dorsales, une douleur et une gêne possible dans les déplacements sont attendues au reveil de l’animal sans analgésie. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit les 364 souris. Des prélèvements de tissus seront effectués post-morterm pour la partie histologie (zone de biospsie et rate) popur l'analyse biologique de la reconstruction de l'épiderme cutané. La décision est prise par les responsables scientifiques et concepteurs.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternatives non animales puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro qui permettrait de représenter au mieux un cas clinique.

Réduction

Les volumes de sang à prélever par animal et leur fréquence étant contraints, les volumes prélevés à chaque prise de sang seront « poolés » par 2 (animaux du même groupe et de même sexe pour limiter la variabilité). Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique : Kruskall-Wallis pour l’étude de la réponse immunitaire d’animaux et cicatricielle.

Raffinement

Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation sera effectuée pour limiter au maximum les perturbations liées à un nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour (télémétrie, signes cliniques tels que le poids, l’apparence et le comportement général). L’eau et la nourriture seront ad libitum. Les souris bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Les souris sont hébergées dans une animalerie A2 en portoirs ventilés. La pose des puces est faite sous anéthésie générale à l'isoflurane. Afin de diminuer la douleur de l'injection de la puce, un dépôt de Tronothane® 1 % (pramocaïne, gel). Pour la partie chirurgie et le suivi post-opératoire : Période préopératoire : injection pré-opératoire de buprénorphine (0,1 mg/kg, SC), au moins 20 minutes avant le début de la chirurgie Période opératoire : anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Période postopératoire : injection post-opératoire immédiate de méloxicam (20 mg/kg, SC). Suivi Injection de buprénorphine (même dose) le soir. Injection de méloxicam (20 mg/kg SC, 1 fois/jour, à J1 et J2). Injection de buprénorphine (même dose) à la demande (2 fois/jour, à J1, J2 et J3) en fonction du résultat de l'évaluation de la douleur, si elle n'est pas contrôlée par le méloxicam. Visite animalier matin et soir.

Choix des espèces

Il n’existe pas d’alternatives non animales puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro qui permettrait de représenter au mieux un cas clinique. Age des souris = 6-7 semaines. Les souris doivent être de jeunes adultes pour pouvoir faire les biopsies (décrits dans les modèles publiés) et avoir un système immunitaire mature.

3 132 souris transgéniques humanisées pour des molécules HLA vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales sous-cutanées répétées et des prélèvements de sang à la veine sous-maxillaire, avant d'être tuées pour prélever la rate et d'autres organes. Le porteur vise un vaccin peptidique dit universel censé couvrir plus de 80 % de la population mondiale, un bénéfice renvoyé au développement futur. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire après vaccination ne peut être reconstituée hors d'un "organisme entier" et juge "indispensable" le recours aux souris transgéniques.

Objectifs

Une avancée majeure dans le traitement des cancers a été réalisée au cours de ces dernières années grâce à l’utilisation de l’immunothérapie. L’immunothérapie consiste à réactiver les cellules du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Bien que très efficace chez certains patients, une large proportion de personnes atteintes par le cancer ne répond pas à ces nouvelles thérapies (environ 80% des patients). De nombreuses études montrent à présent, que chez les patients traités par certaines immunothérapies, l’ajout d’une vaccination dirigée contre des cibles appelées «antigènes» présentes à la surface des cellules tumorales peut améliorer la destruction de la tumeur et induire une rémission ou une stabilisation des patients. Dans ce cas, l’efficacité de la réponse vaccinale dépend directement de la nature des antigènes sélectionnés pour cibler les tumeurs et de la capacité du système immunitaire à reconnaitre efficacement ces cibles tumorales. On appelle antigène toute substance capable de déclencher une réponse immunitaire visant à l'éliminer. Dans le cas des cancers, il s'agit le plus souvent de peptides (fragments de protéines) qui sont reconnus de manière spécifique par certains globules blancs, les lymphocytes T CD8 (étudiés dans le cadre de ce projet). Nous avons développé une méthode pour identifier des cibles tumorales très efficace pour détruire les tumeurs, consistant à activer le système immunitaire avec des antigènes bactériens très semblables à certains antigènes tumoraux. L’utilisation d’antigènes bactériens permet de réactiver une réponse immune similaire à celle pouvant exister lors d’une infection bactérienne et d’induire une réponse contre les tumeurs similaires à celle observée contre un pathogène étranger. Utilisés pour la vaccination des patients, ces antigènes bactériens semblables aux antigènes tumoraux pourraient devenir un nouvel outil pour le traitement des cancers. L’objectif de notre projet est de développer un vaccin thérapeutique efficace qui ciblerait la grande majorité de la population mondiale.

Bénéfices attendus

Les objectifs pour ce projet sont d'étendre nos connaissances scientifiques sur le mimétisme moléculaire peptidique à d'autres HLA et de développer un vaccin peptidique universel (pour tous).

Procédures

Les interventions auxquelles les souris seront soumises sont les suivantes pour la 1e procédure expérimentale (Immunisation par méthode prime-boost): • Vaccination par injection sous-cutanée : 2 injections à 14 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 3 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10 et 17 jours après la vaccination). Pour la procédure expérimentale n°2 (Cinétique de vaccination) : • Vaccination par injection sous-cutanée : 5 injections à 7 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 4 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10, 17 et 31 jours après vaccination)

Impact sur les animaux

Lors de l’immunisation des animaux et du suivi des cinétiques de vaccination, douleurs légères associées à une injection sous-cutanée et à des prélèvements de sang par voie sous-maxillaire (plaie réduite au point d’injection ou de prélèvement, œdème).

Devenir

Tous les animaux de cette procédure seront euthanasiés en fin d'expérience afin de pouvoir prélever leur rate et autres organes pour effectuer les analyses in vitro.

Remplacement

La mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination est un phénomène complexe. Cela implique la reconnaissance des antigènes par des cellules spécifiques et la collaboration de différents types cellulaires (lymphocytes T, B et cellules présentatrices d’antigène). L’efficacité de la réponse immunitaire est favorisée par de nombreux facteurs solubles provenant du microenvironnement dans lequel l’antigène est présenté. Ces particularités (collaboration de différents types cellulaires et microenvironnement) ne peuvent pas actuellement être reconstituées en dehors d’un organisme vivant. L’étude d’une réponse immunitaire après vaccination sur organisme entier ne peut donc être remplacée et n’a pas d’équivalent expérimental n’utilisant pas d’animaux. Il est donc indispensable d’avoir recours aux modèles animaux transgéniques pour le HLA humain pour récapituler ces interactions complexes antre cellules et microenvironnement afin de démontrer la mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination. Ce projet ne vise pas à l’évaluation directe d’une réponse anti-tumorale chez l’animal. La vaccination sera réalisée chez des animaux non porteurs de tumeur.

Réduction

En amont, 2 étapes ont permis de réduire le nombre de peptide et d’animaux qui seront utilisés : 1/ Une analyse in silico et la réalisation de tests in vitro ont permis de sélectionner un nombre restreint de peptides vaccinaux immunogènes et de forte affinité pour les HLA ciblés. 2/ L’analyse in silico via l’outil en ligne tools.iedb.org/population/ a permis de déterminer que le ciblage de 3 HLA-A (parmi les 68 possibles) et 2 HLA-B (parmi les 125 possibles) permet une couverture de 80% de la population mondiale. La réduction du nombre d’animaux a été réalisée pour permettre d’obtenir un nombre suffisant de données pour répondre à la problématique. L’utilisation d’outils statistiques du calcul de puissance de test et de taille d’échantillons (https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#), permet de définir un nombre minimal d’animaux de 12 par groupe, en considérant un seuil de significativité à p

Raffinement

Le bien-être des animaux étant primordial, les souris sont acclimatées au moins 7 jours avant le début de la procédure expérimentale. A réception, les souris sont hébergées par 7 maximum par cage pour les femelles et 6 maximum par cage pour les mâles. Les animaux seront maintenus dans des conditions environnementales contrôlées (température, humidité, cycle jour/nuit), dans un espace suffisant, en groupe pour maintenir les interactions sociales, et avec un enrichissement environnemental permettant de répondre aux besoins physiologiques et comportementaux des souris (présence de petite maison permettant aux animaux de se cacher). Toutes les manipulations seront réalisées dans le respect de l’animal. Le temps de manipulation des animaux sera de plus réduit au maximum afin de réduire le stress des animaux et l’impact possible sur la réponse immunitaire. La procédure expérimentale (vaccination) est de classe de gravité légère et ne nécessite pas d’y associer un protocole d’anesthésie. Les prises de sang régulières seront effectuées afin de suivre l’évolution dans la circulation sanguine la reponse immunitaire, ce qui élève le niveau de la procédure à une classe modérée. Ces prélèvements de sang seront effectués à la veine sous-maxillaire, 1 fois par semaine (ou tous les 15jours), selon le chronogramme prédéfini (cf annexe). Un volume total prélevé inférieur à 10% du volume sanguin de l’animal (soit au total environ 100µL/semaine ou 200µL/15jours, pour une souris de 25g) sera effectué afin de ne pas causer de dommage aux animaux. Toujours pour le bien-être de l’animal, le prélèvement sera effectué par alternance sur les 2 côtés.

Choix des espèces

Le principe de la vaccination repose sur la présentation des antigènes par le système HLA chez l’Homme. Le système de présentation antigénique est différent d’une espèce à l’autre. Ainsi les antigènes reconnus chez la souris peuvent être très différents de ceux reconnus chez l’homme car présentés par des molécules CMH (complexe majeur d’histocompatibilité) différents. Le vaccin final développé dans le cadre de ce projet représente un mélange de plusieurs peptides restreints par le HLA. Ce vaccin sera un vaccin HLA universel qui traitera une grande majorité des patients cancéreux (prédiction >80%) car ciblant les HLA du locus A et B les plus représentés chez l’homme (HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B35 et HLA-A2). Ce projet nécessite donc l’utilisation de souris dites humanisées transgéniques pour les différents HLA humains et parfaitement caractérisées pour leurs réponses aux vaccins peptidiques humains (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7 ou HLA-B35 restreint). Le modèle de souris transgéniques humanisées pour les différents HLA-A et HLA-B sont des modèles existants et relevant pour étudier l’immunogénicité de ces vaccins destinés à l’homme. Les études pourront être réalisées sur des souris adultes âgées au début de l’expérimentation de 7 jusqu’à 15 semaines, âge où le système immunitaire est mature et donc à partir duquel une réponse immunitaire peut être correctement évaluable. Pour chaque étude, des souris d’âges similaires seront utilisées (plus ou moins une semaine). En cas de variation de plus d’une semaine, les animaux seront répartis de façon équilibrée dans chacun des groupes afin d’assurer l’homogénéité des groupes.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées par le virus de la Vaccine par voie intranasale sous anesthésie, elles reçoivent du chloramphénicol par injections répétées et une prise de sang au sinus rétro-orbital juste avant la mise à mort, pour étudier le métabolisme des lymphocytes T CD8. Le porteur indique fixer un point limite à 20 % de perte de poids, l'antibiotique n'ayant pas encore été testé dans ce contexte infectieux. Il affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend son étude in vitro impossible.

Objectifs

Lors d’une infection virale, les T-CD8s naïfs et spécifiques des antigènes viraux sont activés dans les ganglions drainant l’organe infecté. Suite à leur activation, les T-CD8s prolifèrent et se différencient en cellules effectrices qui migrent vers l’organe infecté et éliminent les cellules infectées. En parallèle, pendant la phase effectrice, un petit nombre de T-CD8 mémoires se développent, qui vont persister sur le long terme. Les T-CD8s mémoires sont capables de réagir de manière plus rapide et plus efficace en cas de nouvelle rencontre avec le même virus. La fonction des T-CD8s et la génération de T-CD8s mémoires fonctionnels sont largement dépendantes d’une succession de changements métaboliques et reposent sur une communication étroite entre la respiration mitochondriale et la glycolyse. En effet, alors que les T-CD8 naïfs (qui n'ont jamais été activés) acquièrent leurs besoins énergétiques de la respiration mitochondriale, leur activation mène à un remodelage métabolique en faveur de la glycolyse, leur permettant d’assurer leurs fonctions effectrices. Enfin, les T-CD8 mémoires possèdent un métabolisme respiratoire, accompagné d’une augmentation de la masse mitochondriale leur permettant de répondre rapidement lors d’une réponse secondaire. Bien que ces changements métaboliques soient à présent bien admis, les mécanismes sous-jacents qui les contrôlent restent peu, voire pas, connus. De manière intéressante, la respiration mitochondriale repose sur la traduction d’ARNs spécifiques et exclusivement exprimés dans les mitochondries, un processus nommé la traduction mitochondriale. L'émergence d’études sur ce sujet suggèrent ainsi un rôle spécifique de la traduction mitochondriale, dans l’établissement des réponses immunes innées et adaptatives. Ainsi, ce projet vise à disséquer, au niveau moléculaire, la contribution relative des traductions mitochondriale et cytosolique, dans le contrôle de la respiration mitochondriale et de la glycolyse, au cours des réponses T-CD8 anti-virales. Pour cela, des souris C57Bl/6J seront infectées par voie intranasale, avec le virus de la Vaccine. La traduction mitochondriale sera spécifiquement inhibée, grâce à l’utilisation de Chloramphenicol, injecté par voie intra-péritonéale. Différents temps après infection, l'analyse du nombre, du phénotype, et des fonctions des T-CD8s, sera effectuée ex vivo sur un prélèvement de sang et des organes lymphoïdes.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de combler le manque de connaissances mécanistiques concernant les besoins métaboliques des T-CD8, et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour moduler les fonctions cytotoxiques des T-CD8 et la génération/maintenance des cellules mémoires.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Injection Intraveineuse (sous brève anesthésie Isoflurane) – uniquement pour la procédure 2 : 1 fois par animal – durée 30 secondes - Injection intrapéritonéale (pour anesthésie Kétamine/Xylazine) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie Kétamine/Xylazine) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine - Injections Intra-péritonéales (pour traitements chloramphénicol): 1 fois par jour pendant 4 à 10 jours en fonction des groupes – durée 30 secondes par injection - Prélèvements sanguins au sinus retro-orbital (sous brève anesthésie Isoflurane) : 1 fois par animal, juste avant la mise à mort – durée 30 secondes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une légère douleur générée par les injections intra-péritonéales et le stress généré par l’anesthésie et la procédure d’inoculation du virus par voie intranasale. L'infection par le virus de la Vaccine est une procédure utilisée en routine dans le laboratoire dont les conséquences ne génèrent pas de souffrance sur les animaux. Le chloramphenicol utilisé dans ce projet (50mg/Kg, en IP) est un antibiotique largement utilisé chez l'humain et dans des modèles animaux. Les doses utilisées sont basées sur la littérature qui ne décrit aucune nuisance ou effet indésirable sur l’état général des animaux. De plus le chloramphénicol (qui inhibe la traduction mitochondriale) devrait, selon la littérature, avoir un impact surtout dans la génération et la survie des cellules T CD8 mémoires, et seulement un impact négligeable sur la réponse effectrice (et donc sur la capacité des animaux à contrôler l'infection). Cependant, étant donné que cette drogue sera testée pour la première fois dans le cadre d'une infection virale in vivo, un point limite de 20% de perte de poids est fixé.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever les organes (ganglions lymphatiques, poumons, rate etc) et effectuer ex vivo: - des analyses cellulaires pour déterminer le phenotype et la fonctionalité des lymphocytes T CD8 - des analyses moléculaires et les mecanismes impliqués dans la traduction mitochondriale, au cours de la réponse T-CD8

Remplacement

La réponse immunitaire anti-virale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous utiliserons 15 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Nous utiliserons des tests de comparaison de moyennes de Student et des tests non-paramétriques pour comparer les groupes. Le calcul de la puissance des tests statistiques et nos expériences antérieures ont montré que ces nombres d'animaux par point expérimental étaient nécessaires et suffisants pour l’interprétation de nos résultats.

Raffinement

Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, i) les infections intra-nasales seront réalisées sous anesthésie profonde et la température corporelle des animaux sera maintenue lors de l'anesthésie; ii) nous effectuerons une brève anesthésie à l'isfluorane (3% dans une chambre à oxygène) pour les prélèvements de sang en rétro-orbital; iii) les injections I.V. au sinus rétro-orbital seront réalisée sous anesthésie à Isoflurane (3% dans une chambre à oxygène); iv) nous maintiendrons les animaux en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée) ; v) assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, comme décrit au sein de chaque procédure.

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser, à terme, des animaux génétiquement modifiés. Dans ce projet, des souris sauvages (fond C57Bl/6J) seront utilisés.